专利名称：一种快速检测啤酒中有害菌的方法
技术领域：
本发明属于啤酒技术领域。特别涉及一种应用荧光原位杂交技术及荧光微菌落技 术相结合，专门用于啤酒中有害微生物快速检测的方法。
背景技术：
啤酒有害菌是指能厌氧存活于包装啤酒中，引起啤酒变酸浑浊的一类细菌，这种 细菌主85%以上是由乳酸菌类，如短乳杆菌，四联球菌等组成。对啤酒生产中有害菌的检测 是各啤酒厂为避免生产损失所必须面对的任务，也是全世界饮料行业所重点关注的问题。 在传统的啤酒微生物检测中，第一步往往是在选择性培养基上筛选微生物，这是一个定量 的过程。在第一步的基础之上再进行进一步的分析，比如显微镜观察、过氧化氢酶实验和 PCR鉴定实验等，来进一步鉴定啤酒腐败菌，这是一个定性的过程。这些传统的啤酒有害军 定量定性过程往往需要足够长的时间，定量过程就需要一周或者更长时间，定性做生理鉴 定要5-7天时间，分子鉴定也要3-5天时间，总计要半个月左右的时间，这样就不能及时的 反映生产过程污染状况，使微生物检测滞后于啤酒生产，往往都是在啤酒质量出现问题才 能去发现和补救，造成很多食品质量问题，如浑浊，发酸等。因此如何提高啤酒有害菌检测 速度就是啤酒生产过程中微生物检测的两个决定性因素，就是如何快速实现定性定量。荧光原位杂交技术(FISH)可以快速检测微生物，并根据探针不同来定性微生物， 能够同时提供关于微生物形态、数量、空间分布与细胞环境方面的信息，使人们可以在自 然或人工的微生物环境中监测和鉴定不同的微生物个体。目前，FISH技术在国外已有广 泛的应用，K. Thelen已经将标记有荧光的基因探针用于啤酒腐败菌中的快速检测；Sergi Ferrer等人也已经应用FISH技术检测白酒中的乳酸菌，都在有害菌的快速检测中取得了 很好的效果。但是，FISH技术在上述应用方面也存在缺陷。例如，在营养饥饿状态下，细菌 的染色体含量降低，因而细胞中的16S rRNA减少，会导致荧光杂交信号减弱形成假阴性结 果，导致检测结果偏低。这是十分致命的，因为检测结果现实无菌，但实际上酒里面有很多 菌。另外，细菌普遍存在的自发荧光现象及探针的特异性不足还可能导致假阳性结果。因 此，虽然荧光原位杂交技术已经有了很广泛的应用，但是，在定量问题上仍没有很好的解决 办法。微菌落技术同样是一种快速检测细菌的方法，在检测细菌方面同样有很广泛的的 应用。裴晓芳等用醋酸纤维素薄膜作载体，建立了一种新颖的、快速的、简单实用的微菌落 技术，Nobuyasu等采用荧光微菌落对透析液中的细菌进行检测，采用微菌落法可以将检测 时间缩短到48h内，而常规的检测需要7天。微菌落技术大大提高了检测的时间和准确度。 但是，该技术存在不能定性的缺点，因此不能为啤酒厂提供精确的污染菌方面的信息，不知 道是何种菌污染了啤酒，不能区别是否是啤酒有害菌。目前，如何快速定性并且准确定量的检测啤酒生产过程中有害菌成了困扰啤酒行 业的一大难题。
发明内容
本发明的目的是利用荧光原位杂交与荧光微菌落结合的技术快速检测啤酒厂中 的有害菌。当把微菌落技术和荧光原位杂交技术结合后，可以使荧光原位杂交检测的不再 是单个菌，而是菌落，这样可以很好的避免假阳性及假阴性的现象发生。同时，微菌落技术 作为一种可以在短时间培养后定量的技术，和FISH结合以后，可以完善FISH技术不容易定 量的特点。另一方面，FISH技术根据其探针的特异性同样弥补了微菌落技术不能够定性检 测的缺憾。从而，达到啤酒厂生产所需要的实现短时间内对所检测微生物既定性又定量的 要求。本发明由以下步骤组成(1)快速增菌培养基的制备培养基取快速增菌培养基粉末(蛋白胨，酵母膏，牛肉膏，吐温80，磷酸氢二钾， 醋酸钠，叶酸，放线菌酮，琼脂，葡萄糖，麦芽根浸粉，泛酸钙组成)溶于蒸馏水中，121°C灭 菌15分钟，倒平板。该培养基能让有害菌快速增长，加快检测时间。(2)微菌落试验取含菌的样液300_500mL，将经过高温灭菌的聚碳酸酯膜放至抽滤系统进行抽滤， 而后取出滤膜光面向上贴于快速增菌培养基平板上，于放入厌氧罐中厌氧培养1 后，(兼性四联球菌仅需5小时)，进行荧光染色，将聚碳酸酯膜放于浸湿CFDA染色液的无 菌滤纸上，避光染色5-15分钟，然后取出放至浸湿无菌水的无菌滤纸上洗去膜片下面的染 色液。(3)荧光原位杂交试验将进行过CFDA染色的膜片直接进行荧光原位杂交实验。先用乙醇固定然后用蛋 白酶溶菌酶处理的方式效果很差，荧光信号微弱不利于检测。为了可以使探针更好的与菌 的RNA结合，采用了首先将膜片进行蛋白酶K 58 0C处理lOmin，接着取出膜片，浸入含有溶 菌酶的磷酸缓冲液中处理lOmin。取出后，放入有乙醇的染色缸中，最后再在质量分数为 50%，80%，100%乙醇中脱水，每一醇度浸泡:3min。室温下直立干燥，这样效果取得了显著 提高。添加10 μ L体积预先设计好的探针溶液(50ng/yL)，该探针根据不同的有害菌设 计不同的探针序列，可以定性有害菌。和90 μ L杂交缓冲液到微量离心管中，冰浴中避光 保存。杂交箱里放吸水纸，用杂交液湿润。添加20 μ L的杂交混合液、10 μ L的blocking regent到膜片上与样品混合，将膜片放入杂交箱里，恒温箱中进行杂交反应。杂交缓冲液、 杂交洗脱液、杂交温度与时间经由探针优化条件确定。在从杂交箱里取出膜片前，将盛有清洗液的一个染色缸在48°C震荡水浴锅中预 热。把膜片放入预热后的清洗液中，震荡洗涤膜片20-25min，清洗后取出膜片放至浸湿无菌 水的无菌滤纸上洗去膜片下面的洗脱液。待洗脱液洗脱后，将膜片放到整片大玻璃载玻上在荧光显微镜4X或IOX下观察 计数，采用蓝光激发。随机观察30-40个视野的微菌落，按下式计算样本中的菌落数
权利要求
1. 一种快速检测啤酒有害菌的方法，其特征在于该方法包括如下步骤(1)快速增菌培养基的制备培养基取快速增菌培养基粉末(蛋白胨，酵母膏，牛肉膏，吐温80，磷酸氢二钾，醋酸 钠，叶酸，放线菌酮，琼脂，葡萄糖，麦芽根浸粉，泛酸钙组成)溶于蒸馏水中，121°C灭菌15 分钟，倒平板。该培养基能让有害菌快速增长，加快检测时间。(2)微菌落荧光染色取样液300-500mL，将经过高温灭菌的聚碳酸酯膜放至抽滤系统进行抽滤，取出滤膜放 在快速增菌培养基上厌氧培养30小时。然后将滤膜取下，避光染色，染色后清洗滤膜， 洗掉染色液，以去除背景影响。(3)荧光原位杂交试验将进行过CFDA染色的膜片直接进行荧光原位杂交实验。将膜片进行蛋白酶K处理， 取出膜片，浸入含有溶菌酶的磷酸缓冲液中处理，取出后，放入有乙醇的染色缸中，分别在 质量分数为50 %，80 %，100 %乙醇中脱水，每一浓度浸泡3min，添加IOyL体积探针溶液 (50ng/ μ L)和90 μ L杂交缓冲液到微量离心管中，冰浴中避光保存，杂交箱里放吸水纸，用 杂交液湿润，添加20 μ L的杂交混合液、10 μ L的blocking regent到膜片上与样品混合，将 膜片放入杂交箱里，恒温箱中进行杂交反应，将盛有清洗液的一个染色缸在48°C震荡水浴 锅中预热，把膜片放入预热后的清洗液中，震荡洗涤膜片20-25min，取出膜片放至浸湿无菌 水的无菌滤纸上洗去膜片下面的洗脱液。(4)结果观察将膜片放到载玻片上在荧光显微镜4X或IOX下观察计数，采用蓝光激发，随机观察 30-40个视野的微菌落，按下式计算样本中的菌落数X为样本菌落总数(cfu/ml) ；A为30-40个视野微菌落总数(cfu) 为滤膜有效过 滤直径(mm) ；Φ2为油镜视野直径(mm)，V为滤过的样液量(ml)，计数后采用红光激发，观 察荧光原位杂交实验结果。并对菌进行定性分析。
2.根据权利要求1所述的一种快速检测啤酒有害菌的方法，其特征在于所述步骤 ⑴中快速增菌培养基所含组分为蛋白胨5 8g，酵母膏4 6g，牛肉膏6 10g，吐温 800. 5 lg，磷酸氢二钾1 2g，醋酸钠3 6g，叶酸0. 1 0. 2g，放线菌酮6 10mg，琼 脂10 15g，葡萄糖10 15g，麦芽根浸粉0. 1 0. 5g，泛酸钙0. 2 0. 5g。
3.根据权利要求1所述的一种快速检测啤酒有害菌的方法，其特征在于所述步骤(1) 中快速增菌培养基所含组分为蛋白胨8g，酵母膏6g，牛肉膏6g，吐温800. 8g，磷酸氢二 钾2g，醋酸钠6g，叶酸0. 2g，放线菌酮6mg，琼脂15g，葡萄糖15g，麦芽根浸粉0. 5g，泛酸钙 0. 4go
4.根据权利要求1所述的一种快速检测啤酒有害菌的方法，其特征在于所述步骤(2) 荧光微菌落染色是将聚碳酸酯膜放于浸湿CFDA染色液的无菌滤纸片上，避光染色5-15分 钟，染色过后的滤纸片的清洗也是在浸湿无菌水的滤纸片上进行，以避免菌的损失。
5.根据权利要求1所述的一种快速检测啤酒有害菌的方法，其特征在于所述步骤(3) 荧光杂交是在滤膜片上进行，将膜片进行蛋白酶K处理温度是58°C，时间10分钟。取出膜片，浸入含有溶菌酶的磷酸缓冲液中处理时间是10分钟。
6.根据权利要求1所述的一种快速检测啤酒有害菌的方法，其特征在于所述步骤(3) 荧光杂交探针序列分别为短乳杆菌检测探针5’ -TAGCCGGTGTAACCCTGACTCTG-3’，一端用 Cy3标记；四联球菌检测探针5，-GAGATTAGGAAGAACACCAGTGGCGAA-3’，其一端用Cy3标记。
7.根据权利要求1所述的一种快速检测啤酒有害菌的方法，其特征在于所述步骤(3) 荧光杂交中杂交反应温度49 V，反应90分钟。
8.根据权利要求1所述的一种快速检测啤酒有害菌的方法，其特征在于所述步骤(4) 结果观察时先采用蓝光激发，后采用红光激发。
全文摘要
本发明公开了一种应用荧光原位杂交和荧光微菌落结合的技术为啤酒厂快速定性及定量检测有害菌的方法。包括样液及培养基的制备、荧光微菌落及荧光原位杂交试验操作。而后用荧光显微镜观察并计数，根据荧光探针与CFDA染料所被激发的不同颜色的荧光来定性及定量分析啤酒厂生产过程中所带来的有害菌。本发明还公布了两个特异探针，分别是用于短乳杆菌检测的探针5’-TAGCCGGTGTAACCCTGACTCTG-3’，一端用Cy3标记；四联球菌检测探针5’-GAGATTAGGAAGAACACCAGTGGCGAA-3’，其一端用Cy3标记。本发明通过把两种方法相结合，避免了荧光原位杂交不容易定量，实验结果易出现假阳性及假阴性的现象；同时也很好的解决了荧光微菌落技术不能定性的问题。达到了啤酒厂生产所需要的快速检测，并且定性及定量的要求。
文档编号C12Q1/04GK102071243SQ201010565260
公开日2011年5月25日 申请日期2010年11月30日 优先权日2010年11月30日
发明者严伟杰, 孟思, 宋绪磊, 沈建国, 王德良, 穆英健, 郭立芸 申请人:中国食品发酵工业研究院, 北京燕京啤酒股份有限公司