专利名称：从丙酮和乙酰辅酶a酶促产生3-羟基-3-甲基丁酸的方法
从丙酮和乙酰辅酶A酶促产生3-羟基-3-甲基丁酸的方法本发明涉及从丙酮和提供活化乙酰基的化合物产生3-羟基-3-甲基丁酸(又称作β-羟基异戊酸或HIV)的方法，所述方法包括将丙酮和提供活化乙酰基的化合物酶促转化为3-羟基-3-甲基丁酸。所述转化使用一种酶，其能够催化丙酮的氧(代)(OXO)(即C =0)基的碳原子和提供活化乙酰基的化合物的甲基之间形成共价键。优选地，在所述方法中使用的酶是具有HMG辅酶A合酶(EC 2.3.3. 10)活性的酶和/或PksG蛋白，和/或具有 C-C键切割/缩合裂合酶，例如HMG辅酶A裂合酶(EC 4. I. 3. 4)活性的酶。本发明也涉及能够从丙酮和提供活化乙酰基的化合物产生3-羟基-3-甲基丁酸的生物，并涉及上述酶和生物用于产生3-羟基-3-甲基丁酸的用途。最后，本发明涉及丙酮在产生3-羟基-3-甲基丁酸中的用途。3-羟基-3-甲基丁酸(又称作羟基异戊酸或HIV，见图I)是必需氨基酸亮氨酸的代谢物并在人体内合成。在葡萄柚、苜蓿和鲶鱼(catfish)中可发现小量的
3-羟基-3-甲基丁酸。也知道其存在于一些亮氨酸分解代谢的代谢疾病，即低血容量酸血症(hypovaleric acidemia)中。据显示,3_轻基_3_甲基丁酸可能对提高肌肉重量和强度有作用。(Nissen 等人，J. Appl. Physiol. 81 (1996)，2095-2104)。Wilson 等人 (Nutrition&Metabolism 5(2008))提出了以下作用机制—通过HMG辅酶A还原酶的转化提高肌纤维膜的完整性——通过mTOR途径提高蛋白质合成——通过抑制泛素途径抑制蛋白质降解。推测3-羟基-3-甲基丁酸帮助肌肉对抗蛋白质降解，辅助肌肉修复和提供增加的持久力。已有描述在医院的加护病房中用3-羟基-3-甲基丁酸帮助患有慢性阻塞性肺病的患者，与HIV有关的肌萎缩、癌症、具有严重伤害的创伤受害者。因此，3-羟基-3-甲基丁酸具有商业利益，因为其作为肌肉强化剂用于健美和作为药物用于避免肌萎缩的用途。美国专利7026507描述了制备3-羟基-3-甲基丁酸钠的固体制剂的方法，其中在第一个处理步骤中，4,4-dimethyloxetan-2_one与氢氧化钠水溶液反应，形成3-羟基-3-甲基丁酸钠溶液，然后，如果适当则在浓缩后在进一步处理步骤中对合成的二氧化硅应用溶液，如果适当则干燥得到的产物。提供这样的生产3-羟基-3-甲基丁酸的方法将是理想的，其不依赖无机生产步骤且可在活的生物中生产，从而对环境有利且廉价。在这个背景下，Lee等人(Appl. Enviixm. Microbiol. 63 (1997), 4191-4195)描述了通过使用微生物 Galactomyces reessii 将 3-甲基丁酸转化为3-羟基-3-甲基丁酸产生3-羟基-3-甲基丁酸的方法。然而，尽管此方法允许产生3-羟基-3-甲基丁酸，仍然需要提供备选的有效和成本实用的产生3-羟基-3-甲基丁酸的方法，特别是通过生物学过程。本发明满足了产生3-羟基-3-甲基丁酸的备选方法的此需求，并提供了基于生物资源和允许在体外或在微生物和其他物种体内产生3-羟基-3-甲基丁酸的方法。特别地，本发明涉及从丙酮和提供活化乙酰基的化合物产生3-羟基-3-甲基丁酸 (又称作β_羟基异戊酸或HIV)的方法，所述方法包括将丙酮和提供活化乙酰基的化合物酶促转化为3-羟基-3-甲基丁酸。
丙酮由以下通式代表CH3-(C = O)-CH30在优选的实施方案中，提供活化乙酰基的化合物由以下通式(I)表征
权利要求
1.一种产生3-羟基-3-甲基丁酸的方法，其包括丙酮和由以下通式(I)表征的提供活化乙酰基的化合物的酶促转化
2.权利要求I的方法，其中X是辅酶A。
3.权利要求I的方法，其中X是酰基载体蛋白。
4.权利要求I或2的方法，其中所述酶是具有HMG辅酶A合酶(EC2.3. 3. 10)活性的酶，或其中所述酶是具有C-C键切割/缩合裂合酶，例如HMG辅酶A裂合酶(EC 4. 1.3.4) 活性的酶，或其中所述酶是PksG蛋白。
5.权利要求I至4中任一项的方法，其特征在于在能够产生丙酮和表达如权利要求I 定义的酶的生物的存在下实现所述转化。
6.一种重组生物，其由以下特征表征(a)其能够产生丙酮；和(b)其表达能够催化丙酮的氧(代)(即C= O)基的碳原子和根据通式(I)的提供活化乙酰基的化合物的甲基的相应碳原子(C2)之间形成共价键的酶。
7.权利要求6的生物，其中所述酶是具有HMG辅酶A合酶(EC2. 3. 3. 10)活性，和/或具有C-C键切割/缩合裂合酶，例如HMG辅酶A裂合酶(EC4. I. 3. 4)活性的酶，和/或PksG蛋白。
8.权利要求6或7的生物，其中所述生物是天然具有产生丙酮的能力的生物，优选地， 属于梭菌属、芽孢杆菌属或假单胞菌属，更优选地属于丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、解纤维梭菌、多粘芽孢杆菌或恶臭假单胞菌种的微生物。
9.权利要求6或7的生物，其中所述生物来源于天然不产生丙酮、并通过引入允许在所述生物中产生丙酮所必需的基因而被基因改造从而能够产生丙酮的生物。
10.权利要求9的方法，其中所述生物是能够进行光合作用的生物。
11.如权利要求7至10中任一项中定义的生物在产生3-羟基-3-甲基丁酸中的用途。
12.包含权利要求7至10中任一项的生物的组合物。
13.一种组合物，其包含⑴丙酮；和(ii)由以下通式(I)表征的提供活化乙酰基的化合物
14.如权利要求I中定义的酶在产生3-羟基-3-甲基丁酸中的用途。
15.丙酮在产生3-羟基-3-甲基丁酸中的用途，其中包含丙酮和由以下通式(I)表征的提供活化乙酰基的化合物的酶促转化
全文摘要
本发明描述了从丙酮和提供活化乙酰基的化合物产生3-羟基-3-甲基丁酸(又称作β-羟基异戊酸或HIV)的方法，所述方法包括将丙酮和提供活化乙酰基的化合物酶促转化为3-羟基-3-甲基丁酸。所述转化使用一种酶，其能够催化丙酮的氧(代)(即C＝O)基的碳原子和提供活化乙酰基的化合物的甲基之间形成共价键。优选地，在所述方法中使用的酶是具有HMG辅酶A合酶(EC 2.3.3.10)活性的酶和/或PksG蛋白，和/或具有C-C键切割/缩合裂合酶，例如HMG辅酶A裂合酶(EC 4.1.3.4)活性的酶。也描述了能够从丙酮和提供活化乙酰基的化合物产生3-羟基-3-甲基丁酸的生物，上述酶和生物在产生3-羟基-3-甲基丁酸中的用途，以及丙酮在产生3-羟基-3-甲基丁酸中的用途。
文档编号C12N15/52GK102597254SQ201080041020
公开日2012年7月18日 申请日期2010年9月14日 优先权日2009年9月15日
发明者菲利普·马利埃 申请人:菲利普·马利埃