专利名称：α-酮庚二酸的制备的制作方法
α-酮庚二酸的制备本发明涉及制备α -酮庚二酸(下文也称为“ΑΚΡ” ；AKP也被称为2_氧代-庚二酸)的方法。本发明还涉及制备6-氨基己酸(下文也称为“6-ACA”)的方法。本发明也涉及制备己二酸的方法，涉及制备5-甲酰基戊酸(下文也称为“5-FVA”)的方法，涉及制备 α-氨基-庚二酸(AAP)的方法，并涉及制备己二胺(也称为1，6_己二胺)的方法。本发明还涉及可被用于根据本发明的方法中的异源细胞。本发明还涉及异源细胞在ε_己内酰胺(下文称为“己内酰胺”))、己二酸或己二胺的制备中的用途。己二酸(adipic acid)(己二酸(hexanedioic acid))例如被用于生产聚酰胺。另外，己二酸的酯可被用在增塑剂、润滑剂、溶剂和多种聚氨酯树脂中。己二酸的其他用途是作为食品酸化剂，应用于粘合剂、杀虫剂、鞣制和染色。已知的制备方法包括用硝酸氧化环己醇或环己酮或其混合物(KA油)。己二胺例如被用于生产聚酰胺，例如尼龙6，6。其他用途包括用作用于其他构筑块 (例如六亚甲基二异氰酸酯)的起始材料和作为环氧化物的交联剂。已知的制备方法从丙烯腈开始通过己二腈来进行。己内酰胺是一种内酰胺，其可以被用于生产聚酰胺，例如尼龙-6或尼龙-6，12 (己内酰胺和十二内酰胺的共聚物)。由多种大宗化学品制备己内酰胺的各种方式是本领域已知的，并且包括由环己酮、甲苯、苯酚、环己醇、苯或环己烷制备己内酰胺。这些中间产物化合物通常得自矿物油。考虑到日益增长的、使用更加可持续的技术来制备材料的需要，期望提供一种方法，其中由能够从生物可再生资源获得的中间产物化合物或至少由使用生物化学方法被转化成己内酰胺的中间产物来制备己内酰胺、己二酸或己二胺。另外，期望提供一种方法，所述方法较之利用来自石油化学来源的大宗化学品的传统化学工艺需要更少的能源。由6-ACA制备己内酰胺是已知的，例如如US-A 6，194，572中所述的。如WO 2005/068643中所公开的，可以在存在具有α，β -烯酸酯还原酶活性的酶时，通过转化 6-氨基己-2-烯酸(6-ΑΗΕΑ)来生物化学地制备6-ACA。可以例如生物化学地或通过纯化学合成，由赖氨酸制备6-ΑΗΕΑ。尽管可以通过WO 2005/068643中公开的方法，通过6-ΑΗΕΑ 的还原制备6-ACA，但是本发明人发现在还原反应条件下，6-ΑΗΕΑ可自发并且基本不可逆地环化形成不想要的副产物，特别是β-高脯氨酸。所述环化可能是6-ACA生产中的瓶颈， 并可导致产率的可观损失。本发明人认识到由AKP制备6-ACA是可能的。可例如基于H. Jager et al. Chem. Ber. 1959，92，对92-2499所述的方法化学制备4亚。可以如下制备4亚使用乙醇钠作为碱， 用草酸二乙酯烷基化环戊酮，将得到的产物在强酸OM HCl)中回流并例如通过从甲苯中结晶来回收产物。但是，如上指明的，存在日益增长的、使用更持续的技术制备材料的需要。因此，本发明人认识到，期望提供这样一种方法，其中AKP由可从生物可再生资源获得的中间产物化合物制备。本发明的目的是提供制备AKP的新颖方法，所述方法可被尤其用于制备6-ACA、己二酸、己二胺或其他化合物。
本发明的又一目的是提供新颖生物催化剂，其适于在制备AKP的方法中催化一步或多步反应步骤。从下面的说明将理解根据本发明可解决的一个或多个其他目的。本发明人已认识到使用特定的生物催化剂制备AKP是可能的。因而，本发明涉及制备α-酮庚二酸(AKP)的方法，所述方法包括将2_羟基庚二酸转化为α-酮庚二酸(AKP)，所述转化使用生物催化剂尤其是异源生物催化剂催化。在本发明的方法中制备的AKP还可被用在另一化合物的制备中，或可例如被用作诸如用于生物化学研究的化学品，或者作为PH-缓冲化合物，例如用于制备性或分析性分离技术如液相色谱或毛细管电泳中。特别地，如果需要，AKP可被用于制备5-FVA、AAP O-氨基庚二酸，也被称为α-氨基庚二酸)、6-ACA或己二酸。用于生物催化制备FVA、AAP或 6-ACA的合适的生物催化剂例如可在WO 2009/113855中找到。因而，本发明还涉及制备5-FVA的方法，所述方法包括使在根据本发明的方法中制备的AKP生物催化脱羧，因此形成5-FVA。5-FVA是例如用于制备6-ACA、己内酰胺、己二胺或己二酸的合适的中间产物化合物。AKP可例如在AAP的制备中用作中间产物。因而，本发明还涉及制备AAP的方法，其包括使在根据本发明的方法中制备的AKP 生物催化转氨，因此形成ΑΑΡ。AAP是例如用于制备6-ACA、己二胺或己内酰胺的合适的中间产物化合物。6-ACA可例如被转化为己内酰胺或转化为己二胺。本发明还涉及异源细胞，其包含编码下述酶的核酸序列，所述酶在2-羟基庚二酸向α-酮庚二酸的转化中具有活性。该核酸序列和所编码的酶对细胞而言通常是异源的。根据本发明的细胞可在制备选自AKP、5-FVA、6_ACA、AAP、己二酸、己二胺和己内酰胺的组的至少一种化合物的方法中具体被用作生物催化剂。根据本发明，当形成6-ACA并任选地形成己内酰胺时，未发现关于中间产物的不想要的环化的问题，该问题导致产率的损失。预期本发明的方法允许得到与WO 2005/68643中所述方法相当或甚至更好的产率。预期在利用活生物时，尤其是在要考虑生物的生长和维持的方法中，本发明的方法尤其是有利的。还预期在本发明的一个实施方式中，可提高本发明方法中6-ACA的生产力(形成的 g/1. h)。除非另有说明，在本文中使用的术语“或者”被定义为“和/或”。除非另有说明，在本文中使用的术语“一个” (“a”或“an”)被定义为“至少一个”。涉及单数名词(例如化合物、添加剂等)时，复数旨在被包括在内。因此，除非另有说明，当涉及特定成分时，例如“化合物”，这表示所述成分的“至少一种”，例如“至少一种化合物”。在本文中提到羧酸或羧酸酯例如6-ACA、另一氨基酸、5-FVA、己二酸/己二酸酯、 琥珀酸/琥珀酸酯、乙酸/乙酸酯时，除非另有说明，这些术语旨在包括质子化的羧酸(游离酸)、它们相应的羧酸酯(其共轭碱)及其盐。在本文中提到氨基酸例如6-ACA时，所述术语旨在包括两性离子形式(其中氨基被质子化且羧酸根是去质子化的形式)的氨基酸， 其中氨基被质子化且羧基为中性形式的氨基酸，和其中氨基为中性形式且羧酸根是去质子化形式的氨基酸，以及它们的盐。涉及存在若干立体异构体的化合物(例如，顺式和反式异构体，R和S对映体)时， 原则上化合物包括可在本发明的具体的方法中使用的所述化合物的所有对映体、非对映异构体和顺式/反式异构体。参考括号中的酶种类(EC)提到酶时，所述酶种类是以Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biο1οgy(NC-1UBMB)提供的Enzyme Nomenc 1 ature为基础，将酶归类或可归类在其中的种类，所述命名法可见 http://www. chem. qmul. ac. uk/iubmb/enzyme/。(尚)未归类但是可以同样被归类在特定种类中的其他合适的酶旨在包括在内。若在本文中提到参照登记号的蛋白或基因，除非另有说明，该号码具体被用来指具有如在2009年9月11日的Uniprot中找到的序列的蛋白或基因。术语“同源物”在本文中尤其用于具有至少30%、优选地至少40%、更优选地至少 60%、更优选地至少65%、更优选地至少70%、更优选地至少75%、更优选地至少80%、尤其是至少85 %、更尤其是至少90 %、至少91%、至少92 %、至少93 %、至少94 %、至少95 %、 至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列同一性的多核苷酸或多肽。此外，同源物通常具有超过30%的显著序列相似性，尤其具有至少35%、优选地至少40 %、更优选地至少60 %、更优选地至少65 %、更优选地至少70 %、更优选地至少 75%、更优选地至少80%、尤其至少85%、更尤其至少90%、至少91%、至少92%、至少 93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列相似性。同源物通常与是其同源物的多肽或多核苷酸具有相同的预期功能，诸如编码分别能催化相同反应(典型地，相同底物向相同化合物转化)或类似反应的相同多肽。典型地，“相似反应”是相同类型的反应，例如脱羧或转氨。因而，作为经验法则，同源酶可以被归类到共有EC种类(x.y.z)的最前三个数字的EC种类中，例如对于脱羧酶的EC 4.1.1。 典型地，在类似反应中，与用于与类似反应类似的反应的底物相同种类的底物(例如胺、 羧酸、氨基酸)被转化为与类似反应类似的反应的产物的相同种类的产物。类似反应尤其包括由相同化学转化定义的反应，如通过相同的KEGG RDM模式定义的反应，其中R原子和 D 原子描述化学转化(KEGG RDM 模式0h，Μ. et al. (2007) Systematic analysis of enzyme-catalyzed reaction patterns and prediction of microbial biodegradation pathways. J. Chem. Inf. Model.，47，1702—1712)。术语同源物也旨在包括由于遗传密码子的简并性或实验适应而与另一核酸序列不同并且编码相同多肽序列的核酸序列(多核苷酸序列)。术语“功能性类似物”在本文中用于下述核酸序列，所述核酸序列不同于所述类似物是其类似物的给定序列，但仍编码具有相同氨基酸序列的多肽(蛋白、酶)或编码此类多肽的同源物。特别地，优选的功能性类似物是这样的核苷酸序列，所述核苷酸序列在感兴趣的宿主细胞中较之该核苷酸序列被称其功能性类似物的相对应的核苷酸序列具有相似、相同或甚至更好的表达水平。在该方面中，注意到，如技术人员所理解的，如果肽(蛋白、酶) 的表达是期望的，更好的表达水平通常是更高的表达水平。但是，在具体实施方式
中，更好的表达水平可以是较低的表达水平，因为这在所述宿主细胞中的代谢途径的情况下可能是期望的。功能性类似物可以是天然存在的序列(即野生型功能性类似物)或经遗传修饰的序列(即非野生型功能性类似物)。编码特定肽的密码子优化的序列通常是野生型序列的非野生型功能性类似物，所述非野生型功能性类似物被设计以实现期望的表达水平。序列同一性或相似性在本文中被定义为两条或更多多肽序列或两条或更多核酸序列之间的相互关系，通过比较所述序列来测定。通常，序列同一性或相似性在序列全长上比较，但是也可以仅在彼此对齐的序列的一部分上比较。在本领域中，“同一性”或“相似性” 也表示多肽序列或核酸序列之间的序列相关性程度，根据情况由这类序列之间的匹配来确定。测定同一性或相似性的优选方法被设计为在测试的序列之间给出最大匹配。在本发明的上下文中，测定两条序列之间同一性和相似性的一种优选的计算机程序方法包括BLASTP 和 BLASTN (Altschul，S. F. et al. ,J. Mol. Biol. 1990，215，403-410)，公众可以从 NCBI 和其他来源(BLAST Manual, Altschul，S.，et al.，NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894)获得。 使用BLASTP进行多肽序列比较的优选参数为缺口开放10. 0，缺口延伸0. 5，Blosum 62矩阵。使用BLASTN进行核酸序列比较的优选参数为缺口开放10. 0，缺口延伸0. 5，DNA全矩阵(DNA同一性矩阵)本文所用的异源生物催化剂(特别是异源细胞)是包含异源蛋白或异源核酸(通常是作为细胞的DNA或RNA的一部分)的生物催化剂。用于核酸序列(DNA或RNA)或蛋白质时，术语“异源”指这样的核酸或蛋白质，其不作为所存在生物、细胞、基因组或DNA或 RNA序列中的天然部分而存在，或者存在于与其自然界中不同的细胞或者位置或者基因组或DNA或RNA序列的位置。应该理解，异源生物中的异源DNA是该异源生物基因组的一部分。异源核酸或蛋白质对于其所引入的细胞而言不是内源的，而是得自其它细胞或者是合成或重组产生的。通常(但不一定)，这些核酸编码不在转录或表达该DNA的细胞中天然产生的蛋白质。类似地，异源RNA编码不在该异源RNA所存在细胞中天然表达的蛋白质。异源核酸和蛋白质还可称为外源核酸或蛋白质。术语异源核酸或蛋白质包括本领域技术人员认为对于表达细胞而言是异源或外源的任何核酸或蛋白质。提到来自特定来源的酶或其它生物催化部分时，来自第一种生物但实际在另一 (遗传修饰的)生物中产生的重组酶或其它重组生物催化部分也明确地包括在内，作为来自该第一种生物的酶或其它生物催化部分。在本发明的方法中，使用了生物催化剂，即所述方法中的至少一个反应步骤被生物材料或得自生物来源(例如生物或从生物得到的生物分子)的部分所催化。生物催化剂可尤其包含一种或多种酶。生物催化反应可包含其中至少一个转化被生物催化剂催化的一个或多个化学转化。因此，“生物催化剂”可在制备AKP的至少一个反应步骤中，由AKP制备5-FVA或AAP的至少一个反应步骤中，由5-FVA制备6-ACA或己二酸的至少一个反应步骤中，由AAP制备6-ACA的至少一个反应步骤中，在制备己二胺的至少一个反应步骤中或由 6-ACA制备己内酰胺的至少一个反应步骤中加速化学反应。生物催化剂可以任何形式使用。在一个实施方案中，一种或多种酶形成活生物的一部分(如活的完整细胞)。酶可在细胞内发挥催化功能。酶还可能被分泌进所述细胞存在的培养基中。在一个实施方案中，使用从天然环境中分离(从生产它们的生物中分离) 的一种或多种酶，例如作为溶液、乳液、分散液、冻干细胞(悬浮液)、裂解物、或固定在支持物上。考虑到提高调节反应条件以使得反应平衡向想要的一侧移动的灵活性，从酶的来源生物中分离的酶的用途尤其是有用的。活细胞可以是生长中的细胞、静止或休眠(dormant)细胞(例如孢子)或稳定期细胞。还可能使用酶形成通透化(即使其对酶的底物或一种或多种酶的底物前体通透)的细胞的部分。(本发明方法中使用的)生物催化剂原则上可以是任何生物，或者得自或来自任何生物。该生物可以是天然生物或异源生物。所述异源生物通常是包含编码异源酶的至少一种核酸序列的宿主细胞，所述异源酶能够催化本发明方法的至少一个反应步骤。异源核酸序列的来源生物可以是真核生物或原核生物。具体地，所述生物可独立地选自动物(包括人)、植物、细菌、古细菌(archaea)、酵母和真菌。宿主细胞可以是原核生物或真核生物。在一个实施方式中，宿主细胞选自由真菌、酵母、裸藻(euglenoid)、古细菌和细菌组成的组。宿主细胞可尤其选自由 Aspergillus、Penicillium、Ustilago、Cephalosporium、Trichophytum、Paecilomyces、 Pichia、Hansenula、Saccharomyces、Candida、Kluyveromyces、Yarrowia、Bacillus、 Corynebacteriumλ Escherichia、Azotobacter、Frankia、Rhizobium、Bradyrhizobium、 Anabaena、Synechocystis、Microcystis、Klebsiella、RhodobacterΛ Pseudomonas、 Thermus、Deinococcus 禾口 Gluconobacter 组成的属的组。特别地，在本发明的方法中使用的宿主菌株以及因此宿主细胞可选自由 Escherichia coli、Azotobacter vinelandii、Klebsiella pneumoniae、Anabaena sp.、 Synechocystis sp.、Microcystis aeruginosa、Deinococcus radiourans> Deinococcus geothermalis、 Thermus thermophilus、 Bacillus sphaericus、 Bacillus subtilis、 Bacillus amyloliquefaciens> Bacillus methanolicus> Corynebacterium glutamicum、 Aspergillus niger> Penicillium chrysogenum> Penicillium notatum、Paecilomyces carneus、Cephalosporium acremonium、UstiIago maydis、Pichia pastoris> Saccharomyces cerevisiae>Kluyveromyces lactis>Candida crucei>Candida maltosa> Yarrowia lipolytica和Hansenula polymorpha宿主细胞组成的组。特别地，在其中AKP 将被转化为另外的产物(例如5-FVA、AAP、己二酸酯、己二胺或6-ACA)的实施方式中，下述被认为有利的宿主细胞是天然能将AKP转化为此类产物或至少能催化必要反应中的之一的生物。例如，Escherichia coli具有氨基转移酶活性，由此，E. coli可催化由AKP形成 AAP (也见下文)或5-FVA (可在细胞中形成，如果细胞还含有合适的脱羧酶，也见下文)向 6-ACA的转化。另外，E. coli可具有AKP脱羧酶活性(适于将AKP转化为5-FVA)和/或醛脱氢酶活性(催化由5-FVA制备己二酸酯)。另外，下述被认为是有利的宿主细胞包含合成庚二酸酯(庚二酸酯合成途径)的酶体系或其部分。庚二酸酯被认为是生物素生物合成中的中间产物并且同样地，本发明人认为能从头合成生物素的生物也被预期含有庚二酸酯的合成途径。已描述(通过脂肪酸的氧化)从脂肪酸生产庚二酸酯。这导致碳链断裂并产生第二羧酸官能度(W.R.Streit， P. Entcheva. Biotin in microbes，the genes involved in its biosynthesis, its biochemical role and perspectives for biotechnological production. Appl Microbiol Biotechnol(2003) 61 :21-31 ；Max J.Cryle, IIme Schlichting. Structuralinsights from aP450 Carrier Protein complex reveal how specificity is achieved in the P450BioIACP complex. PNAS(2008) 105(41) : 15696-15701)。提供庚二酸酯合成的酶体系的其他生物可选自Bacillus sensu Iato组、 Geobacillus、Brevibacillus 等属(见 Zeigler and Perkins, 2008, Practical Handbook of Microbiology，，，Second Edition (E. Goldman and L. Green, eds. ), pp 301-329, CRC Press, Boca Raton，FL 中的表 1)，尤其选自 Bacillus sensu stricto 组所代表的 Bacillus，尤其是Bacillus subtilis>Bacillus lentimorbus>BaciIlus lentus>Bacillus anthracis> Bacillus firmus、Bacillus pantothenticus> Bacillus cereus、Bacillus circulans、Bacillus coagulans、Bacillus megaterium、Bacillus thuringiensis、 Bacillus licheniformis> Bacillus amyloliquefaciens> Bacillus pumilus、Bacillus halodurans (Zeigler and Perkins, 2008, Ibid)，更尤其选自 Bacillus subtilis 168 禾口其衍生菌株。另外，提供庚二酸酯合成的酶体系的生物还可选自例如Corynekicterium、 Lactobacillus、Lactococci> Streptomyces 禾口 Pseudomonas 的属。特别地，包含合成庚二酸酯的酶体系的宿主细胞可选自革兰氏阳性菌(Streit and Entcheva, Appl Microbiol Biotechnol (2003) 61 :21-31)的组。例如，已报道 Bacillus sphaericus 包含合成庚二酸酯的酶体系(Gloeckler et al.，Gene87 :63_70，1990)。另外，Bacillus subtilis 是包含庚二酸酯合成途径的酶的生物的例子(见例如EP-A 635 572)。革兰氏阴性菌也可提供庚二酸。所述微生物通常还包含制备庚二酰-CoA的酶体系，见例如 Escherichia coli(0tsuka et al. , J. Biol. Chem. 263 19577-19585 (1988)； 0' Regan et al.，Nucleic Acids Res. 17 :8004(1989))。甚至在这些细菌的野生型菌株不能生产庚二酸的情况下，通过它们制备庚二酰-CoA的能力，它们可提供庚二酸酯来源， 因为当庚二酰-CoA水解时，形成庚二酸酯。在特定的实施方式中，包含合成庚二酸酯的酶体系的根据本发明的宿主细胞能以高产率生产作为庚二酸酯的前体的一种或多种脂。宿主细胞可能天然生产所述脂，或已通过整合参与所述脂的生产的一个或多个基因而被遗传工程改造，所述基因来自如下生物 其野生型能天然生产所述脂。此类生物的例子包括产油酵母、微藻、真菌和细菌。的 ^ ! 自 Dunalliela bardawiK Chlamydomonas reinhardtii、 Prymnesium parvum、 Parietochloris incise、 Phaeodactylum tricornutum、 Crypthecodinium cohnii 的组。合适的细菌可选自革兰氏阳性菌，尤其是Actinomycetales目的革兰氏阳性菌，例如 Streptomyces coelicolor、Streptomyces lividans、Streptomyces albus、 Streptomyces griseus、 Nocardia asteroides、 Nocardia corallina、 Nocardia globerula、Nocardia restricta、Rhodococcus erythropolis、Rhodococcus fascians、 Rhodococcus opacus、Rhodococcus ruber、Rhodococcus sp..菌株 20，、Mycobacterium avium、Mycobacterium ratisbonense、Mycobacterium smegmatis、Mycobacterium tuberculosis、Dietzia maris 禾口 Gordonia amarae ；革兰氏阴性菌，例如 Acinetobacter calcoaceticus、Acinetobacter lwoffi、Acinetobacter sp H01-N、Acinetobacter sp. 211、Pseudomonas aeruginosa ；禾口蓝藻，例如 Trichodesmium erythraeum 禾口 Nostoc commune。
合适白勺酵母禾口真菌可选自 Cryptococcus curvatus、Lipomyces starkeyi> Rhodosporidium toruloides、Rhodotorula glutinis、Pichia ciferii、Rhodotorula graminis> Entomophtora coronata> Cunninghamella japonica> Mortierella alpina> Mucor circinelloides、Pythium ultimum、Crypthecodinium cohnii、Schizochytrium limacinum禾口 Thraustochytrium aureum的组(对于合适的酵母禾口真菌，还见Ratledge C, Wynn JP. The Biochemistry and molecular biology of lipid accumulation in oleaginous microorganisms, Advances in applied microbiology (2002) 51 :1-51 ；还另夕卜见 Qiang Hu, Milton Sommerfeld, Eric Jarvis, Maria Ghirardi, Matthew Posewitz, Michael Seibert and Al Darzins. Microalgal triacylglyceroIs as feedstocks for biofuel production -perspectives and advances, The Plant Journal(2008)54, 621-639 ； 禾口 H.Μ·Alvarez, A. Steinbuechel.Triacylglycerols in prokaryotic microorganisms, Appl Microbiol Biotechnol (2002) 60 :367_376，其内容通过引用被并入本文)。当提到羧酸的酯或硫酯，例如庚二酸酯或庚二酸硫酯、己二酸酯或硫酯、乙酸酯或硫酯、琥珀酸酯或硫酯时，这些术语旨在包括任何活化基团，尤其是任何生物活化基团，包括辅酶A(也指CoA)、磷酸泛酰巯基乙胺(其可与酰基或肽基载体蛋白(分别为ACP或PCP) 连接)、N-乙酰半胱胺、甲基-巯基-乙酸酯、甲基-巯基-丙酸酯、乙基-巯基-丙酸酯、 甲基-巯基-丁酸酯、巯基丙酸酯和提供相同或类似功能的其他酯或硫酯。在活细胞被用作生物催化剂的情况下，酯或硫酯，尤其是CoA，可通过所使用的生物催化剂生产或源自也能生产用于催化反应的合适的酶的生物。CoA-连接酶和CoA-转移酶已在许多生物中被鉴定出并可提供期望的活化酯或硫酯。在一个实施方式中，宿主细胞包含源自动物，尤其源自其部分(例如肝、胰、 脑、肾、心或其他器官)的异源核酸序列。动物可尤其选自哺乳动物的组，更尤其选自 Leporidae、Muridae、Suidae、Bovidae 禾口 Hominidae 的组。源自 Hominidae 的序列可尤其来自选自Hominidae的组的哺乳动物，更尤其来自Homo sapiens。特别地，如果使用源自 Homo sapiens的序列，将使用分离自人体的序列。在一个实施方式中，宿主细胞包含源自植物的异源核酸序列。合适的植物尤其包括选自以下组的植物:Asplenium ；Cucurbitaceae,尤其是 Curcurbita,例如 Curcurbita moschata(南瓜)，或 Cucumis ；Brassicaceae,尤其是 Arabidopsis,例如 k. thaliana ； Mercurialis,例如 Mercurialis perennis ；Hydnocarpus 禾口 Ceratonia0在一个实施方式中，宿主细胞包含源自细菌的异源核酸序列。合适的细菌可尤其选自 Vibrio、Pseudomonas、Bacillus、Corynebacterium、Brevibacterium、Enterococcus、 Streptococcus、Klebsiella、Lactococcus、Lactobacillus、Clostridium、Escherichia、 Klebsiella、Anabaena、Microcystis、Synechocystis、Rhizobium、Bradyrhizobium、 Thermusλ Mycobacterium、ZymomonasΛ Proteus、Agrobacterium、GeobacilIusΛ Acinetobacterλ AzotobacterΛ Ralstonia、RhodobacterΛ Paracoccus、NovosphingobiumΛ Nitrosomonas、 Legionella、 Neisseria、 Rhodopseudomonas、 Staphylococcus、 Deinococcus、Aerococcus 禾口 Salmonella 的组。在一个实施方式中，宿主细胞包含源自真菌的异源核酸序列。合适的真菌可尤其在 Rhizopus、Phanerochaete、Emericella、Ustilago、Neurospora、Penicillium、 Cephalosporium、Paecilomyces、Trichophytum 禾口 Aspergillus 的组之中选择。在一个实施方式中，宿主细胞包含源自酵母的异源核酸序列。合适的酵母可尤其在 Candida、Hansenula、Kluyveromyces> Schizosaccharomyces、Pichia、Yarrowia 禾口 Saccharomyces的组之中选择。本领域技术人员应当明白，在根据本发明的方法中可以利用具有合适活性的生物催化剂(野生型，其中表达天然生物催化部分)或天然存在的生物催化部分的突变体。可以通过本领域技术人员已知的生物学技术，例如分子进化或合理设计(rational design) 改进天然存在的生物催化部分的特性。可例如通过使用本领域技术人员已知的诱变技术修饰下述生物的编码DNA来制造野生型生物催化部分的突变体，所述生物能够发挥生物催化剂的作用或者能够生产生物催化剂部分(如酶)。它们包括随机诱变、定点诱变、定向进化和基因重组。具体地，可以修饰DNA，使其编码与野生型酶差异至少一个氨基酸的酶，使其编码与野生型相比包含一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入的酶，或者使得突变体组合两个或更多亲本酶的序列，或者影响合适的(宿主)细胞中藉此被修饰的DNA的表达。后者可以通过本领域技术人员已知的方法如密码子优化或密码子对优化来实现，例如基于WO 2008/000632中所述方法。突变体生物催化剂可具有例如关于一个或多个以下方面的经改进的特性底物选择性、活性、稳定性、溶剂耐受性、PH谱、温度谱、底物谱、对抑制的敏感性、辅因子利用和底物亲和力。可以通过应用例如合适的高通量筛选或选择方法，基于本领域技术人员已知的这类选择方法，来鉴定具有改进的特性的突变体。根据本发明的方法，由2-羟基庚二酸制备AKP。2-羟基庚二酸原则上可以任何方式获得。例如2-羟基庚二酸可从2-氧代庚二酸或庚二酸制备。在特定的实施方式中，2-羟基庚二酸通过水解2-羟基庚二酸的酯来制备。所述酯
可例如根据下述反应制备
0ο
1HCN
,οΑ^-^-γ"酶(醇腈 )
OOH
Ig，EtOH
OO
OH在特定的实施方式中，2-羟基庚二酸可以生物催化获得。更具体地，可使用生物催化剂，催化庚二酸向2-羟基庚二酸氧化，由庚二酸制备2-羟基庚二酸。所述生物催化剂一般包含催化庚二酸向2-羟基庚二酸氧化的酶。
在一个实施方式中，催化所述氧化反应的酶是“作用于成对供体(用O2作为氧化剂)并引入氧或还原氧的氧化还原酶(EC 1. 14)”。此类酶尤其可选自可分类在EC 1. 14. 11下的酶(用2_氧代戊二酸酯作为一个供体，并将一个氧原子引入另一供体中或引入每一供体中)的组，更具体可选自可分类在EC 1. 14. 11. 1( Y-丁基甜菜碱双加氧酶)、ECl. 14. 12 (用NADH或NADPH作为一个供体，并将两个氧原子引入另一供体中)、EC 1. 14. 13(用NADH或NADPH作为一个供体，并将一个氧原子引入另一供体中)、EC 1. 14. 14(用还原型黄素或黄素蛋白作为一个供体，并将一个氧原子引入另一供体中)或EC 1. 14. 1(用还原型铁硫蛋白作为一个供体，并将一个氧原子引入另一供体中)下的酶。可分类在EC 1.14. 13下的酶可尤其选自对羟基苯乙腈-2-单加氧酶(EC 1. 14. 13. 42)的组。在又一个实施方式中，催化庚二酸向2-羟基庚二酸氧化的酶是作用于CH或CH2 基团的氧化还原酶(EC1. 17)。在细胞中的或根据本发明使用的EC 1.17的酶可尤其选自 EC 1. 17. 1(用NAD+或NADP+作为受体)、EC 1. 17. 3 (用氧作为受体)、EC 1.17.4(用二硫化物作为受体)、ECl. 17. 5 (用醌或类似的化合物作为受体)、EC 1. 17. 7 (用铁硫蛋白作为受体)和EC 1. 17. 99 (用其他受体)的组。在又一个实施方式中，催化庚二酸向2-羟基庚二酸氧化的酶是具有庚二酸羟化酶活性的羟化酶。在又一个实施方式中，催化庚二酸向2-羟基庚二酸氧化的酶是具有庚二酸-2-单加氧酶活性的羟化酶。取决于特定的酶，技术人员能选择合适的供体/受体体系、合适的辅因子等等。催化庚二酸向2-羟基庚二酸氧化的酶原则上可从具有编码此类酶的核酸序列的任何生物中选择。具体地，酶可源自选自Corynebacterium、Escherichia(例如EC 1. 1. 3. 3-苹果酸氧化酶来自Escherichia coli或来自E. coli的酶活性，其在本文下文的序列表中被提至丨J )Bacillus、Pichia、Pseudomonas> Vibrio、Zymonas> Aspergillus、 Rattus (例如来自大鼠肾的EC 1. 1. 1. 98 (R)-2-羟基-脂肪酸脱氢酶或EC 1. 1. 1.99 (S)-2-羟基-脂肪酸脱氢酶)Jrimates (例如来自人胎盘的EC 1. 1. 1. 172 :2_氧代己二酸还原酶)、Saccharomyces (例如 EC 1. 1. 99. 6 :D~2~ 羟基-酸脱氢酶或来自 Saccharomyces 的酶活性，其在本文下文的序列表中被提到)、Mirococcus (例如来自Micrococcus Iysodeikticus 白勺 EC 1. 1. 3. 3- ^ ^ fi ^ g| ) > Gluconobacter> Caenorhabditis> Drosophila、Leporidae (例如来自兔肾的EC 1. 1. 99. 6 :D_2-羟基-酸脱氢酶)的组的生物。在特定的实施方式中，催化庚二酸向2-羟基庚二酸氧化的酶选自包含如kq ID No :191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、 209、210所示的氨基酸序列或任何这些序列的同源物。庚二酸可以任何方式获得，例如其可购自Sigma-Aldrich，其可由环己酮化学制备(Organic Syntheses, Coll. Vol. 2, p. 531 ；Vol 11，ρ 42 (1931))，或其可从能合成庚二酸酯的生物获得。此类生物可例如选自能通过针对生物素的庚二酰-CoA途径生产生物素的生物，例如E. coli、B. subtilis或B. sphaericus或能合成庚二酸酯的本文中所述的其他生物。未经修饰的蛋白或基因产物可得自Bacillus sensu Iato组、Geobacillus、 Brevibacillus 等白勺 M ( JAL Zeigler and Perkins,2008, Practical Handbook of Microbiology,Second Edition(E. Goldman and L. Green,eds.),pp 301-329, CRC Press, Boca Raton, FL 中的表 1)禾口还得自诸如 Corynebacterium、Lactobacillus、Lactococci> Streptomyces(Streptomyces lydicus、 Streptomyces lavendulae)禾口 Pseudomonas 的属。更优选地，未经修饰的蛋白选自由Bacillus sensu stricto组代表的Bacillus 禾中，尤其是 Bacillus subtilis、Bacillus lentimorbus、Bacillus lentus、Bacillus anthracis> Bacillus firmus、Bacillus pantothenticus> Bacillus cereus、Bacillus circulans、Bacillus coagulans、Bacillus megaterium、Bacillus thuringiensis、 Bacillus licheniformis> Bacillus amyloliquefaciens> Bacillus pumilus、Bacillus halodurans(Zeigler and Perkins，2008，Ibid)。更优选地，未经修饰的蛋白选自 Bacillus subtilis 168和其衍生菌株。在有利的实施方式中，根据本发明的(使用的)生物催化剂包含例如通过发酵碳源从可被转化为庚二酸酯的合适碳源制备庚二酸酯的酶体系。在有利的方法中，利用碳源的全细胞生物转化形成庚二酸酯，来制备庚二酸酯。已知通过氧化裂解由长链脂肪酸形成庚二酸酯。在本发明的方法中，例如通过向生物催化剂(尤其其是宿主细胞的情况下)供应植物油、脂肪酸酯(生物柴油)等，此类脂肪酸可因此被提供作为碳源。例如可选择天然包含此类体系的宿主细胞，例如E. coli或B. sphaericus，或所述宿主细胞可通过遗传修饰获得。例如可提供具有选自bioC和bioH(来自E.coli)的至少一个基因或选自biol、bioW、bioX和bioH的至少一个基因的宿主细胞(也见W. R. Streit, P. Entcheva. Biotin in microbes, the genes involved in its biosynthesis, its biochemical role and perspectives for biotechnological production. Appl Microbiol Biotechnol(2003)61 :21-31)。碳源可尤其含有至少一种选自下组的化合物一元醇、多元醇、羧酸、二氧化碳、月旨肪酸、甘油酯、三或二 -酰基-甘油酯，包括包含任何所述化合物的混合物。合适的一元醇包括甲醇和乙醇。合适的多元醇包括甘油和碳水化合物。合适的脂肪酸或甘油酯可尤其以食用油的形式提供，优选地为植物来源。尤其可以使用碳水化合物，因为通常碳水化合物可从生物可更新来源如农产品 (优选地农业废料)中大量获得。优选地，使用选自下组的碳水化合物葡萄糖、果糖、蔗糖、 乳糖、蔗二糖、淀粉、纤维素和半纤维素。尤其优选的是葡萄糖和包含葡萄糖的寡糖或包含葡萄糖的多糖以及所述寡糖或所述多糖的水解产物。按照根据本发明的方法，2-羟基庚二酸被生物转化为AKP。生物催化剂可尤其包含用于催化羟基庚二酸向AKP转化的酶，所述酶选自下述组-作用于供体的CH-OH基团的氧化还原酶(EC1. 1)，尤其是选自ECl. 1. 1(用NAD+ 或NADP+作为受体)、EC 1. 1.2(用细胞色素作为受体)、EC 1. 1. 3 (用氧作为受体)、EC 1.1.4(用二硫化物作为受体)、EC1. 1. 5 (用醌或类似化合物作为受体)、EC 1.1.7(用铁硫蛋白作为受体)和EC 1.1.99(用其他受体)的组的此类氧化还原酶；-作用于供体的醛或氧代基的氧化还原酶(EC1.2)；-具有2-羟基庚二酸脱氢酶活性的酶，具有2-羟基庚二酸氧化酶活性的酶；
-归类在EC1. 97下的氧化还原酶；和-归类在EC1.98下的氧化还原酶。催化羟基庚二酸向AKP转化的可分类在EC 1. 1. 1下的氧化还原酶可尤其选自EC 1. 1. 1. 1的用NAD+作为受体的醇脱氢酶、EC 1. 1. 1. 2的用NADP+作为受体的醇脱氢酶、EC 1. 1. 1. 的乙醛酸还原酶、EC 1. 1. 1.27的L-乳酸脱氢酶、EC 1. 1. 1. 的D-乳酸脱氢酶、 EC 1. 1. 1. 的甘油酸酯脱氢酶、EC 1. 1. 1.30的3-羟丁酸脱氢酶、EC 1. 1. 1. 31的3-羟异丁酸脱氢酶、EC 1. 1. 1. 37的苹果酸脱氢酶、EC 1. 1. 1. 59的3-羟丙酸脱氢酶、EC 1. 1. 1. 60 的2-羟基-3-氧代丙酸还原酶、EC 1. 1. 1. 71的醇脱氢酶[NAD(P)+]、EC1. 1. 1. 79的乙醛酸还原酶[NADP+]、EC 1. 1. 1. 81的羟基丙酮酸还原酶、ECl. 1. 1. 82的苹果酸脱氢酶[NADP+]、 EC 1. 1. 1.85的3-异丙基苹果酸脱氢酶、EC 1. 1. 1. 93的酒石酸脱氢酶、EC 1. 1. 1. 98的 (R) -2-羟基-脂肪酸脱氢酶、EC 1. 1. 1. 99的(S) -2-羟基-脂肪酸脱氢酶、EC 1. 1. 1. 167 的羟基丙酸脱氢酶、EC 1. 1. 1. 172的2-氧代己二酸还原酶、EC 1. 1. 1. 237的羟基苯丙酮酸还原酶和EC 1. 1. 1. 259的3-羟基庚二酰-CoA脱氢酶。催化羟基庚二酸向AKP转化的可分类在EC 1. 1. 2下的酶可尤其选自D-乳酸脱氢酶(EC 1. 1. 2. 4 和 EC 1. 1. 2. 5)。催化羟基庚二酸向AKP转化的可分类在EC 1.1.3下的酶可尤其选自乳酸氧化酶和其他羟基酸氧化酶；苹果酸氧化酶(EC 1.1.3.3)、(S)-2-羟基-酸氧化酶(EC 1. 1. 3. 15)；仲醇氧化酶(EC 1. 1. 3. 18)；羟基植烷酸氧化酶(EC 1. 1. 3. 27)的组。催化羟基庚二酸向AKP转化的可分类在EC 1. 1.99下的酶可尤其选自2_羟基戊二酸脱氢酶(EC 1. 1.99.2)、D-2-羟基-酸脱氢酶(EC1. 1. 99. 6)、葡糖酸脱氢酶(EC 1. 1. 99. 14)、苹果酸脱氢酶(EC1. 1. 99. 16)和 2-氧代-酸还原酶(EC 1. 1. 99. 30)。在尤其优选的方法中，催化AKP的制备的酶选自下述组-用氧作为受体的氧化还原酶(EC1. 1.3)，例如乳酸氧化酶或另一羟基酸氧化酶；例如来自Hominidae、尤其来自Homo sapiens的羟基酸氧化酶HAOl (EC 1. 1. 3. 15)或来自Aerococci、尤其来自Aerococcus viridans的乳酸氧化醇；-L-乳酸脱氢酶(EC 1. 1. 1.27)；-D-乳酸脱氢酶(EC 1. 1. 1. 28)；-苹果酸脱氢酶[NAD+](EC 1. 1. 1.37)；-羟基丙酮酸还原酶(EC1.1. 1. 81)；-苹果酸脱氢酶[NADP+](EC 1. 1. 1.82)；-3-异丙基苹果酸脱氢酶(EC 1. 1. 1. 85)；-酒石酸脱氢酶(EC1. 1. 1.93)；- (R) -2-羟基-脂肪酸脱氢酶(EC1. 1. 1.98)；- (S) -2-羟基-脂肪酸脱氢酶(EC 1. 1. 1. 99)；-2-氧代己二酸还原酶(EC1. 1. 1. 172)；-2-羟基戊二酸脱氢酶(EC 1. 1. 99. 2)；和-D-2-羟基-酸脱氢酶(EC 1. 1. 99. 6)。最优选地，催化AKP的制备的酶选自2-氧代己二酸还原酶(EC1. 1. 1. 172)的组。尤其优选的，酶包含根据SEQ ID NO :186、SEQ ID NO :189的氨基酸序列或任何这些序列的同源物。编码催化AKP的制备的酶的合适的核酸可具体包含由SEQ ID NO 185, SEQ ID NO :187, SEQ ID NO 188, SEQ ID NO 190表示的核酸序列和其功能性类似物。在特定的实施方式中，根据本发明制备的AKP用于制备6-ACA。本发明人已认识至IJ，通过下述方法，AKP可被转化为6-ACA，所述方法中，首先AKP被脱羧形成5-FVA，之后可使用氨基转移反应由5-FVA制备6-ACA，或者首先AKP经受氨基转移反应形成ΑΑΡ,之后通过脱羧反应，由AAP制备6-ACA。在制备6-ACA的优选的方法中，制备包括在存在能催化α -酮酸或氨基酸(即化合物包含至少一个羧酸基和至少一个氨基)脱羧的生物催化剂时的生物催化反应。具有此种催化活性的酶可因此被分别称为α-酮酸脱羧酶或氨基酸脱羧酶。所述酸优选地是二酸，其中所述生物催化剂对与酮基或氨基相邻的酸基具有选择性。通常，合适的脱羧酶具有能够催化AKP向5-FVA转化的α -酮庚二酸脱羧酶活性， 或能够催化AAP向6-ACA转化的α -氨基庚二酸脱羧酶活性。能使α-酮酸或氨基酸脱羧的酶可尤其选自脱羧酶(EC 4. 1. 1)的组，优选地，选自谷氨酸脱羧酶(EC 4. 1. 1. 15)、二氨基庚二酸脱羧酶(EC4. 1. 1. 20)、天冬氨酸酯1_脱羧酶(EC 4. 1. 1. 11)、支链α -酮酸脱羧酶、α -酮异戊酸脱羧酶、α -酮戊二酸脱羧酶和丙酮酸脱羧酶(EC 4. 1. 1. 1)的组。一种或多种其他合适的脱羧酶可尤其在草酸脱羧酶(EC 4. 1. 1. 2)、草酰乙酸脱羧酶(EC 4. 1.1. 3)、乙酰乙酸脱羧酶(EC 4. 1.1. 4)、缬氨酸脱羧酶/亮氨酸脱羧酶(EC 4. 1. 1. 14)、3_羟基谷氨酸脱羧酶(EC4. 1. 1. 16)、鸟氨酸脱羧酶(EC 4. 1. 1. 17)、赖氨酸脱羧酶(EC4. 1. 1. 18)、精氨酸脱羧酶(EC 4. 1. 1. 19)、2_酮戊二酸脱羧酶(EC4. 1. 1. 71)和二氨基丁酸脱羧酶(EC 4. 1. 1. 86)的组中选择。脱羧酶可尤其是选自如下生物的组的脱羧酶南瓜；黄瓜；酵母；真菌，例如 Saccharomyces cerevisiae、Candida flareri> Hansenula sp.、Kluyveromyces marxianus、Rhizopus javanicus、Zymomonas mobilis,更尤其来自 Zymomonas mobilis 的丙酮酸脱羧酶突变体I472A，和Neurospora crassa ；哺乳动物，尤其来自哺乳动物脑；和细菌。例如可以使用来自hchericia coli(E. coli)的谷氨酸脱羧酶、天冬氨酸脱羧酶、α-酮-异戊酸脱羧酶和支链α-酮酸脱羧酶，或可以使用来自Neurospora crassa、Mycobacterium leprae、Clostridium perfringens、Lactobacillus brevis、 Mycobacterium tuberculosis、Streptococcus 或 Lactococcus 的谷氨酸脱羧酶。谷氨酸脱幾醇可源自其的Lactococcus种的例子尤其包括Lactococcus lactis,例如Lactococcus Iactis 菌株 B1157、Lactococcus lactis IFPL730,更尤其 Lactococcus lactis var. maltigenes (以前禾尔为 Streptococcus lactis var. maltigenes)。可尤其使用来自 Pseudomonas的草酰乙酸脱羧酶。可被使用的脱羧酶和编码此类脱羧酶的基因的具体例子在SEQ IDNo:105-SEQ ID No 122中示出。在本发明的优选的方法中，6-ACA的制备包含在能够在存在氨基供体时催化转氨基反应的酶的存在下的酶促反应，所述酶选自氨基转移酶(E. C. 2. 6. 1)的组。通常，合适的氨基转移酶具有能够催化5-FVA向6-ACA转化的6-氨基己酸6-氨基转移酶活性，或具有能够催化AKP向AAP转化的α -氨基庚二酸2_氨基转移酶活性。氨基转移酶可尤其选自β-氨基异丁酸α-酮戊二酸氨基转移酶、β-丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、4-氨基-丁酸氨基转移酶(EC2. 6. 1. 19)、L-赖氨酸6-氨基转移酶(EC 2. 6. 1. 36)、2_氨基己二酸氨基转移酶(EC 2. 6. 1. 39)、5_氨基戊酸氨基转移酶(EC 2. 6. 1. 48)、2_氨基己酸氨基转移酶(EC 2. 6. 1. 67)和赖氨酸丙酮酸6-氨基转移酶(EC2. 6. 1. 71)的组。在一个实施方式中，氨基转移酶可选自下组丙氨酸氨基转移酶(EC2. 6. 1. 2)、 亮氨酸氨基转移酶(EC 2. 6. 1. 6)、丙氨酸-氧代-酸氨基转移酶(EC 2. 6. 1. 12)、β -丙氨酸-丙酮酸氨基转移酶(EC 2.6.1.18)、(S)-3-氨基-2-甲酰基丙酸氨基转移酶(EC 2. 6. 1. 22)、L, L- 二氨基庚二酸氨基转移酶(EC 2. 6. 1. 83)。氨基转移酶可尤其选自来自以下的氨基转移酶Vibrio，尤其Vibrio fIuvialis ；Pseudomonas,尤其 Pseudomonas aeruginosa ；Bacillus,尤其 Bacillus weihenstephanensis ；Mercurialis,尤其 Mercurialis perennis,更尤其 Mercurialis perennis 的嫩芽；Asplenium, 更尤其 Asplenium unilaterale 或 Asplenium septentrionale ；Ceratonia, ^ X ^ Ceratonia siliqua ； HfiItl ； # X ^ Saccharomyces cerevisiae.当酶是哺乳动物的酶时，其尤其可源自哺乳动物肾，来自哺乳动物肝，来自哺乳动物心或来自哺乳动物脑。例如，合适的酶可选自以下的组来自哺乳动物肾的氨基异丁酸α-酮戊二酸氨基转移酶，尤其是来自猪肾的β-氨基异丁酸 α -酮戊二酸氨基转移酶；来自哺乳动物肝的β -丙氨酸氨基转移酶，尤其是来自兔肝的 β -丙氨酸氨基转移酶；来自哺乳动物心的天冬氨酸氨基转移酶；尤其是来自猪心的天冬氨酸氨基转移酶；来自哺乳动物肝的4-氨基-丁酸氨基转移酶，尤其是来自猪肝的4-氨基-丁酸氨基转移酶；来自哺乳动物脑的4-氨基-丁酸氨基转移酶，尤其是来自人、猪或大鼠脑的4-氨基丁酸氨基转移酶。在一个实施方式中，氨基转移酶选自以下的组来自Neurospora的α-酮己二酸-谷氨酸氨基转移酶，尤其是来自Neurospora crassa的α-酮己二酸谷氨酸氨基转移酶；来自Ε. coli的4-氨基-丁酸氨基转移酶，或来自Thermus的α-氨基己二酸氨基转移酶，尤其是来自Thermus thermophilus的α -氨基己二酸氨基转移酶，和来自 Clostridium、尤其是来自Clostridium aminovalericum的5-氨基戊酸氨基转移酶。合适的2-氨基己二酸氨基转移酶可例如由Pyrobaculum islandicum提供。在特定的实施方式中，使用包含根据SEQ ID NO :2、83、86、90、92、94、96、98、100、 102,104的氨基酸序列或该序列同源物的氨基转移酶。编码此类氨基转移酶的合适的核酸序列包括 SEQ ID NO :1、82、84、85、89、91、93、95、97、99、101 和 103 的序列。另外的序列 IDNO 3表示针对根据SEQ ID NO 2的氨基酸序列的密码子优化的核酸序列。氨基供体尤其可以是氨、铵离子、胺或氨基酸。合适的胺是伯胺和仲胺。氨基酸可具有D-构型或L-构型。氨基供体的例子是丙氨酸、谷氨酸、异丙胺、2-氨基丁烷、2-氨基庚烷、苯甲胺、ι-苯基-ι-氨基乙烷、谷氨酰胺、酪氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、β -氨基异丁酸、β-丙氨酸、4-氨基丁酸和α-氨基己二酸。在又一个优选的实施方式中，制备6-ACA的方法包含在存在能够在存在氨来源时催化还原性氨基化反应的酶时的生物催化反应，所述酶选自作用于供体的CH-NH2基团的氧化还原酶(EC 1.4)的组，尤其是选自氨基酸脱氢酶(E.C. 1.4. 1)的组。通常，合适的氨基酸脱氢酶具有催化5-FVA向6-ACA转化的6-氨基己酸6-脱氢酶活性，或者具有催化AKP 向AAP转化的α-氨基庚二酸2-脱氢酶活性。合适的氨基酸脱氢酶尤其选自二氨基庚二酸脱氢酶(EC 1.4. 1. 16)、赖氨酸6-脱氢酶(EC 1. 4. 1. 18)、谷氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.3; EC 1. 4. 1. 4)和亮氨酸脱氢酶(EC 1. 4. 1. 9)的组。在一个实施方式中，氨基酸脱氢酶可选自被归类为以下的氨基酸脱氢酶以NAD 或NADP作为受体发生作用的谷氨酸脱氢酶(EC 1. 4. 1. 3)、以NADP作为受体发生作用的谷氨酸脱氢酶(EC 1.4. 1.4)、亮氨酸脱氢酶(EC 1.4. 1.9)、二氨基庚二酸脱氢酶(EC 1. 4. 1. 16)和赖氨酸 6-脱氢酶(EC 1. 4. 1. 18)。氨基酸脱氢酶可尤其源自选自下组的生物=Corynebacterium,尤其是 Corynebacterium glutamicum ;Proteus，尤其是 Proteus vulgaris ；Agrobacterium，尤其是Agrobacterium tumefaciens ；Geobacillus,尤其是Geobacillus stearothermophiIus ； Acinetobacter,尤其是 Acinetobacter sp. ADPl ；Ralstonia,尤其是 Ralstonia solanacearum ；Salmonella, ^ ^ Salmonella typhimurium ；Saccharomyces, 胃 ^ Saccharomycescerevisiae ；Brevibacterium, ^ ^ Brevibacterium fIavum ；禾口 Bacillus,尤其是 Bacillus sphaericus>BaciIlus cereus 或 Bacillus subtilis。例如， 合适的氨基酸脱氢酶可选自来自Bacillus，尤其来自Bacillus sphaericus的二氨基庚二酸脱氢酶；来自Brevibacterium sp.的二氨基庚二酸脱氢酶；来自Corynebacterium的二氨基庚二酸脱氢酶，尤其来自Corynebacterium glutamicum的二氨基庚二酸脱氢酶； 来自Proteus的二氨基庚二酸脱氢酶，尤其来自ftOteus vulgaris的二氨基庚二酸脱氢酶；来自Agrobacterium、尤其来自Agrobacterium tumefaciens的赖氨酸6-脱氧酶，来自 Geobacillus>X^Jft 自 Geobacillus stearothermophiIus ^jWMM 6-月兑S1BI ；^ 自 AcinetcAacter的以NADH或NADPH作为辅因子发挥作用的谷氨酸脱氢酶(EC 1.4. 1.3)，尤其是来自Acinetobacter sp. ADPl的谷氨酸脱氢酶；来自Ralstonia的谷氨酸脱氢酶(EC 1. 4. 1. 3)，尤其是来自Ralstonia solanacearum的谷氨酸脱氢酶；来自Salmonella的以 NADPH作为辅因子发挥作用的谷氨酸脱氢酶，尤其是来自Salmonella typhimurium的谷氨酸脱氢酶；来自Saccharomyces的谷氨酸脱氢酶(EC 1. 4. 1. 4)，尤其是来自Saccharomyces cerevisiae的谷氨酸脱氢酶；来自Brevibacterium的谷氨酸脱氢酶(EC 1. 4. 1. 4)，尤其是来自Brevibacterium fIavum的谷氨酸脱氢酶；和来自Bacillus的亮氨酸脱氢酶，尤其是来自 Bacillus cereus 或 Bacillus subtilis 的亮氨酸脱氢酶。在特定的实施方式中，AKP在存在脱羧酶或催化这类转化的其他生物催化剂时， AKP被生物催化性转化成5-甲酰基戊酸酯(5-FVA)。根据本发明使用的脱羧酶可尤其选自以下组来自 E. coli、Lactococcus lactis、Lactococcus lactis var. maltigenes 或 Lactococcus lactis subsp. cremoris 的 α -酮酸脱羧酶；来自 E. coli、Lactococcus lactis菌株B1157或Lactococcus lactis IFPL730的支链α -酮酸脱羧酶；来自 Saccharomyces cerevisiae、Candida flareri、Zymomonas mobilis、Hansenula sp.、 Rhizopus javanicusλNeurospora crassa 或 Kluyveromyces marxianus 的丙酮酸脱羧酶； 来自 Mycobacterium tuberculosis 的 α -酮戊二酸脱羧酶；来自 E. coli、Lactobacillus brevis、Mycobacterium leprae、Neurospora crassa 或 Clostridium perfringens 的谷氛酸脱羧酶；和来自E. coli的天冬氨酸脱羧酶。之后5-FVA被转化成6-ACA。这可以化学完成可以在氢化催化剂(例如SiO2/ Al2O3支持物上的Ni)上通过用氨还原性氨化5-FVA，以高产率制备6-ACA JBEP-A 628 535 或DE 4 322 065中针对9-氨基壬酸(9-氨基正壬酸)和12-氨基正十二烷酸(12-氨基月桂酸)所述。或者，可以通过在PtO2上氢化6-肟基己酸(6-oximocaproic acid)获得6-ACA， 所述6-肟基己酸通过5-FVA和羟胺的反应制备(同系的12-氨基正十二烷酸的合成见例如 F. 0. Ayorinde,E. Y. Nana,P. D. Nicely, Α. S. Woods,Ε. 0. Price, C. P. Nwaonicha J. Am. Oil Chem. Soc. 1997，74，531-538)。在一个实施方式中，5-FVA向6-ACA的转化可在存在以下时生物催化地进行(i) 氨基供体和(ii)氨基转移酶、氨基酸脱氢酶或能够催化这类转化的另一生物催化剂。具体地，在这样的实施方式中，氨基转移酶可选自以下组来自Vibrio fluvialis,Pseudomonas aeruginosa或Bacillus weihenst印hanensis的氨基转移酶；来自猪肾的β _氨基异丁酸 α -酮戊二酸氨基转移酶；来自兔肝的β -丙氨酸氨基转移酶；来自Mercurial is perennis 嫩芽的氨基转移酶；来自猪肝或来自人、大鼠或猪脑的4-氨基丁酸氨基转移酶；来自兔肝的β -丙氨酸氨基转移酶；和L-赖氨酸α -酮谷氨酸-ε -氨基转移酶。在使用氨基酸脱氢酶时，这类氨基酸脱氢酶可尤其选自来自Agrobacterium tumefaciens或Geobacillus stearothermophilus的赖氨酸6-脱氢酶的组。另一合适的氨基酸脱氢酶可选自来自 Bacillus sphaericus> Brevibacterium sp.、Corynebacterium glutamicum 或 Proteus vulgaris的二氨基庚二酸脱氢酶的组；选自来自Acinetobacter sp. ADPl或Ralstonia solanacearum的以NADH或NADPH作为辅因子起作用的谷氨酸脱氢酶(EC 1. 4. 1. 3)的组； 选自来自Salmonella typhimurium的以NADPH作为辅因子起作用的谷氨酸脱氢酶(EC 1. 4. 1. 4) ^ Ε ；Saccharomyces cerevisiae 5 Brevibacterium flavum StJ^1M 酸脱氢酶(EC1.4.1.4)的组；或选自来自Bacillus cereus或Bacillus subtilis的亮氨酸脱氢酶的组。在一个特定的实施方式中，AKP被化学转化为5-FVA。2_酮羧酸成为相应醛的有效化学脱羧可以使用仲胺(例如吗啉)，在恒沸水去除同时损失(X)2下，通过中间产物烯胺的形成来进行，例如基于^Tetrahedron Lett. 1982，23 (4)，459-462中所述方法。中间产物末端烯胺随后被水解为相应的醛。之后可以在存在氨基转移酶时通过转氨基反应，或者通过氨基酸脱氢酶或能够催化这类转化的另一生物催化剂的酶促还原性氨基化，将5-FVA生物催化地转化为6-ACA。这类氨基转移酶或氨基酸脱氢酶可尤其选自上文描述的5-FVA转化为6-ACA时提到的生物催化剂。或者，可以通过例如上文提到的化学方法将5-FVA转化成为6-ACA。在一个特定的实施方式中，在存在以下时将AKP生物催化地转化为AAP ⑴氨基转移酶、氨基酸脱氢酶、或能够催化这类转化的另一生物催化剂，和(ii)氨基供体。根据本发明使用的将AKP转化为AAP的这类氨基转移酶可尤其选自以下组来自猪心的天冬氨酸氨基转移酶；来自Neurospora crassa或酵母的α-酮己二酸谷氨酸氨基转移酶；来自 Mercurialis perennis嫩芽的氨基转移酶；来自E. coli的4-氨基丁酸氨基转移酶；来自 Thermus thermophilus 的 α-氨基己二酸氨基转移酶；来自 Asplenium septentrionale或Asplenium unilaterale的氨基转移酶；和来自Ceratonia siliqua的氨基转移酶。合适的氨基酸脱氢酶可尤其选自以下组来自Acinetobacter sp. ADPl或 Ralstonia solanacearum的用NADH或NADPH作为辅因子起作用的谷氨酸脱氢酶(EC 1. 4. 1. 3) ；[=1 Salmonella typhimurium>Saccharomyces cerevisiae 5 Brevibacterium flavum的用NADPH作为辅因子起作用的谷氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.4)；来自Bacillus sphaericus>Brevibacterium sp. >Corynebacterium glutamicum 或 Proteus vulgaris 白勺氨基庚二酸脱氢酶。另一合适的氨基酸脱氢酶可选自来自Agrobacterium tumefaciens或 Geobacillus stearothermophilus 的赖氨酸6_ 脱氧酶的组；或选自来自 Bacillus cereus 或Bacillus subtilis的亮氨酸脱氢酶的组。之后可通过脱羧，将AAP化学转化为6-ACA。这可以例如在存在酮或醛催化剂时通过在高沸点溶剂中加热来进行。例如，如M. Hashimoto, Y. Eda, Y. Osanai, Τ. Iwai and S. Aoki在Chem. Lett. 1986,893-896中所述，在150_160°C下含1_2￥八％环己酮的环己醇中以良好的产率对氨基酸脱羧。类似的方法描述于Daiso，Eur. Pat. App 1. 1586553，2005和 S. D. Brandt, D. Mansel 1, S. Freeman, I. A. Fleet, J. F. Alder, J. Pharm. Biomed. Anal. 2006, 41,872-882 中。或者，可以在存在脱羧酶或催化这类脱羧的其他生物催化剂时，生物催化地进行 AAP向6-ACA的脱羧。脱羧酶可选自能催化α-氨基酸脱羧的脱羧酶。脱羧酶可尤其选自以下组来自Curcurbita moschata、黄瓜、酵母或牛脑的脱羧酶；和二氨基庚二酸脱羧酶 (EC 4. 1. 1. 20)。二氨基庚二酸脱羧酶可例如来自能从二氨基庚二酸酯合成赖氨酸的生物。 此类生物可尤其在细菌、古细菌和植物中找到。二氨基庚二酸脱羧酶可尤其来自革兰氏阴性菌，例如E. coli。在一个特定的实施方式中，AKP被化学转化成ΑΑΡ。AAP可以通过针对类似化合物所述的催化Leuckart-WalIach反应，从2_氧代庚二酸制备。所述反应使用甲醇中的甲酸铵和作为均相催化剂的[RhCp*Cl2]2 进行(M. Kitamura, D.Lee，S. Hayashi, S. Tanaka， M. Yoshimura J. Org. Chem. 2002，67，8685—8687)。或者，可以如 S. 0go，K. Uehara and S. Fukuzumi in J. Am. Chem. Soc. 2004，126，3020-3021 所述，使用[IrmCp* (bpy) H2O] SO4 作为催化剂，用水性甲酸铵进行Leuckart-Wallach反应。还可能通过与(手性)苄胺反应并随后在Pd/C或Pd (OH) 2/C上氢化中间产物亚胺，实现α-酮酸成为(对映异构体富集的) 氨基酸的转化。见例如 R. G. Hiskey, R. C. Northrop J. Am. Chem. Soc. 1961，83，4798。之后在存在脱羧酶或能够进行这类脱羧的另一生物催化剂时，将AAP生物催化地转化成6-ACA。这类脱羧酶可尤其选自上文针对AAP向6-ACA的转化描述生物催化剂时所述的生物催化剂。或者，可以通过例如上文所述的化学方法，进行AAP向6-ACA的转化。在一个特定的实施方式中，在存在脱羧酶或能够催化这类转化的其他生物催化剂时，AKP被生物催化地转化成5-FVA，并且5-FVA之后在存在氨基转移酶、氨基酸脱氢酶或能够催化这类转化的其他生物催化剂时被转化成6-ACA。适用于这些反应的脱羧酶可尤其选自上文描述AKP向5-FVA的生物催化转化时提到的脱羧酶的组。用于转化5-FVA的合适的氨基转移酶或氨基酸脱氢酶可尤其选自上文描述5-FVA向6-ACA的生物催化转化时描述的那些。
在一个特定的实施方式中，在存在氨基转移酶、氨基酸脱氢酶或能够催化这类转化的其他生物催化剂时，AKP被生物催化地转化成ΑΑΡ,并且之后AAP在存在脱羧酶时被转化成6-ACA。适于这些反应的酶可尤其选自以下组上文描述AKP向AAP的生物催化转化和AAP向6-ACA的生物催化转化时分别描述的氨基转移酶、氨基酸脱氢酶和脱羧酶。在本发明的另一实施方式中，通过醛基的氧化，从根据本发明的方法中制造的AKP 制备的5-FVA被转化为己二酸。这可化学实现，例如通过选择性化学氧化，或生物催化实现。在本发明的优选的方法中，上述制备包括在存在能催化醛基氧化的生物催化剂时的生物催化反应。生物催化剂可使用NAD或NADP作为辅因子。在醛基氧化中具有催化活性的酶可尤其选自氧化还原酶(EC 1.2.1)的组，优选地选自醛脱氢酶(EC 1.2. 1.3、EC 1.2. 1.4和EC 1. 2. 1. 5)、丙二酸-半醛脱氢酶(EC 1. 2. 1. 15)、琥珀酸-半醛脱氢酶(EC 1. 2. 1. 16和ECl. 2. 1. 24)；戊二酸-半醛脱氢酶(EC 1. 2. 1. 20)、氨基己二酸半醛脱氢酶(EC 1. 2. 1. 31)、己二酸半醛脱氢酶(EC 1. 2. 1. 63)的组。在KEGG数据库中描述了例如己内酰胺降解途径中的己二酸半醛脱氢酶活性。醛脱氢酶原则上可获得自或衍生自任何生物。生物可以是原核生物或真和生物。 生物可尤其选自细菌、古细菌、酵母、真菌、原生生物、植物和动物(包括人)。在一个实施方式中，细菌选自以下组Acinetobacter (尤其Acinetobacter baumanii 禾口 Acinetobacter sp. NCIMB9871) > Azospirillum(尤其 Azospirillum brasilense)Ralstonia、Bordetella、Burkholderia、Methylobacterium、Xanthobacter> Sinorhizobium、Rhizobium、Nitrobacter> Brucella(尤其 B. melitensis)、Pseudomonas> Agrobacterium(尤其 Agrobacterium tumefaciens)、Bacillus、Listeria、Alcaligenes、 Corynebacterium 禾口 Flavobacterium。在一个实施方式中，生物选自酵母和真菌的组，尤其选自Aspergillus (尤其 A. niger 禾口 k. nidulans)禾口 Penicillium(尤其 P. chrysogenum)白勺组。在一个实施方式中，生物是植物，尤其是Arabidopsis，更尤其A. thaliana.在特定的实施方式中，生物催化剂包含由SEQ ID 78-81或其同源物表示的酶(在醛基的氧化中具有催化活性)。在本发明的另一实施方式中，从根据本发明的方法中制造的AKP制备的6-ACA被转化为己二胺。这可通过如下来实现还原酸基以形成醛基并使由此形成的醛基转氨，因此提供氨基，产生己二胺。这可化学或生物催化实现。在本发明的优选的方法中，上述制备包括在存在能催化酸还原形成醛基的生物催化剂时的生物催化反应和/或存在氨基供体时(例如在本文别处描述的氨基供体)能催化所述转氨的生物催化剂存在时的生物催化反应。能催化酸基还原以形成醛基的生物催化剂可尤其包含选自氧化还原酶(EC 1. 2. 1)的组，优选地选自醛脱氢酶(EC 1. 2. 1. 3、EC 1. 2. 1. 4和ECl. 2. 1. 5)的组，例如在本文别处描述的生物中所找到的那些。能催化所述转氨的生物催化剂可尤其包括选自氨基转移酶(E. C. 2. 6. 1)的组的酶，例如在本文别处描述的生物中所找到的那些。在根据本发明的方法中获得的产物(例如AKP、6_ACA)可如期望地与生物催化剂分离。合适的分离方法可基于本领域公知的方法。可根据针对生物催化剂尤其是酶的已知条件、本文中公开的信息和任选地一些常规试验，选择本发明的方法中的反应条件。原则上，使用的反应培养基的pH可以在宽泛的界限内选择，只要生物催化剂在所述PH条件下有活性即可。可以使用碱性、中性或酸性条件，这取决于生物催化剂和其他因素。当所述方法包括使用微生物(例如用于表达催化本发明方法的酶)时，选择PH使得所述微生物能够发挥其预期的一种或多种功能。在25°C下基本水性体系的情况下，尤其可在低于中性pH四个pH单位和高于中性pH两个pH单位的范围内选择pH，即在pH 3和 PH 9之间选择。如果水是唯一的溶剂或主要的溶剂(以总液体为基础>50wt.%，尤其是 > 90wt. % )，则体系被认为是水性的，其中例如小量(以总液体为基础< 50wt. %，尤其是 < IOwt. % )的醇或另一种溶剂可以以使得可能存在的微生物保持活性的浓度溶解(例如作为碳源)在该体系中。尤其是在使用酵母和/或真菌的情况下，可优选酸性条件，尤其是 25°C下基于基本水性体系的pH可以在pH 3到pH 8的范围内。需要时可以使用酸和/或碱调节或者用合适的酸和碱的组合缓冲PH。原则上，孵育条件可以在在宽泛的界限内选择，只要生物催化剂显示足够的活性和/或生长即可。这包括需氧、微需氧、限氧和厌氧的条件。厌氧条件在本文中被定义为下述条件无任何氧，或其中生物催化剂(尤其是微生物)基本不消耗氧并且通常对应于少于5mmol/l. h的氧消耗，尤其是小于2. 5mmol/l. h 的氧消耗，或小于lmmol/1. h的氧消耗。需氧条件是下述条件，其中对不受限制的生长而言足够水平的氧溶于培养基中， 能够支持至少10mmol/l. h、更优选地多于20mmol/l. h、甚至更优选地多于50mmol/l. h和最优选地多于lOOmmol/1. h的氧消耗速率。限氧条件被定义为下述条件其中氧消耗由从气体转移至液体的氧限制。限氧条件的下限由厌氧条件的上限决定，即通常至少lmmol/1. h，尤其是至少2. 5mmol/l. h，或至少5mmol/l. h。限氧条件的上限由需氧条件的下限决定，即少于lOOmmol/1. h、少于50mmol/ 1. h、少于 20mmol/l. h 或少于 10mmol/l. h。条件是需氧、厌氧还是限氧取决于所述方法进行的条件，尤其是进入气流的量和组成、使用的设备的实际混合/传质特性、使用的微生物的类型和微生物密度。在本发明的优选的方法中，至少AKP的制备在发酵条件下进行。术语发酵条件如本领域中常见的在本文中以宽泛意义使用，即其用来指其中微生物被用来制备感兴趣的产物的工业方法。在发酵条件下的此类方法可在需氧、厌氧或限氧环境中进行。该术语可用来将方法与生物催化方法区分开，所述生物催化方法中使用了一种或多种从其中酶已被表达的生物中分离的酶。原则上，使用的温度不是关键性的，只要生物催化剂(尤其是酶)显示大量活性即可。通常，温度可以是至少0°c，尤其是至少15°C，更尤其是至少20°C。想要的最大温度取决于生物催化剂。通常这类最大温度是本领域已知的，例如在可商业获得的生物催化剂的情况下在产品数据页中指出，或者可以基于公知常识和本文公开的信息常规地测定。温度通常是90°C或更少，优选地是70°C或更少，尤其是50°C或更少，更尤其是40°C或更少。具体地，如果生物催化反应在宿主生物外进行，则可以高浓度(例如大于50%，或大于90wt. % )使用包含有机溶剂的反应培养基，如果使用的酶在这样的培养基中保持足够的活性的话。
可以使用本领域本身已知的分子生物学技术，构建包含用于在本发明方法中用于催化反应步骤的一种或多种酶的异源细胞。例如此类技术可以被用于提供下述载体，所述载体包含一个或多个编码一种或多种所述生物催化剂的基因。包含一个或多个此类基因的载体可包含一个或多个调节元件，例如一个或多个启动子，所述启动子可与编码生物催化剂的基因可操作地连接。在本文中使用时，术语“可操作地连接”是指在功能性关系中的多核苷酸元件(或编码序列或核酸序列)的连接。当核酸序列被置于与另一核酸序列的功能性关系之中时， 所述核酸序列是“可操作地连接”的。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则所述启动子或增强子与所述编码序列可操作地连接。在本文中使用时，术语“启动子”是指一种核酸片段，其功能是控制一个或多个基因的转录，位于基因的转录起点的关于转录的方向的上游，并且在结构上由DNA-依赖性 RNA聚合酶、转录起点和任何其它DNA序列的结合位点的存在识别，包括但不限于转录因子结合位点、阻抑因子和激活因子蛋白结合位点和本领域技术人员已知的直接或间接地作用以调节来自启动子的转录量的任何其它核苷酸序列。“组成型”启动子是在大部分环境和发育条件下有活性的启动子。“诱导型”启动子是在环境或发育调节下有活性的启动子。当用于指出给定的(重组的)核酸或多肽分子与给定的宿主生物或宿主细胞之间的相互关系时，术语“同源的”应当被理解为表示该核酸或多肽分子天然地由相同物种(优选地相同变种或菌株)的宿主细胞或生物生产。可用于实现编码本发明方法中使用的酶，尤其是如上文所述的氨基转移酶、氨基酸脱氢酶或脱羧酶的核酸序列表达的启动子对编码要表达的酶的核酸序列而言可以是天然的，或者可以对与之可操作地连接的核酸序列(编码序列)而言是异源的。优选地，启动子对宿主细胞而言是同源的，即内源的。如果使用(对编码感兴趣的酶的核苷酸序列而言)异源启动子，则所述异源启动子优选地能够生产比编码序列的天然启动子更高稳态水平的包含所述编码序列的转录本 (或者单位时间能够生产更多转录本分子，即mRNA分子)。本发明上下文中合适的启动子包括本领域技术人员公知的组成型和诱导型启动子以及经改造的启动子。“强组成型启动子”是与天然宿主细胞相比引起mRNA以高频率起始的启动子。革兰氏阳性微生物中这类强组成型启动子的例子包括SP01-26、SP01-15、veg、pyc (丙酮酸羧化酶启动子)和amyE。革兰氏阳性微生物中诱导型启动子的例子包括IPTG诱导型I^spac启动子，木糖诱导型I^xylA启动子。革兰氏阴性微生物中组成型和诱导型启动子的例子包括但不仅限于tac、tet、 trp—tet、lpp、lac、lpp—lac、laclq、T7、T5、T3、gal、trc、ara(Pbad)、SP6、入 _PR 和入 _PL。用于(丝状)真菌细胞的启动子是本领域已知的，并且可以是例如葡萄糖-6-磷酸脱氢酶gpdA启动子，蛋白酶启动子如ρ印A、p印B、p印C，葡糖淀粉酶glaA启动子，淀粉酶 amyA、amyB启动子，过氧化氢酶catR或catA启动子，葡萄糖氧化酶goxC启动子，β -半乳糖苷酶IacA启动子，α -葡萄糖苷酶aglA启动子，翻译延伸因子tefA启动子，木聚糖酶启动子如xlnA、xlnB、xlnC、xlnD，纤维素酶启动子如eglA、eglB、cbhA，转录调节子的启动子如areA、creA、xlnR、pacC、prtT或任何其他启动子，并且可以在NCBI网站(http://www.ncbi. nlm. nih. Rov/entrez/)上找至Ll其他启云力子。因此，本发明还涉及可提供一种或多种下述生物催化剂的新颖宿主细胞，所述生物催化剂能够在AKP的制备中和任选地从AKP制备进一步化合物(例如5-FVA、AAP、6-ACA、 己二酸、己二胺或己内酰胺)中催化至少一个反应步骤。本发明还涉及包含编码一种或多种下述酶的一个或多个基因的新颖载体，所述酶能够在AKP的制备中和任选地从AKP制备进一步化合物(例如5-FVA、AAP、6-ACA、己二酸、己二胺或己内酰胺)中催化至少一个反应步骤。一个或多个合适的基因可尤其选自编码如本文上述的酶的基因。异源细胞可尤其是上文描述生物催化剂时提到的细胞。具体地，根据本发明的异源细胞包含编码下述异源酶的一个或多个异源核酸序列 (其可以是一个或多个载体的部分)，所述异源酶能在从2-羟基庚二酸制备AKP中催化反应步骤。在又一个实施方式中，细胞包含编码下述酶的核酸序列，所述酶催化从庚二酸制备2-羟基庚二酸。此外，此类细胞还可包含用于催化从碳源制备庚二酸的酶体系。在又一个实施方式中，根据本发明的异源细胞包含编码下述酶的至少一个核酸序列，所述酶用于催化AKP向AAP、6-ACA、5-FVA、己内酰胺、己二胺或己二酸转化。在细胞被意图用于从AKP制备进一步的产物(例如5-FVA或AAP，其又可以被进一步转化为6-ACA、己内酰胺、己二胺或己二酸)的情况下，存在编码此类酶的核酸序列是尤其期望的。异源细胞优选地不含可将AKP、5-FVA、AAP、6_ACA、己内酰胺、己二胺或己二酸向不期望的副产物降解或转化的任何酶。如果任何此种活性，例如作为己内酰胺或己二酸酯降解途径的部分的此种活性被鉴定出，如本文上文所述的该活性可被去除、减小或改进。通过若干方法，可实现编码不期望的活性的基因的失活。一种途径是使用反义分子或RNAi分子的临时途径(例如基于Kamath et al. 2003. Nature 421:231-237)。另一种是使用可调节的启动子体系，其可使用外在引发剂例如四环素关闭(例如基于Park & Morschhauser, 2005, Eukaryot. Cell. 4 :13沘_1；342)。还一种是应用化学抑制剂或蛋白抑制剂或物理抑制剂(例如基于iTour et al. 2003. Nat Biotech 21 :1505-1508)。非常优选的方法是去除编码不期望活性的完整基因或其部分。为防止其发挥不期望活性，修饰细胞的基因组的另外合适的方法是通过转座子插入使基因失活。为获得此类突变体，可应用现有技术方法比如单交叉重组或双同源重组。为此，需要构建可在宿主细胞的染色体中的预定的靶基因座上整合的整合性克隆载体。在本发明的优选的实施方式中，整合性克隆载体包含下述DNA片段，所述DNA片段对宿主细胞基因组的用于靶向克隆载体整合到预定基因座上的预定靶基因座中的DNA序列而言是同源的。为了启动靶向的整合，克隆载体在宿主细胞转化前优选地被线性化。优选地进行线性化使得克隆载体的至少一个末端、但优选地任一末端位于对靶基因座而言同源的序列的侧翼。靶基因座侧翼的同源序列的长度优选地至少0. Ikb,甚至优选地至少0. 2kb,更优选地至少0. 5kb,甚至更优选地至少11Λ，最优选地至少21Λ。取决于生物、序列和靶DNA的长度，长度最终是实验中最适宜的。可通过过表达编码催化前体分子向庚二酸酯转化的酶的同源和/或异源基因，来增加庚二酸酯优选地在宿主细胞中的胞质区室(cytosolic compartment)中的供应。在另一方面中，本发明涉及在可以是真核细胞或能生产根据本发明的所述化合物的另一细胞的细胞中增加AKP或6-ACA或其中间产物(例如庚二酸酯或羟基庚二酸酯)的生产的方法，所述方法包括使能产生所述化合物的真核细胞的一个种群经受诱变；并针对增加的生产，选择突变体真核细胞的一个种群。小的改进，例如至少的改进已令人感兴趣。优选地，较之真核细胞的开始的种群，进行诱变使得突变体真核细胞的一个种群的至少 10%显示增加的生产。可通过本领域已知的各种方法进行诱变，例如紫外线(UV)诱变、电离辐射或用致变物孵育。合适的致变物是甲磺酸乙酯(EMS)、硫酸二乙酯(DES)、甲磺酸甲酯(MMS)、硫酸二甲酯(DMS)、硝基喹啉氧化物(NQO)、亚硝基胍(NTG)、氮芥(HN2)、β-丙内酯、亚硝酸、亚硝基咪唑啉酮(NIL)和氚标记尿苷。可基于通常的一般知识来确定的合适的诱变时间，这取决于例如致变物和生物。上限可通过致死曲线确定。过大量的暴露可杀死所有细胞。受制于此，技术人员能确定合适上限，合适上限例如可以是3个小时或更少，或1个小时或更少。诱变后，选择增加生产的突变体真核细胞的种群。诱变细胞并选择增加生产的突变体真核细胞被重复一次或多次。在另外优选的实施方式中，根据本发明的异源细胞包含编码下述酶的至少一个核酸序列，所述酶由SEQ ID NO :186, SEQ ID NO 186或其同源物表示，所述核酸序列可尤其从 SEQ ID NO :185, SEQ ID NO 187, SEQ ID NO 188, SEQ ID NO 190 和其功能性类似物的组中选择。再者或或者，优选的异源细胞包含下述酶，所述酶包含如SEQ ID No :191,192, 193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208 或任何这些序列的同源物所示的氨基酸序列。在一个实施方式中，异源细胞包含(重组载体包含)编码具有α-酮庚二酸氨基转移酶活性的酶的核酸序列和/或编码具有α-氨基庚二酸脱羧酶活性的酶的核酸序列。在优选的实施方式中，根据本发明的异源细胞包含编码具有AKP脱羧酶活性的酶的核酸序列和/或编码具有5-FVA氨基转移酶活性的酶的核酸序列。在优选的实施方式中， 根据本发明的异源细胞包含编码具有α -氨基庚二酸2-脱氢酶或AKP氨基转移酶活性的酶的核酸序列和/或具有α-氨基庚二酸脱羧酶活性的酶的核酸序列。在优选的实施方式中，根据本发明的异源细胞包含编码具有6-氨基己酸6-脱氢酶活性的酶的核酸序列和任选地编码具有α-酮庚二酸脱羧酶活性的酶的核酸序列。在优选的实施方式中，根据本发明的异源细胞包含编码具有AKP-脱羧酶活性的酶的核酸序列和/或编码具有己二酸脱氢酶活性的酶的核酸序列。本发明还涉及包含由序列ID No :187、序列ID NO :190或其非野生型功能类似物表示的序列的核酸。本发明现将通过下述实施例阐明。 实施例A部分涉及制备AKP的实施例一般方法分子和遗传技术标准遗传和分子生物学技术是本领域普遍已知的，并且先前已被描述(Maniatis et al. 1982 "Molecular cloning a laboratory manual，，· Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor，N. Y. ；Miller 1972 "Experiments in moleculargenetics，，，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor ；Sambrook and Russell 2001" Molecular cloning :a laboratory manual，，(3rdedition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press ；F.Ausubel et al, eds. , " Current protocols in molecular biology" , Green Publishing and Wiley Interscience, New York 1987)。质粒和菌株pMS470(Balzer, D. ；Ziegelin, G. ；Pansegrau, W. ；Kruft, V. ；Lanka, Ε. Nucleic Acids Research 1992，20 (8)，1851 — 1858.)和 pBBRlMCS(Kovach ME, Phillips Rff, Elzer PH, Roop RM 2nd, Peterson KM.Biotechniques. 1994May ；16 (5) :800-2. pBBRlMCS :a broad-host-range cloning vector)先前已被描述过。Ε. coli 菌株 T0P10 和 DH10B(Invitrogen，Carlsbad, CA, USA)被用于所有的克隆程序。Ε. coli 菌株 BL21 AKlnvitrogen, Carlsbad, CA, USA)和 BL21 (Novagen (EMD/Merck), Nottingham, UK)被用于蛋白表达。pRS414、pRS415 和 pRS416 (Sikorski，R. S. & Hieter，P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae Genetics 122(1),19-27(1989) ；Christianson, Τ. W. , Sikorski, R. S. , Dante, M. , Shero, J. H. & Hieter, P. Multifunctional yeast high-copy-number shuttle vectors. Gene 110 (1)，119-122 (1992))被用于 S. cerevisiae 中的表达。S. cerevisiae 菌株 CEN. PK 113-6B (ura3，trpl，leu2，MATa)、CEN. PK 113-5D(ura3, MATa)、CEN. PK102-3A (ura3, leu2, MATa)和 CEN. PK 113-9D(ura3, trpl, MATa)被用于蛋白表达。培养基Ε. coli的生长使用hTY培养基(16g/l胰蛋白胨、10g/l酵母提取物、5g/l NaCl) 0 补充抗生素(100 μ g/ml氨苄青霉素，50-100 μ g/ml新霉素)来维持在E. coli中的质粒。 为了在E. Coli中诱导基因表达，以0.02% (阿拉伯糖)和0. 2mM (IPTG)终浓度使用阿拉伯糖(针对BL21-AI衍生物)和IPTG (针对pMS470, pBBRlMCS衍生物)。具有4%半乳糖的Verduyn培养基被用于S. cerevisiae的生长。质粒的鉴定通过本领域普遍已知的遗传、生物化学和/或表型手段鉴定带有不同基因的质粒，如转化体对抗生素的抗性，转化体的PCR诊断性分析或质粒DNA的纯化，经纯化的质粒 DNA的限制性分析或DNA序列分析。所述的所有新构建体的整合通过限制性消化确定，并且如果包括PCR步骤，额外地通过测序确定。用于α -酮酸测定的UPLC-MS/MS分析方法Waters HSS T3柱1. 8 μ m，100mm*2. Imm被用于分离α -酮酸，用如在表1中描绘的梯度洗脱液。洗脱液A由含有0. 甲酸的LC/MS级水组成，洗脱液B由含有0. 甲酸的乙腈组成。流速为0. 25ml/min并且柱被自动恒温在40°C的温度下。表1 用于分离α -酮酸S、6-ACA、5-FVA和高柠檬酸的梯度洗脱程序
权利要求
1.制备α-酮庚二酸的方法，其包括将2-羟基庚二酸转化为α-酮庚二酸，所述转化使用生物催化剂催化。
2.根据权利要求1方法，其中所述生物催化剂包含选自如下的组的酶‘作用于供体的CH-OH基团的氧化还原酶(EC 1.1)'、‘作用于供体的醛或氧代基的氧化还原酶(EC 1. 2)‘、具有2-羟基庚二酸脱氢酶活性的酶、具有2-羟基庚二酸氧化酶活性的酶、归类在 EC 1.97下的氧化还原酶和归类在EC 1.98下的氧化还原酶。
3.根据权利要求的方法2，其中所述酶选自如下的组-用氧作为受体的氧化还原酶(EC 1.1. 3)，例如乳酸氧化酶或另一羟基酸氧化酶； -L-乳酸脱氢酶(EC 1. 1. 1. 27)；-羟基丙酮酸还原酶、β -羟基丙酮酸还原酶；NADH 羟基丙酮酸还原酶和D-甘油酸酯脱氢酶(EC1. 1. 1. 81)；-苹果酸脱氢酶[NADP+]、NADP+-苹果酸酶、NADP+-苹果酸脱氢酶(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)；苹果酸NADP脱氢酶；NADP+苹果酸脱氢酶；NADP+-连接的苹果酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶(NADP+) (EC1. 1. 1. 82)；-3-异丙基苹果酸脱氢酶、异丙基苹果酸酶；异丙基苹果酸脱氢酶；苏型-Ds-3-异丙基苹果酸脱氢酶、3-羧基-2-羟基-4-甲基戊酸酯NAD+氧化还原酶(EC 1. 1. 1. 85)；-酒石酸脱氢酶，内消旋酒石酸脱氢酶(EC 1. 1. 1. 93)； -(R)-2-羟基-脂肪酸脱氢酶(EC1. 1. 1.98)； -(S)-2-羟基-脂肪酸脱氢酶(EC 1. 1. 1.99)；-2-氧代己二酸还原酶(EC 1. 1. 1. 172)、2-酮己二酸还原酶、α-酮己二酸还原酶， 2-酮己二酸还原酶；-2-羟基戊二酸脱氢酶(EC 1. 1. 99. 2)；和 -D-2-羟基-酸脱氢酶(EC 1.1. 99. 6)。
4.根据权利要求2或3的方法，其中所述酶源自下述生物，所述生物选自Hominidae和 Aerococcus的组；尤其选自Homininae例如来自Homo sapiens，禾口 Aerococcus viridans 的组。
5.根据上述权利要求的任一项的方法，其中2-羟基庚二酸从庚二酸制备。
6.根据权利要求5的方法，其中所述羟基庚二酸的制备由包含选自如下的组的酶的生物催化剂催化作用于成对供体(用O2作为氧化剂)并引入氧或还原氧的氧化还原酶(EC 1. 14)， 作用于CH或CH2基团的氧化还原酶(EC1. 17)， 具有庚二酸水解酶活性的水解酶(EC 3)和具有庚二酸-2-单加氧酶活性的水解酶(EC 3)。
7.根据前述权利要求的任一项的方法，其中所述生物催化剂包含含有根据SEQID 186、SEQ ID 189或其同源物的序列的酶。
8.根据权利要求5-7的任一项的方法，其中所述庚二酸使用包含庚二酸酯合成途径的一种或多种酶的生物催化剂来制备，所述庚二酸酯合成途径的一种或多种酶可尤其选自参与庚二酰-CoA的生物合成的酶，例如BioI、BioZ、BioH、BioW、BioC的组。
9.根据权利要求8的方法，其中所述酶体系来自下述生物，所述生物选自细菌的组，尤其选自Eschericia和Bacillus的组，更尤其选自Eschericia coli和Bacillus sphaericus 的组。
10.制备6-氨基己酸的方法，其包括将在根据权利要求1-8中任一项的方法中制备的 α -酮庚二酸转化为6-氨基己酸。
11.制备己二酸的方法，其包括使在根据权利要求1-9中任一项的方法中制备的α-酮庚二酸生物催化脱羧，由此形成5-甲酰基戊酸，并优选地通过醛还原，将所述5-甲酰基戊酸转化为己二酸。
12.根据上述权利要求的任一项的方法，其中所述方法在发酵条件下进行。
13.异源细胞，其包含编码下述酶的核酸序列，所述酶在2-羟基庚二酸向α-酮庚二酸的转化中具有催化活性。
14.根据权利要求13的异源细胞，其中所述细胞包含编码下述酶的核酸序列，所述酶在庚二酸向2-羟基庚二酸的转化中具有催化活性。
15.根据权利要求13或14的异源细胞，其包含编码能合成庚二酸酯的生物的庚二酸酯合成途径的酶的至少一个核酸序列。
16.根据权利要求13-15的任一项的异源细胞，其包含编码对于催化从α-酮庚二酸制备6-氨基己酸中的反应步骤具有催化活性的酶的至少一个核酸序列或编码对于催化从 α-酮庚二酸制备己二酸中的反应步骤具有催化活性的酶的至少一个核酸序列。
17.根据权利要求13-16的任一项的异源细胞，其包含编码由SEQIDNO 186、189和其同源物中的任意一种表示的酶的至少一个核酸序列。
18.根据权利要求13-17的任一项的异源细胞，其中所述细胞来自选自Escherichia coli，、Azotobacter vinelandii、Klebsiella pneumoniae、Anabaena sp. 、Synechocystis sp.、Microcystis aeruginosa、Deinococcus radiourans、Deinococcus geothermalis、 Thermus thermophiIus、 Bacillus sphaericus、 Bacillus subtilis、 Bacillus amyloliquefaciensλBaciIlus methanolicus、Corynebacterium glutamicum、Aspergillus niger、Penicillium chrysogenum、Penicillium notatum、Paecilomyces carneus、 Cephalosporium acremonium、Ustilago maydis、Pichia pastoris、Saccharomyces cerevisiae、Kluyveromyces lactis、Candida crucei、Candida maltosa、Yarrowia lipolytica 禾口 Hansenula polymorpha 的组的生物.
19.根据权利要求13-18的任一项的异源细胞在己内酰胺、己二胺或己二酸的制备中的用途。
20.核酸，其包含如由SEQID No 187.SEQ ID NO 190、或其非野生型功能类似物表示的序列。
全文摘要
本发明涉及制备α-酮庚二酸的方法，其包括将2-羟基庚二酸转化为α-酮庚二酸，所述转化使用生物催化剂催化。另外，本发明涉及异源细胞，其包含编码在2-羟基庚二酸向α-酮庚二酸的转化中具有催化活性的酶的核酸序列。另外，本发明涉及根据本发明的异源细胞在己内酰胺、己二胺或己二酸的制备中的用途。
文档编号C12P7/44GK102575270SQ201080040679
公开日2012年7月11日 申请日期2010年9月10日 优先权日2009年9月11日
发明者埃克斯勒·克里斯多佛·特里弗泽, 彼托纳拉·凯瑟琳娜·雷马克斯-弗兰肯, 琳达·维莫特 申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司