专利名称：蜡状芽孢杆菌发酵产磷脂酶c的方法
技术领域：
本发明涉及一种蜡状芽孢杆菌发酵产磷脂酶C的方法。
背景技术：
本发明涉及的磷脂酶C是用于油脂工业生产的植物油脂脱胶工段。植物油中的磷脂主要有磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)和磷脂酰丝氨酸(PQ。磷脂酶C分为PC-PLC (特异性水解PC和PE)和PI-PLC (特异性水解PI)。磷脂酶C广泛存在于动物、植物和微生物中，但从动物、植物中进行提取的工艺复杂，由于伴随物多且性质比较复杂，使得在提取的过程中磷脂酶C的活性损失大。微生物发酵具有生产周期短的优势，且发酵产物易于分离，是获得磷脂酶C的首选。由蜡状芽孢杆菌发酵得到的磷脂酶C中，PC-PLC(特异性水解PC和PE)和PI-PLC(特异性水解PI)都有， 非常适合作为用于植物油脱胶的磷脂酶C的生产菌种。目前在国内市场上没有能够用于植物油脱胶的磷脂酶C供应，而Sigma试剂级磷脂酶C的价格10毫克在2000元人民币左右，在经济上不合算，不能作为植物油脱胶之用。 考虑到磷脂酶C的实际用途是为了能够用于植物油脱胶，所需的磷脂酶C纯度不需要特别高，只要能够达到植物油脱胶的效果即可。国内有研究人员筛选到了能够产磷脂酶C的菌株，但其筛菌过程繁琐且周期长， 对其进行菌种鉴定后，编号不是国内或国际统一的，根据这个编号买不到该菌株，在推广上不具有普遍性。我们从国内微生物菌种保藏中心现有的菌种中进行筛选，所用菌株的编号明确，大大缩短筛菌周期，且易于推广。也有研究人员通过基因工程的方法，利用毕赤酵母进行表达，进而产磷脂酶C，但是由于毕赤酵母存在大量包涵体，使得后续的分离提取过程非常繁琐。本方法后续分离操作简便，非常适合放大生产。目前发酵产磷脂酶C的方法都是以经过多次纯化，提高其酶活为目的，并非针对特定应用目的进行的。本方法所产的磷脂酶C是针对用于植物油脱胶的。利用蜡状芽孢杆菌产磷脂酶C的发酵过程中，都是采用的LB培养基，而本方法则针对性的添加了 ZnSO4 · 7H20或SiCl2,卵磷脂或磷脂混合物(PC、ΡΕ、PI、PS等的混合)，极大的提高了蜡状芽孢杆菌产磷脂酶C的能力。该发明方法采用国内微生物菌种保藏中心的蜡状芽孢杆菌为出发菌株，通过卵黄平板进行筛选，找出能够产磷脂酶C的菌株，然后进行发酵培养，得到能够用于植物油脱胶的磷脂酶C。实施例中所列菌株CMCC63302与GIM1. 300是同一种菌株，只是编号不同， ASl. 196与GIM1. 4是同一种菌株，只是编号不同。
发明内容
本发明克服现有技术中的缺点，提供了一种菌株编号明确，生产能力强的蜡状芽孢杆菌发酵产磷脂酶C的方法。
为了解决上述技术的问题，本发明是通过以下技术方案实现的蜡状芽孢杆菌发酵产磷脂酶C的方法，是将蜡状芽孢杆菌接种到LB培养基中培养后得到种子液；将种子液接种到发酵培养基中培养得到发酵液；对发酵液进行分离即得到磷脂酶C。本发明也可以通过以下技术方案实现以上所述的发酵培养基由牛肉膏、蛋白胨、 NaCl、水、ZnSO4 · 7H20和卵磷脂组成。本发明也可以通过以下技术方案实现以上所述的发酵培养基由牛肉膏、蛋白胨、 NaCl、水、ZnCl2和磷脂混合物组成。本发明也可以通过以下技术方案实现以上所述的蜡状芽孢杆菌为CMCC63302号菌株。本发明也可以通过以下技术方案实现以上所述的蜡状芽孢杆菌为ASl. 196号菌株。本发明还可以通过以下技术方案实现以上所述的蜡状芽孢杆菌为GIMT1. 104号菌株。与现有技术相比，本发明的有益效果是采用蜡状芽孢杆菌发酵产磷脂酶C的方法具有菌株编号明确，工艺简便，生产能力强的优点。
具体实施例方式下面对本发明作进一步详细描述采用蜡状芽孢杆菌发酵产磷脂酶C的方法，是通过50%卵黄液的制备取新鲜土鸡蛋一枚，用75%的酒精擦净外表，用消毒的镊子轻轻敲开蛋壳，流出蛋清，用无菌水冲洗卵黄1 2次，用灭菌后的玻璃注射器吸取10毫升卵黄，加入到装10毫升无菌水的100毫升的三角瓶中摇勻，密封，即可制得50%卵黄液。卵黄平板的组成=NaCl,0. 66% ；硼酸，1.09% ；硼砂，0. 19% ；琼脂，1.5% ；卵黄液， 5%。先称取NaCl、硼酸、硼砂，溶于水中，加入1.5%的琼脂，加热使琼脂充分溶解，用纱布滤去少量未溶解的琼脂，补水至准确体积后灭菌。取10毫升50%卵黄液加入至90毫升已灭菌并已冷却至55度左右的硼砂琼脂液中，趁热摇勻后倒入培养皿中，冷却凝固后即得卵黄平板。配置LB培养基NaCl，0. 5% ；蛋白胨，0. 5% ；牛肉膏，0. 3%。调整pH至7.0 7. 2，121度灭菌20分钟。将菌种接种到装有LB培养基的锥形瓶中，37度，摇床培养得到种子液。接种种子液于LB培养基中，37度，180转/分钟，摇床培养2 30小时，从第2小时开始，每隔1小时取样一次，室温，10000转/分钟的转速，离心20分钟，取上清液。在卵黄平板上平放牛津杯，吸取100微升上清液置于杯中，于恒温培养箱中37度培养M小时，观察是否有乳白色晕圈出现，如果有，则说明此菌株经发酵培养后可以产生磷脂酶C，可进行下一阶段的发酵培养。发酵路线如下(1)配置发酵培养基牛肉膏，3 15克；蛋白胨，5 10克；NaCl，5 8克；水， 1000克；ZnSO4 · 7H20或ZnCl2,0 100毫克；卵磷脂或磷脂混合物(PC、ΡΕ、PI、PS等的混合)，0 10克；pH，4 10。121度灭菌20分钟。(2)微生物发酵将菌种接种到装有LB培养基的锥形瓶中，37度，摇床培养得到种子液。然后将体积比0. 01 15%的种子液接种到装有发酵培养基的锥形瓶中，20 50 度，70 260转/分钟的摇床上培养1 M小时，得到发酵液。发酵液可以通过以下几种方式进行分离①发酵液在4 35度，3000 10000转/分钟，离心5 45分钟，取上清，即为磷脂酶C的酶液，测酶活。此法比较环保，环境污染小且酶的损失小。②调整pH至6 8，加固体(NH4)2SO4至55 80%，室温搅拌0. 5 2小时，2 15度过夜沉淀，2 15度，3000 10000转/分钟，离心5 45分钟，颗粒悬于发酵液体积 0. 1 10%的10毫摩尔/升Tris-HCl缓冲液中(pH6 8)，用30 1000倍体积的10毫摩尔/升Tris-HCl缓冲液(pH6 8)进行2 10次透析，得到磷脂酶C的酶液，测酶活。 此法是在酶的纯化中用的最多的，很经典的方法，但因为要大量使用(NH4)2SO4，对环境是不利的。③发酵液在4 35度，3000 10000转/分钟，离心5 45分钟，取上清，转入截留分子量8000 40000道尔顿的透析袋中，于真空度0. 1 20000帕条件下进行抽滤透析，转移出透析袋中的液体，即为磷脂酶C的酶液，测酶活。此法比较环保，环境污染小且酶的损失小。下面分别叙述采用三种编号菌株的生产过程(1)菌株编号=CMCC633O2从平板培养基转移一环菌株于50毫升的LB培养基中，37度，150转/分钟，摇床培养4小时，作为种子液。接种1. 5毫升种子液于100毫升LB培养基中，进行37度，180转 /分钟，摇床培养4小时，室温，10000转/分钟的转速，离心20分钟，取上清液。在卵黄平板上平放牛津杯，吸取100微升上清液置于杯中，于恒温培养箱中37度培养M小时，观察到有乳白色晕圈出现。从平板培养基转移一环菌株于50毫升的LB培养基中，37度，150转/分钟，摇床培养4小时，作为种子液。接种1. 5毫升种子液于100毫升发酵培养基中，进行37度，150 转/分钟，摇床培养4小时，4度，9000转/分钟，离心分离20分钟，收集得到的上清，调整 pH至6. 5，加固体(NH4)2SO4至55%，室温搅拌1小时，5度过夜沉淀，4度，8000转/分钟， 离心25分钟，颗粒悬于发酵液体积10%的10毫摩尔/升Tris-HCl缓冲液中(pH6. 5)，用 300倍体积的10毫摩尔/升Tris-HCl缓冲液(pH6. 5)进行3次透析，得到磷脂酶C的酶液，测酶活为8.1单位/毫升。(2)菌株编号AS1. 196从平板培养基转移一环菌株于50毫升的LB培养基中，37度，150转/分钟，摇床培养4小时，作为种子液。接种1. 5毫升种子液于100毫升LB培养基中，进行37度，180转 /分钟，摇床培养4小时，室温，10000转/分钟的转速，离心20分钟，取上清液。在卵黄平板上平放牛津杯，吸取100微升上清液置于杯中，于恒温培养箱中37度培养M小时，观察到有乳白色晕圈出现。从平板培养基转移一环菌株于50毫升的LB培养基中，37度，150转/分钟，摇床培养4小时，作为种子液。接种1毫升种子液于100毫升发酵培养基中，进行37度，150转 /分钟摇床培养12小时，25度，10000转/分钟，离心分离20分钟，收集得到的上清，测酶活为21. 2单位/毫升。
(3)菌株编号:GIMT 1. 104从平板培养基转移一环菌株于50毫升的LB培养基中，37度，150转/分钟，摇床培养4小时，作为种子液。接种1. 5毫升种子液于100毫升LB培养基中，进行37度，180转 /分钟，摇床培养4小时，室温，10000转/分钟的转速，离心20分钟，取上清液。在卵黄平板上平放牛津杯，吸取100微升上清液置于杯中，于恒温培养箱中37度培养M小时，观察到有乳白色晕圈出现。从平板培养基转移一环菌株于50毫升的LB培养基中，37度，150转/分钟，摇床培养4小时，作为种子液。接种2毫升种子液于100毫升发酵培养基中，进行37度，150转 /分钟摇床培养8小时，25度，10000转/分钟，离心分离20分钟，收集得到的上清，转入截留分子量8000道尔顿的透析袋中，于真空度15000帕条件下进行抽滤透析，转移出透析袋中的液体，测酶活为13. 2单位/毫升。
权利要求
1.一种蜡状芽孢杆菌发酵产磷脂酶C的方法，其特征在于将蜡状芽孢杆菌接种到LB培养基中培养后得到种子液；将种子液接种到发酵培养基中培养得到发酵液；对发酵液进行分离即得到磷脂酶C。
2.如权利要求1所述的蜡状芽孢杆菌发酵产磷脂酶C的方法，其特征在于发酵培养基由牛肉膏、蛋白胨、NaCl、水、ZnSO4 · 7H20和卵磷脂组成。
3.如权利要求1所述的蜡状芽孢杆菌发酵产磷脂酶C的方法，其特征在于发酵培养基由牛肉膏、蛋白胨、NaCl、水、ZnCl2和磷脂混合物组成。
4.如权利要求1、2或3所述的蜡状芽孢杆菌发酵产磷脂酶C的方法，其特征在于蜡状芽孢杆菌为CMCC63302号菌株。
5.如权利要求1、2或3所述的蜡状芽孢杆菌发酵产磷脂酶C的方法，其特征在于蜡状芽孢杆菌为ASl. 196号菌株。
6.如权利要求1、2或3所述的蜡状芽孢杆菌发酵产磷脂酶C的方法，其特征在于蜡状芽孢杆菌为GIMT 1. 104号菌株。
全文摘要
本发明公开了一种蜡状芽孢杆菌发酵产磷脂酶C的方法。属于酶催化反应的技术领域。其用于解决在生产磷脂酶C所用菌株和工艺复杂的的问题。蜡状芽孢杆菌发酵产磷脂酶C的方法，是将蜡状芽孢杆菌接种到LB培养基中培养后得到种子液，将种子液接种到由牛肉膏、蛋白胨、NaCl、水、ZnSO4·7H2O或ZnCl2和卵磷脂或磷脂混合物(PC、PE、PI、PS等的混合)组成的发酵培养基中培养得到发酵液，对发酵液进行分离即得到磷脂酶C。采用这种蜡状芽孢杆菌发酵产磷脂酶C的方法，可广泛地应用于植物油脱胶的磷脂酶C生产。
文档编号C12R1/085GK102206616SQ201110022039
公开日2011年10月5日 申请日期2011年1月20日 优先权日2011年1月20日
发明者刘元法, 周红茹, 宋志华, 李进伟, 王兴国, 金青哲, 黄健花 申请人:江南大学