专利名称：沙门氏菌lamp快速检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明属于生物制品领域，涉及一种利用环介导等温扩增(LAMP)技术快速检测沙门氏菌的检测试剂盒及其检测方法。
背景技术：
沙门氏菌病是公共卫生学上具有重要意义的人畜共患病之一，据世界卫生组织的报告，1985年以来，在世界范围内，由沙门氏菌引起的已确诊的人类患病人数显著增加，在一些欧洲国家已增加五倍以上。在我国内陆地区，由沙门氏菌引起的食物中毒屡居首位。据资料统计，在我国细菌性食物中毒中，70% 80%是由沙门氏菌引起，而在引起沙门氏菌中毒的食品中，90%以上是肉类等动物性产品。动物性产品中含有多种丰富的营养成分，非常适宜于沙门氏菌的生长繁殖，人们一旦摄入了含有大量沙门氏菌的动物性产品，就会引起细菌性感染，进而在毒素的作用下发生食物中毒。由沙门氏菌引起的疾病主要分为两大类一类是伤寒和副伤寒，另一类是急性肠胃炎。其中鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌等是污染动物性产品，进而引起人类沙门氏菌食物中毒的主要致病菌。沙门氏菌污染主要来源于患病的人和动物及其带菌者，主要由其粪便、尿、乳汁以及流产胎儿、胎衣和羊水排出的病菌污染水源、土壤和饲料等，其中饲料和水源的污染是导致沙门氏菌传染的主要原因。各种饲料中均可发现沙门氏菌，尤其是动物性饲料(如鱼粉)常见。鉴于沙门氏菌对人类健康的严重危害，目前世界各国政府对动物性饲料中沙门氏菌的限量标准均制定出非常严格的规定，对动物性饲料中沙门氏菌的规定均为不得检出，为所有微生物限量标准中的最严格级。目前已建立多种针对沙门氏菌的检测方法，如常规的检测方法、免疫学为基础的检测方法和以分子生物学为基础的检测方法等，但是这些方法或耗时长，或敏感性差、或特异性不强。环介导等温扩增法(LAMP)是一种新型的核酸扩增方法，该方法针对病原保守基因上的八个区域设计六条特异性引物，利用BstDNA聚合酶在60°C 65°C进行恒温扩增 30-60min，通过观察反应液浊度并结合染料颜色变化判定结果，该方法灵敏、快速、准确、操作简单，不需要特殊仪器，成本低，可用于产品现场快速检测。现有技术中已经有沙门氏菌LAMP检测试剂盒及其检测方法，在实际使用过程中， 还是存在检测试剂盒的配置不够合理，反应体系不够稳定，以及所设计引物的针对性和灵敏度不够高等缺陷。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种灵敏、特异、简便、引物针对性强的沙门氏菌LAMP快速检测试剂盒及其检测方法。本发明的沙门氏菌LAMP快速检测试剂盒由提取沙门氏菌基因组试剂和LAMP反应试剂组成；
4所述提取沙门氏菌基因组试剂包括SDS、蛋白酶K，CTAB/NaCl溶液和NaAC ； 所述LAMP反应试剂由反应液A和反应液B组成，反应液A含有IOX Lamp buffer,Bst DNA聚合酶、dNTP、内引物1、内引物2、外引物1、外引物2，甜菜碱、超纯水，其中
IOX Lamp buffer 含有 200mM Tris-HCl (pH 8.8 ,25° C)、IOOmM氯化钾、IOOmM硫酸铵、20mM硫酸镁和1%曲拉通X-100 ；
内引物 1 为AAGAGGCRCCTTGCGCTAAAGTTTTTGCCAAACCTCGCTTATCGG ； 内引物 2 为TAGCACGTCAGCAAAGCGTACCTTTTTGTGGGGAAGGTTAAGGAGG ； 外引物 1 为CTGTACGCGAAGCCTTGTT ； 外引物 2 为ACTGCTGGAkCAGCCGRA ； 反应液B为荧光染料。上述提取沙门氏菌基因组试剂中，SDS浓度10mg/ml、蛋白酶K浓度10mg/ml，CTAB/ NaCl溶液和NaAC浓度3M。上述LAMP反应试剂中，聚合酶浓度8U/μ 1、dNTP浓度2. 5 mM、内引物1浓度 40 μ M、内引物2浓度40 μ Μ、外引物1浓度5 μ Μ、外引物2浓度5 μ Μ，甜菜碱浓度5Μ。所述荧光染料为1000XSYBR Green I。本发明的试剂盒检测沙门氏菌的方法包括以下步骤
a.组织样品中DNA的提取，具体步骤
1)、取ImL沙门氏菌，10000rpm，5min，弃上清；
2)、菌体沉淀，用600μ TE 悬浮，并加 6(^L10%SDS，6PLproteinK10mg/ml，混勻，37°C，
lh;
3)、加180μ 5mol/L NaCl，混勻，再加入 180μ CTAB/NaCl 溶液，混勻，65°C，20min ；
4)、用与上一步骤液体等体积的酚和氯仿混合溶液抽提，混合溶液中的酚和氯仿体积比为25 :24，离心12000rpm，5min，移取上清至干净EP管中；
5)、重复步骤4;
6)、取上清，约500μ ，加入 6“L RNAse，37°C，30min ；
7)、加入ImL 100% 无水乙醇，50μ 3Μ NaAc, -20°C,90min ；
8)、12000rpm，5min,弃上清，加入75%乙醇200μ 冲洗沉淀；
9)、弃上清，加入40μ TE溶解DNA，有白色沉淀溶解，作为模板备用；
b.沙门氏菌的环介导等温扩增，具体步骤
在装有22 μ 1的LAMP反应试剂的反应管中加入3 μ 1待检DNA，于63_65°C恒温水浴箱中放置45min ；
c.扩增产物的显色检测，具体步骤
在步骤b反应结束后，加入1 μ 1的1000 X STOR Green I荧光染料；直接用肉眼观察颜色变化，颜色变为绿色，则说明样品中含有沙门氏菌；颜色为橙色，说明样品不含沙门氏菌。本发明解决了现有技术中检测沙门氏菌的方法所需周期长、灵敏度较低、成本高、 现场应用困难等缺陷，提供的沙门氏菌的检测试剂盒及其检测方法，对沙门氏菌进行LAMP 检测，快速、准确性高、灵敏性好、现场应用方便，可广泛应用于兽医、食品、出入境检疫等领域。
具体实施例方式实施例
按下列配方制作沙门氏菌的环介导等温扩增检测试剂盒；
1、提取沙门氏菌基因组
1 )、取ImL沙门氏菌，IOOOOrpm, 5min,弃上清。2)、菌体沉淀，用 600μ TE 悬浮，并加 6(^L10%SDS，6PLproteinK10mg/ml，混勻， 37°C, Ih03)、力Π 180μ 5mol/L NaCl,混勻，再加入 180μ CTAB/NaCl 溶液，混勻，65°C， 20mino4)、用等体积酚氯仿(25 :24)抽提，12000rpm，5min，移取上清至干净EP管中。5)、重复步骤4。6)、取上清，约 500μ ，加入 6μ RNAse，37°C，30min。7)、加入 ImL 100% 无水乙醇，50μ 3Μ NaAc，_20°C，90min。8)、12000rpm，5min，弃上清，加入75%乙醇200μ 冲洗沉淀。9)、弃上清，加入40μ TE溶解DNA，有白色沉淀溶解，作为模板备用。2、配制LAMP反应试剂，包括以下成分
1)、反应液A含有 IOX Lamp buffer,Bst DNA 聚合酶8υ/μ1、2·5 mM dNTP、40yM内引物1、40μΜ内引物2、5μΜ外引物1、5μΜ外引物2、甜菜碱(5Μ)、超纯水，其中
IOX Lamp buffer含有200mM Tris-HCl (pH 8.8 ,25° C)、IOOmM氯化钾、IOOmM硫酸铵、20mM硫酸镁和1%曲拉通X-100 ； 所含引物序列为
内引物 1 为AAGAGGCRCCTTGCGCTAAAGTTTTTGCCAAACCTCGCTTATCGG 内引物 2 为TAGCACGTCAGCAAAGCGTACCTTTTTGTGGGGAAGGTTAAGGAGG 外引物 1 为CTGTACGCGAAGCCTTGTT 外引物 2 为ACTGCTGGAkCAGCCGRA
2)、反应液B :1000XSYBR Green I。反应液A每次反应由22 μ 1组成，其配制如下
2.5μ 1 IOX Lamp bufferU. 0μ 1 Bst DNA 聚合酶(8U/μ 1 )、4 μ 1 2. 5 mM dNTP、 0. 5μ 1 40μΜ 内引物 1、0. 5μ 1 40μΜ 内引物 2、0. 5μ 1 5μΜ 外引物 1、0. 5μ 1 5μΜ 夕卜弓 I 物2，5 μ 1甜菜碱(5Μ)和7. 5 μ 1灭菌超纯水。3、沙门氏菌的环介导等温扩增
在装有22 μ 1反应液A的反应管中加入3 μ 1待检DNA，于63_65°C恒温水浴箱中放置 45min ；
4、扩增产物的显色检测
在上述反应结束后，加入Ιμ 1反应液B，直接用肉眼观察颜色变化，如颜色变为绿色， 则说明样品中含有沙门氏菌；如果颜色为橙色，说明样品不含沙门氏菌。
试验例1 本发明试剂盒在检测沙门氏菌中的应用效果敏感性和临床检测。
一、敏感性1. 1样品猪霍乱沙门氏菌(原始浓度为6. 2X IO6CFU/μ 1)
1.2样品处理将猪霍乱沙门氏菌DNA (原始浓度为6. 2 X IO6CFU/ μ 1)做ΚΓ-ΙΟ-7的倍比稀释。1. 3检测体系各组分配比如下
沙门氏菌LAMP检测试剂盒反应液A由22μ 1组成，其配制如下
2.5μ 1 IOX Lamp bufferU. Ομ 1 Bst DNA 聚合酶(8U/μ 1 )、4 μ 1 2. 5 mM dNTP、 0. 5μ 1 40μΜ 内引物 1、0. 5μ 1 40μΜ 内引物 2、0. 5μ 1 5μΜ 外引物 1、0. 5μ 1 5μΜ 夕卜弓 I 物2，5 μ 1甜菜碱(5Μ)和7. 5 μ 1灭菌超纯水。1. 4沙门氏菌的环介导等温扩增反应
在装有22 μ 1反应液A的反应管中加入3 μ 1待检DNA，于63_65°C恒温水浴箱中放置 45min ；
1.5扩增产物的显色检测
在上述反应结束后，加入 μ 1反应液B，直接用肉眼观察颜色变化，如颜色变为绿色， 则说明样品中含有沙门氏菌；如果颜色为橙色，说明样品不含沙门氏菌。1. 6试剂盒的敏感性结果
试验结果表明采用本发明试剂盒最低检测6 CFU/管，表明本发明试剂盒具有很高的敏感性。二、临床检测
2.1样品临床采集的沙门氏菌阳性与阴性样品 2. 2检测体系各组分配比如下
沙门氏菌LAMP检测试剂盒反应液A由22μ 1组成，其配制如下 2. 5μ 1 IOX Lamp bufferU. Ομ 1 Bst DNA 聚合酶(8U/μ 1 )、4 μ 1 2. 5 mM dNTP、 0. 5μ 1 40μΜ 内引物 1、0. 5μ 1 40μΜ 内引物 2、0. 5μ 1 5μΜ 外引物 1、0. 5μ 1 5μΜ 夕卜弓 I 物2，5 μ 1甜菜碱(5Μ)和7. 5 μ 1灭菌超纯水。2. 3沙门氏菌的环介导等温扩增反应
在装有22 μ 1反应液A的反应管中加入3 μ 1待检DNA，于63_65°C恒温水浴箱中放置 45min ；
2. 4扩增产物的显色检测
在上述反应结束后，加入1μ 1反应液B，直接用肉眼观察颜色变化，含有沙门氏菌的样品变为绿色；不含沙门氏菌的样品，颜色为橙色。
权利要求
1.一种沙门氏菌LAMP快速检测试剂盒由提取沙门氏菌基因组试剂和LAMP反应试剂组成；其特征是所述提取沙门氏菌基因组试剂包括SDS、蛋白酶K，CTAB/NaCl溶液和NaAC ； 所述LAMP反应试剂由反应液A和反应液B组成，反应液A含有IOX Lamp buffer、Bst DNA聚合酶、dNTP、内引物1、内引物2、外引物 1、外引物2，甜菜碱、超纯水，其中IOX Lamp buffer 含有 200mM Tris-HCl (pH 8.8 ,25° C)、IOOmM氯化钾、IOOmM硫酸铵、20mM硫酸镁和1%曲拉通X-100 ；内引物 1 为AAGAGGCRCCTTGCGCTAAAGTTTTTGCCAAACCTCGCTTATCGG 内引物 2 为TAGCACGTCAGCAAAGCGTACCTTTTTGTGGGGAAGGTTAAGGAGG 外引物 1 为 KTGIWCGCGAAGCCTTGTT 外引物 2 为ACTGCTGGAkCAGCCGRA 反应液B为荧光染料。
2.根据权利要求1所述的沙门氏菌LAMP快速检测试剂盒，其特征是提取沙门氏菌基因组试剂中，SDS浓度10mg/ml、蛋白酶K浓度10mg/ml，CTAB/NaCl溶液和NaAC浓度3M。
3.根据权利要求1所述的沙门氏菌LAMP快速检测试剂盒，其特征是所述LAMP反应试剂中，聚合酶浓度8U/y l、dNTP浓度2. 5 mM、内引物1浓度40 μ Μ、内引物2浓度40 μ Μ、 外引物1浓度5 μ Μ、外引物2浓度5 μ Μ,甜菜碱浓度5Μ。
4.根据权利要求1所述的沙门氏菌LAMP快速检测试剂盒，其特征是所述荧光染料为 1000XSYBR Green I。
5.一种用权利要求1所述试剂盒检测沙门氏菌的方法，包括以下步骤a.组织样品中DNA的提取，具体步骤1)、取ImL沙门氏菌，10000rpm，5min，弃上清；2)、菌体沉淀，用600μ TE 悬浮，并加 6(^L10%SDS，6PLproteinK10mg/ml，混勻，37°C，lh;3)、加180μ 5mol/L NaCl，混勻，再加入 180μ CTAB/NaCl 溶液，混勻，65°C，20min ；4)、用与上一步骤液体等体积的酚和氯仿混合溶液抽提，混合溶液中的酚和氯仿体积比为25 :24，离心12000rpm，5min，移取上清至干净EP管中；5)、重复步骤4;6)、取上清，约500μ ，加入 6“L RNAse，37°C，30min ；7)、加入ImL 100% 无水乙醇，50μ 3Μ NaAc，-20°C，90min ；8)、12000rpm，5min,弃上清，加入75%乙醇200μ 冲洗沉淀；9)、弃上清，加入40μ TE溶解DNA，有白色沉淀溶解，作为模板备用；b.沙门氏菌的环介导等温扩增，具体步骤在装有22 μ 1的LAMP反应试剂的反应管中加入3 μ 1待检DNA，于62_64°C恒温水浴箱中放置45min ；c.扩增产物的显色检测，具体步骤在步骤b反应结束后，加入1μ 1的1000 X STOR Green I荧光染料；直接用肉眼观察颜色变化，颜色变为绿色，则说明样品中含有沙门氏菌；颜色为橙色，说明样品不含沙门氏菌。.
全文摘要
本发明属于生物制品领域，涉及一种利用环介导等温扩增(LAMP)技术快速检测沙门氏菌的，检测试剂盒及其检测方法。其试剂盒由提取沙门氏菌基因组试剂和LAMP反应试剂组成；所述提取沙门氏菌基因组试剂包括SDS、蛋白酶K，CTAB/NaCl溶液和NaAC；所述LAMP反应试剂由反应液A和反应液B组成；反应液A含有10×Lampbuffer、BstDNA聚合酶、dNTP、内引物1、内引物2、外引物1、外引物2，甜菜碱、超纯水；反应液B为荧光染料。本发明对沙门氏菌进行LAMP检测，快速、准确性高、灵敏性好、现场应用方便，可广泛应用于兽医、食品、出入境检疫等领域。
文档编号C12Q1/68GK102199665SQ20111007570
公开日2011年9月28日 申请日期2011年3月29日 优先权日2011年3月29日
发明者刘骏, 吴小华, 孙园园, 朱金连, 王富海, 赵鹏, 钱科 申请人:镇江出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心