专利名称：一种耐高温中性纤维素酶Cel6及其基因和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种耐高温中性纤维素酶Cel6及其基因和应用。
背景技术：
生物质的再生和降解是自然界中一个非常重要的环节，自然界中每年有15%的总碳通过植物被固定，其中50%的固定碳形成了结构多糖和木质素，通常将这一部分称为木质纤维素(Sandgren et al. Prog Biophys Mol Bio, 2005,89 :246-291.)。植物通过光和作用每年可产生约400亿吨木质纤维素，木质纤维素主要由纤维素、木质素和半纤维组成，还含有少量的灰分、蛋白质和果胶(Dashtban et al. Int J Biol Sci, 2009, 5 :578-595.)。 纤维素的降解需要纤维素酶，纤维二糖水解酶，葡萄糖苷酶将纤维寡糖，二糖水解得到葡萄糖。纤维素酶广泛存在于自然界的生物体中，按纤维素酶催化反应的最适pH值，可将其分为酸性纤维素酶(最适PH值为3-5)、中性纤维素酶(最适pH值为6-8)和碱性纤维素酶(最适 PH 值为 8-11) (Zhang YHP，et al. Biotechnol Adv 2006，24 :62-481.)。纤维素酶在造纸、酿造、纺织、饲料、生物能源等领域均具有广泛的应用前景(WongKK, et al. Microbiol Rev 1988，52 :305-317.)。但是，不同的工业应用需求不同性质的纤维素酶，例如，饲料工业需要嗜酸的纤维素酶，纺织工业需要中性耐碱的纤维素酶。目前工业上广泛应用的木霉所产纤维素酶最适pH在5. O左右，最适温度在50-60°C之间，不能满足棉织品水洗整理工业、造纸制浆业的工业要求。由于棉纤维耐碱不耐酸，强酸性处理后易损坏(许爱国等，中性纤维素酶在棉织物整理中的应用，印染,2006，21，11-12)。目前，国内纺织工业主要依赖进口，且价格昂贵。因此，获得新型具有耐碱高温的中性纤维素酶的研究具有重大意义。克隆和分离具有中性、热稳定性好的纤维素酶可以更好的应用于纺织等领域。
发明内容
本发明的目的是提供一种能高效应用的耐高温中性纤维素酶。本发明的再一目的是提供编码上述耐高温中性纤维素酶的基因。本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。本发明的另一目的是提供一种制备上述耐高温中性纤维素酶的基因工程方法。本发明的另一目的提供上述耐高温中性纤维素酶的应用。本发明从瓶霉(Phialophora sp. G5)中分离得到一种新的耐高温中性纤维素酶Cel6。本发明提供了一种耐高温中性纤维素酶Cel6，其氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示。SEQ ID NO. I MTAKHVFLAAALAATALAAPVSESQNCASEWGQCGGTGFTGASCCASGSTCTQQNEYYSQCVPGSQVTTGQIASTPAATVVGSATMGSSPSQMTAPAASASGTTSYSGNPFEGVQMWANAYYASEVLNLAVPSLSGDMVAKASAVAKVPSFQWLDTAAKVPTVMADTLADIAKANQAGASPAYAGLFVVYDLPDRDCAAAASNGEYSIADNGVANYKAYIDAIKAQLVANSDTRILLVVEPD SLANLVTNMNVAKCANAHDAYLECINYAVTQLNLPNVAMYLDAGHAGffLGffSANLQPAATLFANVYSNAGKPASLRGLATNVANYNAWTIASAPSYTQGDSNYDEKLYVQALSPLLSSAGWDAHFITDQSRSGKQPTGQNAWGDWCNVIGTGFGTRPTTDTGLDIEDALVWVKPGGECDGTSNTTAARYDYHCGLSDALQPSPEAGTWFQAYFVQLLTNANPAF其中，该酶基因编码466个氨基酸，N端18个氨基酸为其预测的信号肽序列^mtakhvfIaaalaatala^ (SEQ ID NO. 3)。因此，成熟的中性纤维素酶Cel6的理论分子量为46. 6kDa，其氨基酸序列如SEQIDNO. 2所示APVSESQNCASEWGQCGGTGFTGASCCASGSTCTQQNEYYSQCVPGSQVTTGQIASTPAATVVGSATMGSSPSQMTAPAASASGTTSYSGNPFEGVQMWANAYYASEVLNLAVPSLSGDMVAKASAVAKVPSFQWLDTAAKVPTVM ADTLADIAKANQAGASPAYAGLFVVYDLPDRDCAAAASNGEYSIADNGVANYKAYIDAIKAQLVANSDTRILLVVEPDSLANLVTNMNVAKCANAHDAYLECINYAVTQLNLPNVAMYLDAGHAGWLGWSANLQPAATLFANVYSNAGKPASLRGLATNVANYNAWTIASAPSYTQGDSNYDEKLYVQALSPLLSSAGWDAHFITDQSRSGKQPTGQNAWGDffCNVIGTGFGTRPTTDTGLDIEDALVWVKPGGECDGTSNTTAARYDYHCGLSDALQPSPEAGTWFQAYFVQLLTNANPAF本发明的中性纤维素酶Cel6同时具有好的热稳定性而且在中性和碱性的范围内均具有高活性等特性。本发明筛选到的纤维素酶，其最适PH值为7. Q，并在pH 4. O 11. O范围内具有40%以上的酶活力；最适温度为65°C，在80°C处理60min后仍具有60%左右的酶活力。本发明提供了编码上述耐高温中性纤维素酶的基因cel6。具体地，该基因的序列如 SEQ ID NO. 3 所示atgactgccaaacacgtctttctcgcggccgctctcgcagcgacagcgctggccgccccggtttccgaaagccagaactgtgcttcagaatgggggcaatgcggaggtactggcttcacaggcgcaagctgctgtgcgtcagggagcacgtgtacgcagcagaacgaatactattcccaatgcgtaccggggagccaggtaacaaccggccagatcgccagtaccccggcggcgaccgtggttggctccgccaccatggggagctcccctagccagatgaccgcgccggcagcctccgcctcgggcacaacgtcgtacagcgggaatcccttcgagggcgtgcagatgtgggccaacgcctactacgcctccgaggtgctcaacctcgcggtgcccagcctgagcggcgacatggtggccaaggcctctgccgtggccaaggtgcccagcttccagtggctggacacggccgccaaggtgcccaccgtcatggccgacaccctcgccgacatcgcgaaggccaaccaggccggggccagccctgcgtacgcgggtctcttcgtcgtgtacgacctgccggaccgcgactgcgccgccgcggcgtccaacggcgagtacagcatcgctgacaacggggtggccaactacaaggcgtacatcgacgccatcaaggcccagctggtggccaactcggacacccgcatcctgctggtggtggagccggactcgctggccaacctggtgaccaacatgaacgtcgccaagtgtgccaacgcccacgacgcgtacctcgagtgcatcaactacgccgtcacccagctcaacctgcccaacgtggccatgtacctcgacgccggccacgccggctggctcggctggagcgccaacctgcagcccgccgccaccctcttcgccaacgtgtactccaacgccggcaagcccgccagcctgcgcggcctggccaccaacgtcgccaactacaacgcctggaccatcgcctccgcgccttcctacacccagggcgacagcaactacgacgagaagctgtacgtgcaggccctctccccgctcctcagctccgccggctgggacgcccacttcatcaccgaccagagccgctccggcaagcagccgacgggccagaatgcttggggcgactggtgcaacgtgatcggcacagggttcggcacgcgtccgaccaccgacaccgggctggacatcgaggatgccctcgtctgggtgaagcccggcggcgaatgcgacggcacgagcaacaccaccgcggcccgctacgactaccactgcggcctctccgacgctctgcagccctcgcccgaggccggcacctggttccaggcatacttcgtgcagcttctca
ccaacgccaacccggccttctaa去除信号肽序列后的基因序列SEQ ID NO. 4 gccccggtttccgaaagccagaactgtgcttcagaatgggggcaatgcggaggtactggcttcacaggcgcaagctgctgtgcgtcagggagcacgtgtacgcagcagaacgaatactattcccaatgcgtaccggggagccaggtaacaaccggccagatcgccagtaccccggcggcgaccgtggttggctccgccaccatggggagctcccctagccagatgaccgcgccggcagcctccgcctcgggcacaacgtcgtacagcgggaatcccttcgagggcgtgcagatgtgggccaacgcctactacgcctccgaggtgctcaacctcgcggtgcccagcctgagcggcgacatggtggccaaggcctctgccgtggccaaggtgcccagcttccagtggctggacacggccgccaaggtgcccaccgtcatggccgacaccctcgccgacatcgcgaaggccaaccaggccggggccagccctgcgtacgcgggtctcttcgtcgtgtacgacctgccggaccgc gactgcgccgccgcggcgtccaacggcgagtacagcatcgctgacaacggggtggccaactacaaggcgtacatcgacgccatcaaggcccagctggtggccaactcggacacccgcatcctgctggtggtggagccggactcgctggccaacctggtgaccaacatgaacgtcgccaagtgtgccaacgcccacgacgcgtacctcgagtgcatcaactacgccgtcacccagctcaacctgcccaacgtggccatgtacctcgacgccggccacgccggctggctcggctggagcgccaacctgcagcccgccgccaccctcttcgccaacgtgtactccaacgccggcaagcccgccagcctgcgcggcctggccaccaacgtcgccaactacaacgcctggaccatcgcctccgcgccttcctacacccagggcgacagcaactacgacgagaagctgtacgtgcaggccctctccccgctcctcagctccgccggctgggacgcccacttcatcaccgaccagagccgctccggcaagcagccgacgggccagaatgcttggggcgactggtgcaacgtgatcggcacagggttcggcacgcgtccgaccaccgacaccgggctggacatcgaggatgccctcgtctgggtgaagcccggcggcgaatgcgacggcacgagcaacaccaccgcggcccgctacgactaccactgcggcctctccgacgctctgcagccctcgcccgaggccggcacctggttccaggcatacttcgtgcagcttctcaccaacgccaacccggccttctaa本发明通过RT-PCR的方法分离克隆了耐高温中性纤维素酶基因cel6，DNA全序列分析结果表明，中性纤维素酶Cel6的基因全长1401bp。成熟蛋白理论分子量为46. 6kDa，将纤维素酶基因cel6序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对，该基因与来源于Talaromyces emersonii的cellobiohydrolase (EC 3. 2. I. 91)氨基酸序列一致性为67% 说明Cel6是一种新的纤维素酶。本发明还提供了包含上述耐高温中性纤维素酶基因cel6的重组载体，命名为pPIC-cel6。将本发明的纤维素酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的纤维素酶成熟蛋白基因插入到质粒PPIC9上的EcoR I和NotI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOXl启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC9-cel6。本发明还提供了包含上述耐高温中性纤维素酶基因cel6的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组菌株GS115/cel6。本发明还提供了一种制备耐高温中性纤维素酶Cel6的方法，包括以下步骤I)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；2)培养重组菌株，诱导重组纤维素酶表达；
3)回收并纯化所表达的纤维素酶Cel6。其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichia pastoris)GS115，得到重组菌株GS115/cel60本发明还提供了上述耐高温中性纤维素酶Cel6的应用。本发明首先所要解决的技术问题是克服现有酸性纤维素酶在纺织工业上应用的不足，提供一种性质优良的、适合于在中碱性PH环境下应用新的中性纤维素酶。本发明中来源于瓶霉属Phialophora sp. G5的纤维素酶Cel6具有以下性质最适pH7. O,并在PH5. O 8. O范围内具有60%以上的酶活力，具有很好的pH稳定性，37°C下作用2h后，在pH 2. 0-11. O之间，剩余酶活性均在80%以上。最适温度65°C，良好的热稳定性，80°C都有较好的稳定性，保温60min后仍保持60%以上的酶活。中性和碱性范围内具有较高酶活力，良好的PH和热稳定性等特性使其在纺织工业应用上具有很大的潜力。其耐高温特性，可使 其在需求耐高温环境的工业生产上应用。本纤维素酶可应用于纺织、能源工业。
图I重组纤维素酶的最适pH。图2重组纤维素酶的pH稳定性。图3重组纤维素酶的最适温度。图4重组纤维素酶的热稳定性。
具体实施例方式试验材料和试剂I、菌株及载体1、菌株及载体本发明从瓶霉(Phialophora sp.)中分离得到一种新的耐高温中性纤维素酶Cel6。毕赤酵母表达载体PPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen 公司。2、酶类及其它生化试剂内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。3、培养基(I) LB培养基1% NaCl, O. 5%酵母提取物，I %蛋白胨⑵YPD培养基2 %葡萄糖，I %酵母提取物，2 %蛋白胨(3)MM 固体培养基琼脂粉 I. 7% (w/v), YNB I. 34% (w/v)，生物素 4X 10-5% (w/ν),甲醇 O. 5% (ν/ν)(4)MD固体培养基以2% (w/v)的葡萄糖代替甲醇，其余同丽固体培养基(5) BMGY培养基酵母提取物I % (w/v)，蛋白胨2 % (w/v)，甘油I % (ν/ν)，生物M 4X10-5% (w/v), YNB I. 34% (w/v)(6) BMMY培养基以O. 5%甲醇代替甘油，其余同BMGY培养基说明以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J-萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实施例I瓶霉Phialophora sp.纤维素酶编码基因cel6的克隆提取瓶霉Phialophora sp.基因组 DNA:采用CTAB法提取真菌基因组，参见(Graham et al.，1994)，有所修改①离心取真菌培养物约2g，尽量除去培养基，在液氮中充分研磨几次；②加入15-20mL预热的CTAB裂解液(一般O. 5_lg加3mL)，混匀后于65°C温育2h,中间每15min混勻一次；③加入等体积的Tris饱和酚和氯仿的等体积混合物，混匀后，12，OOOg 4°C离心15min，然后将上清液转移到新的离心管中(视蛋白残留的程度重复一次)；④上清液中加入等体积的氯仿，混匀后，12，OOOg 4°C离心15min，将上清液转移到 新的离心管中；⑤在上清液中加入等体积的_20°C预冷的异丙醇，-20°C静置30min以上，离心弃
上清；⑥沉淀用70%乙醇漂洗两次，然后真空抽干，重悬于500 μ LI蒸馏水；⑦加入10 μ LRNase (10mg/mL), 37°C处理 30min 以上；⑧采用DNA纯化试剂盒进行纯化，以提高DNA的浓度和纯度。 根据第六家族纤维素酶基因的保守(YDLPGRDC和KPGGE⑶)序列设计合成了简并引物 CBhGH6-F，CBhGH6-RCBhGH6-F 5/ -TACGACCTTCCGGINMGIGAYTG-3'；CBhGH6-R 5/ -CCATCGCACTCNCCNCCIGKYTT-3')。以Phialophora sp. G5CGMCC 3328总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为94°C变性5min ;然后94°C变性30sec，55°C退火30sec，72°C延伸lmin，30个循环后72°C保温lOmin。得到一约698bp片段，将该片段回收后与pEASY_T3载体相连送博迈德公司测序。根据测序得到的核苷酸序列，设计上游和下游各三条TAIL-PCR特异性引物设计方向为需要扩增的未知区域方向，sp2的位置设计在spl的内侧，sp3位于sp2的内侧。每两个引物之间的距离没有严格规定，引物长度一般22 30nt，退火温度在60 65°C。并将它们分别命名为Cel6upl、Cel6up2、Cel6up3 (上游特异性引物)、Cel6dpl、Cel6dp2、Cel6dp3(下游特异性引物)见表I。表I.纤维素酶Cel6TAIL_PCR特异性引物
权利要求
1.一种耐高温中性纤维素酶Cel6，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. I或2所
2.一种耐高温中性纤维素酶基因cel6，其特征在于，编码权利要求I所述的耐高温中性纤维素酶Cel6。
3.如权利要求2所述的耐高温中性纤维素酶基因cel6，其特征在于，其碱基序列如SEQID NO. 4 所示。
4.包含权利要求2所述耐高温中性纤维素酶基因cel6的重组载体。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为载体pPIC-Cel6
6.包含权利要求2所述耐高温中性纤维素酶基因cel6的重组菌株。
7.根据权利要求6所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，
8.一种制备权利要求I所述耐高温中性纤维素酶cel6的方法，其特征在于，包括以下步骤 1)用权利要求4的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株； 2)培养重组菌株，诱导重组纤维素酶表达； 3)回收并纯化所表达的纤维素酶Cel6。
9.权利要求I所述耐高温中性纤维素酶Cel6的应用。
全文摘要
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种耐高温中性纤维素酶Cel6及其基因。本发明提供了一种来源于瓶霉属Phialophora sp.的纤维素酶Cel6，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，且本发明提供了编码上述中性纤维素酶的编码基因cel6。本发明的纤维素酶具有以下性质最适pH7.0，在pH4.0～11.0保持40％以上的酶活，最适温度65℃，具有良好的pH稳定性和热稳定性。做为一种新型的酶制剂，可广泛用于纺织、能源工业等。
文档编号C12N15/56GK102827818SQ201110159738
公开日2012年12月19日 申请日期2011年6月15日 优先权日2011年6月15日
发明者王兴吉, 郭庆文, 王忠连, 李芳芳, 刘文龙, 孙硕, 钱娟娟 申请人:山东隆科特酶制剂有限公司