专利名称：白癜风黑素细胞移植涂布载体系统的制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医学领域，尤其涉及一种白癜风黑素细胞移植涂布载体系统的制备方法及其应用。
背景技术：
白癜风是一种常见的难治性皮肤色素脱失性疾病，组织病理上主要表现为黑素细胞的缺失。白癜风虽对健康无严重影响，但患者常为外观形象产生沉重的心理负担，影响工作、学习等正常生活，容易发展为心理疾病。传统的治疗手段包括药物治疗、物理疗法及外科手术等，因受药物及物理治疗有效率的限制，外科手术常成为白癜风患者的最终选择。常用的方法包括自体表皮移植、黑素细胞悬液移植等，这些疗法虽有一定疗效但自体表皮移植仅适用于较小片白斑的治疗，对于较大白斑实际上可操作性较小；而黑素细胞悬液移植因缺乏载体固定从而造成细胞的流失，植入率低。黑素细胞培养后移植是目前公认的治疗白癜风的有效手段之一，现有的黑素细胞培养基包含十四烷肽佛波醇乙酯(TPA)、霍乱毒素(CT)等促黑素细胞增殖因子，但它们具有一定的毒性作用，临床移植时可能存在一定的风险。虽然目前有学者以碱性成纤维生长因子(bFGF)、肝细胞生长因子(HGF)、干细胞因子(SCF)等取代TPA、CT，但其费用昂贵，手术成本高，难以推广，使得黑素细胞培养后移植的临床应用受到限制
发明内容
本申请人针对上述的问题，进行了研究改进，提供一种白癜风黑素细胞移植涂布载体系统的制备方法及其应用，配置一种优良的黑素细胞培养基，使黑素细胞在体外能大量增殖；并且解决现有的细胞移植过程中细胞悬液易流失的问题，提高植入率，降低手术成本。为了解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案一种白癜风黑素细胞移植涂布载体系统的制备方法，包括以下步骤(1)配置黑素细胞培养基取黑素细胞基本培养液Hams F12 80 120份，加入胎牛血清FBS 8 12份，人粒细胞集落刺激因子G-CSF 0. 16 0. 24份，100ng/ml的促黑素生成素α -MSH 0. 08 0. 12份，异甲基黄嘌呤ΙΒΜΧ0. 08 0. 12份，1. 5ug/ml的肾上腺素及维生素C混合液0. 8 1. 2份，青链双抗霉素0. 8 1. 2份，在4°C的冰箱中保存；(2)黑素细胞的体外培养①无菌条件下获得自体皮肤样本，清洗后用0. 25%的胰蛋白酶-EDTA消化液在37°C条件下消化IOmin 15min ；②终止消化，获取细胞悬液， 离心，弃上清，收集沉淀黑素细胞，加入上述黑素细胞培养基，置于细胞培养箱以37°C、5% C02、饱和湿度条件下孵育；每2 3天更换1次上述黑素细胞培养基；③根据黑素细胞生长和增殖情况，进行传代5 6代即可完成体外培养，制成黑素细胞悬液；(3)涂布载体系统的合成以卡波姆940凝胶为涂布载体，卡波姆940凝胶常规高压灭菌处理，按1 4 6的体积比加至黑素细胞悬液，并均勻混合至嗜喱状。
进一步的所述黑素细胞培养基的优选组份为黑素细胞基本培养液Hams F12 100份，胎牛血清FBS 10份，人粒细胞集落刺激因子G-CSF 0. 20份，100ng/ml的促黑素生成素α -MSH 0. 10份，异丁基甲基黄嘌呤IBMX 0. 10份，1.5ug/ml的肾上腺素及维生素C混合液1. 0份， 青链双抗霉素1.0份。一种白癜风黑素细胞移植涂布载体系统的应用，在无菌条件下磨削皮肤白斑至点状出血，均勻涂抹上述白癜风黑素细胞移植涂布载体系统，以油纱布覆盖，常规包扎。本发明的目的之一在于针对现有技术的不足，配置一种优良的黑素细胞培养基， 使黑素细胞在体外能大量增殖。这种培养基中含有人体自身能分泌的粒细胞集落刺激因子 (G-CSF)。实验证明了黑素细胞能够表达G-CSF受体，且G-CSF对黑素细胞确具有促增殖作用。我们将黑素细胞接种至96孔板，分为A、B、C三组，每组细胞密度相同，设4个复孔；将浓度为 0. 0083g/L、0. 0167g/L 及 0. 0333g/L 的 G-CSF 分别加入 A、B、C 组，于 24h.48h.72h 小时测量黑素细胞增殖率，结果如图1所示。此外，与TPA、bFGF等其他细胞因子相比，它还具有安全性高，成本费用低，增殖效果佳的优点，运用该培养基能够获得大量纯化的黑素细胞，为细胞移植打下了坚实的基础。本发明的另一目的是为了解决传统细胞移植过程中细胞悬液易流失的问题，因此，本发明采用卡波姆940凝胶作为涂布载体，可以起到很好的固定作用，使黑素细胞的植入率大大提高。另外，我们用MTT比色法检测了凝胶对黑素细胞增殖活力的影响收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入IOOuL,铺板使待测细胞密度为1000-10000/孔；24h 细胞贴壁后吸去培养基，实验组加入含卡波姆凝胶的培养基，空白组加入不含凝胶的培养基，每组设立4个复孔，分别于24h、4 !和72h测量细胞的增殖率，如图3所示，测试结果证实凝胶并不会损伤黑素细胞，这进一步肯定了这种新的载体涂布系统在临床应用上的优点及可行性。本发明的技术效果在于本发明公开的一种白癜风黑素细胞移植涂布载体系统的制备方法及其应用，通过使用含人粒细胞集落刺激因子G-CSF的黑素细胞培养基，使黑素细胞在体外大量增殖；并加以卡波姆凝胶与上述黑素细胞培养基构成一种涂布载体系统，卡波姆凝胶起到很好的固定作用，从而解决现有的黑素细胞移植过程中细胞悬液易流失的问题，减少黑素细胞的流失量，提高植入率并且不会对黑素细胞造成损伤，降低手术成本，在临床应用中，操作简单安全，为白癜风的治疗提供了新的途径。
图1是人粒细胞集落刺激因子G-CSF对黑素细胞促增殖作用的折线图。图2是本发明的培养基体外培养获得的大量黑素细胞的图片。图3是MTT法测定卡波姆940凝胶对黑素细胞增殖影响的柱状图。图4是本发明的涂布载体系统临床应用示意图。
具体实施例方式
下面对本发明的具体实施方式
作进一步详细的说明。
实施例1、(1)配制黑素细胞培养基取黑素细胞基础培养液(Hams F12) 100毫升(mL)，加入胎牛血清(FBS) IOmL,人粒细胞集落刺激因子G-CSF(商品名瑞白)200微升(yL)，浓度为100纳克/毫升(ng/mL) 的促黑素生成素α -MSH 100 μ L，异甲基黄嘌呤ΙΒΜΧ100 μ L，浓度为1. 5微克/毫升(μ g/ mL)的肾上腺素及维生素C混合液1. OmL,青霉素-链霉素溶液1. OmL,在4°C的冰箱中保存。(2)黑素细胞的体外培养供皮区常规消毒，无菌条件下获得自体皮肤样本；用磷酸盐缓冲液(PBQ洗净后加入0. 25%的胰蛋白酶-EDTA消化液9mL，置于37°C温箱中消化Hmin。用胎牛血清(1 1体积比)或含血清的培养基终止消化，吹打，获取细胞悬液；以 1400转/分(r/min)的转速离心5分钟，离心完毕弃去上清液，收集沉淀的黑素细胞，加入含G-CSF的黑素细胞培养基，置于细胞培养箱以37°C、5% C02、饱和湿度条件下孵育，每2 天更换1次黑素细胞培养基；根据黑素细胞生长和增殖情况，进行传代到6代，使细胞数量达到移植需要，收获黑素细胞悬液。(3)涂布载体系统的合成将卡波姆940凝胶分装至印pendorf管，常规高压灭菌处理18分钟。将无菌的卡波姆凝胶与黑素细胞悬液按1 5的体积比混和，用无菌吸头调勻制备成嗜喱状，即完成黑素细胞移植涂布载体系统的制备。实施例2、(1)配制黑素细胞培养基取黑素细胞基础培养液(Hams F12) 120毫升(mL)，加入胎牛血清(FBS) 12mL,人粒细胞集落刺激因子G-CSF(商品名瑞白)170微升(yL)，浓度为100纳克/毫升(ng/mL) 的促黑素生成素α-MSH 120 μ L，异甲基黄嘌呤IBMXl 10 μ L，浓度为1. 5微克/毫升(μ g/ mL)的肾上腺素及维生素C混合液0. 8mL，青霉素-链霉素溶液1. 2mL，在4°C的冰箱中保存。(2)黑素细胞的体外培养供皮区常规消毒，无菌条件下获得自体皮肤样本；用磷酸盐缓冲液(PBQ洗净后加入0. 25%的胰蛋白酶-EDTA消化液8mL，置于37°C温箱中消化lOmin。用胎牛血清(1 1体积比)或含血清的培养基终止消化，吹打，获取细胞悬液；以 1500转/分(r/min)的转速离心4分钟，离心完毕弃去上清液，收集沉淀的黑素细胞，加入含G-CSF的黑素细胞培养基，置于细胞培养箱以37°C、5% C02、饱和湿度条件下孵育，每2 天更换1次黑素细胞培养基；根据黑素细胞生长和增殖情况，进行传代到6代，使细胞数量达到移植需要，收获黑素细胞悬液。(3)涂布载体系统的合成将卡波姆940凝胶分装至印pendorf管，常规高压灭菌处理15分钟。将无菌的卡波姆凝胶与黑素细胞悬液按1 4的体积比混和，用无菌吸头调勻制备成嗜喱状，即完成黑素细胞移植涂布载体系统的制备。实施例3、
5
(1)配制黑素细胞培养基取黑素细胞基础培养液(Hams F12) 80毫升(mL)，加入胎牛血清(FBS) 8mL,人粒细胞集落刺激因子G-CSF(商品名瑞白)230微升(yL)，浓度为100纳克/毫升(ng/mL)的促黑素生成素α -MSH 80 μ L，异甲基黄嘌呤ΙΒΜΧ90 μ L，浓度为1. 5微克/毫升(μ g/mL) 的肾上腺素及维生素C混合液1. 2mL,青霉素-链霉素溶液0. 8mL，在4°C的冰箱中保存。(2)黑素细胞的体外培养供皮区常规消毒，无菌条件下获得自体皮肤样本；用磷酸盐缓冲液(PBQ洗净后加入0. 25%的胰蛋白酶-EDTA消化液10mL，置于37°C温箱中消化15min。用胎牛血清(1 1体积比)或含血清的培养基终止消化，吹打，获取细胞悬液；以 1500转/分(r/min)的转速离心4分钟，离心完毕弃去上清液，收集沉淀的黑素细胞，加入含G-CSF的黑素细胞培养基，置于细胞培养箱以37°C、5% C02、饱和湿度条件下孵育，每3 天更换1次黑素细胞培养基；根据黑素细胞生长和增殖情况，进行传代到6代，使细胞数量达到移植需要，收获黑素细胞悬液。(3)涂布载体系统的合成将卡波姆940凝胶分装至印pendorf管，常规高压灭菌处理20分钟。将无菌的卡波姆凝胶与黑素细胞悬液按1 6的体积比混和，用无菌吸头调勻制备成嗜喱状，即完成黑素细胞移植涂布载体系统的制备。实施例4、(1)配制黑素细胞培养基取黑素细胞基础培养液(Hams F12) 120毫升(mL)，加入胎牛血清(FBS) 12mL,人粒细胞集落刺激因子G-CSF(商品名瑞白)240微升(yL)，浓度为100纳克/毫升(ng/mL) 的促黑素生成素α -MSH 120 μ L，异甲基黄嘌呤ΙΒΜΧ120 μ L，浓度为1. 5微克/毫升(μ g/ mL)的肾上腺素及维生素C混合液1. 2mL，青霉素-链霉素溶液1. 2mL，在4°C的冰箱中保存。(2)黑素细胞的体外培养供皮区常规消毒，无菌条件下获得自体皮肤样本；用磷酸盐缓冲液(PBQ洗净后加入0. 25%的胰蛋白酶-EDTA消化液8mL，置于37°C温箱中消化lOmin。用胎牛血清(1 1体积比)或含血清的培养基终止消化，吹打，获取细胞悬液；以 1500转/分(r/min)的转速离心4分钟，离心完毕弃去上清液，收集沉淀的黑素细胞，加入含G-CSF的黑素细胞培养基，置于细胞培养箱以37°C、5% C02、饱和湿度条件下孵育，每2 天更换1次黑素细胞培养基；根据黑素细胞生长和增殖情况，进行传代到6代，使细胞数量达到移植需要，收获黑素细胞悬液。(3)涂布载体系统的合成将卡波姆940凝胶分装至印pendorf管，常规高压灭菌处理15分钟。将无菌的卡波姆凝胶与黑素细胞悬液按1 5的体积比混和，用无菌吸头调勻制备成嗜喱状，即完成黑素细胞移植涂布载体系统的制备。实施例5、(1)配制黑素细胞培养基
取黑素细胞基础培养液(Hams F12) 80毫升(mL)，加入胎牛血清(FBS) 8mL,人粒细胞集落刺激因子G-CSF(商品名瑞白)160微升(yL)，浓度为100纳克/毫升(ng/mL)的促黑素生成素α -MSH 80 μ L，异甲基黄嘌呤ΙΒΜΧ80 μ L，浓度为1. 5微克/毫升(μ g/mL) 的肾上腺素及维生素C混合液0. 8mL,青霉素-链霉素溶液0. 8mL,在4°C的冰箱中保存。(2)黑素细胞的体外培养供皮区常规消毒，无菌条件下获得自体皮肤样本；用磷酸盐缓冲液(PBQ洗净后加入0. 25%的胰蛋白酶-EDTA消化液10mL，置于37°C温箱中消化15min。用胎牛血清(1 1体积比)或含血清的培养基终止消化，吹打，获取细胞悬液；以 1500转/分(r/min)的转速离心4分钟，离心完毕弃去上清液，收集沉淀的黑素细胞，加入含G-CSF的黑素细胞培养基，置于细胞培养箱以37°C、5% C02、饱和湿度条件下孵育，每3 天更换1次黑素细胞培养基；根据黑素细胞生长和增殖情况，进行传代到6代，使细胞数量达到移植需要，收获黑素细胞悬液。(3)涂布载体系统的合成将卡波姆940凝胶分装至印pendorf管，常规高压灭菌处理20分钟。将无菌的卡波姆凝胶与黑素细胞悬液按1 6的体积比混和，用无菌吸头调勻制备成嗜喱状，即完成黑素细胞移植涂布载体系统的制备。将上述实施例中制备的黑素细胞移植涂布载体系统应用于白癜风黑素细胞移植术中，按如下步骤操作(如图4)患者皮肤1常规消毒后局部浸润麻醉，圆锥形磨削头装在磨削机钻接头上，以 3000-5000转/分(r/min)的转速将皮损处的表皮磨去，磨至真皮浅层点状出血为止，生理盐水纱布压迫止血；均勻涂抹上制备好的细胞嗜喱2 (黑素细胞移植涂布载体系统)，油纱布3(商品名曼纱灵)裁剪成适当大小(以磨削处面积为准)后覆盖在创面上，再用消毒纱布盖上5-10层常规包扎。临床试用效果选择稳定期患者13例45处皮片应用该涂布载体系统进行白癜风黑素细胞的自体移植，术后2周随访，患者均无红肿等炎症反应，13例患者中有11例患者的 39处皮片有色素出现，随访1月 6月，色素持续存在，证实这种安全、简便、低成本的载体涂布系统在黑素细胞移植手术应用中取得了良好疗效，为白癜风的治疗提供了新的途径。
权利要求
1.一种白癜风黑素细胞移植涂布载体系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤(1)配置黑素细胞培养基取黑素细胞基本培养液HamsF1280 120份，加入胎牛血清FBS 8 12份，人粒细胞集落刺激因子G-CSF 0. 16 0. 24份，100ng/ml的促黑素生成素α -MSH 0. 08 0. 12份，异甲基黄嘌呤ΙΒΜΧ0. 08 0. 12份，1. 5ug/ml的肾上腺素及维生素C混合液0. 8 1. 2份，青链双抗霉素0. 8 1. 2份，在4°C的冰箱中保存；(2)黑素细胞的体外培养①无菌条件下获得自体皮肤样本，清洗后用0.25%的胰蛋白酶-EDTA消化液在37°C条件下消化IOmin 15min ；②终止消化，获取细胞悬液，离心，弃上清，收集沉淀黑素细胞，加入上述黑素细胞培养基，置于细胞培养箱以37°C、5% C02、饱和湿度条件下孵育；每2 3天更换1次上述黑素细胞培养基；③根据黑素细胞生长和增殖情况，进行传代5 6代即可完成体外培养，制成黑素细胞悬液；(3)涂布载体系统的合成以卡波姆940凝胶为涂布载体，卡波姆940凝胶常规高压灭菌处理，按1 4 6的体积比加至黑素细胞悬液，并均勻混合至嗜喱状。
2.按照权利要求1所述的白癜风黑素细胞移植涂布载体系统的制备方法，其特征在于所述黑素细胞培养基的优选组份为黑素细胞基本培养液HamsF12 100份，胎牛血清 FBS 10份，人粒细胞集落刺激因子G-CSF 0. 20份，lOOng/ml的促黑素生成素α-MSH 0. 10 份，异甲基黄嘌呤IBMX 0. 10份，1. 5ug/ml的肾上腺素及维生素C混合液1. 0份，青链双抗霉素1.0份。
3.—种权利要求1所述的白癜风黑素细胞移植涂布载体系统的应用，其特征在于在无菌条件下磨削皮肤白斑至点状出血，均勻涂抹上述白癜风黑素细胞移植涂布载体系统， 以油纱布覆盖，常规包扎。
全文摘要
本发明涉及一种白癜风黑素细胞移植涂布载体系统的制备方法，以黑素细胞基本培养液Hams F12、胎牛血清、人粒细胞集落刺激因子、促黑素生成素、异甲基黄嘌呤、肾上腺素及维生素C混合液、青链双抗霉素配置黑素细胞培养基，用于自体黑素细胞的体外培养，并以卡波姆凝胶与上述黑素细胞培养基构成一种涂布载体系统。本发明通过使用含人粒细胞集落刺激因子G-CSF的黑素细胞培养基，使黑素细胞在体外大量增殖；卡波姆凝胶起到很好的固定作用，从而解决现有的黑素细胞移植过程中细胞悬液易流失的问题，减少黑素细胞的流失量，提高植入率并且不会对黑素细胞造成损伤，降低手术成本，在临床应用中，操作简单安全，为白癜风的治疗提供了新的途径。
文档编号C12N5/071GK102266586SQ201110175730
公开日2011年12月7日 申请日期2011年6月28日 优先权日2011年6月28日
发明者吴迪, 周梅华, 朱文元, 李雪, 鲁严 申请人:江苏省人民医院