专利名称：一种发酵制备花生抗氧化肽的方法
技术领域：
本发明涉及一种发酵制备花生抗氧化肽的方法，属于食品蛋白加工领域。
背景技术：
随着自由基生命科学研究的不断进展，氧化应激损伤和抗氧化保护作用的研究受到了人们的日益关注。严重的氧化应激状态下，当活性氧的浓度超过细胞防御能力时，氧化损伤就可改变细胞的结构和功能，影响机体健康。同样，食品是一系列复杂的体系，过多的自由基存在也会严重影响体系的稳定性。现代食品工业的发展表明，通过添加具有抗氧化活性物质的方法可以增加食品体系的稳定性。随着营养学和生物技术的发展，人们发现介于蛋白质和氨基酸间的肽类，由于其特殊的结构特点，食用安全性更高，抗氧化活性更为显著，亦可归属于抗氧化剂，作为人体内清除自由基的物质来源。目前，酶解法制备抗氧化肽主要有两种工艺技术蛋白酶酶解法和发酵法。蛋白酶酶解法反应条件温和，可得到一定分子量范围的抗氧化肽产品，现在主要使用的方法是蛋白酶酶解法，但由于酶的底物专一性和酶的空间构象的限制，使得蛋白酶酶解法只能利用分离蛋白作为底物，增加了操作成本。发酵法利用微生物生长繁殖时能产生蛋白酶的原理，直接将微生物与原料混合一起进行发酵，省去了提取分离蛋白的步骤。此外，微生物除了产生蛋白酶外，还能产生纤维素酶、植酸酶等，可以分解细胞壁，有利于蛋白与蛋白酶的活性位点结合，提高水解效率，增加酶解产物的抗氧化活性，降低生产成本，但发酵法在动物血清蛋白抗氧化肽制备中有报道，在植物特别是花生抗氧化肽提取中仍未见报道。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种操作简便、反应条件温和，可连续化生产具有较好抗氧化活性的花生抗氧化肽的发酵制备方法。花生蛋白质含量为25 36%，其生物价为58，蛋白质效价为1:7，含18种氨基酸， 包括8种必需氨基酸，研究表明，蕴藏在花生蛋白质肽链中的一些短肽具有抗氧化活性。由于枯草芽孢杆菌能产蛋白酶，黑曲霉能产蛋白酶、纤维素酶和植酸酶，米曲霉能产蛋白酶和纤维素酶，本发明拟采用枯草芽孢杆菌、黑曲霉和米曲霉的混合菌种作为发酵菌种，通过固体发酵或液体发酵方法制备花生抗氧化肽，以提高酶解效率和抗氧化肽的抗氧化活性，为花生抗氧化肽的开发提供新途径。为达到上述目的，本发明采用以下步骤
低变性脱脂花生蛋白粉加入蒸馏水，搅拌均勻，超声波分散溶解，调节PH值，灭菌，冷却；接入菌种种子培养液，发酵培养；超声波辅助酶解，灭酶，离心，上清液冷冻干燥得到花生抗氧化肽。具体来说，所述的方法如下
(1)低变性脱脂花生蛋白粉中加入蒸馏水，玻璃棒搅拌均勻，超声波分散溶解，调节PH值，灭菌，冷却；
(2)接入菌种种子培养液，固体发酵或液体发酵培养，得到发酵物；
(3)发酵物经超声波辅助酶解，灭酶，离心，上清液冷冻干燥得到花生抗氧化肽。优选地，步骤(1)所述的低变性脱脂花生蛋白粉加入蒸馏水6. 5ml/g原料(固体发酵)，19. 5ml/g原料(液体发酵)，超声波分散溶解条件超声波功率为300w，超声波频率为^kHz,温度为25°C，时间为15min，用浓度为1. Omol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至 6. 5 7. 5，高压灭菌锅内121°C灭菌15min。优选地，步骤(2)所述的菌种种子培养液为枯草芽孢杆菌、黑曲霉和米曲霉的混合种子培养液，接入量为22.5% (固体发酵)，6.5% (液体发酵)，枯草芽孢杆菌、黑曲霉和米曲霉的菌龄分别为妨h、70h和38h，混合种子培养液中它们的比例为枯草芽孢杆菌黑曲霉 米曲霉=1. 8:1. 4:1.8,固体发酵条件为温度31. 5°C，培养箱中静置培养34h，液体发酵条件为温度34. 5°C，以65r/min转速，摇瓶振荡培养36h。优选地，步骤(3)所述的发酵物经超声波辅助酶解的方法是固体发酵物加入 l(Tl5ml/g原料的蒸馏水后超声波辅助酶解，而液体发酵物直接超声波辅助酶解，超声波辅助酶解的条件超声波功率为180w，超声波频率为^kHz,温度为48. 5°C，时间为22. 5min, 灭酶的条件为100°C恒温水浴中灭酶18min，离心条件为12°C，6500r/min转速离心12min。本发明的有益效果在于本发明制备的花生抗氧化肽产品具有清除羟自由基、超氧阴离子自由基、DPPH自由基、对羟自由基介导脱氧核糖损伤的抑制作用、铁还原力、钼还原力、铁离子螯合能力、铜离子螯合能力、抑制脂质体过氧化活性、抗亚油酸体系氧化作用、 抗油脂过氧化能力等体外抗氧化活性，可以作为功能食品用于清除体内自由基、预防和辅助治疗现代文明病，也可以作为天然抗氧化剂用在食品的贮藏和保鲜中，延长食品货架期； 发酵制备花生抗氧化肽的方法反应条件温和，环境友好，可大批量连续化生产，为花生抗氧化肽的开发提供了新的途径。
具体实施例方式实施例1
低变性脱脂花生蛋白粉加入蒸馏水6. 5ml/g原料，玻璃棒搅拌均勻，以超声波功率为 300w，超声波频率为^kHz,温度为25°C的条件，超声分散溶解15min，得到花生蛋白粉糊状物，用浓度为1. Omol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至6. 86，在高压灭菌锅内，121°C灭菌 15min，冷却至室温；取菌龄分别为46h、70h和38h的枯草芽孢杆菌、黑曲霉和米曲霉，在花生蛋白粉糊状物中接入以枯草芽孢杆菌黑曲霉米曲霉=1. 8:1. 4:1. 8比例混合的种子培养液，接入量为22. 5%，在培养箱中，以温度31. 5°C，静置固体发酵培养34h，得到固体发酵物；在固体发酵物中加入12. 5ml/g原料的蒸馏水，在超声波功率为180w，超声波频率为 ^kHz,温度为48. 5°C的条件下，超声波辅助酶解22. 5min ；在100°C恒温水浴中灭酶18min， 冷却到室温，在12°C条件下，6500r/min转速离心12min，取上清液冷冻干燥得到花生抗氧化肽。该抗氧化肽的抗氧化活性如下清除羟自由基的IC5tl值为0. 35mg/mL，清除超氧阴离子自由基的IC5tl值为1. 47mg/mL,清除DPPH自由基的IC5tl值为1. 39mg/mL,对羟自由基介导脱氧核糖损伤的抑制作用的IC5tl值为0. 53mg/mL，铁还原力的吸光值为0. 5时所需花生抗氧化肽的浓度为4. Hmg/mL，钼还原力的吸光值为0. 5时所需花生抗氧化肽的浓度为1. 26mg/mL，铁离子螯合力的IC5tl值为1. 71mg/mL，铜离子螯合力的IC5tl值为1. 48mg/mL，抑制脂质体过氧化活性的IC5tl值为1. 82mg/mL，抗亚油酸体系氧化作用的IC5tl值为2. 06mg/mL，抗油脂过氧化能力的IC5tl值为2. 13mg/mL。实施例2
低变性脱脂花生蛋白粉加入蒸馏水6. 5ml/g原料，玻璃棒搅拌均勻，以超声波功率为 300w，超声波频率为^kHz,温度为25°C的条件，超声分散溶解15min，得到花生蛋白粉糊状物，用浓度为l.Omol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至6. 62，在高压灭菌锅内，121°C灭菌 15min，冷却至室温；取菌龄分别为46h、70h和38h的枯草芽孢杆菌、黑曲霉和米曲霉，在花生蛋白粉糊状物中接入以枯草芽孢杆菌黑曲霉米曲霉=1. 8:1. 4:1. 8比例混合的种子培养液，接入量为22. 5%，在培养箱中，以温度31. 5°C，静置固体发酵培养34h，得到固体发酵物；在固体发酵物中加入14. 5ml/g原料的蒸馏水，在超声波功率为180w，超声波频率为 ^kHz,温度为48. 5°C的条件下，超声波辅助酶解22. 5min ；在100°C恒温水浴中灭酶18min， 冷却到室温，在12°C条件下，6500r/min转速离心12min，取上清液冷冻干燥得到花生抗氧化肽。该抗氧化肽的抗氧化活性如下清除羟自由基的IC5tl值为0. 57mg/mL，清除超氧阴离子自由基的IC5tl值为0. 98mg/mL,清除DPPH自由基的IC5tl值为1. 02mg/mL,对羟自由基介导脱氧核糖损伤的抑制作用的IC5tl值为0. 42mg/mL，铁还原力的吸光值为0. 5时所需花生抗氧化肽的浓度为2. 46mg/mL，钼还原力的吸光值为0. 5时所需花生抗氧化肽的浓度为0. 99mg/ mL，铁离子螯合力的IC5tl值为1. 2%ig/mL，铜离子螯合力的IC5tl值为1. llmg/mL，抑制脂质体过氧化活性的IC5tl值为1. 43mg/mL，抗亚油酸体系氧化作用的IC5tl值为1. 08mg/mL，抗油脂过氧化能力的IC5tl值为1. ^mg/mL。实施例3
低变性脱脂花生蛋白粉加入蒸馏水19. 5ml/g原料，玻璃棒搅拌均勻，以超声波功率为 300w，超声波频率为^kHz,温度为25°C的条件，超声分散溶解15min，得到花生蛋白粉悬浮液，用浓度为l.Omol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至7.观，在高压灭菌锅内，121°C灭菌 15min，冷却至室温；取菌龄分别为46h、70h和38h的枯草芽孢杆菌、黑曲霉和米曲霉，在花生蛋白粉糊状物中接入以枯草芽孢杆菌黑曲霉米曲霉=1. 8:1. 4:1. 8比例混合的种子培养液，接入量为6. 5%，在摇床中，以温度34. 5°C，摇瓶液体发酵培养36h，得到液体发酵物； 取液体发酵物，在超声波功率为180w，超声波频率为^kHz,温度为48. 5°C的条件下，超声波辅助酶解22. 5min ；在100°C恒温水浴中灭酶18min，冷却到室温，在12°C条件下，6500r/ min转速离心12min，取上清液冷冻干燥得到花生抗氧化肽。该抗氧化肽的抗氧化活性如下清除羟自由基的IC5tl值为0. 17mg/mL,清除超氧阴离子自由基的IC5tl值为0. 49mg/mL, 清除DPPH自由基的IC5tl值为0. 61mg/mL，对羟自由基介导脱氧核糖损伤的抑制作用的IC5tl 值为0. 33mg/mL，铁还原力的吸光值为0. 5时所需花生抗氧化肽的浓度为1. 09mg/mL，钼还原力的吸光值为0. 5时所需花生抗氧化肽的浓度为0. 65mg/mL，铁离子螯合力的IC5tl值为0. 58mg/mL,铜离子螯合力的IC5tl值为0. 43mg/mL,抑制脂质体过氧化活性的IC5tl值为 0. 41mg/mL，抗亚油酸体系氧化作用的IC5tl值为0. 75mg/mL，抗油脂过氧化能力的IC5tl值为 0. 28mg/mL。
权利要求
1.一种发酵制备花生抗氧化肽的方法，包括以下步骤(1)低变性脱脂花生蛋白粉中加入蒸馏水，玻璃棒搅拌均勻，超声波分散溶解，调节PH 值，灭菌，冷却；(2)接入菌种种子培养液，固体发酵或液体发酵培养，得到发酵物；(3)发酵物经超声波辅助酶解，灭酶，离心，上清液冷冻干燥得到花生抗氧化肽。
2.根据权利要求1所述的发酵制备花生抗氧化肽的方法，其特征在于，步骤(1)所述的低变性脱脂花生蛋白粉加入蒸馏水6. 5ml/g原料(固体发酵)，19. 5ml/g原料(液体发酵)，超声波分散溶解条件超声波功率为300w，超声波频率为^kHz,温度为25°C，时间为15min， 用浓度为l.Omol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至6. 5 7. 5，高压灭菌锅内121°C灭菌15min。
3.根据权利要求1所述的发酵制备花生抗氧化肽的方法，其特征在于，步骤(2)所述的菌种种子培养液为枯草芽孢杆菌、黑曲霉和米曲霉的混合种子培养液，接入量为22. 5% (固体发酵)，6. 5% (液体发酵)，枯草芽孢杆菌、黑曲霉和米曲霉的菌龄分别为妨h、70h和38h， 混合种子培养液中它们的比例为枯草芽孢杆菌黑曲霉米曲霉=1. 8:1. 4:1. 8，固体发酵条件为温度31. 5°C，培养箱中静置培养34h，液体发酵条件为温度34.5°C，以65r/min转速，摇瓶振荡培养36h。
4.根据权利要求1所述的发酵制备花生抗氧化肽的方法，其特征在于，步骤(3)所述的发酵物经超声波辅助酶解的方法是固体发酵物加入l(Tl5ml/g原料的蒸馏水后超声波辅助酶解，而液体发酵物直接超声波辅助酶解，超声波辅助酶解的条件超声波功率为180w， 超声波频率为^kHz,温度为48. 5°C，时间为22. 5min，灭酶的条件为100°C恒温水浴中灭酶 18min，离心条件为12°C，6500r/min转速离心12min。
全文摘要
本发明公开了一种发酵制备花生抗氧化肽的方法，包括以下步骤低变性脱脂花生蛋白粉加入蒸馏水，超声波分散溶解，调节pH值，灭菌，冷却；接入菌种种子培养液，发酵培养；超声波辅助酶解，灭酶，离心，上清液冷冻干燥得到花生抗氧化肽。以本发明制得的花生抗氧化肽产品具有清除羟自由基、超氧阴离子自由基、DPPH自由基、对羟自由基介导脱氧核糖损伤的抑制作用、铁还原力、钼还原力、铁离子螯合能力、铜离子螯合能力、抑制脂质体过氧化活性、抗亚油酸体系氧化作用、抗油脂过氧化能力等抗氧化活性，操作简便，反应条件温和，适合工业化生产。
文档编号C12P21/06GK102286601SQ201110229979
公开日2011年12月21日 申请日期2011年8月11日 优先权日2011年8月11日
发明者于丽娜, 孙杰, 张会翠, 张初署, 朱凤, 杨庆利, 毕杰 申请人:山东省花生研究所