光可断裂的标记核苷酸和核苷与标记的核苷酸和核苷以及其在dna测序中的使用方法

专利名称：光可断裂的标记核苷酸和核苷与标记的核苷酸和核苷以及其在dna测序中的使用方法
技术领域：
本发明一般涉及用于DNA测序和其它类型DNA分析的化合物和方法。更具体而言， 本发明涉及利用光可断裂基团标记的核苷酸和核苷、利用不可断裂基团标记的核苷酸和核苷以及其在DNA测序和分析中的使用方法。
背景技术：
快速DNA测序方法已经成为分析种群中疾病和突变以及开发治疗方法的需求。最常观察到的人序列变异形式是单核苷酸多态性(SNP)，其以大约1/300至1/1000个基因组序列碱基对而存在。基于人基因组全序列，正在努力通过绘制SNP谱或直接关联来确认成为常见疾病原因的基因关联。基于快速、高通量和低成本的DNA测序技术的开发将促进对遗传信息(例如SNP)在应用医学中的理解和应用。一般而言，10% -15%的SNP将通过改变特定氨基酸残基来影响蛋白质功能、通过改变剪切机制来影响对基因的适当加工、或者通过改变调节机制来影响基因或蛋白质的正常表达水平。设想信息性SNP的鉴定将导致对遗传病的更准确诊断、对风险易感性的更好预测、或对组织中偶发性突变的识别。个体SNP特性的一个应用将是利用预防性药物治疗来显著延迟疾病的发生或进展。此外，药物代谢基因的SNP特性可用于制定具体的给药方案以提供更安全和更有效的结果。为实现这些宏大的目标，基因组测序将进入具有对大多数种群进行部分测序可能性的重测序(resequencing)阶段，其将涉及对特定区域或分布在整个人类基因组中的单碱基对进行平行测序以获得特定复杂疾病的SNP特性。成为大多数常见疾病原因的序列变异很可能与分散在全部相关基因中并以低频率存在的多个SNP有关。因此，与仅靶向已知SNP的技术相比，利用从头测序策略的DNA测序技术更可能检测和/或发现这些少见的、广泛分布的变异体。传统上，通过“Sanger”法或“双脱氧”法实现DNA测序，其包括通过利用DNA聚合酶引入2，，3，-双脱氧核苷酸(ddNTP)的DNA合成的链终止(Sanger, F.，Nicklen, S.，and Coulson, A. R. (1977)DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467) 所述反应还包括天然2，-脱氧核苷酸(dNTP)，其通过DNA 合成扩增DNA链。链扩增与链终止之间的大体平衡的竞争导致形成一系列套式DNA(nested DNA)片段，其均勻地分布在数以千计的碱基中并且在碱基对增长尺寸方面不同。利用电泳根据套式DNA片段的各自尺寸对其进行拆分。测序反应中的dNTP/ddNTP比决定链终止的频率，并因此决定终止链的长度分布。然后，当利用合适的激光源照射时，通过之前的4种不同荧光团与4种DNA碱基(即A、C、G和T)的结合发出其各自颜色的荧光来检测所述片段。目前，Srnger 测序通过直接 PCR 测序(Gibbs，R. Α·，Nguyen，P. -N.，McBride，LJ.， Koepf, S. M.，and Caskey, C. Τ. (1989) Identification of mutations leading to the Lesch-Nyhan syndrome by automated direct DNA sequencing of in vitro amplified cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86，1919-1923)或基因组测序(Hunkapiller，Τ.，Kaiser, R. J.，Koop，B. F.，and Hood, L. (1991) Large-scale and automated DNA sequencing Determination.Science 254，59—67 ；International Human Genome Sequencing Consortium. Initial sequencing and analysis of the human genome. (2001)Nature 409,860-921)已经成为用于发现SNP的最广泛应用的方法。另一种具有前景的测序方法是周期可逆终止(CRT)，其为一种测多模板的同步单个碱基加成的周期性方法。该方法本身与Sanger法(Metzker，M.L. (2005)Genome Rex 15， 1767-1776)的不同之处在于其可不需要凝胶电泳(其为推进该领域的主要瓶颈)而进行。 然而，与Sanger测序相似，读取长度较长意味着需要较少次测序试验来覆盖整个基因组。仍然难于实现长CRT读取的目标，因为利用可商购的DNA聚合酶，可逆的终止子通常起到弱底物的作用。利用3’-0_阻滞基团和通过连接基团与荧光染料结合的核碱基构成可逆的终止子。在随后的碱基加成之前，阻滞基团和染色基团均需要除去。这些核苷酸修饰不能良好地耐受DNA聚合酶，这可通过多种策略进行突变来提高酶性能。脱保护时，将核碱基连接物置于一边，随着其后的CRT循环，在生长中的DNA双螺旋中进行依次累积。据信弱的酶动力学和随后修饰的DNA双螺旋限制了较长的读取长度。本发明部分地描述了需要终止部分和荧光染色部分的单一结合来提高酶动力学和脱保护效率的新的可逆核苷酸结构。 这些可逆终止子通过多种可商购的DNA聚合酶而被有效地引入，所述生长中的DNA双螺旋通过脱保护步骤转变为其天然状态。CRT技术的DNA测序读取长度由每个核苷酸加成循环的总效率所决定。例如，如果认为50%原始材料的终点具有可接受的信噪比，那么下述等式可用于评价循环效率对读取长度的作用(RL广eff = 0.5，其中RL是碱基的读取长度，CefT是总循环效率。换句话说，可以通过90%的总循环效率实现7个碱基的读取长度，通过99%的循环效率实现70个碱基的读取长度，可通过99. 9%循环效率实现700个碱基的读取长度。为实现对大长度测序的目标，所述方法必须提供非常高的循环效率或者所述恢复可降至可接受的信噪比以下。表现出较高引入效率和脱保护效率的可逆终止子将实现较高的循环效率，因而实现较大的读取长度。为使CRT终止子适当地起作用，必须在温和条件下有效地断裂掉所述保护基。保护基的除去通常涉及利用强酸或强碱、催化或化学还原的处理，或者这些方法的组合。这些条件对于所述DNA聚合酶、核苷酸、寡核苷酸引物模板、或固体载体而言可能是反应活性的，产生不希望的结果。使用光化学保护基是一种有吸引力的替代强烈化学处理的方法，并且可以非侵入方式进行使用。已有多种光可除去的保护基(例如2-硝基苄基、苄氧基羰基、3-硝基苯基、苯甲酰甲基、3，5-二甲氧基苯偶姻基(3，5-dimeth0Xybenz0inyl)、2，4-二硝基苯硫基及其各自的衍生物)被用于合成肽、多糖和核苷酸(Pillai，V. N. R. (1980)Photoremovable Protecting Groups in Organic Synthesis. Synthesis, 1-26)。在这些保护基中，光敏感的2-硝基苄基保护基已成功用于以下的基团用于二核糖核苷合成的核糖核苷的2' -0H(0htsuka, Ε.，Tanaka, S.禾口 Ikehara，Μ· (1974)Studies on transfer ribonucleic acids and related compounds. IX(I)Ribooligonucleotide synthesis using a photosensitive o-nitrobenzyl protection at the2 ' -hydroxy1 group. Nucleic Acids Res. 1,1351-1357),自动化核酶合成中的核苷亚磷酰胺(ribophosphoramidite) 的 2，-0H(Chaulk，S. G.禾口 MacMi1lan，A. M. (1998)Caged RNA :photo-control of a ribozyme. Nucleic Acids Res. 26,3173-3178)、Affymetrix 化学中用于寡核苷酸合成的亚磷酰胺的 3，-OH(Pease, Α. C, Solas, D.，Sullivan, Ε. J.，Cronin, Μ. Τ.，Holmes, C. P.禾口 Fodor, S. P. Α. (1994)Light-generated oligonucleotide arrays for rapid DNA sequence analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91，5022-5026)以及用于 DNA 测 jS M 的 3’ -OH(Metzker, Μ. L. ， Raghavacharl, R. ， Richards, S. ， Jacutin, S. Ε.， Civitello, Α. , Burgess, K.禾口 Gibbs, R. Α. (1994)Termination of DNA synthesis by novel 3 ' -modified deoxyribonucleoside triphosphates. Nucleic Acids Res. 22, 4259-M67)。在脱保护条件(紫外线> 300nm)下，可以在不影响嘧啶或嘌呤碱基的情形下有效地断裂 2-硝基苄基(Pease，Α. C，Solas, D.，Sullivan, Ε. J.，Cronin, Μ. Τ.，Holmes，
C.P.禾口Fodor，S.P. Α. (1994)Light-generated oligonucleotide arrays for rapid DNA sequence analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91,5022-5026) VXR (Bartholomew,
D.G.禾口Broom，A.D. (1975)One-step Chemical Synthesis of Ribonucleosides bearing a Photolabile Ether Protecting Group. J. Chem. Soc. Chem. Commun.，38)0在当今跨越不同研究部门(包括比较基因组学和进化学、法医学、流行病学、以及用于诊断和治疗的应用医学)的应用下，对于开发新的测序技术的需求从来没有这样强烈过。对于在人序列变异研究中的广泛应用而言，目前的测序技术太昂贵、费力且耗时。基因组中心的成本是基于每1，000个( 2(ι碱基的美元数来计算的，并且通常可分成仪器、人员、 试剂、材料以及管理花费等类别。目前，这些中心以不到1美元/1，000个Q2tl碱基进行运作，其中至少50%的成本单独由DNA测序仪器产生。对于新的检测方法、仪器小型化、微流体分离技术的开发以及每次运行的试验数的增加将最有可能对降低成本产生最大的影响。因此，本发明的一个目的是提供可用于在高通量测序反应中对基因组信息进行有效测序的新化合物。本发明的另一个目的是提供新的试剂和试剂组合，所述新的试剂和试剂组合可以有效并可买得起的方式提供基因组信息。本发明的又一个目的是提供用于诊断方法和用于开发针对个体的靶向治疗剂的试剂的文库和阵列。

发明内容
光可断裂的标记核苷酸和核苷本发明提供了可用在DNA测序技术中的核苷化合物及其磷酸酯和盐。所述化合物任选地是核糖核苷三磷酸(NTP)和脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)化合物的形式。所述核苷酸和核苷化合物包含利用荧光染料标记的光可断裂基团。所述包含光可断裂保护基的核苷酸和核苷化合物被设计成终止DNA合成然后有效断裂，使得可以平行模式对所述核酸寡聚体进行快速测序。所述核苷酸和核苷化合物上这种利用荧光染料标记的可断裂基团的存在可提高对大的DNA寡聚体进行平行测序的速度和准确度，以使得可进行例如对整个基因组的快速测序以及对多态性和其它有价值遗传信息的鉴定。提供了含有核碱基腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或其天然存在的衍生物的多种核苷酸和核苷化合物，其包含可断裂基团和/或可被衍生化而包含可检测的标记物(例如染料)。在一个实施方案中，所述核苷的碱基与2-硝基苄基共价连接，所述2-硝基苄基的 α碳位置任选地被本文中所述的一个烷基或芳基取代。所述2-硝基苄基可被官能化以提高终止性能和光催化的脱保护速率。即使在核糖上的3’ -OH基未被封闭时，与所述核碱基相连的2-硝基苄基或α碳被取代的2-硝基苄基的终止性能仍然存在。这些3’ -OH基未封闭的终止子可良好耐受多种可商购的DNA聚合酶，这代表了优于3’-0封闭的终止子的一个关键优点。所述α碳被取代的2-硝基苄基还可被衍生化而包含所选的荧光染料。
在一个实施方案中，所述核苷的碱基与2-硝基苄基共价连接，所述2-硝基苄基任选地被本文中所述的供电子和吸电子基团中的一种或多种所取代。所述2-硝基苄基可被官能化以提高光催化脱保护的速度。所述2-硝基苄基还可被衍生化而包含可检测的荧光染料。具体而言，通过利用2-硝基苄基修饰的四种核苷三磷酸化合物和本文所述的利用不同荧光染料标记的衍生物的组合，提供了用于DNA测序的方法，其可用于鉴别所引入的碱基以揭示作为其基础的DNA序列。标记的核苷酸和核苷还提供了可用在DNA测序技术中的核苷化合物及其磷酸酯和盐。所述化合物任选地是核糖核苷三磷酸(NTP)和脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)化合物的形式。所述核苷酸和核苷化合物包含利用荧光染料标记的不可断裂基团。所述核苷酸和核苷化合物被设计成终止DNA合成，使得可以平行模式对核酸寡聚体进行快速测序。提供了含有核碱基腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或其天然存在的衍生物的多种核苷酸和核苷化合物，其可被衍生化而包含可检测的标记物(例如染料)。在一个实施方案中，所述核苷的碱基与苄基共价连接，所述苄基的α碳位置任选地被本文中所述的一种烷基或芳基所取代。所述苄基可被官能化以提高终止性能。即使在核糖上的3’_0Η基未被封闭时，与核碱基相连接的任选地α碳被取代的苄基的终止性能仍然存在。这些3’ -OH基未封闭的终止子可良好耐受多种可商购的DNA聚合酶，这代表了优于3’ 0封闭的终止子的一个关键优点。所述连接基团还可被衍生化而包含所选的荧光染料。具体而言，通过利用不可断裂的终止基团修饰的四种核苷三磷酸化合物和本文所述的利用不同荧光染料标记的衍生物的组合，提供了用于DNA测序的方法，其可用于鉴别所引入的碱基以揭示作为其基础的DNA序列。
具体实施例方式光可断裂标记的核苷酸和核苷本发明提供了可用在快速DNA测序技术中的核苷酸和核苷化合物及其盐、酯和磷酸酯。所述化合物任选地是核糖核苷三磷酸(NTP)和脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)化合物的形式。在一个实施方案中，所述核苷酸和核苷化合物包含利用荧光染料标记的光可断裂基团。所述核苷酸和核苷化合物包含被设计成终止DNA合成以及快速断裂的光可移除保护基，使得这些单体可用于以平行模式快速测序。所述核苷酸和核苷化合物上这种利用荧光染料标记的可快速断裂基团的存在可提高大的DNA寡聚体的平行测序的速度和准确度，以使得可以例如对整个基因组进行快速测序以及鉴定多态性和其它有价值的遗传信息。提供了包含核碱基腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或其天然存在的衍生物的多种核苷酸和核苷化合物，其包含可断裂基团和/或可被衍生化而包含可检测的标记物(例如染料)。在一个实施方案中，所述核碱基腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或其天然存在的衍生物可与光可除去的保护基如2-硝基苄基共价连接。所述2-硝基苄基可被衍生化以提高其对DNA合成的终止以及脱保护速度，因此增强了其在DNA测序中的用途。还可利用荧光染料通过与光可除去的保护基共价连接而对所述光可除去的保护基(例如2-硝基苄基)进行衍生化。I.光可断裂的标记核苷酸和核苷化合物用于测序的优点提供了可用于DNA测序技术的核苷酸和核苷化合物。循环可逆终止(CRT)是一种检测多个模板的同步、单个碱基加成的周期性方法。该方法本身与Sanger法的不同之处在于其可以在不需要凝胶电泳和高度平行的模式下(其为推进该领域的主要瓶颈)进行，。 然而，与Sanger测序相似，较长读取长度意味着需要较少次测序试验来需要覆盖整个基因组。所述CRT循环包括三个步骤引入、成像和脱保护。对于该过程而言，循环效率、循环时间和灵敏度是重要的因素。循环效率是脱保护和引入效率的结果，并且决定了 CRT读取长度。CRT循环时间是引入、成像和脱保护时间的总和。对于针对整个基因组测序的快速CRT 而言，可使用本文所公开的可表现出快速和有效的脱保护性能的核苷酸和核苷化合物。这些化合物可利用荧光染料进行标记，直接与2-硝基苄基相连，从而提供具有相似脱保护性能的荧光可逆终止子。CRT技术的读取长度由每个核苷酸加成循环、脱保护和引入效率的结果的总效率决定。例如，如果认为50%原始材料的终点具有可接受的信噪比，那么下述等式可用于评价循环效率对读取长度的作用(RL)Ceff = 0. 5其中RL是碱基的读取长度，Ceff是总循环效率。换句话说，可以通过90%的总循环效率实现7个碱基的读取长度，可通过99%的循环效率实现70个碱基的读取长度，可通过99. 9%循环效率实现700个碱基的读取长度。本发明化合物的引入效率可以为引入类似的天然核苷的约70%至约100%。优选地，所述引入效率为约85%至约100%。光可断裂的效率优选为约85%至约100%。此外，当引入本发明化合物时，核酸延伸的终止为约90% 至约100%。在一个实施方案中，核苷酸和核苷化合物的循环效率为至少80% ,90^^91%、 92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,99. 1 %,99. 2 %,99. 3 %,99. 4 %,99. 5 %, 99. 6%、99. 7%、99. 8%或99. 9%。当用于基因组DNA时，可将所述化合物用在CRT中以直接由基因组DNA进行读取。片段基因组DNA可与含有横跨所选染色体的引发位点的高密度寡核苷酸芯片进行杂交。通过CRT法的所评估的读取长度来分离每个引发序列。在两次碱基加成之间，荧光成像仪可同时对整个高密度芯片成像，评价在速度和灵敏度方面的提高。 通过紫外照射除去本文所述的与所述2-硝基苄基相连的荧光团或其衍生物，释放出2-硝基苄基用于下一轮的碱基加成。然后在大约500个CRT循环后，可将所述完全的且不间断
21的基因组序列信息与参比人基因组相比较，以确认单个样品中序列变异的程度和类型。II.光可断裂的标记核苷酸和核苷化合物本发明提供了多种核苷以及其单磷酸酯、二磷酸酯和三磷酸酯化合物。所述化合物可用于DNA测序技术。在一个实施方案中，所述核苷酸和核苷化合物包含利用荧光染料标记的光可断裂的终止基团，所述荧光染料可在CRT反应中被检测到并有效断裂。所述核苷酸和核苷化合物可转化成其各自的天然核苷单磷酸酯用于随后的DNA聚合酶反应。在一个具体实施方案中，提供了含有脱氧核糖或核糖和碱基的核苷酸和核苷化合物，其中所述碱基与光可断裂的终止基团2-硝基苄基共价连接。所述2-硝基苄基可被提高DNA合成终止和脱保护速度的基团所取代。此外，所述2-硝基苄基可通过与报告物基团(例如染料) 相连而可被检测。所述染料可任选地通过双官能团连接物与2-硝基苄基相连。本发明的化合物可通过下式表示
权利要求
1.下式的化合物
2.权利要求1的化合物，其中所述终止部分是光可断裂的。
3.权利要求1的化合物，其中所述终止部分是光不可断裂的。
4.权利要求1的化合物，其进一步限定为选自下列的化合物式I 式II
5.权利要求4的化合物，其中&是NO2,R3和R4至少之一是H。
6.权利要求4的化合物，其中&不是NO2。
7.权利要求5或6的化合物，其中R5、R6和R7之一是下述结构的基团
8.权利要求5或6的化合物，其中R3和R4独立地选自H、-CH3>_CH2CH3、_CH2CH2CH3、异丙基、叔丁基、苯基、2-硝基苯基和2，6-二硝基苯基。
9.权利要求8的化合物，其中R3或R4是-CH3、异丙基或叔丁基。
10.权利要求5或6的化合物，其中民和R4独立地选自H、烷基和芳香基，所述烷基或芳香性基团中任选地含有至少一个杂原子，并且其中所述芳香性基团可任选地是芳基或者是多环基团。
11.权利要求5或6的化合物，其进一步限定为式(I)的化合物。
12.权利要求5或6的化合物，其进一步限定为式(II)的化合物。
13.权利要求5或6的化合物，其进一步限定为式(III)的化合物。
14.权利要求5或6的化合物，其进一步限定为式(IV)的化合物。
15.权利要求5或6的化合物，其进一步限定为式(V)的化合物。
16.权利要求5或6的化合物，其进一步限定为式(VI)的化合物。
17.权利要求5或6的化合物，其进一步限定为式(VII)的化合物。
18.权利要求4的化合物，其进一步限定为
19.权利要求4的化合物，其进一步限定为
20.权利要求4的化合物，其进一步限定为
21.权利要求4的化合物，其进一步限定为
22.权利要求4的化合物，其进一步限定为
23.权利要求4的化合物，其进一步限定为
24.权利要求4的化合物，其进一步限定为
25.权利要求4的化合物，其进一步限定为
26.权利要求4的化合物，其进一步限定为
27.权利要求4的化合物，其进一步限定为
28.权利要求4的化合物，其进一步限定为
29.权利要求4的化合物，其进一步限定为
30.权利要求4的化合物，其进一步限定为
31.权利要求4的化合物，其进一步限定为
32.权利要求4的化合物，其进一步限定为
33.权利要求4的化合物，其进一步限定为
34.权利要求4的化合物，其进一步限定为
35. 一种靶核酸的测序方法，所述方法包括下述步骤 (i)将引物5’端连接到固体表面上；( )将靶核酸与所述连接到固体表面上的引物进行杂交，形成杂交的引物/靶核酸复合物；(iii)获得聚合酶和一种或多种权利要求5的化合物，前提是不同的式I-VII的化合物具有不同的荧光团；(iv)将所述杂交的引物/靶核酸复合物与聚合酶以及一种或多种步骤(iii)的化合物反应，以通过聚合酶反应形成生长中的引物链；(ν)通过荧光团对生长中的引物链成像以鉴定步骤(iv)引入的化合物；(vi)将具有所述生长中引物链的固体表面暴露于光源以除去下式的光可断裂的终止
36. 一种靶核酸的测序方法，所述方法包括下述步骤 (i)将核酸5’端连接到固体表面上；(ii)将引物与所述连接到固体表面上的核酸进行杂交，形成杂交的引物/靶核酸复合物；(iii)获得聚合酶和一种或多种权利要求5的化合物，前提是不同的式I-VII的化合物具有不同的荧光团；(iv)将所述杂交的引物/靶核酸复合物与聚合酶以及一种或多种步骤(iii)的化合物反应，以通过聚合酶反应形成生长中的引物链；(ν)通过荧光团对生长中的引物链成像以鉴定步骤(iv)引入的化合物； (vi)将具有所述生长中引物链的固体表面暴露于光源以除去下式的光可断裂的终止部分
37.权利要求35和36中任一项的方法，其中步骤(iv)的至少一种化合物的引入效率为其天然核苷酸对应物的引入效率的约70%至约100%。
38.权利要求37的方法，其中所述引入效率为约85%至约100%。
39.权利要求35和36中任一项的方法，其中所述聚合酶选自逆转录酶、末端转移酶和 DNA聚合酶。
40.权利要求35和36中任一项的方法，其中在步骤(vi)中通过暴露于光源除去约 85%至约100%的光可断裂的终止部分。
41.权利要求35和36中任一项的方法，其中在根据步骤(iv)引入至少一种化合物之后以约90%至约100%的效率终止链的生长。
42.权利要求35和36中任一项的方法，其中使用脉冲多线激发检测器进行步骤(ν)中的成像。
43.权利要求35和36中任一项的方法，其还包括步骤(vi)前清洗生长中的引物链。
44.权利要求35和36中任一项的方法，其还包括步骤(iv)后清洗延伸的引物。
45.权利要求35和36中任一项的方法，其还包括在步骤(iv)前对步骤(iv)中未反应的任何弓丨物或生长中的引物链加帽。
46.权利要求35和36中任一项的方法，其还包括同步地对多个靶核酸测序。
47.一种将核酸分子中的非天然成分转化成天然成分的方法，所述方法包括以下步骤(i)引入权利要求5的化合物；( )将所得核酸暴露于光源以除去所述核酸中光可断裂的终止部分
48.权利要求47的方法，其还包括将多个核酸分子中的非天然成分同步地转化为天然成分。
49.权利要求48的方法，其还包括同步地终止多个核酸的合成。
50.一种终止核酸合成的方法，所述方法包括将权利要求1至34中任一项的3’-0H未封闭的核苷酸或核苷置于聚合酶的环境中以及将所述3’ -OH未封闭的核苷酸或核苷引入到核酸分子中的步骤。
51.权利要求50的方法，其中通过引入所述3’-0H未封闭的核苷酸或核苷终止DNA合成的效率为约90%至约100%。
52.权利要求50的方法，其中所述3’-0H未封闭的核苷酸或核苷的引入效率为具有与所述3’ -OH未封闭的核苷酸或核苷相同的碱基的天然核苷酸或核苷的引入效率的约70% 至约100%。
53.一种进行Sanger或Sanger型测序的方法，所述方法包括使用权利要求1至34中任一项的化合物作为终止核苷酸类似物。
54.一种测定靶核酸序列的方法，所述方法包括下述步骤 (i)将靶核酸加入到Sanger或Sanger型测序装置；( )向所述测序装置中加入一种或多种权利要求1至34中任一项的化合物，前提是其中如果存在超过一种类型的碱基，则每种碱基与不同荧光团相连接；(iii)加入互补引物和聚合酶；(iv)进行聚合酶反应以将步骤(ii)的至少一种化合物引入到生长中的核酸链中，以及(ν)用荧光测序设备或脉冲多线激发荧光分析Sanger测序反应的结果， 其中步骤(i)-(iii)可以任意顺序进行。
55.权利要求M的方法，其中在根据步骤(iv)引入至少一种化合物后以约90%至约 100%的效率终止核酸链的生长。
56.权利要求M的方法，其中步骤(iv)的至少一种化合物的引入效率为聚合酶反应中具有相同碱基的天然底物的引入效率的约70%至约100%。
57.权利要求56的方法，其中所述引入效率为约85%至约100%。
58.权利要求讨的方法，其中所述聚合酶选自逆转录酶、末端转移酶和DNA聚合酶。
59.一种将非天然成分引入到核酸中的方法，所述方法包括以下步骤 (i)将靶核酸加入到测序装置中；( )将一种或多种权利要求1至34中任一项的化合物加入到所述测序装置中，前提是其中如果存在超过一种类型的碱基，则每种碱基与不同荧光团相连接； (iii)加入聚合酶；以及(iv)进行聚合酶反应以将步骤(ii)的至少一种化合物引入到生长中的核酸链中， 其中步骤(i)-(iii)可以任意顺序进行。
60.权利要求59的方法，其还包括(ν)分析用于引入步骤(ii)的至少一种化合物的聚合酶链式反应的结果。
61.权利要求59的方法，其中在根据步骤(iv)引入至少一种化合物后以约90%至约 100%的效率终止链的生长。
62.权利要求59的方法，其中根据步骤(iv)引入至少一种化合物的效率为聚合酶反应中具有相同碱基的天然底物的引入效率的约70%至约100%。
63.一种进行微测序或微测序型测序的方法，所述方法包括将权利要求1至34中任一项的化合物加入到微测序或微测序型测序方法中。
全文摘要
本发明提供了可用在DNA测序技术和其它类型的DNA分析中的本文所述的新的核苷酸、核苷及其衍生物。在一个实施方案中，具有未保护的3’-OH的核苷酸或核苷在核碱基上被衍生成包括通过连接物与不可断裂的终止基团连接的荧光染料。所述不可断裂的荧光基团被设计成终止DNA合成，使得可以平行模式对DNA寡聚体进行有效测序。在另一个实施方案中，具有未保护的3’-OH的核苷酸或核苷在核碱基上被衍生成包括通过连接物与光可断裂的终止基团连接的荧光染料。所述光可断裂的荧光基团被设计成终止DNA合成以及被断裂，使得可以平行模式对DNA寡聚体进行有效测序。
文档编号C12Q1/68GK102443030SQ20111037672
公开日2012年5月9日 申请日期2007年12月5日 优先权日2006年12月5日
发明者吴卫东, 布赖恩·P·斯图皮, 弗拉迪斯拉夫·A·利托什, 迈克尔·L·梅茨克 申请人:激光基因公司