一种安全性慢病毒载体及其应用的制作方法

专利名称：一种安全性慢病毒载体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种安全性慢病毒载体及其应用。
背景技术：
β地中海贫血(简称β地贫)是一类由于血红蛋白(HbA)生成障碍导致的遗传性疾病。HbA生成过程中3Hb合成受到抑制，破坏了血红蛋白两类亚基的平衡状态，相对过剩的α Hb在红细胞内产生毒性沉积导致溶血性贫血。针对β地贫的发病环节，王宝斌等构建了可专一性地结合游离α Hb的α血红蛋白稳定蛋白(AHSP)基因表达载体并将其导入β 6Μ地贫小鼠体内，以期阻止过剩的α Hb产生毒性沉积。通过分子生物学、生物化学、病理学和血液学等技术手段检测小鼠后发现其地贫表型有所改善(Transgenic Human α -Hemoglobin Stabilizing Protein Could PartiallyRelieve β ws+654-Thalassemia Syndrome in Model Mice. Human Gene Therapy. 201 0 February, 21(2) :149-156.)。这是一个利用慢病毒介导方式治疗血液性疾病的成功范例。但是要将该慢病毒载体真正用于临床治疗，还需要解决一些安全性的问题。①尽管人们已经花了大量精力使慢病毒载体很安全(最低限度保留了约5%的原HIV序列，使之难以形成重组相适应性病毒)，但仍不能保证残留的序列不会对人体产生危害。②HIV具有强有力polyA断裂加尾功能，但是经过删减后的Δυ3的慢病毒载体却会出现“通读”(Readthrough)，转录下游基因，造成安全隐患(Anne-Kathrin Zaiss et al.，(2002). RNA 3，Readthrough ofOncoretrovirus and Lentivirus Implications for Vector Safety and Efficacy. Journal of Virology. July ；76(14) :7209-19.)。

发明内容
因此，本发明要解决的技术问题就是针对目前的慢病毒载体具有安全隐患的不足，提供一种安全性高的慢病毒载体。本发明的解决上述技术问题的技术方案如下。本发明的技术方案之一是一种安全性慢病毒载体，该慢病毒载体携带了整合酶 Cre基因表达盒，并且在3’ LTR的U3区含有LoxP位点序列，在U3区中并在LoxP位点的下游含有用于导入外源基因的限制性酶切位点。其中，整合酶Cre表达盒在慢病毒载体的位置是任何位置，只要不影响慢病毒载体的其他功能即可。较佳的如在慢病毒载体FUGW中为原GFP(荧光蛋白)的位置，将原GFP 基因替换为整合酶Cre基因，仍然使用原来的表达元件即可。所述的整合酶Cre基因是常规的，较佳的其序列如SEQID N0:2所示。LoxP在U3区的位置可以是任何位置，较佳的是 U3区的两个EcoRV酶切位点之间。所述的LoxP位点序列是常规的，较佳的其序列如序列表中 SEQ ID NO 1 所示。优选的，本发明的安全性慢病毒载体进一步在3，LTR的U3区含有cHS4的400bp
3核心序列和SV40的2XUSE两种元件中的任何一种或两种。这可以使载体的通读率下降。本发明中，所含片段优选反向接入的cHS4元件和/或正向接入的2 XUSE元件。更优选反向接入的cHS4元件和正向接入的2XUSE元件叠加。最优选5’方向至3’方向依次是反向接入的cHS4元件和正向接入的2XUSE元件。cHS4反向和2XUSE正向相连接入到 3’ LTR的U3区两个EcoRV位点之间，通读率降低效果最为明显。本发明中，所述的CHS4的400bp核心序列为常规，较佳的是序列表中SEQ ID NO 3所示的序列。所述的SV40的2XUSE是指2个串联的USE元件，为常规，较佳的是序列表中SEQ ID NO 4所示的序列。本发明中，所述的CHS4的400bp核心序列和/或SV40的2 X USE在U3区的位置可以是任何位置，较佳的是在U3区中并在LoxP位点序列的下游。本发明中，所述的慢病毒载体可以是现有的任何慢病毒载体，较佳的是慢病毒载体FUGW。本发明的方法对所有3’ LTR都有作用，对FUGW的3’ LTR效果最佳。本发明的一较佳实施方式为一种安全性慢病毒载体，是改良的FUGW慢病毒载体，在出发慢病毒载体FUGW的3’ LTR的U3区含有LoxP位点序列，将GFP基因替换为整合酶Cre基因，并且在U3区中LoxP位点的下游含有cHS4的400bp核心序列和SV40的2XUSE 两种元件中的任何一种或两种。更佳的，在U3区中LoxP位点的下游构建了一个用于导入外源基因的限制性酶切位点。根据慢病毒载体FUGW全序列，该限制性酶切位点优选Nhe I 酶切位点。Nhe I酶切位点在改良了的慢病毒载体FUGW中没有第二个，因此有利于外源基因的插入。本发明的技术方案之二是一种上述安全性慢病毒载体的制备方法，包括以下步骤，1)构建携带了整合酶Cre基因表达盒，并且在3，LTR的U3区插入了 LoxP位点序列得慢病毒载体；幻在U3区中LoxP位点的下游位置插入cHS4的400bp核心序列和/或SV40的 2 X USE ；3)在U3区中LoxP位点的下游位置引入用于插入外源基因的酶切位点。步骤3)所述的用于插入外源基因的酶切位点只要是在U3区中并在LoxP位点的下游且在cHS4的400bp核心序列和/或SV40的2 X USE的上游。本发明的一较佳实施方式为一种安全性慢病毒载体的制备方法，是对FUGW慢病毒载体的改良，包括在出发慢病毒载体FUGW的3’LTR的U3区插入LoxP位点序列，将GFP基因替换为整合酶Cre基因；在LoxP位点后引入Nhe I酶切位点；在Nhe I酶切位点插入cHS4的400bp核心序列或2 XUSE，在cHS4的400bp核心序列或2XUSE前后(或后前)各引入Nhe I酶切位点和 EcoR V酶切位点；在EcoR V酶切位点插入的2 XUSE。本发明解决上述技术问题的技术方案之三是一种携带外源基因的重组慢病毒载体，该慢病毒载体携带了整合酶Cre基因表达盒，并且在3’ LTR的U3区含有LoxP位点序列，在U3区中并在LoxP位点的下游含有外源基因。所述的外源基因是任何需要转移的基因，优选如AHSP基因。本发明的一较佳实施方式为所述安全性慢病毒载体是改良的慢病毒载体FUGW， 在Nhe I酶切位点插入了外源基因AHSP。本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。本发明所述的安全性慢病毒载体可以应用于基因克隆或表达。特别是在基因治疗，由本发明的慢病毒载体介导转基因具有更高的安全性。本发明的慢病毒载体介导基因， 所产生的假病毒在整合后发生“自杀效应”，将大部分慢病毒基本骨架删除，进一步消除其发生重组相适应性病毒(LCV)存在的可能性。仅仅留下一个完整的LTR和所要被整合到染色体的表达元件。通过这种方法使慢病毒载体在用于人类基因治疗方面又迈出了一大步。 并且本发明的慢病毒载体通读率降低，进一步提高了安全性。


以下结合

本发明的特征和有益效果。
图1是载体FW-AHSP的构建图。图2是载体FCLA的构建图。图3是载体FCLAC㈠U⑴的构建图。图4是慢病毒通读示意图。图5是安全性慢病毒载体感染细胞后发生自删除的示意图。图6是用双重PCR方法鉴定Cre的自删除过程的PCR产物电泳图。
具体实施例方式本发明提供了一种安全性慢病毒载体，该慢病毒载体携带了整合酶Cre基因表达盒，并且在3’LTR的U3区含有LoxP位点序列，在U3区中并在LoxP位点的下游含有用于导入外源基因的限制性酶切位点。慢病毒在反转录过程中3’ U3跃迁至5’端，5’ U5跃迁至 3’端，最后会在原病毒形成两个相同LTR。而两个LoxP位点之间的序列在整合酶Cre的作用下会被删除。因此，本发明提供的慢病毒载体在反转录过程中会形成两个LoxP位点，这两个LoxP位点的序列即大部分的慢病毒载体的骨架序列会被删除，从而大大降低慢病毒发生重组产生适应性病毒(LCV)的可能性。本发明的慢病毒载体在3’ LTR的U3区还进一步含有cHS4的400bp核心序列和SV40的2XUSE两种元件中的任何一种或两种，这可以使载体的通读率大大下降，进一步提高载体的安全性。本发明的慢病毒载体所产生的假病毒在整合后发生“自杀效应”，将大部分慢病毒基本骨架删除，进一步降低产生适应性病毒(LCV)的可能性，只留下一个完整的LTR和外源基因，是一种既能发生自删除又降低了通读率的安全性慢病毒载体。Cre/loxP 重组系统Cre/loxP重组系统可以介导位点特异的DNA重组。该系统含有两种成分①一段长34bp的DNA序列，含有两个13bp的反向重复序列和一个8bp的核心序列。这段34bp序列是Cre重组酶识别的位点，被称为IoxP位点(locus of X-over in PI)。②Cre重组酶 (cyclizationrecombination)，它是一种由343个氨基酸组成的单体蛋白，可以引发IoxP位点的DNA重组。任何序列的DNA，当其位于两个IoxP位点之间的时候，在Cre重组酶的作用下要么被缺失(两个IoxP位点的方向相同)，要么方向发生倒转(两IoxP位点的方向相反)。该系统不需要细胞或者生物体提供其他的辅助因子。IoxP位点是一段较短的DNA 序列，非常容易合成。Cre重组酶是一种比较稳定的蛋白质，因此可以在生物体不同的组织、 不同的生理条件下发挥作用。Cre重组酶的编码基因可以置于任何一种启动子的调控之下， 从而使这种重组酶在生物体不同的细胞、组织、器官，以及不同的发育阶段或不同的生理条件下产生，进而发挥作用。本发明在慢病毒载体5’端U3区序列中插入LoxP位点。使之在反转录过程中跳跃至5’端，在慢病毒载体两端形成两个相同LTR，也就是形成了两个LoxP位点。在Cre整合酶的作用下，IoxP位点发生DNA重组，该两个LoxP位点之间所有的DNA都被删除，仅留下一个LTR和表达元件。这样的结果，使因任何原因而实际存在的病毒其他元件，不能与慢病毒载体的基本骨架发生重组，造成LCV产生的可能性，从而解决了慢病毒载体生物安全性的一个很大问题。本发明同时使慢病毒载体内部可以表达Cre整合酶，从而使IoxP位点发生DNA重组。慢病毒载体慢病毒是反转录病毒中的一属，反转录病毒的共性，是在胞浆内有一个将其RNA 反转录成DNA进而整合到染色体的过程。而在这反转录过程中有一个3’ U3跃迁至5’端， 而5’端U5跃迁至3’端的过程，最终造成原病毒两端都带有相同的LTR。本发明中，所述的慢病毒载体可以是现有的任何慢病毒载体，较佳的是慢病毒载体 FUGW。3，LTR任何慢病毒或慢病毒载体都具有3’ LTR。慢病毒载体的3’LTR元件依次包括U3，R， U5三个区域。本发明对所有3，LTR有作用，对FUGW的3，LTR效果最佳。对FUGW的3，LTR 效果最佳。cHS4 元件本发明中，所述的cHS4元件是鸡珠蛋白超敏区域4(Hypersensitivessite 4 of the chicken-globin locus)的400bp核心序列，较佳的是序列表中SEQ ID NO :3所示的序列。2 X USE 元件本发明中，所述的USE元件是猴空泡病毒40 (Simian virus 40)的转录终止上游序列元件(Upstream sequence elements)。2XUSE是指2个串联的USE元件，较佳的是序列表中SEQ ID NO :4所示的序列。AHSP地中海贫血是由于血红蛋白的珠蛋白链合成速率降低，血红蛋白产量减少所引起的一组遗传性溶血性贫血。血红蛋白内含有两种珠蛋白——α珠蛋白和β珠蛋白，二种珠蛋白比例失衡就会导致地中海贫血。任何一种珠蛋白含量过高都会产生毒性，引起包括发育不良、疲乏、骨损伤或皮肤溃疡等地中海贫血症状。
α 血红蛋白稳定蛋白(lpha hemoglobin stabilizing protein，AHSP)，原称红细胞系分化相关因子(erythroid differentiation-related factor, EDRF)。AHSP 是 α 血红蛋白分子伴侣，它能与α血红蛋白结合，但不能与β珠蛋白或血红蛋白四聚体结合。 AHSP能维持α血红蛋白的稳定性，保持α血红蛋白可溶性，减弱α珠蛋白沉积对细胞膜的破坏作用。本发明中，利用本发明的安全性慢病毒载体携带AHSP基因，从而将AHSP基因导入宿主中。动物试验证明了用本发明的安全性慢病毒载体携带AHSP基因，与常规慢病毒载体相比，所获得的治疗效果是类似的。下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所述的“室温”是指进行试验的操作间的温度，一般为25°C。实施例1一、片段合成a) AHSP片段的扩增。用上游引物AHSP-F :5，-TGGCTCTTGCCTTGCATTTCC-3，，下游弓 I 物 AHSP-R 5’ -GGTAGAGTGGCAGGAGCACAG-3’，以人外周血细胞基因组DNA为模板，进行PCR扩增。反应体系如下
IOx PCRbuffer2.5 pL
dNTPs(2.5mM)2 μL
AHSP-F (IOpmol^L)1 μ
AHSP-R (IOpmol^L)1 μι t^ ^
人血 DNA (约 50ng/pL)1 μL
Pyrobest Taq E (5U^L)0.2 gL
H2O_mjiL^
V 总_25 μL总共做4 个反应管，反应条件为 94 "C 5min ； (94 "C 45sec，56 "C 45sec， 72°C lmin) X 32个循环；72°C IOmin0扩出约Ikb的AHSP片段(包括AHSP表达盒，即包括启动子、编码序列、终止子)，将反应液混合后，取5μ L送至上海博尚生物技术公司进行测序。然后将测序所得序列与NC_000016. 9序列进行比对，发现完全一致。将剩余所有PCR产物加入2倍体积乙醇沉淀后，溶于10 μ L TE,进行补平。反应体系如下
权利要求
1.一种安全性慢病毒载体，其特征在于，该慢病毒载体携带了整合酶Cre基因表达盒， 并且在3’ LTR的U3区含有LoxP位点序列，在U3区中并在LoxP位点的下游含有用于导入外源基因的限制性酶切位点。
2.如权利要求1所述的安全性慢病毒载体，其特征在于，在3’LTR的U3区还含有cHS4 的400bp核心序列和SV40的2 XUSE两种元件中的任何一种或两种。
3.如权利要求7所述的安全性慢病毒载体，其特征在于，在3’LTR的U3区含有5’方向至3’方向依次为反向接入的cHS4元件和正向接入的2XUSE元件。
4.如权利要求7所述的安全性慢病毒载体，其特征在于，所述的cHS4的400bp核心序列和/或SV40的2 XUSE在U3区的位置是在U3区中LoxP位点序列的下游。
5.如权利要求1所述的安全性慢病毒载体，其特征在于，所述的慢病毒载体是慢病毒载体FUGW。
6.如权利要求4所述的安全性慢病毒载体，其特征在于，所述的整合酶Cre基因在慢病毒载体FUGW中的位置是原GFP荧光蛋白基因的位置。
7.—种如权利要求1所述的安全性慢病毒载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤，1)构建携带了整合酶Cre基因表达盒，并且在3’LTR的U3区插入了LoxP位点序列得慢病毒载体；2)在U3区中LoxP位点的下游位置插入cHS4的400bp核心序列和/或SV40的2X USE ；3)在U3区中LoxP位点的下游位置引入用于插入外源基因的酶切位点。
8.一种携带外源基因的重组慢病毒载体，其特征在于，该慢病毒载体携带了整合酶 Cre基因表达盒，并且在3’ LTR的U3区含有LoxP位点序列，在U3区中并在LoxP位点的下游含有外源基因。
9.如权利要求8所述的重组慢病毒载体，其特征在于，所述的外源基因是AHSP基因。
10.如权利要求1安全性慢病毒载体或8所述的重组慢病毒载体在基因克隆或表达中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种安全性慢病毒载体及其应用。本慢病毒载体携带了整合酶Cre基因表达盒，并且在3’LTR的U3区含有LoxP位点序列，在U3区中并在LoxP位点的下游含有用于导入外源基因的限制性酶切位点。本慢病毒载体介导基因转移，所产生的假病毒在整合后发生“自杀效应”，将大部分慢病毒基本骨架删除，消除了发生重组相适应性病毒(LCV)存在的可能性。并且本发明的慢病毒载体通读率降低，进一步提高了安全性。本安全性慢病毒载体可以应用于基因克隆或表达，特别是在基因治疗，由本发明的慢病毒载体介导转基因具有更高的安全性。
文档编号C12N15/867GK102443604SQ201110385219
公开日2012年5月9日 申请日期2011年11月25日 优先权日2011年11月25日
发明者张敬之, 方彧聃, 曾溢滔 申请人:上海市儿童医院