含增强免疫应答的Fc融合蛋白的方法和组合物的制作方法

专利名称：含增强免疫应答的Fc融合蛋白的方法和组合物的制作方法
技术领域：
本发明通常涉及调节免疫应答，且更具体地用Fe融合蛋白增强个体中细胞介导 的免疫应答。
背景技术：
成功应用癌症疫苗治疗病人还是较为困难，并且不断需要改善刺激针对癌细胞表达抗原的细胞介导和其他免疫应答的组合物和方法的效力。本发明满足了此类和其他相关的需求。发明概述本发明提供了抑制个体中的细胞生长的组合物和方法。被本发明组合物和方法靶向的细胞表达抗原、抗原的模拟表位或CXCR4趋化因子受体。在一个实施方式中，所述方法包括将含编码免疫球蛋白(Ig)Fc和由所述细胞表达的抗原或该抗原的模拟表位的多聚核苷酸的组合物给予所述个体。在另一个实施方式中，该方法包括将含编码免疫球蛋白Fe和由所述细胞表达的CXCR4趋化因子受体的拮抗肽的多聚核苷酸的组合物给予所述个体。在各种实施方式中，本发明抑制癌细胞的生长，但不限于肿瘤细胞。编码所述IgFc的多聚核苷酸在一个实施方式中是重组溶瘤性细胞痘苗病毒。所述多聚核苷酸编码的融合蛋白可包括人IgGl Fe或人IgG3 Fe，且还可包括T辅助细胞表位。本发明也提供了包括编码所述蛋白的多核苷酸和/或所述编码蛋白的组合物。所述蛋白包括免疫球蛋白Fe和抗原或所述抗原的肽模拟物，或者免疫球蛋白Fe和由癌细胞表达的受体的拮抗肽。附图简述图I.在荷瘤小鼠中疫苗接种47-0^-或47-0^4(3￥2&致敏的树突状细胞(0〇8)和过继性细胞转移(ACT)的示意图。A，疫苗接种47-LDA-或47-LDA-FcY2a致敏的DC。在IL-15和IL-21载体存在下，每两周用47-LDA-或47_LDA_Fc y 2a致敏的DC免疫A/J小鼠(n=5)。第三次免疫后三周，通过阴性选择获取CD8+脾细胞，并将其用于NXS2荷瘤小鼠的ACT。B，ACT和DC疫苗对原发性肿瘤生长的抑制。用2X106NXS2细胞攻击A/J小鼠。15天后，ACT和DC疫苗接种前一天通过5Gy TBI或9Gy TBI加上BM转移(IO7细胞)诱导荷瘤小鼠中的淋巴细胞减少。第16天，与DC疫苗一起，递送接触过抗原的⑶8+T细胞(2 X IO7)的过继性转移。通过每周1-3次用测微计测量皮下肿瘤和测定肿瘤体积(宽X长X宽/2=mm3)来监测肿瘤生长。C，ACT和DC疫苗对转移性疾病的抑制。NXS2荷瘤小鼠在肿瘤切除时经历了非清髓性(nonmyeloablative)或清髓性TBI。一天后，该小鼠接受了 DC疫苗和自免疫小鼠的CD8+T细胞(2X IO7)或自未免疫未经免疫小鼠的未分离的脾细胞的ACT。存活时间定义为小鼠因扩展性肿瘤生长或转移发生而处死的时间点。图2. 47-LDA-FC Y 2a融合蛋白及其与DC相互作用的表征。A，47_LDA_Fc y 2a融合蛋白和47-LDA多肽与生物素化的14G2单抗和链霉亲和素-HRP的蛋白印迹。B，47-LDA-Fc Y 2a融合蛋白和47-LDA多肽与未成熟⑶IIc+DC的结合。源于骨髓(BM)的DC用FITC-偶联的⑶I Ic特异性mAb联合生物素化的47-LDA-Fc y 2a融合蛋白或47-LDA多肽染色，然后用链霉亲和素-PE染色并通过流式细胞术分析。用抗CD86-PE mAb染色的DC作为特异性对照涵盖于其中。给定⑶Ilc阳性DC上的47-LDA-Fc y 2a,47-LDA和⑶86分子的百分数和平均荧光强度(MFI)。箭头表示直方图中细胞的来源。数据源于所进行三次实验中的一次代表性实验。C，LPS刺激后，由47-LDA-Fc y 2a+、47_LDA+、⑶86+DC和其阴性对应物细胞内表达的IL-12p70。未成熟DC用生物素化的47-LDA-Fc y 2a融合蛋白、47-LDA多肽或CD86特异性单抗染色，然后用链霉亲和素-PE染色。在BD FACSAria 流式细胞仪上 分选阳性和阴性细胞群，用I μ g/ml LPS孵育过夜，并通过用对IL_12p35亚单位特异的大鼠抗小鼠IL_12p70单抗，然后用羊抗大鼠二抗的细胞内染色分析IL-12p70表达。用同型对照抗体估计本底染色(MFK2. 6)。所有流式细胞术评价都在FACScan或FACSCalibur流式细胞仪上进行。在前向角和侧向角散射参数上设门后，用CellQuest软件常规获取并分析至少10，000个门内事件。数据源于所进行三次实验中的一次代表性实验。图3. LPS刺激后，CCL22在47-LDA.和47-LDA-Fc y 2a+DC中的分化表达和由47-LDA-和47-LDA-Fc y 2a_DC疫苗对CD4+脾细胞中的IFN- Y和TNF-的诱导。未成熟DC用生物素化的47-LDA-Fc Y 2a融合蛋白、47-LDA多肽或⑶86特异性单抗染色，然后用链霉亲和素-PE染色。在BD FACSAria 流式细胞仪上分选BD47-LDA+ (A)和47-LDA-Fc Y 2a+(B) DC，用I μ g/ml LPS孵育24小时，并通过用大鼠抗小鼠CCL22单抗，然后羊抗大鼠二抗的细胞内染色分析CCL2表达。CCL22表达阳性的细胞的MFI和百分数如图所示。浅灰色区域指用同型对照抗体估计的本底染色。数据源于所进行三次实验中的一次代表性实验。C，47-LDA-DC和47-LDA-Fc y 2a_DC疫苗(分别为黑色和阴影柱)免疫小鼠的脾细胞中的IFN-Y和TNF-α的表达(分别为黑色和阴影柱)。在IL-15和IL-21载体存在下，用LPS诱导成熟后的，包被47-LDA多肽或47-LDA-Fc y 2a融合蛋白的DC免疫A/J小鼠(n=5)三次。从用LPS处理过的DC免疫的小鼠中分离的细胞作为对照(空心柱)。最后一次免疫后三周，通过用表达47-LDA模拟表达的DC过夜刺激后的细胞内染色分析IFN- Y和TNF- α在⑶4+脾细胞中的表达。D，NXS2神经母细胞瘤特异性的CTL应答。通过阴性选择获取源自47-LDA-DC (·)和47-LDA-Fc Y 2a-DC (■)疫苗免疫小鼠的CD8+脾细胞。如材料和方法部分所述，用表达47-LDA的DC (黑色图标)或空质粒转染的DC (空心图标)以20:1的比例培养细胞。在标准51Cr释放试验中分析对NXS2细胞的CTL活性。所有测定为三重样品所测，SD且SD〈10%。结果表述为四次独立实验的均值土SDSD。图4. 47-LDA-DC和47_LDA_Fc y 2a_DC疫苗免疫小鼠中的调节性T (Treg)细胞诱导和功能的分析。最后一次47-LDA-DC (A)或47-LDA-Fc Y 2a-DC (C)免疫后三周，摘除腋窝淋巴结，并通过抗CD4-PE、抗CD25-FITC和抗FoxP3-AlexaFluor 647单抗，或相关同型对照染色分析其Treg细胞表达。直方图说明门内群(⑶4+⑶25+细胞)中表达FoxP3。为分析Treg细胞对Teff细胞增殖的影响，来自47-LDA-DC (B)或47-LDA-Fc Y 2a_DC (D)疫苗免疫小鼠的⑶8+细胞装载CFSE，并在有或无Treg细胞(比例1:1)的条件下，用表达47-LDA的同系DC (比例20:1)培养72小时。细胞用PE偶联的抗CD8mAb染色，并用流式细胞术分析。标示经历一轮以上细胞分化的细胞百分比。数据源于所进行三次实验中的一次代表性实验。图5. 47-LDA-和47_LDA_Fc y 2a_DC疫苗和ACT对NXS2原发性和转移性肿瘤生长的抑制。上图，ACT和47-LDA-DC疫苗(A)和47-LDA-Fc y 2a_DC疫苗(B)针对原发性肿瘤生长的保护。A/J小鼠(n=8-10)皮下注射2X106NXS2细胞，并在15天后，用静脉过继性转移分离自47-LDA或47-LDA-Fc y 2a疫苗免疫的同系小鼠的富集CD8+的脾细胞治疗。如材料和方法部分所述，通过TBI (5Gy ;·)或(9Gy ;■)加上⑶8+T细胞转移前一天的BM (IO7细胞)移植诱导荷瘤小鼠的淋巴细胞减少。在IL-15和IL-21载体存在下，小鼠每两周免疫
所述DC疫苗。5Gy (〇)或9Gy (□)辐射加上BM移植的NXS2荷瘤小鼠作为对照。下图，过继转移的⑶8+脾细胞和47-LDA-DC (C)和47-LDA-Fc y 2a_DC (D)疫苗对转移性疾病的控制。对于扩散性疾病的免疫治疗，在肿瘤切除时，经历非清髓性(5Gy ;·)或清髓性(9Gy ；■ )TBI的NXS2荷瘤A/J小鼠接受来自免疫小鼠的⑶8+脾细胞(2X IO7细胞)的ACT以及47-LDA-或47-LDA-Fc Y 2a-DC疫苗。5Gy (〇)或9Gy (□)辐射加上BM移植的NXS2攻瘤小鼠作为对照。E，NXS2攻瘤小鼠接受来自未免疫A/J小鼠的ACT以及DC疫苗。在IL-15和IL-21载体存在下，小鼠每两周免疫所述DC疫苗。对照小鼠具有用有(〇)或无(D)TBI和BM移植所切除的原发性肿瘤。存活时间定义为小鼠因扩展性肿瘤生长或转移发生而处死的时间点。绘制Kaplan-Meier生存曲线,并用对数秩Mantel-Cox方法确定显著性。图6. ACT和DC疫苗接种后，荷瘤和无瘤小鼠的细胞应答分析。上图，NXS2荷瘤小鼠的脾细胞中缺乏增殖性应答(A)和CTL活性(B)。A，未免疫小鼠脾细胞的ACT和47-LDA多肽-DC疫苗免疫后，进展为渐进性生长肿瘤的小鼠中分离的脾细胞装载CFSE，并用表达47-LDA的同系DC (比例20:1)培养72小时。细胞用PE偶联的抗⑶4或抗⑶8单抗染色，并用流式细胞术分析。标示经历一轮以上细胞分化的细胞百分比。数据源于所进行四次实验中的一次代表性实验。B，用标准51Cr释放试验分析荷瘤小鼠的刺激或对照CD8+脾细胞针对NXS2细胞的CTL活性。所有测定为三重样品测得，且结果表述为三次独立实验的均值土SD。下图，接受来自未免疫小鼠的ACT和47-LDA-Fc y 2a_DC疫苗后，无瘤小鼠中的增殖性应答(C)和对NXS2的CTL活性(D)分析。如上图中所述进行实验。图7.带有rOVV-EGFP或r0VV-47-LDA_Fc y 2a融合蛋白的基于溶瘤性病毒疗法的治疗性癌症疫苗。A,r0VV-47-LDA-Fc y 2a载体对肿瘤生长的抑制。A/J小鼠(n=10)皮下注射 2 X 106NXS2 细胞，并在 15 天后静脉注射 108PFUr0VV-47-LDA-Fc y 2a (▲)或 rOVV-EGFP(■)载体治疗。PBS治疗的荷瘤小鼠作为对照(〇)。存活时间定义为小鼠因扩展性肿瘤生长或转移发生而处死的时间点。绘制Kaplan-Meier生存曲线，并用对数秩Mantel-Cox方法确定显著性。B，肿瘤特异性免疫记忆保护小鼠免受NXS2再次攻击。rOVV-47-LDA-Fc y 2a(▲)或rOVV-EGFP (■)载体治疗的无瘤小鼠用NXS2再次攻击。NXS2肿瘤攻击的未治疗小鼠作为对照(O)。每天检查动物，直至肿瘤可触，其后通过每周测量皮下肿瘤1-3次监测肿瘤生长。
图8提供了图形化表示的数据，显示出本发明有效抑制临床相关的小鼠模型中的FADU和4T1肿瘤的生长。为获取图8中总结的数据，小鼠皮下(s. c)植入FA⑶或4T1肿瘤细胞。每天通过静脉注射递送转染细胞上清的蛋白G柱上纯化的CTCE-9908-Fc融合蛋白(200毫克/小鼠)。通过每周用测微计测量皮下肿瘤1-3次和测定肿瘤体积(宽X长/宽/2=mm3)监测肿瘤生长。图9. CXCR4-A-Fc融合蛋白及其与CXCR4的相互作用的表征。A，非还原(NRC)和还原(RC)条件下分离自病毒感染细胞上清的CXCR4-A-Fc的蛋白印迹。B，CTCE-9908肽对CXCR4-A-Fc与SUPT-I细胞上的CXCR4结合的抑制。用生物素化的CXCR4_A_Fc (300 μ g/ml)孵育细胞，并分析其与链霉亲和素-PE的结合。对于抑制试验，用CTCE-9908肽(100 μ g/ml)孵育所述细胞，然后用融合蛋白染色。用同型对照估计本底染色。C.融合蛋白对迁移的抑制。4T1细胞(5X IO4)种在仅有培养基或含CXCR4-A-Fc或CTCE-9908肽(100 μ g/ml)的培养基中的8μπι transwell (转移室)系统的上室中。下室加入Iml含SDF-1 (1，OOOng/ml)的培养基。经transwell膜迁移10小时后，固定细胞，染色并在6个观察视野中计数，以量化迁移。结果为每显微镜视野下的迁移细胞数量的均值土SD。实验值减去对照培养物 中的迁移细胞数量。数据为三次实验中的一次代表性实验。D. CXCR4-A-FC对SDF-I诱导钙动员的抑制。在37°C下避光，将10 μ M吲哚-IAM装载细胞(I X IO6) 45分钟。3至5分钟的基底荧光检测后，将CTCE-9908或CXCR4-A-Fc (300 μ g/ml)加至装载吲哚-I的细胞中，然后加入SDF-I (50ng/ml)。记录作为时间函数的荧光变化值，并通过测量410nm发射光(钙结合吲哚-I)与490nm发射光的比值而确定。收集SDF-I和抑制剂给药前后一段时间(0-5分钟)内的410和490nm发射光以及410:490比值。数据为两次实验中的一次代表性实验。***，P〈0. 0001。

图10.单独或联合递送0VV-CXCR4-A-Fc或ASA404对4T1原发性和转移性肿瘤生长的抑制。A.接种BALB/c(n=8-12)和7X 1044T1细胞到胸乳腺脂肪垫中。带有100_150mm3肿瘤体积(V)的4T1荷瘤小鼠静脉注射OVV-EGFP或0VV-CXCR4A_Fc (IO8PFU)或最大耐受剂量的ASA404 (20mg/kg)。B.单独或联合递送0VV-CXCR4-A_Fc或ASA404对4T1原发性和转移性肿瘤生长的抑制。绘制Kaplan-Meier生存曲线且确定肿瘤攻击组小鼠的中位生存时间。用对数秩Mantel-Cox方法估计生存时间的组间统计学差异。C.对于转移性疾病疗法,4T1荷瘤小鼠经历单独或联合ASA404的溶瘤性病毒疗法(V=约200mm3)，且肿瘤八天后切除。对照小鼠未经治疗切除肿瘤。存活时间定义为小鼠因扩展性肿瘤生长或转移发生而处死的时间点。D.单细胞悬液免疫荧光染色处理后4天，通过流式细胞术确定MDSC(Grl+、CDllb+、Ly6G+)在肿瘤微环境中的百分数。E.通过ELISA试验测定由肿瘤制得的细胞裂解液中的SDF-I水平(*，P〈0. 05 ;*#，P〈0. 0001)。数据表示为三次独立实验的算术均值 +SD0发明详述本发明利用了我们的发现，即含抗体Fe区和i)模拟存在于抗原中表位的模拟表位；或ii)癌细胞上表达的受体的肽拮抗剂的融合蛋白能用于增强对表达该抗原的细胞的免疫应答，且抑制通过该肽拮抗剂结合的受体的信号转导。本发明涵盖含此类融合蛋白的组合物、含编码此类融合蛋白的多核苷酸的组合物和使用此类组合物预防和治疗疾病的方法。所述方法包括将本发明组合物给予个体，以使表达所述抗原的细胞或表达所述肽拮抗剂结合的受体的细胞的生长受到抑制。本文所用的“模拟表位”是指模拟表位结构的肽序列。对所述模拟表位产生的免疫应答会指向其模拟的所述表位，还因此会识别含所述表位的抗原。在一个实施方式中，认为所述模拟表位自身能作为抗原起作用。我们证明了包括含活化性Fe融合蛋白和模拟表位或癌细胞上表达的受体的肽拮抗剂的融合蛋白的治疗性疫苗产生了抗肿瘤应答，所述应答的特征部分在于刺激抗原特异性T细胞。在本发明的具体证明中，我们显示出活性Fe融合蛋白环境中表达的含⑶2神经节苷脂的CD166交叉反应性模拟表位(本文称为“47-LDA”)的治疗性疫苗在荷瘤同系小鼠中产生了肿瘤特异性T细胞。所述模拟表位表达为与通用T辅助细胞表位和小鼠IgG2a Fe片段相连的融合蛋白(47-LDA-Fc Y 2a)，以递送所述抗原性盒至树突状细胞(DC)上的活化性Fe Y受体。
47-LDA 模拟表位的序列是 GPGPGEDPSHSLGLDAALFM(SEQ ID NO: I)。SEQ ID NO:2提供包括通用T辅助细胞表位和47-LDA模拟表位的示范性氨基酸序列，其为KCKRQCGPGPGAKFVAAWTLKAAAGPGPGCKRKIHIGPGQAFYTGPG PGEDPSHSLGLDAALFM。 SEQID NO: 2中1-6位氨基酸组成间隔。7-11位和25-29位氨基酸组成接头。虽然认为任意T辅助细胞表位可与本发明结合，T辅助细胞表位的非限制实施方式包括称为非天然泛(pan)DR 表位(PADRE)的通用 Th 肽[AKFVAAWTLKAAA SEQ ID NO: 3]和 HIV gpl20 糖蛋白的 V3 环[CKRKIHIGPGQAFYT SEQ ID NO:4]。这些代表性的T辅助细胞表位也各显示于SEQ ID Ν0:Χ中。 我们也显示出，用47-LDA-Fc Y 2a融合蛋白免疫荷瘤小鼠诱导出比47-LDA多肽-树突状细胞(DC)疫苗更高水平的抗肿瘤免疫应答和保护。治疗性47-LDA-Fc y 2a_DC疫苗的抗肿瘤效力与通过使用表达47-LDA-Fc Y 2a融合蛋白的重组溶瘤细胞痘苗病毒(rOVV)的病毒疗法相关癌症疫苗所得到的效力相当。然而，后者治疗不需要全身照射(TBI)或过继性细胞转移(ACT)，且在已建立的耐受环境中导致抗肿瘤免疫应答的诱导。在本发明另一个实施方式中，我们运用了作为CXCR4趋化因子受体拮抗剂的抗癌试剂(CTCE-9908)。该CXCR4的肽拮抗剂包括氨基酸序列KGVSLSYR-K-RYSLSVGK (SEQ IDN0:5)。因而，在一个实施方式中，CXCR4的肽拮抗剂包括序列KGVSLSYR (SEQ ID N0:6)。CTCE-9908阻断CXCR4受体与CXCL12的在转移性细胞浸润器官组织中至关重要的相互作用，从而减少了肿瘤转移。多种肿瘤细胞类型表达CXCR4受体。CTCE-9908肽已由加拿大温哥华的趋化因子治疗公司(Chemokine Therapeutics)开发,并已用于晚期癌症病人中的I/II期临床试验。通过进行本发明的方法，我们利用了 Fe片段天然存在的二硫键以保持CTCE-9908肽的二聚体结构。我们在DNA载体中，在活化性小鼠和人Fe Y片段(分别为IgG2a和IgGl)的环境中，表达了 CTCE-9908肽，并证实了该构建体在具有小鼠版CTCE融合蛋白的小鼠同系(T41乳癌)和异种移植(FADU人头颈癌)模型中的抗肿瘤效果。我们相信其通过调动抗体依赖性细胞毒性(ADCC)肿瘤杀伤机制放大了该治疗效果。因而，本发明提供了各种增强对抗原的免疫应答的组合物和方法，其中所述抗原为与优选结合活化的Fe Y受体的免疫球蛋白(Ig) Fe区组合的融合构建体。因此，在一个实施方式中，本发明提供了包括融合构建体的组合物，其中所述融合构建体包括小鼠IgG2a或人IgGl的Fe区或此类Fe区的片段。在各种实施方式中，尽管也可使用来自其他抗体类型的Fe区，或合成/人造的Fe区，Fe区是来自IgA、IgG或IgE抗体的Fe区或其片段。所述Fe区可包括或由与哺乳动物，如人产生的Fe区相同的氨基酸序列组成。在各种实施方式中，所述Fe区可具有与由小鼠和/或人产生的Fe区80%至100%之间(涵盖其间的所有整数)的氨基酸序列相似性。所述Fe区可以是完整Fe区，意指整个Fe区，或者可以是所述Fe区的片段。Fe区的片段优选包括特异性结合Fe Y受体的氨基酸序列。本领域普通技术人员知道，抗体的所述“Fe区”是指所述抗体的“可结晶的片段”区，其包括取决于抗体的种类而构成两或三种恒定结构域(CD)的两条重链。本领域熟知编码Fe区的核苷酸序列，以及小鼠和人免疫球蛋白的Fe区氨基酸序列。在一个实施方式中，用作本发明中的Ig区的合适的智人Ig Y-IC区具有序列 ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDffLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEffESNGQP ENNYKTTPPVLDSDGSFFLY SKLTVDKSRff QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK (SEQ ID NO:7)。
在另一个实施方式中，合适的人IgY-3链C区具有ASTKGPSVFP LAPCSRSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YTCNVNHKPSNTKVDKRVEL KTPLGDTTHT CPRCPEPKSC DTPPPCPRCP EPKSCDTPPP CPRCPEPKSCDTPPPCPRCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVQFKffYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTF RVVSVLTVLH QDffLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKTK GQPREPQVYT LPPSREEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESSGQPENN YNTTPPMLDS DGSFFLYSKL TVDKSRffQQG NIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:8)。因为个别抗体同种型拥有对Fe Y受体(带有对小鼠IgG2a和IgG2b同种型或人IgGl和IgG3同种型较高亲和力的活化性Fe Y受体)的不同亲和力，所以由所呈递的抗原复合物结合的活化性-抑制性受体之比的差异可预测DC诱导免疫应答的能力。控制此通路可募集通过抗体疗法或癌症疫苗的获得性免疫力和免疫记忆。在一个实施方式中，所述融合蛋白的Fe部分仅包括抗体重链。本领域技术人员知道为使用小鼠动物模型证实本发明，所述融合蛋白的Fe部分优选为IgG2a或IgG2b Fe小鼠Ig部分，而为了人疾病的治疗和/或预防，所述Fe部分优选为IgGl或IgG3Fc部分。在某些实施方式中，本文提供的所述融合蛋白的Fe部分不涵盖抗原识别部分(即所述融合蛋白的抗体部分不含抗体可变区)。因而，所述融合蛋白不同于含抗原结合部分的抗体，且这还可能涵盖交叉链接的或其他方式连接的模拟表位、抗原或肽受体配体。编码所述Fe融合蛋白的DNA构建体能用本领域技术人员熟知的任意常规技术制得。例如，所述Fe融合编码构建体能用商购试剂制得。比如，英杰公司(INVIV0GEN)提供的pFUSE-Fc系列质粒，其开发以便于通过将编码给定蛋白序列融合至免疫球蛋白(Ig) Fe区来构建Fe融合蛋白。在此构建体中，所述Fe区包括IgG重链和铰链区的CH2和CH3结构域。所述铰链作为所述Fe融合蛋白两部分之间的灵活间隔起作用，这允许所述融合蛋白的每一部分独立地行使功能。一般地，活化Fe Y受体的任意Fe区(和相应地，编码此Fe区的任意多核苷酸)能用于进行本发明。
编码该融合蛋白的DNA构建体能通过使用任意适当的蛋白表达系统表达产生用于分离和/或纯化，或用于治疗性目的的融合蛋白。各类标签或其他部分能添加至该融合蛋白，使得用例如各种亲和层析的方法易于将其纯化。对于治疗性目的，可制取包括该融合蛋白，和/或包括编码该融合蛋白的多核苷酸的组合物，如药学制剂。用于治疗性目的的组合物可通过将该Fe融合蛋白和/或编码它们的多核苷酸与任意适当的药学可接受的载体、赋形剂和/或稳定剂混合而制取。适于与所述试剂混合的组合物的一些实例可见于Remington:The Science and Practice ofPharmacy (《雷明登药物科学与实践》)(2005)21世纪版,宾西法利亚州费城,LippincottWilliams和Wilkins。该组合物还可包括任意适当的佐剂。如果用于本发明方法的治疗性物质为多核苷酸，该多核苷酸可作为裸多核苷酸、联合递送试剂、或作为包括和/或表达该多核苷酸试剂的重组质粒或病毒载体给予个体。适当的给药递送试剂包括密如斯M(Mirus) Transit TKO亲脂试剂、脂质转染试剂、脂质转染胺试剂、细胞转染试剂(cellfectin)、或阳离子聚合物(例如聚赖氨酸)、或脂质体。在一个 实施方式中，该Fc-Ag/拮抗剂融合物由重组溶瘤性重组痘苗病毒(rOVV)编码。就此而言，溶瘤性病毒选择性地在癌细胞中复制并破坏之。这种作用的一级机制由包括该病毒在细胞裂解位点表达免疫原性/治疗性蛋白的二级机制补充。尽管评价溶瘤性病毒活性的大量临床试验利用了局部(例如肿瘤内)或区域(例如腔内或动脉内)途径，我们认为浸润性和转移性癌症的有效治疗将优选使用病毒的系统给药进行[例如见Hu，J. C.，等Clin Cancer Res2006.12:6737-6747]。因为细胞外包膜痘苗病毒覆盖自身于源自宿主细胞的含若干宿主补体控制蛋白和少数外露的病毒蛋白的包膜中，使其抵抗补体中和，所以痘病毒特征在于其能通过血液全身扩散。在临床前模型和早期临床试验中，已证明工程化的溶瘤性痘苗病毒(OVV)在癌症治疗中有前景的结果[Kirn，D. H.和Thorne，S.H. , Nat Rev Cancer 2009. 9:64-71，Mastrangelo, M. J.等.Cancer Gene Ther1999. 6:409-422; Park, B. H.等.Lancet Oncol 2008. 9:533-542; Thorne, S. H.等.CurrGene Ther 2005.5:429-443;Zeh,H.J.和 Bartlett,D.L.，Cancer Gene Ther2002. 9:1001-1012; Zhu, J.等· Blood 2007. 109:619-625]，且已证实，患有广泛分布转移性肿瘤的病人中存在全身病毒扩散[Park, B. H.等.Lancet Oncol 2008. 9:533-542, 47-49;Mastrangelo, M. J.等 J Clin Invest 2000.105:1031-1034;Mastrangelo, M. J.等· AdvExp Med Biol 2000. 465:391-400; DiPaola, R. S.等.J Transl Med 2006.4:1]。然而，多数病人未能有效治疗，因而预计OVV在人上的效果能从与本发明提供的组合物和方法的组合中受益。在一个实施方式中，将所述多核苷酸通过如树突状细胞的抗原呈递细胞给药途径给予所述个体，所述抗原呈递细胞包括表达该Fc-Ag/拮抗剂融合蛋白的多核苷酸。"Fc-Ag/拮抗剂”是指该Fe区存在于具有抗原、其模拟表位或癌细胞特异性肽受体拮抗剂之一的嵌合蛋白或编码这样的嵌合蛋白的核酸序列中。在一个实施方式中，该Fc-Ag/拮抗剂可表达为与通用T辅助细胞表位和Fe片段相连的融合蛋白，以将抗原性表达盒送至所述抗原呈递细胞上的活化的Fe Y受体，以诱导抗原特异性T细胞。在另一个实施方式中，本发明提供了增强对抗原免疫应答的方法，所述方法包括将所述Fc-Ag融合蛋白-树突状细胞扩增的T细胞过继性转移至个体。在一个实施方式中，所述过继性转移的T细胞为⑶8+T细胞。“⑶8+”T细胞是指表达⑶8 (分化群8)的T细胞。CD8是良好表征的跨膜糖蛋白，用作T细胞受体(TCR)的共受体。CD8结合人抗原呈递细胞表面的I类主要组织相容性复合体(MHC-I)蛋白。在一个实施方式中，本发明提供了将疫苗诱导的CD8+T细胞和表达Fc-Ag融合蛋白的树突状细胞的的分离群过继性转移到带瘤宿主，以促进过继性转移的T细胞体内扩增与肿瘤生长的抑制，或编码Fc-Ag融合的多核苷酸。在一个实施方式中，本发明诱发了对所述抗原的增强的T细胞应答，呈递(或被模拟)本发明Fc-Ag融合物中的抗原。所述增强的T细胞应答包括但不必定限于显示出对携带所述抗原的细胞的细胞毒活性的T细胞的增加，或显示出增强的对所述抗原的生存力和/或抗原记忆应答的T细胞的增加，或抗原特异性的效应T细胞的数量和/或活力的增加，或前述类型的细胞介导的免疫应答的组合增加。本发明方法引发的T细胞应答可伴有体液和/或先天免疫应答中的有益变化。在一个实施方式中，可通过抑制个体中表达所述抗原的肿瘤细胞的生长，和/或通过延长个体生存时间证明免疫应答增强。 预计包括能被肽(模拟表位)模拟的表位的任意抗原适用于本发明。抗原优选包括适于被抗原呈递细胞呈递的并与MHC I类分子连接的表位。因而，当其存在于所述融合蛋白中时，所述抗原可以是或可包括蛋白或肽。所述抗原可以是重组抗原，其可以是化学合成的，其可以是从细胞培养物中分离的，或者其可以是从获自个体的生物样品中分离的。所述抗原可以呈递在感染性物种中的细胞上，或者所述抗原可以由病变或感染的细胞、组织或器官表达。在一个实施方式中，所述抗原是肿瘤抗原。肿瘤抗原可以是可商购的抗原，或者其可以通过常规技术获取，如通过重组法，或通过制备肿瘤细胞裂解液以鉴定用于本发明组合物和方法中的新抗原。在各种实施方式中，所述癌细胞抗原可以由癌细胞表达，其具体实例包括但不限于纤维肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、腹膜假黏液瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤(Ewing’s tumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、头颈癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、骨髓癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、维尔姆斯瘤(Wilns’ tumor)、宫颈癌、睾丸癌、肺癌、肺小细胞癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听觉神经瘤、少枝胶质瘤(oliodendroglioma)、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤、成视网膜细胞瘤、白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、胸腺瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom’s macroglobulinemia)和重链病。在一个实施方式中，所述抗原是GD2神经节苷脂的CD166交叉反应性模拟表位。在另一个实施方式中，所述抗原是CTCE-9908。所述抗原可能是由感染性物质或感染性物种表达的抗原，其非限制性的实例包括病毒、细菌、真菌、原虫、或任意其他寄生虫或其他感染性物质。考虑如抗原的分子组成、所述治疗个体的大小和年龄和所述个体可能疑似有或可能已经诊断的疾病类型和阶段的因素，本领域技术人员知道如何制备实施本发明方法的剂量方案。本发明可能用于诱发增强的预防性或治疗性的免疫应答。所述组合物给药的个体可以是需要治疗的个体，和/或已经诊断为、疑似有、或有风险进展为与所述抗原表达相关的疾病或其他紊乱的个体。本领域技术人员可确定涵盖于本发明组合物中和/或用于本发明方法的Fc-Ag/拮抗剂融合蛋白、或编码所述Fc-Ag/拮抗剂融合蛋白的表达载体、或细胞如包括所述Fc-Ag/拮抗剂融合蛋白或编码所述Fc-Ag/拮抗剂融合蛋白的表达载体或其他表达盒的抗原呈递细胞的量。因而，在一个实施方式中，以本发明组合物的有效剂量给药。有效剂量可以是抑制所述个体中表达所述抗原的细胞生长的组合物的量，或延长所述个体存活时间或缓解个体中与所述抗原表达相关的疾病症状的量。本发明方法可联合常规疗法进行，所述常规疗法旨在治疗与所述抗原相关的疾病或紊乱。例如，如果所述方法用于增强个体中对肿瘤抗原的免疫应答，包括但不限于化疗、手术干预和放疗的治疗形式能先于、同时或晚于本发明方法进行。
正如本文表述的实施例所证，为开发一种限制肿瘤疫苗在荷瘤小鼠中与Treg细胞相互作用能力的方法，我们首先比较了由呈递给DC的47-LDA肽模拟物作为与通用Th表位联用的线性多肽或作为与小鼠IgG2a Fe片段的融合蛋白所产生的功能性肿瘤特异性细胞应答。我们显示出47-LDA-Fc Y 2a融合蛋白-DC疫苗不仅扩增了肿瘤特异性⑶8+T细胞，还在将未免疫脾细胞ACT至经历清髓性TBI和BM移植的荷瘤小鼠后诱导了初次免疫应答。47-LDA-Fc Y 2a疫苗诱导的CD8+T细胞抑制了原发性肿瘤生长，并保护了所述荷瘤小鼠免于发展出最轻的残留疾病。另一方面，由47-LDA多肽-DC疫苗诱发的保护导致了肿瘤生长延迟，这仅在清髓性条件下的ACT后显著。此研究的结果与治疗性疫苗接种于荷瘤小鼠期间FcyR能调节T细胞介导的免疫应答的发现一致。47-LDA-Fc Y 2a+DC比47-LDA+DC诱导产生更高水平的肿瘤特异性免疫应答的能力更强的机制仍不清楚。可能是由于表达IL-12的抗原呈递细胞起始I型而非Treg细胞应答能力更强，所以LPS诱导成熟后，，47-LDA-Fc y 2a+DC群内比47-LDA+对应物中表达IL-12的细胞数量上升有助于产生此效果。与接受47-LDA-DC疫苗的动物相比，47-LDA-Fc y 2a+DC中CCL22趋化因子表达的减少和47-LDA-Fc y 2a+DC免疫小鼠中更低比例的Treg细胞进一步支持该观察现象。我们的结果与之前的发现一致，所述发现即炎症环境的特性通过指导所述成熟DC采取与每种这样的T细胞类型相互作用的稳定倾向，能影响Teff和Treg细胞活化之间的平衡。然而值得注意的是，尽管在癌症疫苗的设计中已经表明了 DC功能的改变，但在用肿瘤相关抗原模拟表位的治疗性疫苗接种期间，为抵消与肿瘤进展相关的免疫抑制而协调DC应答已经被广泛评价。因而，这些发现突出了肽模拟表位的用于癌症免疫治疗的新应用。已经确定的是，活化和抑制低亲和力Fe Y R对调节效应细胞免疫应答至关重要。其在诱导获得性免疫中的作用显示出抗原以免疫复合物的形式给予DC期间，活化/抑制受体的功能中的改变能影响DC在体内的活化并增强抗肿瘤T细胞应答。此概念被抑制性Fe Y RIIb受体的选择性阻断使人DC成熟并产生对抗体包被的肿瘤细胞的免疫力，和来自Fe Y RIIb缺陷小鼠的DC显示出共刺激分子更高的表达(能解释启动抗原特异性T细胞的能力的增加)的观察现象所支持。然而，在可危及疫苗有效性和/或实际的可行性的所述抗原结合的再生性方面，大蛋白载体的使用产生诸多困难。因此，包含所述抗原和辅助细胞表位以及具有对活化性Fe Y R结合亲合力增加的IgG抗体的Fe区的合成构建体应该提供在制造和表征方面与免疫复合物不同的优势。这也表明了，47-LDA-Fc Y 2a融合蛋白使DC能在荷瘤小鼠中有效地启动和扩增特异性的CD8+CTL应答的能力可产生肿瘤免疫疗法改进的效
果ODC疫苗或手术后抗肿瘤免疫应答的研究已显示出Treg细胞是携带弱免疫原性肿瘤的宿主中T细胞记忆发育的根本障碍。尽管手术当前仍是对固体肿瘤的主要疗法，但还是需要记忆T细胞应答以对术后肿瘤复发和转移的持续预防。如多数癌症病人中所见，我们的结果显示了仅手术或疫苗不会诱导对弱免疫原性的肿瘤相关抗原的保护。然而，在我们的模型中，手术联合淋巴删除、ACT和DC疫苗接种能使长期的肿瘤保护的进展成为可能。尽管我们不能排除在术后免疫力的诱导期间，没有Treg时肿瘤自身作为抗原的来源可能启动针对多种肿瘤抗原的T细胞应答的可能性，但没有所述47-LDA模拟表位DC疫苗接种 时所产生的抗肿瘤免疫力仅延伸了荷瘤小鼠的存活。相反，在清髓性荷瘤小鼠宿主中，用靶向活化性Fe Y Rs的47-LDA-Fc y 2a融合蛋白主动免疫导致了对原发性肿瘤的显著性抑制，并对发生自发转移疾病的保护。虽然使用离体产生的DC提供了独特的机会以避免肿瘤诱导的DC功能异常，并允许了对DC特性的精确操作，用于对病人细胞离体操作的专业细胞培养设施的需求促进了试图开发能靶向荷瘤宿主身体内的内源性DC的无细胞疫苗。经工程改造以选择性递送肿瘤抗原或其模拟表位到DC的疫苗可与诱导DC体内极化的策略偶联而无需任何体外处理。我们使用rOVV-47-LDA-Fc y 2a载体的病毒治疗方法将转基因直接递送到肿瘤损伤处(数据未显示)用于DC的分泌和交叉呈递，得到的结果表明了没有任何外援细胞因子治疗、ACT、TBI或体外操作时保护性Teff以及记忆T细胞的诱导。需要进一步研究，以更好的定义病毒递送的47-LDA-Fc Y 2a融合蛋白在肿瘤微环境中交叉呈递对Teff和Treg之前的平衡以及病毒疗法诱导的抗肿瘤免疫应答的有效性和持续时间的影响。就此而言，若干系列的证据指出，VV通过产生促炎症反应细胞因子的TLR2/MyD88依赖性通路和使体外和体内的IFN-β活化的TLR独立通路诱发的天然免疫应答。因为持续的天然免疫的TLR刺激需要打破体内已建立的Treg介导的耐受，且VV能提供TLR信号，所以VV作为疫苗载体的这种独特的能力能导致宿主防御的活化并保护小鼠免受肿瘤攻击。因而，在CD4+CD25+Treg存在下，通过基于病毒疫苗打破⑶8+T细胞耐受的可能性表明表达所述47-LDA-Fc y 2a融合蛋白或其他肿瘤相关抗原的rOVV可证明是DC疫苗很好的替代，以克服体内CD4+CD25+T细胞介导的CD8耐受。总之，该工作强调了开发DC对肿瘤/自身抗原的摄取和处理以活化免疫效应细胞和限制所吸引的抗炎症Treg细胞的能力的重要性。我们的发现阐明了旨在选择性活化炎性与调节性型免疫细胞的癌症免疫疗法的新模式。以下实施例旨在用于说明但不限制本发明。实施例I本实施例提供了获取本文所述数据所用材料和方法的记载。动物和细胞系雌性Α/J小鼠,6-8周龄,购自杰克逊实验室(Jackson Laboratory)(緬因州巴港)。遵循Roswell Park癌症研究院动物保护与使用委员会批准的方案进行实验。小鼠NXS2神经母瘤细胞系(由加利福利亚州拉霍亚的Scripps研究院R. A. Reisfeld博士提供)是GD2阴性的C1300小鼠神经母瘤细胞(A/J背景)和GD2阳性的小鼠背根神经节瘤细胞的杂交产物。该杂交细胞系通过其H-2Kk阳性/H-2Kb阴性表型显示出与A/J小鼠同系的MHCI ^ (Lode, H. N. , R. Xiang, T. Dreierj N. M. Varkij S. D. Gillies,和 R. A. Reisfeld. 1998.Natural killer cell-mediated eradication of neuroblastoma metastases to bonemarrow by targeted interleukin-2 therapy.(骨髓神经母细胞瘤转移灶通过革巴向白介素-2治疗由天然杀伤细胞介导的消除)Blood 91:1706-1715.)。14G2a杂交瘤细胞系分泌GD2 特异性 mAb (Mujooj K.，T. J. Kippsj H. M. Yang, D. A. Chereshj U. Wargallaj D. J. Sander,和 R. A. Reisfeld. 1989. Functional properties and effect on growth suppressionof human neuroblastoma tumors by isotype switch variants of monoclonalantiganglioside⑶2 antibody 14.18.(单克隆抗神经节苷脂GD2抗体14. 18.的同型切换变体对人成神经细胞瘤的生长抑制的功能特性和影响)Cancer Res 49:2857-2861)由R. A. Reisfeld 博士(Scripps 研究院)提供。47-LDA-Fc Y 2a融合蛋白的产生包括组织型纤溶酶原激活蛋白(tPA)分泌信号肽序列、两种通用Th肽PADRE的47-LDA [AKFVAAWTLKAAA SEQ ID NO: 3; (Alexander, J. ,M. F. del GuerciojA. MaewaljL-Qiao, J. Fikesj R. W. Chesnutj J. Paulson, D. R. Bundle, S. DeFreesj 和 A. Sette. 2000. LinearPADRE T helper epitope and carbohydrate B cell epitope conjugates inducespecific high titer IgG antibody responses.(线性 PADRE T 辅助表位和糖 B 细胞表位偶联物诱导特异高效价IgG抗体应答)J Immunol 164:1625-1633)和HIV gpl20糖蛋白的 V3 环[CKRKIHIGPGQAFYT SEQ ID N0:4;(Ahluwalia，A.，K. Gokulan，I. Nath，和 D. N. Rao. 1997. Modification of delivery system enhances MHC nonrestrictedimmunogenicity of V3 loop region of HIV-I gpl20.(递送系统的改良增强 V3 loopregion of HIV_lgpl20 的 MHC 非限制性免疫原性)Microbiol Immunol 41:779-784)连同47-LDA模拟肽的表达载体的构建已广泛报道(Bolesta，E.，A. Kowalczyk, A.Wierzbickij P. Rotkiewiczj B. Bambachj C. Y. Tsaoj I. Horwacikj A. Kolinski, H. Rokitaj M.Brecherj X. Wang, S. Ferronej 和 D. Kozbor. 2005. DNA vaccine expressing the mimotopeof GD2 ganglioside induces protective GD2 cross-reactiveantibody responses.(表达GD2神经节苷脂模拟表位的DNA疫苗诱导保护型GD2交叉反应抗体应答)CancerRes 65:3410-3418.) ο小鼠47-LDA-Fc Y 2a融合蛋白通过使用EcoRI和BglII限制性酶切位点在pFUSE-mIgG2Aa_Fcl载体(英韦沃基公司(InvivoGen)，加利福尼亚州圣地亚哥)的hEFl-HTLV启动子与小鼠IgG2a Fe区之间插入47-LDA多肽编码序列而产生。利用Lipofectamine试剂(英杰公司，加利福尼亚州卡尔斯巴德)将47_LDA_Fc Y 2a融合蛋白构建体和空载稳定转染293T细胞，然后在含博来霉素的培养基中选择。在蛋白G柱(GE健康公司(GE Healthcare),生物科学公司(Bio-Sciences Corp)，新泽西州皮斯卡特维)上，从转染细胞上清培养物中纯化47-LDA-Fc Y 2a融合蛋白。根据厂家说明书，通过SDS_15%PAGE、14G2a mAb免疫印迹、然后ECL加上蛋白印迹检测系统(安法马西亚生物技术公司(Amersham Pharmacia Biotech))分析该融合蛋白。免疫如前人所述(Brinker，K.G.，H. Garner,和 J. R. Wright. 2003. Surfactant proteinA modulates the differentiation of murine bone marrow-derived dendritic cells.(表面活性剂蛋白A调控小鼠骨髓衍生的树突细胞分化)Am J Physiol Lung Cell MolPhysiol 284: L232-241 )，从BM前体细胞中体外产生DC。简言之，从6到8周龄的雌性A/J小鼠(n=5)的胫骨和股骨中采集BM细胞，然后在补有10ng/ml GM-CSF的完全培养基中37°C培养6天。每2-3天补充培养基。第7天，多数非贴壁细胞已获得DC形态学，且通过流式细胞术分析确定为⑶I Ic 高和 CD80、CD86、CD40 和 MHC II 类低。DC 以 10 μ g/ml 47-LDA-Fc y 2a融合蛋白或47-LDA多肽(新英格兰肽有限公司(New England Peptide, LLC,)马萨诸塞州加德纳)致敏5小时，用LPS( I. O μ g/ml)孵育I小时以诱导成熟，洗涤并静脉注射(2X IO6)至小鼠(图1A)。在疫苗接种时和五天后分别肌肉注射20yg编码IL-15和IL-21细胞因子的DNA质粒。流式细胞术用生物素标记的47-LDA-Fc Y 2a融合蛋白或47-LDA多肽孵育未成熟DC，然后用链霉亲和素-偶联PE孵育。对于某些实验，DC用以下单抗染色抗⑶llc-FITC、抗⑶80-PE、 抗CD86-PE、抗CD40-PE或抗MHC II类_PE(BD生物科学公司，加利福尼亚州圣何塞)。脾细胞用抗⑶4-PE、抗⑶8-PE、抗⑶25-FITC (BD生物科学公司)或相关的同种对照标记。特异性抗体染色前，细胞用Fe阻断剂(抗⑶16/⑶32单抗)孵育10分钟。细胞用含O. 01%叠氮化钠和1%FCS的HBSS洗涤两遍，用1%多聚甲醛固定，并在分析前4°C避光保存。本底染色用包括适当的荧光染料偶联的或非偶联的小鼠IgGl、IgG2a或IgG2b (BD生物科学公司)的同种对照估计。根据该厂家操作手册用抗FoxP3-AlexaFluor 647mAb (e生物科学公司(eBioscience),加利福尼亚州圣地亚哥)的⑶4+CD25+淋巴细胞的细胞内染色确定腋窝、肱淋巴结和脾脏中Treg细胞的数量。分泌IFN- Y或TNF- α的⑶4+和⑶8+脾细胞的数量使用抗CD4-FITC和抗CD8-FITC mAb联合抗IFN- y -PE或抗TNF- a -PE mAb (BD生物科学公司)确定。通过用检测IL-12p35亚单位内的表位且不与IL-12p40交叉反应的大鼠抗小鼠IL-70p70 mAb (R&D 系统公司(R&D Systems, Inc.))染色测量 IL_12p70 在 LPS 刺激的 DC中的细胞内表达。通过用大鼠抗小鼠CCL22 mAb (R&D系统公司)染色测定CCL22在LPS刺激的DC中的细胞内表达。47-LDA-Fc y 2a\47-LDA多表位(polytope) +或CD86+DC的分选在BD FACSAria 流式细胞仪上进行(BD公司，新泽西州富兰克林湖市)。所有流式细胞术评价都在FACScan或FACSCalibur流式细胞仪上进行。在前向角和侧向角散射参数上设门后，用CellQuest软件(BD生物科学公司)获取并分析至少10，000个门内事件。T细胞的过继性转移和DC疫苗Α/J小鼠海组n=8-10)皮下注射2 X 106NXS2神经母细胞瘤细胞，15天后，通过静脉注射从47-LDA-Fc Y 2a-或47-LDA多表位-DC免疫小鼠中分离的富集⑶8+的脾细胞治疗，如图IA中所述。根据厂家说明书，使用偶联抗小鼠CD4的磁珠(L3T4)和抗小鼠CD45R(B220)mAb (MACS;美天旎生物科学公司(Miltenyi Biotec))阴性选择CD8+脾细胞。所分离的⑶8+脾细胞(2X IO7)用LPS刺激成熟的包被47-LDA多肽或47-LDA-Fc融合蛋白的DC孵育。在rmIL-2 (I μ g/剂量)存在下，T细胞与DC的混合物(20:1比例)静脉注射至清除淋巴细胞的NXS2荷瘤小鼠，如文献所述(Zeng, R. , R. Spolski, S. E. Finkelstein, S.Oh, P. E. Kovanen, C. S. Hinrichs, C. A. Pise-Masison, M. F. Radonovich, J. N. Brady, N.P. Restifo, J. A. Berzofsky,和 W. J. Leonard. 2005. Synergy of IL-21 and IL-15 inregulating CD8+ T cell expansion and function. (IL-21 和 IL-15 在调控 CD8+T 细胞表达和功能中的协同作用)J Exp Med201:139-148)。荷瘤小鼠中的淋巴细胞减少由所述ACT和疫苗接种前一天的5Gy非清髓性TBI或9Gy清髓性TBI加上BM转移(IO7细胞)诱导(图1B)。携带已建立的皮下NXS2肿瘤的对照小鼠用5Gy或9Gy辐射加上BM移植。在IL-15和IL-21载体存在下，小鼠每两周免疫DC疫苗，如文献所述(Kowalczyk，A.，A.ffierzbicki, M. Gil, B. Bambach, Y. Kaneko, H. Rokita, Ε. Repasky, R. Fenstermaker, Μ.Brecher, Μ· Ciesielski,和D.Kozbor. 2007. Induction of protective immune responsesagainst NXS2 neuroblastoma challenge in mice byimmunotherapy with GD2 mimotopevaccine and IL-15 and IL-21 gene delivery.(通过 GD2 模拟表位疫苗和 IL-15 和 IL-21基因递送，在小鼠中诱导针对NX32神经母细胞瘤攻击的保护性免疫应答)Cancer ImmunolImmunother 56:1443-1458)。通过每周I到3次用测微计测量皮下肿瘤和测定肿瘤体积(宽X长X宽/2=mm3)来监测肿瘤生长。对于扩散性疾病的免疫治疗，在肿瘤切除时，NXS2荷瘤小鼠经历了非清髓性(5Gy)或清髓性(9Gy)TBI (图1C)。肿瘤切除一天后，所述小鼠接受来自免疫或未免疫小鼠的脾细胞(2X IO7细胞)的ACT以及DC疫苗。在IL-15和IL-21载体存在下，小鼠每两周 免疫 DC 疫苗，如文献所述(Kowalczyk, A. , A. ffierzbicki, M. Gil, B. Bambach, Y. Kaneko, H.Rokita, E. Repasky, R. Fenstermaker, M. Brecher, M. Ciesielski,和 D. Kozbor. 2007.Induction of protective immune responses against NXS2 neuroblastoma challengein mice by immunotherapy with GD2 mimotope vaccine and IL-15 and IL-21 genedelivery.(通过⑶2模拟表位疫苗和IL-15和IL-21基因递送，在小鼠中诱导针对NX32神经母细胞瘤攻击的保护性免疫应答)Cancer Immunol Immunother 56 :1443-1458)。对照小鼠具有用有或无TBI和BM移植切除的原发性肿瘤。存活时间定义为小鼠因扩展性肿瘤生长或转移发生而处死的时间点。绘制Kaplan-Meier生存曲线，并用对数秩Mantel-Cox方法确定显著性。疫苗诱导的IFN- Y和TNF- α的表达和T细胞增殖的体外分析。分析来自免疫47-LDA-Fc Y 2a或47-LDA多肽包被的DC的Α/J小鼠的脾细胞在用表达47-LDA的DC以20:1的比例过夜刺激后的IFN- Y和TNF- α的表达。从免疫空载的小鼠中分离的细胞作为对照。为研究47-LDA-DC和47-LDA-Fc y 2a_DC疫苗免疫小鼠中的Treg细胞的诱导,最后一次免疫三周后,从免疫小鼠中摘除脾脏、腋窝和肱淋巴结并通过用抗CD4-PE、抗CD25-FITC和抗FoxP3-Alexa Fluor 647 mAb或相关的同种对照染色分析其Treg细胞的数量。为分析Treg细胞对Teff细胞增殖的影响，在37°C下，将来自47-LDA-DC或47-LDA-Fc Y 2a_DC疫苗免疫小鼠的⑶8+T细胞装载25 μ M羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE ；Molecular Probes (分子探针公司)，俄勒冈州尤金市)10分钟，并在有或无Treg细胞(比例I: I)的条件下，用表达47-LDA的同系DC (比例20:1)培养72小时。细胞用PE偶联的抗CD8 mAb染色，并用流式细胞术分析。根据厂家说明书，用CD4+CD25+调节性T细胞分离试剂盒(美天旎公司)分离所述Treg细胞群。为分析ACT和DC疫苗接种后的荷瘤小鼠和无瘤小鼠中的⑶4+和⑶8+T细胞应答，脾细胞用25 μ M CFSE标记，并用表达47-LDA的DC孵育72小时。细胞用PE偶联的抗⑶4或抗⑶8mAb染色,并通过流式细胞术分析。
CTL 试验用表达47-LDA的DC以20:1的比例，以15%T细胞刺激因子(T-STIMTM培养补充剂，协作生物医药产品公司(Collaborative Biomedical Products),马萨诸塞州贝德福德)作为外源IL-2来源培养脾细胞。刺激三天后，细胞分瓶并培养在补有小鼠rIL-2(O. 3ng/ml) (BD生物科学公司)的培养基中。刺激前，根据厂家说明书，通过使用T细胞富集柱(美天旎公司)的阴性选择分离⑶8+T细胞。5天后，通过标准4小时51Cr释放试验分析对NXS2肿瘤细胞的CTL细胞裂解活性。特异性裂解的百分比计算为([实验释放cpm-自发释放cpm]/[最大释放cpm-自发释放cpm] )X 100。从通过加入5%曲通X-100裂解的细胞的上清中确定最大释放。从仅用培养基孵育的靶细胞中确定自发释放。生产用于基于溶瘤性病毒疗法癌症疫苗的表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和47-LDA-Fc Y 2a 融合蛋白的 rOVV。
有各种制作适用于本发明的rOVV的方法。在具体的说明中，表达EGFP和47-LDA-Fc Y 2a融合蛋白的rOVV通过分别使用VSC20痘苗病毒与痘苗穿梭质粒pSEL_EGFP和pCB023-47-LDA-Fc y 2a在CV-I细胞中的同源重组而产生。母代痘苗病毒是带有克隆于VGF基因位置的IacZ基因的VSC20。所述VSC20痘苗病毒如美国专利
发明者D·科兹博 申请人:健康研究股份有限公司