专利名称：马动脉炎病毒的rt-lamp检测试剂及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及马动脉炎病毒的检测技术，具体涉及马动脉炎病毒的RT-LAMP检测试剂及试剂盒。
背景技术：
马病毒性动脉炎是由马动脉炎病毒(Equine viral arteritis, EVA)引起的一种通过呼吸道或生殖器官传播的传染病，是危害养马业的重大疾病之一，被世界动物卫生组织(OIE)列入检疫名录。马动脉炎病毒(EAV)属于套式病毒目(Nidovirale)、动脉炎病
毒科(Arteri--viridae)、动脉炎病毒属(Arterivirus),它是线性单股正链RNA病毒，
含有至少9个以上重叠的开放阅读框架，编码7种结构蛋白小囊膜蛋白(E、GP2b、GP3和 GP4)、核衣壳蛋白(N)、膜基质蛋白(M)、主要囊膜蛋白GP5。1957年Doll等在美国俄亥俄州 Bucyrus首次分离到该病毒，目前分布遍及全世界，多数为亚临床感染，但良种马易发病。病毒只有I个血清型，有欧、美两个代表株，欧洲株为CW株，美洲株为Bucyrus株。近年来，我国社会经济不断发展和人们生活水平不断提高，喜爱养马和赛马的人也越来越多，随着马术比赛国际化交流日益增多，该病的传播风险也越来越高。为防治该病的传播，有必要建立一种快速、高效、操作简便的检测方法。目前EVA的检测方法主要有病毒中和试验、病原鉴定、补体结合试验、血凝抑制试验、酶联免疫吸附试验(ELISA、)和RT-PCR检测等，其中病毒中和试验和病原鉴定(仅限于精液)是OIE国际贸易指定试验方法，授权公告号为CN1851463的发明专利，则公开了间接酶联免疫吸附试验检测EAV方法，RT-PCR检测如杜建等的马动脉炎病毒RT-PCR检测方法的建立(中国动物检疫，2005，(5) :30-32);但上述方法均存在不同的缺点，例如，所需试验周期较长、对仪器要求要求高、操作繁琐、无法现场检测，且灵敏度不高、特异性不强、准确性较低、易受检测材料限制等。研究建立特异、敏感、可对马病毒性动脉炎病毒进行方便、准确检测的方法，在检疫方面具有重要的实际应用价值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供了马动脉炎病毒的RT-LAMP检测试剂及试剂盒，该RT-LAMP检测试剂及试剂盒具有高灵敏度、高特异性、操作简单、对仪器要求简单和结果易于观察等优点，方便适用于现场快速检测；为马病毒性动脉炎的早期防治提供技术支持。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为马动脉炎病毒的RT-LAMP检测试剂，包括F3引物溶液、B3引物溶液、BIP引物溶液和FIP引物溶液，所述F3引物溶液含核苷酸序列为GCCTCGTCTT CGGTCCAT的F3引物，所述B3引物溶液含核苷酸序列为CGCCCGTTTC GAAAAGAGG的B3引物，所述BIP引物溶液含核苷酸序列为TTGAGCGGGG GATGGGAACA CATCGCCAAC TGGTGGTAG的BIP引物，所述FIP引物溶液含核苷酸序列为ACTCAGATAG TGGTTCGCGG CGTCTTGACG CCATCGACAA G 的 FIP 引物。
引物系选择马动脉炎病毒膜蛋白M基因的保守片段为靶目标，应用 PrimerExploer V4 软件(http://primerexplorer. jp/elamp4. O. 0/index, html)分析、设计和合成；将合成的多组内外引物最佳配对筛选实验，得到最合适的上述F3、B3、BIP、FIP 引物；引物由上海生工合成。该RT-LAMP检测试剂组成100 X 25 μ I反应体系的试剂盒10 X ThermoPol缓冲液2. 5 μ 1，浓度8 U / μ L的Bst DNA聚合酶I μ 1，浓度I. 5mM的dNTP 2 μ 1，浓度5 M的甜菜碱(Betaine)2l·! I，浓度25 mM的MgCl2Iy I，浓度都为10 μ M的F3引物溶液和B3引物溶液各0.5 μ 1，浓度都为10μ M的BIP引物溶液和FIP引物溶液各4 μ I。25 μ I检测反应体系时样品DNA模板2 μ 1，余量用双蒸水补足。ThermoPol缓冲液、dNTP液、Bst DNA聚合酶液和Betaine均购于TaKaRa公司。该RT-LAMP检测试剂组成的试剂盒中还可以有阳性对照液和阴性对照液，阳性对照液含有马动脉炎病毒阳性cDNA，阴性对照液为双蒸水，用以对比、验证检测。与现有技术相比，本发明的优点在于马动脉炎病毒的RT-LAMP检测试剂及试剂盒，包括含核苷酸序列为 TTGAGCGGGG GATGGGAACA CATCGCCAAC TGGTGGTAG 的 BIP 引物溶液，含核苷酸序列为CGCCCGTTTC GAAAAGAGG的B3引物溶液、含核苷酸序列为ACTCAGATAG TGGTTCGCGG CGTCTTGACG CCATCGACAA G 的 FIP 引物溶液，含核苷酸序列为 GCCTCGTCTT CGGTCCAT的F3引物溶液、试剂盒中还有IOXThermoPol缓冲液、Bst DNA聚合酶、dNTP、甜菜碱和MgCl2,该RT-LAMP检测试剂及试剂盒对马动脉炎病毒具有高灵敏度，高特异性，操作简单方便只需要简单的水浴锅即可，对仪器要求简单无需昂贵的PCR仪或荧光PCR仪的投入，结果易于观察染料直接肉眼观察结果等优点，适用于现场快速检测1个小时就完成检测；为马病毒性动脉炎的早期防治提供技术支持。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。实施例I、引物设计、筛选和合成选择马动脉炎病毒膜蛋白M基因的保守片段(GENBANK，登陆号为 DQ846750)为靶目标，应用 PrimerExploer V4 软件(http:// primerexplorer. jp/elamp4. O. 0/index, html)分析、设计和合成；将合成的多组内外引物最佳配对筛选实验(特异性和灵敏性试验)，得到最合适的核苷酸序列为GCCTCGTCTT CGGTCCAT的F3引物、核苷酸序列为CGCCCGTTTC GAAAAGAGG的B3引物、核苷酸序列为 TTGAGCGGGG GATGGGAACA CATCGCCAAC TGGTGGTAG 的 BIP 引物、核苷酸序列为ACTCAGATAG TGGTTCGCGG CGTCTTGACG CCATCGACAA G 的 FIP 引物。实施例2、RT-LAMP检测试剂及试剂盒以上述F3引物、B3引物、BIP引物和FIP引物分别配制成引物浓度都为IOyM的F3引物溶液、Β3引物溶液、BIP引物溶液和FIP引物溶液；并组成100Χ25μ I反应体系的试剂盒=IOXThermoPol缓冲液2. 5μ1，浓度8 U / μ L的Bst DNA聚合酶I μ 1，浓度2. 5mM的dNTP 2 μ 1，浓度5 M的甜菜碱(Betaine) 2μ I ，浓度25 mM的MgCl2I μ I，浓度都为ΙΟμΜ的F3引物溶液和Β3引物溶液各O. 5μ1，浓度都为10 μ M的BIP引物溶液和FIP引物溶液各4 μ I。实施例3、特异性试验用QIAGEN核酸提取试剂盒分别提取马动脉炎病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、赤羽病病毒的核酸。然后用cDNA合成试剂盒(购于大连宝生生物)对提取的核酸进行转录5 XAMV Buffer 4μ L,2. 5mM dNTP Mixture 5 μ L， 20 μ M 9N 随机引物 I μ L，Rnase Inhibitor 0. 5 μ L, AMV Rtase I μ L，提取的 RNA 核酸 I μ L，DEPC处理的H2O补齐20 μ L ;将反应溶液轻轻混匀，室温放置lOmin，42°C水浴保温I 小时，后将反应管放入冰中冷却2min，所得产物为cDNA模板，-20°C保存。再用实施例2的 RT-LAMP检测试剂及试剂盒组成25 μ I反应体系10 X ThermoPol缓冲液2. 5 μ I，浓度8 U /μ L的Bst DNA聚合酶I μ 1，浓度2. 5mM的dNTP 2μ1，浓度5 M的甜菜碱(Betaine) 2μ I，浓度25 mM的MgCl2I μ I，浓度都为10 μ M的F3引物溶液和Β3引物溶液各O. 5 μ 1， 浓度都为10 μ M的BIP引物溶液和FIP引物溶液各4 μ 1，cDNA模板2 μ 1，余量用双蒸水补足；在63 °C水浴恒温扩增反应I h，扩增结束后扩增产物中加入IyL SYBR Green I观察颜色变化，结果马动脉炎病毒的扩增产物呈绿色荧光，猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、赤羽病病毒的扩增产物都无颜色变化，说明本发明的RT-LAMP检测试剂及试剂盒对马动脉炎病毒特异性高。实验室也可以取5 UL扩增反应产物上样于I. 5%的琼脂糖胶电泳进行细致检测，马动脉炎病毒的扩增产物出条带并见到绿色荧光，其它病毒的扩增产物无条带，也无绿色荧光。实施例4、灵敏性试验核酸提取、cDNA合成检测和恒温扩增检测与实施例3相同，所不同的只是对马动脉炎病毒的cDNA模板进行梯度稀释成下述浓度进行扩增检测
O.0012pg、0.012pg、0. 12pg、l. 2pg、12pg,结果O. 12pg也可以观察到颜色变化,说明本发明的RT-LAMP检测试剂及试剂盒对马动脉炎病毒灵敏性高，灵敏度比依杜建等建立的马动脉炎病毒RT-PCR检测方法高出100倍，具体杜建等的检测方法在此不作叙述。实施例5、反应体系的优化与实施例4基本相同，只是25 μ I反应体系中，分别对浓度25mM的1%(12用0、1、2、3、4、5μ I扩增反应试验，对浓度10 μ M的F3引物溶液和 Β3 引物溶液用 O. 1,0. 2,0. 3,0. 4,0. 5,0. 6,0. 7,0. 8,0. 9,1 μ I 扩增反应试验，对浓度 10 μ M 的BIP引物溶液和FIP引物溶液用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10μ I扩增反应试验，对浓度5 M 的甜菜碱用0、1、2、3、4、5μ I扩增反应试验，对反应温度进行61、62、63、64、65°C扩增反应试验，结果MgCl2用1μ 1，F3引物溶液和Β3引物溶液都用O. 5 μ 1，BIP引物溶液和FIP引物溶液用4 μ 1，甜菜碱用2 μ 1，反应温度为63°C为优，所以建立10XThermoPol缓冲液
2.5 μ 1，浓度8 U / μ L的Bst DNA聚合酶I μ 1，浓度I. 5mM的dNTP 2 μ 1，浓度5 M的甜菜碱(Betaine) 2μ I，浓度25 mM的MgCl2I μ I，浓度都为10 μ M的F3引物溶液和Β3引物溶液各O. 5 μ 1，浓度都为10 μ M的BIP引物溶液和FIP引物溶液各4 μ I反应体系的试剂盒；访试剂盒也可以是200X25 μ I反应体系，300 X 25 μ I反应体系，或100 X 20 μ I反应体系等，在此不一一举例。实施例6、应用取马血、鼻腔分泌物等进行与实施例3相同的核酸提取、cDNA合成检测和恒温扩增检测，，若扩增产物中呈绿色荧光，则该马感染有马动脉炎病毒，已患或可能会患马病毒性动脉炎，需及时预防和治疗。
权利要求
1.马动脉炎病毒的RT-LAMP检测试剂，包括F3引物溶液、B3引物溶液、BIP引物溶液和FIP引物溶液，其特征在于所述F3引物溶液含核苷酸序列为GCCTCGTCTT CGGTCCAT的 F3引物，所述B3引物溶液含核苷酸序列为CGCCCGTTTC GAAAAGAGG的B3引物，所述BIP引物溶液含核苷酸序列为TTGAGCGGGG GATGGGAACA CATCGCCAAC TGGTGGTAG 的 BIP 引物，所述 FIP 引物溶液含核苷酸序列为ACTCAGATAG TGGTTCGCGG CGTCTTGACG CCATCGACAA G 的 FIP引物。
2.利用权利要求I所述的马动脉炎病毒的RT-LAMP检测试剂组成的试剂盒，为 100 X 25 μ I反应体系的试剂盒，其特征在于该25 μ I反应体系的组份包括IOXThermoPol 缓冲液2. 5 μ 1，浓度8 U / μ L的Bst DNA聚合酶I μ 1，浓度2. 5mM的dNTP 2 μ 1，浓度5 M的甜菜碱2 μ I，浓度25 mM的MgCl2I μ I，浓度都为10 μ M的F3引物溶液和Β3引物溶液各O. 5 μ I，浓度都为10 μ M的BIP引物溶液和FIP引物溶液各4 μ I。
全文摘要
本发明公开了马动脉炎病毒的RT-LAMP检测试剂及试剂盒，包括含核苷酸序列为GCCTCGTCTTCGGTCCAT的F3引物溶液、含核苷酸序列为CGCCCGTTTCGAAAAGAGG的B3引物溶液、含核苷酸序列为TTGAGCGGGGGATGGGAACACATCGCCAACTGGTGGTAG的BIP引物溶液，含核苷酸序列为ACTCAGATAGTGGTTCGCGGCGTCTTGACGCCATCGACAAG的FIP引物溶液，试剂盒中还有10×ThermoPol缓冲液、BstDNA聚合酶、dNTP、甜菜碱和MgCl2，该RT-LAMP检测试剂及试剂盒对马动脉炎病毒具有高灵敏度，高特异性，操作简单方便，对仪器要求简单，结果易于观察等优点，适用于现场快速检测；为马病毒性动脉炎的早期防治提供技术支持。
文档编号C12Q1/70GK102605101SQ201210056298
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月6日 优先权日2012年3月6日
发明者于纪棉, 倪健波, 张超, 戚亭, 李如松, 杨文潮, 王建峰, 相文华, 章胜乔, 郭巍, 黄素文 申请人:宁波检验检疫科学技术研究院