一种单链抗体及其在检测β-兴奋剂中的应用的制作方法

专利名称：一种单链抗体及其在检测β-兴奋剂中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种单链抗体及其在检测0 -兴奋剂中的应用。
背景技术：
￠-兴奋剂(P-agonist)全称￠-肾上腺素受体激动剂(P-adrenoceptoragonist)，是一类化学结构和生理功能类似肾上腺素和去甲肾上腺素的苯乙胺类药物(phenethylamines, PEAs)。常见的P _兴奋剂为克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇等。根据苯环取代基，可将PEAs分为苯胺型和苯酚型苯胺型PEAs结构中具有芳伯胺基，中等极性；苯酚型PEAs —般具有邻(间)苯二酚或苯酚结构。P -兴奋剂能选择性地与细胞膜上的P -肾上素受体结合，起到调节交感神经兴奋、松弛气管平滑肌的功能，因 此在临床上常用于人和动物哮喘类病症的治疗。当￠-兴奋剂用量为临床用量的5-10倍时，能够影响营养物质在动物体内的流向和重新分配，使体内的脂肪分解代谢增强、蛋白质合成和骨骼肌合成增加，并减少脂肪组织，显著提高瘦肉率。最早被用于提高动物瘦肉率的
兴奋剂是克伦特罗，但随着世界范围内对其禁用，莱克多巴胺、沙丁胺醇等成为克伦特罗最常用替代品。^ -兴奋剂残留会聚集在动物可食用组织中，由于其口服活性，一旦通过食物链进入人体，会对健康产生极大的危害，人体中毒后常表现为心跳过速、心率失常、肌肉震颤、头晕头痛、呕心呕吐、发热寒战等症，特别对患有“富贵病”等症的病人及免疫力较低的老人和儿童危害更大，甚至会导致死亡。自从1998年香港发生第一起“瘦肉精”中毒事件后，近二十年来，我国因非法添加兴奋剂而导致的食物中毒事件屡见不鲜。国外也常有相关食物中毒事件的报道。目前
包括我国在内的许多国家都不允许￠-兴奋剂用于食用动物的促生长。我国农业部发布的《关于严禁非法使用兽药的通知》中，明令禁止将P -兴奋剂等药物作为饲料添加剂使用。然而，在经济利益的驱使下，我国部分地区的饲料加工企业和养殖场频繁使用，屡禁不止。瘦肉精事件已引起社会广泛关注，成为严峻的食品安全问题。目前，国内外均对￠-兴奋剂做出了严格的残留限量规定。克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇等几种重要的药物禁止使用于畜牧业，在畜产品中不得检出。^ -兴奋剂残留的主要检测方法有色谱法、免疫分析法、毛细管电泳法及电化学法等。色谱法包括气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、气质联用法(GCMS)、液质联用法(LC-MS)。免疫分析法包括酶联免疫法、胶体金免疫法、时间分辨免疫荧光测定等。其中，免疫分析方法最为快速、经济，但目前应用于免疫检测的抗体主要是多克隆抗体和单克隆抗体，大部分为针对克伦特罗的抗体，而对于沙丁胺醇和其他P -兴奋剂的抗体的制备研究均处起步阶段，因此，尚无成熟的P -兴奋剂多残留免疫检测技术出现。

发明内容
本发明的目的是提供一种单链抗体及其在检测￠-兴奋剂中的应用。
本发明提供的单链抗体，是由重链可变区、连接肽和轻链可变区组成的多肽；所述连接肽位于所述重链可变区与所述轻链可变区之间；所述重链可变区如序列表的序列I自N末端第I至122位氨基酸残基所示；所述轻链可变区如序列表的序列I自N末端第143至251位氨基酸残基所示。所述连接肽可如序列表的序列I自N末端第123至142位氨基酸残基所示。所述单链抗体具体可为序列表的序列I所示的多肽或序列表的序列4所示的多肽。本发明还保护编码所述单链抗体的基因，由所述重链可变区的编码序列、所述连接肽的编码序列和所述轻链可变区的编码序列组成。 所述重链可变区的编码序列可如序列表的序列2自5’末端第9至374位核苷酸所示。所示轻链可变区的编码序列可如序列表的序列2自5’末端第435至761位核苷酸所示。所述连接肽的编码序列可如序列表的序列2自5’末端第375至434位核苷酸所
/Jn o所述基因具体可为如下(a)或(b): (a)序列表的序列2自5’末端第9至761位核苷酸所示的DNA分子；(b)序列表的序列2自5’末端第9至800位核苷酸所示的DNA分子。所述基因具体可为如下(a)或(b): (a)序列表的序列2自5’末端第9至752位核苷酸所示的DNA分子；(b)序列表的序列2自5’末端第9至791位核苷酸所示的DNA分子。含有所述基因的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系均属于本发明的保护范围。所述重组载体具体可为将所述基因插入pET_22b(+)质粒得到的重组质粒，更具体*为将所述基因插入pET-22b(+)质粒的NcoI和XhoI酶切位点之间得到的重组质粒。所述重组菌具体可为将所述重组质粒导入大肠杆菌得到的重组菌，更具体可为将所述重组质粒导入大肠杆菌BL21 (DE3)菌株得到的重组质粒。本发明还保护一种制备所述单链抗体的方法，是发酵培养所述重组菌，得到所述单链抗体。所述方法具体包括如下步骤(I)将所述重组菌培养至0D600=1. 0时加入IPTG并使其浓度为0. 5mM，然后25°C、250rpm振荡培养8小时，离心收集菌体沉淀；(2)将步骤(I)得到菌体进行细胞破碎，离心收集上清液；(3)将步骤(2)得到的上清液依次进行透析和浓缩，得到单链抗体溶液。本发明还保护以上任一所述单链抗体在检测P -兴奋剂中的应用。所述0 -兴奋剂具体可为克伦特罗、沙丁胺醇、溴布特罗、马布特罗或特布他林。所述单链抗体具体可为采用以上所述方法制备得到的单链抗体。重组抗体是新发展起来的第三代抗体制备技术，通过对抗体文库的高效筛选，可以获得特性优良的抗体片段。通过高效的表达系统表达该抗体片段，可以低成本、大量制备该抗体片段。本发明针对目前单克隆抗体和多克隆抗体的不足，以AFMl特异性单抗杂交瘤为来源，制备单链抗体(scFv)，并采用蛋白质体外进化技术和噬菌体展示抗体库技术对其进行性能优化，提高其亲和力及对不同AFT的交叉反应率。本发明提供的单链抗体对多种P -兴奋剂具有良好的交叉反应率、高亲和力和高灵敏度，适用于多种多残留￠-兴奋剂的快速免疫检测，将在￠-兴奋剂检测中发挥重大作用。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例中所用的PBS缓冲液，如无特殊说明，均为pH7. 4,0. OlM的PBS缓冲液。实施例中所用的碳酸盐缓冲液均为pH9. 6,0. 05mol/L的碳酸钠缓冲液。卵清白蛋白简称0VA。实施例I、单链抗体的发现 以小鼠的脾细胞为基因来源，构建天然噬菌体单链抗体展示文库，使用克伦特罗为抗原，从该文库中筛选获取具有免疫亲和力的单链抗体。以此单链抗体为基础，通过同源建模进行蛋白质3D结构模拟，并采用计算机模拟对接技术来分析该单链抗体对不同3 -兴奋剂的识别位点和结合能力。在此抗原抗体互作分析的指导下，进行关键位点的定点突变并构建核糖体展示文库，从中筛选获得对3 -兴奋剂具有广谱性识别能力和较高结合能力的单链抗体。I、天然噬菌体单链抗体展示文库的构建及筛选(I)文库构建取Balb/c小鼠脾脏，分离脾细胞，提取总RNA，使用Qiagen试剂盒纯化得到mRNA，逆转录得到cDNA。使用全套引物，以cDNA为模板分别扩增得到重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)基因，并通过重叠延伸PCR技术(S0E-PCR)拼接上述VH、VL基因，以“VH-连接肽-VL”形式组装为全长scFv基因。将此多样性scFv基因克隆至pCANTAB5e噬菌粒载体中，转化至XLl-Blue感受态细胞，构建噬菌体展示文库。(2)文库筛选使用生物素化的克伦特罗为筛选抗原，以链霉亲和素包被的纳米磁珠为固相载体和分离系统，对上述文库进行4轮亲和富集，并在最后一轮亲和富集后，随机挑选10株单克隆菌落，进行scFv表达和免疫分析鉴定。2、0 -兴奋剂scFv同源建模及分子对接(I)同源建模将scFv序列中的VL和VH序列分别提交至蛋白质数据库(Protein Data Bank,Brookhaven National Laboratory),通过BLAST比对获取同源性最高的蛋白质晶体结构。使用Discovery Studio 2. 5. 5 (DS 2. 5. 5)中Modeler算法对上述VL、VH序列和其同源性晶体结构进行比对(Alignment)，并以晶体结构模板中的抗体可变区框架区为基础构建同源模型。由于抗体⑶R区域变异性较高，因此在上述同源模型基础上利用DS 2. 5. 5中Looper算法界定所得VL、VH模型中的CDR区，并针对CDR区进行PDB数据库检索，获取同源性最高的CDR晶体结构模板并重新构建CDR区。针对变异性最高的HCDR3区，由于其最佳模板的同源性低于50%，因此采用de novo算法重头计算获取其合理构象。在分别构建、获取VH和VL的同源模型后，通过最小二乘法进行蛋白质主链结构重叠以最终构建Fv结构，并进行200步最陆下降法能量最小化(steepest descent energy minimization)和200步共辄梯度能量最小化(Cojugate Gradient energy minimization)。最终所得scFv空间结构模型。(2)分子对接￠-兴奋剂化学结构由NCBI PubChem数据库检索获得。使用DS 2. 5. 5和CXDCGoldsuite 4. 2进行上述P -兴奋剂特异性scFv与克伦特罗分子的柔性对接。获得10个对接结果，采用Gold score对所有对接结果中的小分子构象进行评估，并使用DS 2. 5. 5中配体分析模块(Analyze biding site tool)对结果进行进一步分析。经分析，scFv中抗体重链H CDR3区中H105Tyr和H106Gly分别于克伦特罗分子中的羟基形成了较强的氢键作用，同时轻链L CDR3中L93Trp则通过侧链中的吲哚基团与 克伦特罗中分子的形成了 2对稳定的JI-Ji共轭电子云结构，上述氢键和共轭作用为抗原抗体相互作用中的主要作用力。3、scFv高变区(CDRs)定点突变及筛选在抗体与半抗原的结合中，抗体结构中的⑶Rs区域，尤其是重链⑶R3 (HCDR3)和轻链CDR3(LCDR3)发挥着最为重要的作用。同时，由于半抗原分子的体积极小，故往往其只能够和6个⑶R区中的少数几个发生接触。因此，需要通过分子模拟来指导后续优化，选取相对有效的突变区域及进化策略。根据上述计算机分子模拟分析结果，在scFv对克伦特罗的结合中，重链CDR3区的H105Tyr和H106Gly，轻链CDR3区的L93Trp发挥着最为重要的作用，形成了氢键以及较强的JI-Ji相互作用。此外，轻重链高变区氨基酸形成了极性洞穴。以此分析为指导，选取克伦特罗分子周围50nm范围内的氨基酸残基作为突变靶位点，共选取18个氨基酸残基。根据已知的scFv基因序列设计简并引物，通过PCR技术分别在单链抗体中靶位点引入突变。为避免产生过多无活性或不能正常表达的克隆，采用经调整的“NNS”简并密码子引入突变，在每个氨基酸突变点产生50%的随机突变几率。将PCR扩增产物克隆至核糖体展示载体中，构建核糖体展示文库。每次进行6-7个氨基酸的随机突变，约产生I. 3 X IO9个突变子，所构建的核糖体展示文库约为IXlOici-11,良好的覆盖了所有可能的突变子，达到了高通量突变体筛选的要求。4、活性克隆表达及鉴定在构建突变核糖体展示文库后，使用生物素标记的半抗原和链霉亲和素包被的纳米磁珠对文库中的活性克隆进行纯液相免疫亲和富集筛选。共进行6轮，在每轮富集中逐步降低筛选所用抗原浓度，并更换不同的进化目标对突变文库进行富集筛选(分别为克伦特罗、沙丁胺醇和特布他林)，以改善抗体对同族药物的交叉反应率以及亲和力。在最后一轮富集结束后，随机挑选单独菌落克隆进行scFv的分泌表达，并制备周至腔提取物，进行SDS-Page和ELISA鉴定。所得scFv序列如序列表的序列I所示。序列I中，自N末端第I至122位氨基酸残基为重链可变区，第123至142位氨基酸残基为连接肽，第143至251位氨基酸残基为轻链可变区。实施例2、单链抗体的制备
一、重组质粒的构建I、合成序列表的序列2所不的双链DNA分子(自5’末端第I至6位核苷酸为NcoI酶切识别序列，第9至374位核苷酸为重链可变区的编码序列，第375至434位核苷酸为连接肽的编码序列，第435至761位核苷酸为轻链可变区的编码序列，第771至800位核苷酸为C-myc tag标签的编码序列，第801至806位核苷酸为XhoI酶切识别序列)。2、以步骤I合成的双链DNA分子为模板，用Fl和Rl组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。Fl :5，-CCATGGAAGAAGTTCAGC-3，；Rl 5 -CTCGAGCAGGTCTTCTTCC-3'
3、用限制性内切酶NcoI和XhoI双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。4、用限制性内切酶NcoI和XhoI双酶切pET_22b (+)质粒(Novagen,北京)，回收载体骨架(约5424bp)。5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒。根据测序结果，对重组质粒进行结构描述如下在pET-22b (+)质粒的NcoI和XhoI酶切位点之间插入了序列表的序列2所示的双链DNA分子。在重组质粒中，序列表的序列2所示的双链DNA分子5’末端与载体骨架上的引导肽pelB的编码序列融合、3’末端与载体骨架上的His-tag标签的编码序列融合，表达融合蛋白。二、重组菌的构建将步骤一构建的重组质粒导入大肠杆菌BL21 (DE3)菌株(Novagen,北京),得到重组菌。三、单链抗体的表达I、将步骤二构建的重组菌接种至Super Broth培养基,使重组菌的初始浓度为0D600=0. l，37°C、250rpm 振荡培养至 0D600=1. 0 ;加入 IPTG 并使其浓度为 0. 5mM，25°C、250rpm振荡培养8小时；然后将菌液6000g离心15min，收集菌体沉淀，进行细胞破碎(超声破碎的参数超声探头为60，功率400W，全程工作时间30分钟，其中，每个循环超声3秒间隔5秒钟)，离心(12000g、30min)收集上清液，然后将上清液在PBS缓冲液中进行透析，透析结束用0. 22 ii m滤膜过滤,收集滤液4° C保存备用。2、将Ig粉状Ni-IDA树脂(德国MACHEREY-NAGEL公司)溶于5mL超纯水，然后加入层析柱，使其在重力作用下沉积形成稳定的柱床。待层析柱中的水液面降至柱床面时，缓慢加入5倍柱体积的pH 8. OPBS缓冲液进行纯化柱平衡。随后加入步骤I收集的滤液,使其在重力作用下通过纯化柱，当其液面降至柱床面时，加入10倍柱体积的含20mM咪唑的pH
8.OPBS缓冲液进行洗涤，去除杂蛋白。最后加入3倍柱体积的含IOOmM咪唑的pH8. 0的PBS缓冲液，洗脱目的蛋白，收集过柱后洗脱液。最后用40g/100mL的PEG8000水溶液对过柱后洗脱液进行浓缩(4°C )，得到单链抗体溶液。四、对照溶液的制备I、合成序列表的序列3所不的双链DNA分子(自5’末端第I至6位核苷酸为NcoI酶切识别序列，第18至47位核苷酸为C-myc tag标签的编码序列，第48至53位核苷酸为XhoI酶切识别序列)。步骤2至4同步骤一的2至4。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到对照质粒。根据测序结果，对重组质粒进行结构描述如下在pET-22b (+)质粒的NcoI和XhoI酶切位点之间插入了序列表的序列3所示的双链DNA分子。6、将5得到的对照质粒重组质粒导入大肠杆菌BL21 (DE3)菌株(Novagen,北京)，得到对照菌。7、将对照菌代替重组菌进行步骤三，得到对照溶液。实施例3、单链抗体的应用一、CLE-OVA 的制备盐酸克伦特罗(CLE):购自美国Sigma-Aldrich公司，产品目录号为C275。
I、包被原及其制备用重氮化法将半抗原CLE偶联与载体蛋白OVA上，由于CLE具有芳伯氨基的半抗原，在强酸和冷却条件下芳伯氨基生成亲电动重氮盐，与载体蛋白中的强给电子集团发生反应，生成重氮产物，形成包被抗原CLE-0VA。制备过程如下(I)将5mg盐酸克伦特罗溶于3ml 0. IM盐酸水溶液中，得到盐酸克伦特罗的水溶液，并预冷至0°c ;向盐酸克伦特罗的水溶液中加入IOmg NaNO2,4 °C条件下搅拌5h，形成溶液I ;(2)将20mg0VA溶于5ml PBS缓冲液中，得到OVA的溶液；(3)将OVA的溶液加到溶液I中，4°C条件下搅拌6h，然后装入透析袋，在生理盐水中4°C透析72h(中间换水6次)，然后于4°C条件下，8000rmp离心30min，取上清，即CLE-OVA溶液，分装于安培瓶中，_20°C保存。(4)将CLE-OVA溶液用PBS缓冲液稀释后，测定280nm和260nm的分光光度值，按公式计算稀释液中的蛋白浓度，将测得的蛋白浓度值乘以其稀释倍数后即为原CLE-OVA溶液中的 CLE-OVA 浓度。蛋白质浓度(mg/ml) =1. 45XOD280-O. 74X0D26(I。CLE-OVA 溶液中的CLE-OVA 浓度为 4. 8mg/ml。2、CLE-OVA 的表征将CLE-OVA溶液用PBS缓冲液稀释(使CLE-OVA的浓度为5mg/mL)，作为溶液甲；将含5mg/mL CLE的PBS缓冲液作为溶液乙；将含5mg/mL BSA的PBS缓冲液作为溶液丙。分别将溶液甲、溶液乙和溶液丙进行紫外(200-380nm)光谱扫描。与溶液丙相比溶液甲的紫外图谱发生了明显变化，说明化合物与BSA成功偶联。二、单链抗体的应用I、采用实施例2制备的CLE-OVA (采用碳酸盐缓冲液调节浓度)进行包被，100 U L/孔；CLE-0VA的包被浓度为I U g/mL。2、4°C孵育 16 小时。3、封闭并洗板。4、每孔加入50 ii L盐酸克伦特罗(由盐酸克伦特罗和PBS缓冲液组成；克伦特罗的浓度分别为 0. 0001ng/ml、0. 001ng/ml、0. 01ng/ml、0. 05ng/ml、0. lng/ml、0. 5ng/ml、0. 8ng/ml> lng/ml>5ng/ml> IOng/ml ;将只加入PBS缓冲液的孔作为对照孔)；每个浓度设置3个复孔。5、每孔加入50 ii L实施例2制备的单链抗体溶液。
6、室温孵育2h,洗板。7、每孔加入IOOii L辣根过氧化物酶标记的抗C-myc抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司，TA-I )，室温孵育2h。8、洗板。9、加入TMB显色液，避光显色15min。10、每孔加入100 u L 2mol / L硫酸中止反应；读OD450值。
将采用各个浓度的盐酸克伦特罗得到的吸光值(三个复孔的平均值)除以对照孔的吸光值作为纵坐标，以盐酸克伦特罗浓度(ng/ml)为横坐标绘制曲线图。对照曲线图，得到纵坐标数值等于50%时对应的盐酸克伦特罗浓度(U g/L),即IC5tl值。单链抗体检测盐酸克伦特罗的IC5tl值为0. 05ng/ml，检测限为0. 01ng/ml。三、对照试验将对照溶液代替单链抗体溶液，其它均同步骤二，采用各个盐酸克伦特罗浓度的吸光值均相等，均未发生酶联免疫反应。四、单链抗体的交叉反应率I至3同步骤二的I至3。4、每孔加入50 ii LP-兴奋剂(由P-兴奋剂和PBS缓冲液组成；￠-兴奋剂的浓度分别为 0. 0001ng/ml、0. 001ng/ml、0. 01ng/ml、0. 05ng/ml、0. lng/ml、0. 5ng/ml、0. 8ng/ml、lng/ml>5ng/ml> IOng/ml ;将只加入PBS缓冲液的孔作为对照孔)；每个浓度设置3个复孔。分别采用以下几种P -兴奋剂克伦特罗中国兽医药品监察所；沙丁胺醇Dr.公司，C16903000；溴布特罗Dr.公司，CDCT-XA10683000AL；马布特罗百灵威科技技术有限公司，M104000 ；特布他林Dr.公司，C16903015。5至10同步骤二的5至10。将采用各个浓度的具体P -兴奋剂得到的吸光值(三个复孔的平均值)除以对照孔的吸光值作为纵坐标，以具体￠-兴奋剂浓度(ng/ml)为横坐标绘制曲线图。对照曲线图，得到纵坐标数值等于50%时对应的具体P -兴奋剂浓度(U g/L),即IC5tl值。用下式计算单链抗体对P -兴奋剂的交叉反应率。
、单链抗体检测盐酸克伦特罗的1(5。值
交叉反应率(％) = - X100%O
单链抗体检测其它P -兴奋剂的10 值单链抗体检测沙丁胺醇的交叉反应率为90%。单链抗体检测溴布特罗的交叉反应率为65%。单链抗体检测马布特罗的交叉反应率为52%。单链抗体检测特布他林的交叉反应率为45%。可以开发用于同时检测上述￠-兴奋剂检测的快速产品。
权利要求
1.一种单链抗体，是由重链可变区、连接肽和轻链可变区组成的多肽；所述连接肽位于所述重链可变区与所述轻链可变区之间；所述重链可变区如序列表的序列I自N末端第I至122位氨基酸残基所示；所述轻链可变区如序列表的序列I自N末端第143至251位氨基酸残基所示。
2.如权利要求I所述的单链抗体，其特征在于所述连接肽如序列表的序列I自N末端第123至142位氨基酸残基所示。
3.如权利要求2所述的单链抗体，其特征在于所述单链抗体为序列表的序列I所示的多肽或序列表的序列4所示的多肽。
4.编码权利要求I所述单链抗体的基因，由所述重链可变区的编码序列、所述连接肽的编码序列和所述轻链可变区的编码序列组成。
5.如权利要求4所述的基因，其特征在于所述重链可变区的编码序列如序列表的序列2自5’末端第9至374位核苷酸所示；所示轻链可变区的编码序列如序列表的序列2自5’末端第435至761位核苷酸所示。
6.如权利要求5所述的基因，其特征在于所述连接肽的编码序列如序列表的序列2自5’末端第375至434位核苷酸所示。
7.如权利要求6所述的基因，其特征在于所述基因为如下(a)或(b) Ca)序列表的序列2自5’末端第9至761位核苷酸所示的DNA分子； (b)序列表的序列2自5’末端第9至800位核苷酸所示的DNA分子。
8.含有权利要求4至7中任一所述基因的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。
9.制备权利要求I至3中任一所述单链抗体的方法，是发酵培养权利要求8所述重组菌，得到所述单链抗体。
10.权利要求I至3中任一所述单链抗体在检测P-兴奋剂中的应用。
全文摘要
本发明公开了单链抗体及其在检测β-兴奋剂中的应用。本发明提供的单链抗体，是由重链可变区、连接肽和轻链可变区组成的多肽；所述连接肽位于所述重链可变区与所述轻链可变区之间；所述重链可变区如序列表的序列1自N末端第1至122位氨基酸残基所示；所述轻链可变区如序列表的序列1自N末端第138至246位氨基酸残基所示。本发明提供的单链抗体对多种β-兴奋剂具有良好的交叉反应率、高亲和力和高灵敏度，适用于多种多残留β-兴奋剂的快速免疫检测，将在β-兴奋剂检测中发挥重大作用。
文档编号C12N5/10GK102653561SQ20121016071
公开日2012年9月5日 申请日期2012年5月22日 优先权日2012年5月22日
发明者丁双阳, 史为民, 吴聪明, 孟辉, 张素霞, 江海洋, 沈建忠, 温凯, 王战辉 申请人:中国农业大学