专利名称：具有纤维素酶活性的重组利迪链霉菌及其构建方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程菌及其构建方法与应用，特别涉及具有纤维素酶活性的重组利迪链霉菌及其构建方法与应用。
背景技术：
我国是以种植业为基础的农业大国，许多重大病害，如灰霉病、炭疽病、番茄叶霉病、西瓜枯萎病、小麦赤霉病等对农业生产造成了严重损失。每年通过使用农药可减少经济损失达300亿元左右，但化学农药施用量占农药用量的80%以上，造成严重的环境污染、农药残留、抗性增加等，严重威胁着人类的健康和生态环境。因此，生物防治是农药发展的必然趋势。微生物及其代谢产物具有高度专一性，杀虫效率高，不杀伤天敌，且容易降解，无残留，对人畜无毒，能增强植物的抗病性，刺激植物生长，同时能够有效缓解化学农药带来的抗药性等优点。近几年微生物农药在生产上的推广应用，已经产生了巨大的经济效益、社会 效益和生态效益，目前已被很多国家列入国家重点科研规划。根据用途和防治对象的不同，用于生物防治的微生物种类也很多样，其中放线菌由于次生代谢产物丰富而广泛应用于农业生物防治中，放线菌的代谢产物——抗生素在医疗、饲料及农业生产中做出了很大贡献。放线菌的生防作用主要是通过重寄生作用，竞争作用，分泌抗生素、酶及其他次生代谢物质等方式抑制病原真菌的生长。目前，关于链霉菌的研究主要集中于其次生代谢产物的分离鉴定、抗生素合成代谢调控、产品开发等方面的研究，关于生防菌的多功能性研究得比较少。但是，作为天然菌株，单一菌株的代谢产物种类有限，会出现抑菌机制单一，抑菌能力差，抑菌谱窄等现象，将两种或者几种活性物质共同作用于病原菌，可以产生协同效应，很好的抑制病原菌的生长。利迪链霉菌(S. lydicus) A02是分离自北京郊区的一株产纳他霉素的放线菌，该菌具有较强的抗真菌活性，对灰霉病菌(Botrytis cinerea)、番茄早疫病菌(Alternayiasolani)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearium)、番爺叶霉病菌(Fulviafulva)、芳:菜斑枯病菌(septoria apiicola)、大葱紫斑病菌(Alternaria poprri)、水稻稻痕病菌(Pyricularia oryzae)、玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)等多种植物真菌性气传病害的病原菌有明显的抑制作用，为了开发防效更好的植物病害生防制剂，需要研发抗菌活性更高的新菌株。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题是提供构建对植物病原真菌的抗菌活性高于宿主利迪链霉菌的重组利迪链霉菌(基因工程菌)的方法，该重组利迪链霉菌具有纤维素酶活性。本发明所提供的构建具有纤维素酶活性的重组利迪链霉菌的方法，包括将SEQIDNo. I所示的纤维素酶的编码基因导入作为宿主菌的利迪链霉菌中筛选得到具有纤维素酶活性的重组利迪链霉菌的步骤。
上述方法中，所述纤维素酶的编码基因的编码序列为SEQ ID No. 2的第14-1495位。上述方法中，所述纤维素酶的编码基因通过所述纤维素酶编码基因的表达载体导入作为宿主菌的利迪链霉菌中，所述纤维素酶编码基因的表达载体中启动所述纤维素酶编码基因转录的启动子是红霉素抗性基因启动子。在本发明的一个实施例中，所述红霉素抗性基因启动子的核苷酸序列是SEQIDNo. 3。上述方法中，所述将SEQ ID No. I所示的纤维素酶的编码基因导入作为宿主菌的利迪链霉菌包括如下步骤将所述纤维素酶编码基因的表达载体导入大肠杆菌中得到重组大肠杆菌，再将所述重组大肠杆菌与所述作为宿主菌的利迪链霉菌进行双亲接合获得具有纤维素酶活性的重组利迪链霉菌。 在本发明的实施例中，所述纤维素酶活性体现为降解羧甲基纤维素钠。 在本发明的实施例中，所述纤维素酶编码基因的表达载体为将所述纤维素酶的编码基因插入PIB139的所述红霉素抗性基因启动子下游得到的重组表达载体，具体是将SEQID No. 2所示的DNA片段经NdeI和EcoRI酶切后插入pIB139的NdeI和EcoRI位点得到的重组表达载体pIB139-glu。在本发明的实施例中，所述作为宿王囷的利迪链霉囷可为利迪链霉囷(Streptomyces lydicus) A02CGMCC No. 1654,所述大肠杆菌为去甲基化 E. coliET12567 (pUZ8002)。本发明所要解决的另一个技术问题是提供由上述任一种方法得到的重组利迪链霉菌。所述重组利迪链霉菌具体可为利迪链霉菌AG02，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No. 6814。本发明所要解决的再一个技术问题是提供所述重组利迪链霉菌的用途。本发明所提供的用途是下述I)或2)或3)或4):I)所述重组利迪链霉菌或其代谢物在抑制植物病原真菌中的应用；2)所述重组利迪链霉菌或其代谢物在制备植物病原真菌抑制剂中的应用；3)所述重组利迪链霉菌或其代谢物在制备植物真菌病害抑制剂中的应用；4)所述重组利迪链霉菌或其代谢物在抑制植物真菌病害中的应用。上述应用中，所述植物病原真菌为下述至少一种甘蓝枯萎病菌(Fusariumoxysporum f. sp. conglutinans)和西瓜枯萎病菌(F. oxysporumf. sp. niveum)；所述植物真菌病害为下述至少一种由甘蓝枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp.conglutinans)引起的病害和由西瓜枯萎病菌(F. oxysporum f. sp. niveum)引起的病害。所述重组利迪链霉菌的代谢物可从重组利迪链霉菌的发酵液中获得。所述重组利迪链霉菌的代谢物具体可按照如下方法制备，在液体培养基中培养所述重组利迪链霉菌，除去液体培养物(发酵液)中的重组利迪链霉菌即得到所述重组利迪链霉菌的代谢物。实验证明，本发明构建的重组利迪链霉菌增强了宿主利迪链霉菌对植物病原真菌的抗菌活性，特别是对西瓜枯萎病菌的抗菌活性是宿主利迪链霉菌的I. 5倍，对甘蓝枯萎病菌的抑菌活性是利迪链霉菌A02的I. 4倍。
生物材料信息分类命名利迪链霉菌(Streptomyceslydicus)菌株编号AG02保藏机构中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏机构简称CGMCC地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号
保藏日期2012年11月12日保藏中心登记入册编号CGMCC No. 6814下面结合具体实施例详细描述本发明，这些实施例用于理解而不是限制本发明。
图I为纤维素酶基因表达载体pIB139_glu的NdeI和EcoRI酶切结果。其中，泳道M为DNA分子量标准，I和2为pIB139_glu。图2为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus) AG02和利迪链霉菌(Streptomyceslydicus) AO2 的纤维素降解活性。其中，左侧平板为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus) AG02,右侧平板为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus) A02。图3为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus) AG02和利迪链霉菌(Streptomyceslydicus) AO2 的抑菌活性比较。A中的病原菌为西瓜枯萎病菌,左侧为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus) A02发酵液上清对西瓜枯萎病菌的抑菌圈，右侧为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AG02发酵液上清对西瓜枯萎病菌的抑菌圈。B中的病原菌为甘蓝枯萎病菌,左侧为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus) A02发酵液上清对甘蓝枯萎病菌的抑菌圈，右侧为利迪链霉菌(Sti^ptomyces lydicus)AG02发酵液上清对甘蓝枯萎病菌的抑菌圈。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的链霉菌表达载体pIB139 (Christopher J. Wilkinson, etal.Increasingthe Efficiency of Heterologous Promoters in Actinomycetes. J. Mol.Microbiol. Biotechnol. (2002)4(4) :417 - 426.)公众可从北京市农林科学院获得，以重复本申请实验。下述实施例中的去甲基化E. coliET12567(pUZ8002) (Paget MSB, ChamberlinL，Atrih A,Foster SJ，Buttner MJ. Evidence that the extracytoplasmic functionsigma factorsigma(E) is required for normal cell wall structure in Streptomycescoelicolor A3 (2) · JBacteriol. (1999) 181:204 - 211)公众可从北京市农林科学院获得，以重复本申请实验。
下述实施例中的病原菌甘蓝枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp.conglutinans)和西瓜枯萎病菌(F. oxysporum f. sp. niveum)(隋勤，刘伟成，裘季燕，刘霆，潘争艳，刘学敏.利迪链霉菌A02的抑菌谱及其抑菌活性的稳定性.植物保护，2007, 33(5)67-71 ;卢彩鸽，刘伟成，刘霆，董丹，张涛涛，刘德文.利迪链霉菌AOl活性代谢产物对甘蓝枯萎病菌的抑制作用及其机理.中国农业科学2012，45(18) :3764-3772)公众可从北京市农林科学院获得，以重复本申请实验。实施例I、构建抗植物病原真菌的重组利迪链霉菌I、纤维素酶基因表达载体pIB139_glu的构建本实施例构建的纤维素酶基因表达载体名称为pIB139_glu，该载体中含有纤维素酶基因(编码序列是SEQ ID No. 2的第14-1495位，编码SEQ ID No. I的蛋白质)。pIB139-glu中启动该纤维素酶基因转录的启动子是红霉素抗性基因启动子(SEQ IDNo. 3)。
pIB139-glu的具体构建方法如下将SEQ ID No. 2所示的两端带有NdeI和EcoRI酶切位点的纤维素酶基因片段经NdeI和EcoRI酶切后与经过相同酶切的链霉菌表达载体PIB139 (携带SEQ ID No. 3的红霉素抗性基因启动子PermE)连接，得到将pIB139的NdeI和EcoRI之间的片段替换为纤维素酶基因的重组表达载体pIB139-glu。pIB139-glu转化大肠杆菌DH5 α，以阿泊拉霉素(apramycin)抗性筛选从而获得携带纤维素酶基因的转化子，该转化子以p3 (5’ -GGAATTCCATATGATGAAACGGTCAATCTCG-3)和 p4 (5’ -GGAATTCCTAATCAGTTTTCCTTGA-3')为引物进行 PCR 扩增得到约 I. 5kb 的片段，用NdeI和EcoRI酶切pIB139-glu得到5. 9kb的pIB139质粒片段及约I. 5kb的纤维素酶基因片段(图1)，从而确定纤维素酶基因片段正确连接到PIB139载体中。2、利用pIB139_glu将纤维素酶基因导入利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02CGMCC No. 1654得到具有纤维素酶活性的重组利迪链霉菌将pIB139-glu载体转化去甲基化E. coliET12567 (pUZ8002)，通过两亲接合的方法，转化利迪链霉菌A02，通过阿泊拉霉素抗性筛选得到阳性转化子，PCR验证得到正确的转化子。具体转化方法如下I)将 pIB139-glu 载体转化去甲基化 E. coliET12567 (pUZ8002)通过热激法将pIB 139-glu 载体导入 E. coliET12567 (pUZ8002)并经过 100 μ g/ml阿泊拉霉素抗性筛选得到转入pIB139-glu载体的重组菌E. coliET12567 (pUZ8002) /pIB139_glu。2)两亲接合构建抗植物病原真菌的重组利迪链霉菌参考文献(Bierman M et al. 1992)进行两亲接合,具体方法如下将重组菌E. coliET12567(pUZ8002)/pIB139-glu接种到含有氯霉素、卡那霉素和阿泊拉霉素抗性的LB液体培养基，370C，200rpm,培养过夜，次日早晨按1%的接种量接到新鲜LB培养基中培养至OD6qq=O. 4-0. 6，收集菌液，40C，4000rpm,离心2min，弃上清，用20mL冰冷的纯的LB培养液重悬沉淀,4°C, 4000rpm,离心2min,弃上清，目的是洗去抗生素。用2mL冰冷的纯的LB培养液重悬沉淀。(2)将PDA斜面生长2周的利迪链霉菌(Sti^ptomyceslydicus)A02CGMCC No. 1654 (CN 100467588C)孢子用无菌双蒸水洗脱下来，并用加样器吹打均匀，制备得到孢子悬浮液。(3) 250 μ L链霉孢子悬液加入500 μ L 2ΧΥΤ培养液，轻轻混匀。50°C热击 lOmin，活化孢子。500 μ L 重组菌 E. coliET12567 (pUZ8002)/pIB 139-glu菌液与500 μ L活化好的利迪链霉菌(Streptomyces lydicus) A02CGMCC No. 1654抱子悬液，轻轻混勻。4000rpm,室温离心3min,去上清，混勻沉淀涂布于MS培养基+10mM/LMgCl2, 28°C倒置培养至次日早晨(18h)，之后涂抗生素溶液(将O. 5mg萘啶酮酸和60yg阿泊拉霉素溶于ImLddH2O中得到的液体)。2-3天后挑取单菌落到新的加入上述抗生素溶液的MS平板上。挑取在该MS平板上的菌落用上述p3和p4进行PCR，将其中一株可以得到
1.5kb的扩增产物的重组菌命名为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AG02。利迪链霉菌(Streptomyceslydicus) AG02已于2012年11月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号=CGMCC No. 6814。利迪链霉菌(Streptomyceslydicus) AG02CGMCC No. 6814 菌体的形态特征如下革兰氏染色阳性；在GYM琼脂培养基上生长7天后，基内菌丝发育良好，无横隔，不断裂；气生菌丝生长良好，多分枝；孢子丝柔曲或弯曲，孢子椭圆形。3)利迪链霉菌(Streptomyces lydicus) AG02CGMCC No. 6814 的纤维素降解活性 将利迪链霉菌(Streptomyceslydicus) AO2CGMCC No. 1654 和利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AG02CGMCC No. 6814分别接种到纤维素培养基平板上在29°C培养2天，进行刚果红染色，结果表明利迪链霉菌(Streptomyces lydicus) AG02CGMCC No. 6814能够产生明显的透明圈，具有降解纤维素的能力，且活性较强，而野生型链霉菌菌株利迪链霉菌(Streptomyces lydicus) A02CGMCC No. 1654不产生透明圈，从而说明表明重组载体pIB139_glu成功转入利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02CGMCC No. 1654,纤维素酶基因已经表达(图2)。 本实施例中MS培养基
甘露醇20g
黄S.粉2 Og
琼脂粉20g
水圮W个:I OOOmi；本实施例中纤维素培养基羧甲基纤维素钠20g、Na2HP042. 5g、KH2P042. 5g、蛋白胨
2.5g、酵母膏0. 5g、用蒸懼水定容至1000mL。实施例2、利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AG02的抑菌活性高于利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02CGMCC No. 1654该实施例中，所用的培养基如下高氏一号斜面培养基Κ2ΗΡ040·5g，NaCl 0. 5g，KNO3I. 0g，FeSO4 · 7Η200· Olg, MgSO4 · 7H20 0. 5g，可溶性淀粉 20g，琼脂 20g，水 1000ml ；pH 7. 2-7. 4。种子培养基15g黄豆粒(加蒸懼水煮沸0. 5-lh,取滤液),5g蛋白胨,2. 5g硫酸铵，20g葡萄糖，IOg淀粉，0. 25g硫酸镁，0. 2g磷酸二氢钾，5g氯化钠，配成水溶液，调pH7_8后，加Ig碳酸1丐，加水定容至1000ml。发酵培养基15g黄豆粒(加蒸懼水煮沸0. 5-lh,取滤液),5g蛋白胨,2. 5g硫酸铵，IOg蔗糖，IOg淀粉，0. 25g硫酸镁，0. 2g磷酸二氢钾，5g氯化钠，配成水溶液，调pH7_8后，力口Ig碳酸1丐，加水定容至1000ml。I、植物真菌病害抑制剂的制备
将利迪链霉菌(Streptomyceslydicus) AO2CGMCC No. 1654 和利迪链霉菌(Streptomyces lydicus) AG02CGMCC No. 6814分别接种到高氏一号斜面培养基上，28°C培养7-10天，待其产生足量的孢子，用无菌钼环刮取其孢子2 - 3环接种于250ml三角瓶内的50ml种子培养基内，置可控温摇床上，在28<€条件下，200印111/111；!_11 (旋转半径13mm)恒温振荡培养24h-30h ;然后在无菌条件下将其分接于10个500ml三角瓶内的发酵培养基内(每瓶装液量为100ml)，利迪链霉菌(Streptomyces lydicus) A02CGMCC No. 1654和利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)AGO2CGMCC No. 6814的接种量相同，每瓶接种后OD6qq值均为O. I ;接种后的摇瓶在31/C条件下，以240rpm/min (旋转半径13mm)的转速振荡培养96h ；此时菌株已在发酵液中产生高浓度的抑菌活性代谢产物。将以上步骤获得的发酵液5000rpm/min离心10 — 15min沉降菌丝体及固形物，上清液用O. 45 μ m的无菌微孔滤膜过滤，收集滤液(该滤液中无菌体)，该利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02CGMCC No. 1654 的无菌发酵滤液和利迪链霉菌(Streptomyceslydicus)AG02CGMCC No. 6814的无菌发酵滤液即为植物真菌病害抑制剂样品，置4°C贮存备
用。 2、抑菌活性试验供试祀标病原菌为甘蓝枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans)和西瓜枯萎病菌(F. oxysporum f. sp. niveum)。刮取PDA平板上培养产生的甘蓝枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp.conglutinans)和西瓜枯萎病菌(F. oxysporum f. sp. niveum)的分生孢子，用无菌水制成菌悬液，均匀地涂于新制备的PDA平板上，置超净工作台内吹干；用直径7mm的无菌打孔器在平板四周对称位置打孔，然后每孔中注入利迪链霉菌(Streptomyceslydicus) A02CGMCCNo. 1654的无菌发酵滤液100 μ I或利迪链霉菌(Streptomyceslydicus) AG02的无菌发酵滤液100 μ 1，以未接种利迪链霉菌的发酵培养基为对照；28°C下培养3天，十字交叉法测量抑菌圈直径。每处理三个重复。实验结果表明利迪链霉菌(Streptomyceslydicus) AO2CGMCC No. 1654 无菌发酵滤液和利迪链霉菌(Streptomyces lydicus) AG02CGMCC No. 6814无菌发酵滤液在PDA平板上可对甘蓝枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans)和西瓜枯萎病菌(F. oxysporum f. sp. niveum)均产生明显的抑菌圈，利迪链霉菌(Streptomyceslydicus) AGO2CGMCC No. 6814 无菌发酵滤液对甘蓝枯萎病菌(Fusarium oxysporumf. sp. conglutinans)和西瓜枯萎病菌(F. oxysporum f. sp. niveum)抑菌圈直径分别为32mm土 I. 2mm、34mm土 I. 6mm，利迪链霉菌(Streptomyces lydicus) AO2CGMCC No. 1654 无菌发酵滤液对甘蓝枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans)和西瓜枯萎病菌(F. oxysporum f. sp. niveum)抑菌圈直径分别为 23_± I. lmm、22_± I. 2_ (图 3)。说明利迪链霉菌(Streptomyces lydicus) AG02CGMCC No. 6814无菌发酵滤液对甘蓝枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans)的抑菌活性是利迪链霉菌(Streptomyceslydicus) A02 的 1.4 倍，利迪链霉菌(Streptomyces lydicus) AG02CGMCCNo. 6814 无菌发酵滤液对西瓜枯萎病菌(F. oxysporum f. sp. niveum)的抑菌活性是利迪链霉菌(Streptomyces lydicus) A02 的 I. 5 倍。
权利要求
1.构建具有纤维素酶活性的重组利迪链霉菌的方法，包括将SEQID No. I所示的纤维素酶的编码基因导入作为宿主菌的利迪链霉菌中筛选得到具有纤维素酶活性的重组利迪链霉菌的步骤。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述纤维素酶的编码基因的核苷酸序列为 SEQ ID No. 2 的第 14-1495 位。
3.根据权利要求I或2所述的方法，其特征在于所述纤维素酶的编码基因通过所述纤维素酶编码基因的表达载体导入作为宿主菌的利迪链霉菌中，所述纤维素酶编码基因的表达载体中启动所述纤维素酶编码基因转录的启动子是红霉素抗性基因启动子。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述将SEQID No. I所示的纤维素酶的编码基因导入作为宿主菌的利迪链霉菌包括如下步骤将所述纤维素酶编码基因的表达载体导入大肠杆菌中得到重组大肠杆菌，再将所述重组大肠杆菌与所述作为宿主菌的利迪链霉菌进行双亲接合获得具有纤维素酶活性的重组利迪链霉菌。
5.根据权利要求I至4中任一所述的方法，其特征在于所述作为宿主菌的利迪链霉菌为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus) A02CGMCC No. 1654。
6.由权利要求I至5中任一所述方法得到的重组利迪链霉菌。
7.根据权利要求6所述的重组利迪链霉菌，其特征在于所述重组利迪链霉菌的菌株号为AG02，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCCNo.6814。
8.权利要求6或7所述的重组利迪链霉菌或其代谢物的下述任一应用 1)所述重组利迪链霉菌或其代谢物在抑制植物病原真菌中的应用； 2)所述重组利迪链霉菌或其代谢物在制备植物病原真菌抑制剂中的应用； 3)所述重组利迪链霉菌或其代谢物在制备植物真菌病害抑制剂中的应用； 4)所述重组利迪链霉菌或其代谢物在抑制植物真菌病害中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述植物病原真菌为下述至少一种甘蓝枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans)和西瓜枯萎病菌(F. oxysporumf.sp.niveum)； 所述植物真菌病害为下述至少一种由甘蓝枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp.conglutinans)引起的病害和由西瓜枯萎病菌(F. oxysporum f. sp. niveum)引起的病害。
全文摘要
本发明公开了抗植物病原真菌的重组利迪链霉菌及其构建方法与应用。构建具有纤维素酶活性的重组利迪链霉菌的方法，包括将SEQ ID No.1所示的纤维素酶的编码基因导入作为宿主菌的利迪链霉菌中筛选得到具有纤维素酶活性的重组利迪链霉菌的步骤。本发明构建的重组利迪链霉菌增强了宿主利迪链霉菌对植物病原真菌的抗菌活性，特别是对西瓜枯萎病菌的抗菌活性是宿主利迪链霉菌的2倍。
文档编号C12N15/76GK102965389SQ201210482520
公开日2013年3月13日 申请日期2012年11月23日 优先权日2012年11月23日
发明者吴慧玲, 刘伟成, 刘建华, 董丹, 卢彩鸽, 刘霆, 张殿朋, 张涛涛, 田兆丰, 卢向阳 申请人:北京市农林科学院