专利名称：一种检测克罗诺杆菌属菌株的方法及其试剂盒和引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物检测领域，具体涉及一种检测克罗诺杆菌属菌株的方法及其试剂盒和引物。
背景技术：
克罗诺杆菌属(Cronobacter spp)是人和动物肠道内寄生的一种革兰阴性无芽孢杆菌。作为一种重要的食源性条件致病菌，克罗诺杆菌属菌株能够引起婴儿致命的感染，致死率高达10%_80%。它通常能导致婴儿严重的临床症状，例如脑脓疡，脑膜炎，坏死性小肠结肠炎和全身性败血症。曾经有在婴儿配方粉中分离到阪崎克罗诺杆菌菌株的报道。克罗诺杆菌属菌株是通过配方粉危害婴幼儿健康的重要条件性致病菌。新生婴儿或早产儿都存在通过食用污染有克罗诺杆菌属的婴儿配方粉而感染克罗诺杆菌属菌株的风险。在污染环节调查中发现，整个婴幼儿配方粉生产工艺流程中，可检测到克罗诺杆菌的污染点占到全部取样点的31%。因此，对克罗诺杆菌属菌株快速鉴定与鉴别是实现有效控制的基础。该菌在1980年被首次命名和定义后，又于2008年由一个种被重新分为克罗诺杆菌新属(Cronobacter spp·),属下分为5个新种(其中Cronobacter sakazakii称为新组合)、1个克罗诺杆菌基因种(Genomospeciese)和3个新亚种，尽管该菌的分类和名称已变，但目前检测仍然沿用程序式的阪崎肠杆菌标准检测方法，以传统生化反应进行鉴定，需要18-24h，而且无法区分为哪一种，这显然已经不能满足对克罗诺杆菌属菌株检测的需求。在鉴别方面，尽管已有扩增片段长度多态性分析(Amplified fragment length polymorphismas, AFLP)、16S rRNA全序列比较、DNA-DNA杂交实验及多位点测序等多种可靠方法，但这些根据遗传特征的分析方法耗时长、工作量大。因此，目前缺少对克罗诺杆菌属菌株的高效率的鉴定与鉴别方法。发明内容
本发明要解决的技术问题在于克服现有传统技术检测时间长的缺陷，提供一种克罗诺杆菌属菌株的PCR检测方法、核酸及引物对。采用本发明的检测方法检测克罗诺杆菌属菌株，检测时间短，成本低，更加具有实用性，检测结果特异，结果判定简单。
本发明的技术方案如下
本发明的技术方案之一是一种检测克罗诺杆菌属菌株的方法，包括以下步骤
(I)提取待检样品的基因组DNA，以其为模板，以克罗诺杆菌属特异性扩增引物对为引物，进行PCR扩增，所述的引物对中，一条引物的序列为SEQ ID NO. I所示，另一条引物的序列为SEQ ID NO. 2所不；和
(2)检测438bp位置单一扩增产物的存在。
根据本发明，步骤(I)中，所述PCR中，PCR的反应体系较佳的为=IXPCR反应缓冲液，10-15mmol/L Mg2+，O. 2-0. 3mmol/L dNTP，0. 1-0. 3 μ M 引物 1，O. I-O. 3 μ M 引物 2，Taq 酶 O. 01-0. υ/μ L，DNA 模板 lO-lOOng/μ L。更佳的为:1 XPCR 反应缓冲液，12. 5mmol/L Mg2+，O.25mmol/L dNTP，O. 2 μ M 引物 I (SEQ ID NO. I)，0. 2 μ M 引物 2 (SEQ ID NO. 2)，Taq 酶0.04U/ μ L, DNA 模板 50ng/ μ L。
步骤(I)中，所述PCR中，PCR的扩增程序较佳的为92_95°C预变性3_6min，之后开始以下循环，每个循环的程序为92-95°C变性20-40s，60-65°C退火20_40s，70_74°C延伸20-40s ;循环共30-40个；循环结束后，70-74°C延伸8_12min，降温至4_15°C，结束。更佳的为94°C预变性5min，之后开始以下循环，每个循环的程序为94°C变性30s，63°C退火 30s，72°C延伸30s ;循环共35个；循环结束后，72°C延伸lOmin，降温至12°C，结束。
步骤(2)中，所述的检测结果的判断方法如下在检测的结果中，如果存在438bp 位置的单一扩增产物，则说明待检样品中含有克罗诺杆菌菌属菌株；如果不存在438bp位置的单一扩增产物，则待检样品中不含有克罗诺杆菌属菌株。
步骤(2)中所述的检测方法，可以是本领域常规的方法，优选的为凝胶电泳检测法，可以是琼脂糖凝胶，也可以是聚丙烯酰胺凝胶。
本发明的方法尤其适用于检测食品中的克罗诺杆菌属菌株，特别是奶粉中的克罗诺杆菌属菌株的检测。
本发明的技术方案之二是一种检测克罗诺杆菌属菌株的试剂盒，其包括一条序列为SEQ ID NO. I所示的引物和一条序列为SEQ ID NO. 2所示的引物。较佳的，还包括 IOXPCR缓冲液，Taq酶，dNTP溶液和MgCl2。所述的IOXPCR缓冲液，Taq酶，dNTP溶液和 MgCl2都如本领域常规所述。
本发明的技术方案之三是一种扩增克罗诺杆菌属菌株的引物，其序列如SEQ ID NO. I所示或者如SEQ ID NO. 2所示。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于采用本发明的检测方法检测克罗诺杆菌属菌株，检测时间短，降低了检测成本；提高了检测效率；本发明的检测方法，具有单一特异性，检测结果可靠，结果判定简单。本发明为食品安全检测技术领域提供了一种简单快速灵敏的检测克罗诺杆菌属细菌的方法，对我国的食品安全具有较大意义。
图I是实施例I中PCR产物经I. 5%琼脂糖凝胶电泳实验结果。泳道I 17依次为 阪崎克罗诺杆菌ATCC29544，穆汀斯克罗诺杆菌ATCC51329，鼠伤寒沙门氏菌ATCC14023，肠炎沙门氏菌ATCC13311，阴沟肠杆菌ATCC13047，大肠杆菌ATCC43889，大肠杆菌ATCC25922， 奇异变形杆菌ATCC12453，普通变形杆菌ATCC33420，枸橼酸杆菌ATCC8090，肺炎克雷伯杆菌ATCC27336，肺炎克雷伯杆菌ATCC46114，宋志氏志贺氏菌CMCC51334，痢疾志贺氏菌 CMCC51335，福氏志贺氏菌 ATCC51371，绿脓杆菌 CDCB32116，IOObp DNA Marker。
图2是实施列I中PCR产物经I. 5%琼脂糖凝胶电泳图谱。泳道I 17依次为 蜡样芽胞杆菌ATCC1220，气味沙雷氏菌ATCC33077，粘质沙雷氏菌ATCC14040，恶臭假单胞菌ATCC17485，产碱假单胞菌IQCC12604，金黄色葡萄球菌ATCC29213，金黄色葡萄球菌 ATCC8095,屎肠球菌ATCC14025，粪肠球菌ATCC49452，产气肠杆菌ATCC13048，霍乱弧菌SJTU32001,副溶血弧菌ATCC17802,副溶血弧菌ATCC33846,创伤弧菌ATCC27562,单核增生李斯特菌AB97021,单核增生李斯特菌ATCC13313, IOObp DNA Marker。
图3是实施列I中PCR产物经I. 5%琼脂糖凝胶电泳图谱。泳道I 17依次为 阪崎克罗诺杆菌ATCC29544，穆汀斯克罗诺杆菌ATCC51329，克罗诺杆菌基因种NCTC9529, 丙二酸盐阳性克罗诺杆菌DSM18702，苏黎世克罗诺杆菌DSM18703，都柏林克罗诺杆菌都柏林亚种DSM18705，都柏林克罗诺杆菌洛桑亚种DSM18706，都柏林克罗诺杆菌乳粉亚种 DSM18707,阪崎克罗诺杆菌BDCS001，阪崎克罗诺杆菌BDCS002，阪崎克罗诺杆菌BDCS003， 阪崎克罗诺杆菌BDCS004，阪崎克罗诺杆菌BDCS005，阪崎克罗诺杆菌BDCS006，阪崎克罗诺杆菌 BDCS007，阪崎克罗诺杆菌 BDCS008, IOObp DNA Marker。
图4实施列I中是PCR产物经1. 5%琼脂糖凝胶电泳图谱。泳道I 17依次为阪崎克罗诺杆菌BDCS009，阪崎克罗诺杆菌BDCS010，阪崎克罗诺杆菌BDCSOlI，阪崎克罗诺杆菌 BDCSO12,阪崎克罗诺杆菌BDCS013，阪崎克罗诺杆菌BDCS014，阪崎克罗诺杆菌BDCS015，阪崎克罗诺杆菌BDCS016，阪崎克罗诺杆菌BDCS017，阪崎克罗诺杆菌BDCS018，阪崎克罗诺杆菌BDCS019，阪崎克罗诺杆菌BDCS020，阪崎克罗诺杆菌BDCS021，阪崎克罗诺杆菌BDCS022， 阪崎克罗诺杆菌BDCS023，阪崎克罗诺杆菌BDCS024，IOObp DNA Marker。
图5是实施列I中PCR产物经I. 5%琼脂糖凝胶电泳图谱。泳道I 8依次为阪崎克罗诺杆菌BDCS025，阪崎克罗诺杆菌BDCS026，阪崎克罗诺杆菌BDCS027，阪崎克罗诺杆菌BDCS028，阪崎克罗诺杆菌BDCS029，阪崎克罗诺杆菌BDCS030，ddH20, IOObp DNA Marker。
图6是实施列I中PCR产物经I. 5%琼脂糖凝胶电泳验证引物灵敏度实验图谱。 泳道 I 10 依次为IOObp DNA Marker, 141. Ong/PCR, 14. lng/PCR, I. 41ng/PCR, 141pg/ PCR, 14. lpg/PCR, I. 41pg/PCR, 141fg/PCR, 14. lfg/PCR,，ddH20。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例I
克罗诺杆菌属菌株PCR检测方法
步骤一，引物合成
合成能够PCR扩增克罗诺杆菌属gyrB基因序列中的保守序列的引物(由上海生工生物工程技术服务有限公司合成)，引物序列如下
SEN2-L :5，-ATGGATAAAGAGGGCTACAG-3’ (SEQ ID N0:1),
SEN2-R :5，-CGCCTGATTCTTACGGTTAC-3，(SEQ ID NO:2)。
步骤二，PCR检测方法的体系及反应参数
采用上述引物，以克罗诺杆菌属标准菌株的基因组DNA为模板，进行PCR反应体系和反应程序的建立和优化，经过单因素、多因素试验和杂交试验，发现以下反应体系和反应程序都能得到单一的438bp左右的扩增产物。所述PCR反应体系为1XPCR反应缓冲液，10-15mmol/L Mg2+，O. 2-0. 3mmol/L dNTP，0. 1-0. 3 μ M 引物 1，O. I-O. 3 μ M 引物 2，Taq 酶 O. 01-0. IU/μ L，DNA 模板 lO—lOOng/μ L。所述 PCR 扩增程序为92_95°C预变性 3_6min,之后开始以下循环，每个循环的程序为92-95°C变性20-40s，60-65 °C退火20_40s，70-74 °C 延伸20-40s ;循环共30-40个；循环结束后，70-74°C延伸8_12min，降温至4_15°C，结束。 而最优的反应体系和反应程序如下，其438bp左右的扩增产物的产量最高，电泳条带最明显清晰。最优的PCR反应体系为:1XPCR反应缓冲液，12. 5mmol/L Mg2+，O. 25mmol/L dNTP,0.2 μ M引物I，O. 2 μ M引物2，Taq酶O. 04U/ μ L，DNA模板40ng/ μ L。最优的PCR扩增程序为94°C预变性5min，之后开始以下循环，每个循环的程序为94 V变性30s，63 °C退火30s， 72°C延伸30s ;循环共35个；循环结束后，72°C延伸lOmin，降温至12°C，结束。
因此，本发明建立了最优的PCR检测方法如下先加入16. I μ L无菌水到反应管中，再依次加入 IOXPCR 反应缓冲液 2. 5 μ L，25mmol/L 的 Mg2+ 2. O μ L, 2. 5mmol/L 的 dNTP1.O μ L, 5 μ M引物I. O μ L, 2. 5U/μ L Taq酶O. 4 μ L,最后加模板溶液2 μ L,并以无菌水为模板作为反应的阴性对照。然后将反应管离心后，放入PCR反应仪中，按照以下PCR程序进行 在94°C预变性5min，接着作35个循环，每个循环的程序包括94°C变性30s，退火温度63°C， 退火时间为30s，然后在72°C延伸30s，循环结束后在72°C延伸lOmin，最后降温至12°C，结束所有操作程序。
步骤三，检测
取阪崎克罗诺杆菌和丙二酸盐阳性克罗诺杆菌等克罗诺杆菌属标准菌株8株及 30株分离菌株(如表I所示，表中所示菌株均为本领域的技术人员可通过公开的渠道获得的)，按照基因组DNA模板提取方法，分别提取基因组DNA。提取过程如下将阪崎克罗诺杆菌和丙二酸盐阳性克罗诺杆菌等38株菌株(如表I所示)分别接种至50mL的TSB液体培养基中，在37°C增菌8h后,取ImL菌液，放入I. 5mL离心管中;之后在3，OOOr/min离心IOmin, 取上清液，再在12，OOOr/min离心5min,收集菌体。用无菌双蒸水重新悬浮菌体，离心洗漆后加入100 μ L无菌超纯水，在沸水浴中煮15min，立即取出，在-20°C放置30min。在37°C 解冻后，12，OOOr/min离心5min，取上清液放置_20°C备用。
每株菌株的DNA溶液(DNA浓度50ng/ μ L )均取2 μ L作为PCR反应模板添加到PCR 反应体系中进行扩增反应。采用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，判断在438bp位置是否存在单一扩增条带，结果见表1，电泳结果见图1-5。
从表I中可知，除了克罗诺杆菌属菌株的标准菌株和食品分离株外，其余阴性对照菌株均没有特异扩增条带。表I中，-:PCR结果为阴性；+ :PCR结果为阳性。表I中克罗诺杆菌属(Cronobacter spp)使用了 8株标准菌株，代表了该属内所有种的典型标准菌株。属内包括6个种(其中Cronobacter sakazakii称为新组合)，即阪崎克罗诺杆菌 ATCC25944，丙二酸盐阳性克罗诺杆菌DSM18702，穆汀斯克罗诺杆菌ATCC51329，苏黎世克罗诺杆菌DSM18703，克罗诺杆菌基因种1NCTC9529和都柏林克罗诺杆菌。其中都柏林克罗诺杆菌包括三个亚种，即都柏林克罗诺杆菌都柏林亚种DSM18705，都柏林克罗诺杆菌洛桑亚种DSM18706和都柏林克罗诺杆菌乳粉亚种DSM18707。克罗诺杆菌属和肠杆菌属的亲缘关系最近，尤其和肠杆菌属内的阴沟肠杆菌亲缘关系最近。本次试验共使用了肠杆菌属标准菌株12株，志贺氏菌属标准菌株3株，沙雷氏菌属标准菌株2株，克雷伯属标准菌株2株， 葡萄球菌属标准菌株2株，假单胞菌属标准菌株3株，李斯特菌属标准菌株2株，弧菌属标准菌株3株及分离菌株I株。所使用的这些菌株都是食源性致病菌，而且绝大多数都属于肠杆菌科的，它们和克罗诺杆菌属菌株具有较近的亲缘关系。如果这些菌株经本发明的引物通过PCR实验后扩增不到特异的片段，那么其它的和克罗诺杆菌属菌株亲缘关系较远的菌株更加难以扩增到目的片段(438bp)，因此经过这些亲缘关系较近的菌株的验证，充分保证了本次试验设计的引物的特异性。上述结果充分证明本发明的方法能扩增克罗诺杆菌属的任何菌株，而不会扩增其它的任何菌株。
表I.特异性评价所用菌株及试验结果
权利要求
1.一种检测克罗诺杆菌属菌株的方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)提取待检样品的基因组DNA，以其为模板，以克罗诺杆菌属特异性扩增引物对为引物，进行PCR扩增，所述的引物对中，一条引物的序列为SEQ ID NO. I所示，另一条引物的序列为SEQ ID NO. 2所示；和 (2)检测438bp位置单一扩增产物的存在。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(I)中，所述PCR中，PCR的反应体系为1 XPCR 反应缓冲液，10-15mmol/L Mg2+，O. 2-0. 3mmol/L dNTP，0. 1_0·3μΜ 引物 1，O.1-0. 3μ M 引物 2，Taq 酶 O. 01-0. lU/yL，DNA 模板 IO-IOOng/μ L0
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(I)中，所述PCR中，PCR的反应体系为I XPCR 反应缓冲液，12. 5mmol/L Mg2+，O. 25mmol/L dNTP，0. 2μΜ 引物 1，O. 2 μ M 引物 2，Taq酶 O. 04U/ μ L, DNA 模板 40ng/ μ L。
4.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(I)中，所述PCR中，PCR的扩增程序为92-95°C预变性3-6min，之后开始以下循环，每个循环的程序为92_95°C变性20_40s，60-65 °C退火20-40s，70-74°C延伸20_40s ;循环共30-40个；循环结束后，70-74°C延伸8-12min，降温至 4_15°C，结束。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(I)中，所述PCR中，PCR的扩增程序为94°C预变性5min，之后开始以下循环，每个循环的程序为94°C变性30s，63 °C退火30s，72°C延伸30s ;循环共35个；循环结束后，72°C延伸lOmin，降温至12°C，结束。
6.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的检测方法为琼脂糖凝胶电泳检测法。
7.一种检测克罗诺杆菌属菌株的试剂盒，其特征在于，其包括一条序列为SEQ ID NO. I所示的引物和一条序列为SEQ ID NO. 2所示的引物。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括10XPCR缓冲液，Taq酶，dNTP溶液和MgCl2。
9.一种扩增克罗诺杆菌属菌株的引物，其特征在于，其序列如SEQ ID NO. I所示或者如SEQ ID NO. 2 所示。
全文摘要
本发明公开了一种检测克罗诺杆菌属菌株的方法及其检测试剂盒。该方法包括以下步骤(1)提取待检样品的基因组DNA，以其为模板，以克罗诺杆菌属特异性扩增引物对为引物，进行PCR扩增，所述的引物对中，一条引物的序列为SEQ ID NO.1所示，另一条引物的序列为SEQ ID NO.2所示；和(2)检测438bp位置单一扩增产物的存在。本发明的方法，检测克罗诺杆菌属菌株时间短，降低了检测成本，提高了检测效率，具有单一特异性，检测结果可靠，结果判定简单。本发明为食品安全检测技术领域提供了一种简单快速灵敏的检测克罗诺杆菌属细菌的方法，对我国的食品安全具有较大意义。
文档编号C12Q1/68GK102978291SQ201210572569
公开日2013年3月20日 申请日期2012年12月25日 优先权日2012年12月25日
发明者陈万义, 艾连中, 任婧, 穆海菠, 杭锋, 郭本恒, 李云飞 申请人:光明乳业股份有限公司