专利名称：大肠杆菌o157h7的免疫pcr基因检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种大肠杆菌0157:H7 (Escherichia coli 0157:H7)免疫PCR基因检测试剂盒，属于食源性致病菌检测领域，专门针对食源性致病菌大肠杆菌0157:H7 (Escherichia coli 0157:H7)的检测。本试剂盒适用于各种食品中大肠杆菌0157:H7的快速检测。
背景技术：
食源性致病菌是全球性最严重的食品安全问题，2003 2004年的统计结果显示，我国食物中毒致病因素依次为微生物性、化学性、有毒动植物性病原。微生物性病原是导致食物中毒的主要因素，中毒人数最多。食源性致病菌快速检测一直是研究关注的焦点。肠出血性大肠埃希菌(EHEC)0157:H7 (Escherichia coli 0157:H7)引起的肠道感染性疾病已成为一个严重的全球性公共卫生问题，该病可引起腹泻、出血性肠炎、继发溶血性尿毒综合症(HUS)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)等。HUS和TTP的病情凶险，其中3% 5%的HUS病人死亡，约有12%的HUS病人有严重的后遗症，危害十分严重。自1982年美国首次发现该病以来，在世界上许多国家相继发生了暴发和流行，尤其1996年5 8月间日本发生了由大肠杆菌0157:H7引起的人类历史上规模最大的一次暴发流行，累积患者近万人，并有数人死亡，引起了世界的普遍关注。我国在1987年就发现由此菌引起的散在感染，近几年已陆续有十多个省份在食品、家禽、家畜、昆虫和腹泻病患者中检出该致病菌，存在着疫情暴发、流行的潜在威胁。目前检测大肠杆菌0157:H7的传统方法主要有生化反应和血清分型等。生化方法烦琐、费时，并受诸多因素影响，容易漏检自然变异株，以及不能检测活的非可培养状态的细菌。血清学方法·发展较快，灵敏度也较高，但只能做追溯性诊断或提供间接的诊断依据，不能进行快速鉴·定。因此，建立快速准确的诊断方法已成为临床的迫切需求。免疫PCR(immuno polymerase chain reaction, IM-PCR)是一种检测微量抗原的高灵敏度技术。该技术把抗原抗体反应的高特异性和聚合酶链反应的高敏感性有机结合起来，其本质是一种以PCR扩增一段DNA报告分子代替酶反应来放大抗原抗体结合率的一种改良型ELISA。免疫PCR是迄今最敏感的一种抗原检测方法，理论上可以检测单个抗原分子，但实践中它的敏感性受许多因素的影响，如连接分子、显示系统的选择、DNA报告分子的浓度、PCR循环次数等。目前，国内外报道的免疫PCR的敏感性一般比现行的ELI SA法高IO2 IO8倍。本实用新型是一种大肠杆菌0157:H7免疫捕获PCR检测试剂盒，以此来快速检测大肠杆菌0157:H7。
实用新型内容针对现有技术的不足，本实用新型的目的在于建立一种快速，准确的可进行快捷检测食源性致病菌大肠杆菌0157:H7的检测试剂盒。将致病菌免疫富集方法和基因水平检测方法有效结合。先用特异性抗体将样品中的病原菌特异性免疫富集，然后PCR扩增，不仅很大程度提高了检测灵敏度，而且免疫结合然后PCR扩增，提高了检测的特异性，大大提高了病原菌检测的效率。本实用新型采取的技术方案是这样的大肠杆菌0157:H7免疫捕捉PCR检测试剂盒包括盒盖(I)、盒体(2)、塑料底板(3)、第一试剂单元、第二试剂单元、自封袋(12);第一试剂单元是分子生物学试剂，EP管内分别装的为10XPCR Buffer (4)、dNTP(5)、TaqDNA聚合酶(6)、ddH20双蒸水(7)、正向引物(8)、反向引物(9);第二试剂单元试剂瓶内分别装有的是阳性对照溶液(10)、阴性对照溶液(11);自封袋内装有的是包被了大肠杆菌0157:H7单克隆抗体的检测免疫PCR管；盒盖和盒体相连接，第一试剂单元和第二试剂单元依次镶嵌于塑料底板上，自封袋放置于塑料底板上，塑料底板放置于盒体内。。进一步，所述的分子生物学试剂中，10XPCR Buffer装量为300 yL ;dNTP装量为150 μ L ;TaqDNA聚合酶装量为60 μ L ;正向引物装量为150 μ L ;反向引物为装量为150 μ L。进一步，所述的阳性对照溶液为灭活的大肠杆菌0157:Η7菌液，阴性对照溶液为灭菌的改良Ε.C新生霉素增菌肉汤。本实用新型的有益效果:大肠杆菌0157:Η7免疫捕获PCR检测试剂盒，是一种食源性致病菌检测 试剂盒，属于食源性致病菌检测领域，适用于各种食品中大肠杆菌0157:Η7的快速检测。该试剂盒集病原菌浓缩，特异性抗体识别，PCR扩增为一体，具有检测结果准确性高、高灵敏度、检测快速、使用方便等优点。适用于菌株快速鉴定、食品中毒源检测等领域，尤其适用于样品中微量病原的快速检测。适用于质监部门，进出口检疫部门等对食样进行大肠杆菌0157:Η7菌的鉴定。大肠杆菌0157:Η7免疫捕获PCR检测试剂盒检测准确性高，样品中的大肠杆菌0157:Η7经过特异性抗体的识别，之后进行PCR扩增，致病菌经过免疫学、分子生物学两种检测技术的双重检测，确保了检测的准确性，避免PCR检测中的假阳性。具有高灵敏度，PCR管壁上的单克隆抗体捕捉并富集了样品中的大肠杆菌0157:Η7，间接提高了模板量，大大提高了检测灵敏度，经测试，该试剂盒对大肠杆菌0157:Η7的检测灵敏度可以达到IO2Cfu/mL，因此特别适合样品污染不严重，病菌较少的样品。可一次鉴定到具体种，在单克隆抗体捕捉的病原后，通过PCR准确的将同属不同种的大肠杆菌0157:H7—次检测到种。避免杂菌干扰，管壁上的单克隆抗体只识别样品中的大肠杆菌0157:H7，其它非目标菌抗体捕捉后的洗涤中被去除，因此大大降低了杂菌的干扰。无需提取DNA，目标菌损失小，全部实验在同一 PCR管中完成，降低了常规PCR检测中核酸提取过程中的病原损失。检测快速，全部检测可在4个小时完成。因此是一种快速、简便、准确、高灵敏度的检测大肠杆菌0157:H7的试剂盒。试剂盒检测特异性验证研究:该试剂盒对大肠杆菌0157:H7特异性进行检测。特异性抗体识别，特异性引物rfbF和优化的PCR条件对目标菌进行了扩增，同时采用10类非目标菌检测，结果显示只有大肠杆菌0157:H7有目标条带499bp的PCR产物，其它的10类非目标菌都无目标条带出现，显示了试剂盒的特异性。试剂盒检测灵敏度验证研究:本试剂盒对大肠杆菌0157:H7灵敏度进行检测。大肠杆菌0157:H7纯菌液直接PCR检测最低检出限为1.04X 105cfu/mL，而免疫捕获PCR的最低检出限为1.04X 102cfu/mL，对于纯菌液，免疫捕获PCR灵敏度是直接PCR灵敏度的1000倍，是ELISA检测灵敏度的1000倍。本试剂盒在食样检测中灵敏度达到1.04X 103cfu/mL。[0014]依赖PCR的大肠杆菌0157:H7免疫捕获检测试剂盒，涉及了一种检测高危险性食源性致病菌的分子技术，克服了现有检测食源性致病菌检测技术费时耗力，灵敏度低等的缺点。本实用新型的试剂盒能快速、准确、灵敏的从食品中直接检测到病原菌。大大简化了检测程序，适用于质监部门，进出口检疫部门等对食样进行大肠杆菌0157:H7菌的鉴定。
图1是本实用新型的结构示意图图2是大肠杆菌0157:H7免疫捕获检测试剂盒使用流程和原理具体实施方式
下面结合实施例和附图对本实用新型做进一步详细、完整地说明，所举实例只用于解释本实用新型，并非用于限定本实用新型的范围。实施例1 一种大肠杆菌0157:H7免疫捕获检测试剂盒包括盒盖(I)、盒体(2)、塑料底板(3)、第一试剂单元、第二试剂单元、自封袋
(12)。第一试剂单元是分子生物学试剂，EP管内分别装的为10XPCR Buffer (4)、dNTP(5)、TaqDNA聚合酶(6)、ddH20双蒸水(7)、正向引物(8)、反向引物(9);第二试剂单元试剂瓶内分别装有的是阳性对照溶液(10)、阴性对照溶液(11);自封袋内装有的是包被了大肠杆菌0157:H7单克隆抗体的检测免疫PCR管。盒盖和盒体相连接，第一试剂单元和第二试剂单元依次镶嵌于塑料底板上，自封袋放置于塑料底板上，塑料底板放置于盒体内。所述的大肠杆菌0157:H7单克隆抗体的检测免疫PCR管的具体包被方法为:①、用包被液稀 大肠杆菌0157:H7单克隆抗体至1: 300倍，抗体浓度为10 μ g/mL，将稀释好的单克隆抗体每管50 μ L加入PCR管中，4°C过夜包被；②、包被缓冲液(Carbonate Coating buffer (I X))的配方为:无水碳酸钠Na2CO3L 59g，碳酸氢钠NaHC032.93g，叠氮化钠NaN30.2g，溶于IOOOml蒸馏水中，调pH至9.6，4°C保存。实施例2梯度稀释大肠杆菌0157:H7纯菌液直接PCR研究实验大肠杆菌0157:H7标准菌株培养18h后，然后用无菌生理盐水依次10倍递减稀释，依次标记为10' 10_2、10_3、10_4、10_5、10_6、10_7，用10_5、10_6、10_7梯度的菌液进行平板菌落计数。菌落计数原始菌液浓度为1.04X 109cfu/mL,依次稀释原菌液，菌液浓度梯度为:1.04X IO8 1.04X 10cfu/mL。取各个梯度的菌液各5 μ L加入PCR管中，然后加入本实用新型试剂盒内的4号试剂5 μ L，5号试剂2 μ L，8号试剂2 μ L，9号试剂2 μ L，6号试剂I μ L，7号试剂补足体积至50 μ Lo PCR的扩增条件为95°C 5min ；35个循环(95°C 15s ；55°C 30s ；72 °C lmin)，72°C 5min，4°C保存。取IOyL的PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳来检测目标条带并且凝胶成像分析。凝胶成像结果中，M泳道为IOOObp DNA ladder #泳道为阴性对照；1_8号泳道对应的细菌浓度为:1.04Χ108、1.04Χ107、1.04Χ106、1.04Χ105、1.04Χ104、1.04Χ103、1.04X ΙΟ2、1.04X10cfu/mL。泳道1_4号有特异性目标条带出现，片段大小为499bp，亮度依次减弱。5-8泳道和阴性对照未有特异性条带。结果显示，大肠杆菌0157:H7纯菌液直接PCR检测的灵敏度为1.04X 105cfu/mL。[0026]实施例3梯度稀释大肠杆菌0157:H7纯菌液本试剂盒检测IC-PCR研究实验取梯度稀释的大肠杆菌0157:H7菌液(1.04X108 1.04X 10cfu/mL)各200 μ L置于本试剂盒内的检测PCR管中，放置于37°C孵育2h，然后用移液器小心吸去菌液，用PBST洗三次，在无菌滤纸上扣干残液，然后在PCR管内加入本实用新型试剂盒内的4号试齐[J 5 μ L，5号试剂2 μ L，8号试剂2 μ L，9号试剂2 μ L，6号试剂I μ L，7号试剂补足体积至50 μ L15PCR 的扩增条件为 95°C 5min ;35 个循环(95°C 15s ；55°C 30s ；72°C lmin)，72°C 5min,4°C保存。取IOyL的PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳来检测目标条带并且凝胶成像分析。凝胶成像结果中，M泳道为IOOObp DNA ladder #泳道为阴性对照；1_8号泳道对应的细菌浓度为:1.04Χ108、1.04Χ107、1.04Χ106、1.04Χ105、1.04Χ104、1.04Χ103、1.04X ΙΟ2、1.04X10cfu/mL。泳道1_7号有特异性目标条带出现，片段大小为499bp，亮度依次减弱。8泳道和阴性对照未有特异性条带。结果显示，大肠杆菌0157:H7免疫PCR检测试剂盒检测大肠杆菌0157:H7纯菌液检测限的灵敏度为1.04X 102cfu/mL。实施例4本试剂盒对大肠杆菌0157:H7和非大肠杆菌0157:H7特异性研究实验，供试菌株有:大肠杆菌0157:H7ATCC82346,金黄色葡萄球菌ATCC27660，鼠氏伤寒沙门氏菌ATCC22956，肠炎沙门氏菌ATCC13076，单增李斯特菌ATCC43251，小肠结肠炎耶尔森氏菌ATCC23715，福氏志贺氏菌ATCC12022，宋内氏志贺氏菌ATCC25931，痢疾志贺氏菌ATCC51329，乙型溶血性链球菌ATCC10373，阪崎肠杆菌ATCC29004。各取供试菌株200 μ L加入本试剂盒的检测PCR管中，放置于37°C孵育2h，然后用移液器小心吸去菌液，用PBST洗三次，在无菌滤纸上扣干残液，然后在PCR管内加入本实用新型试剂盒内的4号试剂5 μ L，5号试剂2 μ L，8号试剂2 μ L，9号试剂2 μ L，6号试剂I μ L，7号试剂补足体积至50 μ L0 PCR的扩增条件为 95 0C 5min ；35 个循环(95 °C 15s ；55°C 30s ；72°C lmin), 72 °C 5min，4°C 保存。取IOyL的PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳来检测目标条带并且凝胶成像分析。 实施结果只有大肠0157菌的泳道出现目的条带(499bp)，其他10株对照菌株均没有目的条带出现，说明该试剂盒有很好的特异性。实施例5梯度稀释模拟带菌大肠杆菌0157:H7直接PCR研究实验按照国标GB/T4789.36-2008《食品卫生微生物学检验大肠埃希氏菌0157:H7/NM检验》，取食样25g(mL)加入到225mL改良E.C新生霉素增菌肉汤m(EC) η中，在拍击式均质器上均质2 3min，作为食品匀浆，然后对匀浆液人工污染不同浓度梯度的大肠杆菌0157:H7纯菌液，人工污染的食品匀浆液中大肠杆菌0157:H7菌液浓度依次为:1.04X IO8 1.04X 102cfu/mL。取不同梯度的人工污染的食品匀浆液各5 μ L加入PCR管中，然后加入本实用新型试剂盒内的4号试剂5 μ L, 5号试剂2 μ L, 8号试剂2 μ L, 9号试剂2 μ L, 6号试剂I μ L，7号试剂补足体积至50 μ L0 PCR的扩增条件为95°C 5min ；35个循环(95°C 15s ；55°C 30s ；72°C lmin)，72°C 5min，4°C保存。取10 μ L的PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳来检测目标条带并且凝胶成像分析。研究结果得到食品样本模拟带菌大肠杆菌0157:Η7直接PCR的灵敏度可达到1.04X IO5 1.04Χ 106cfu/mL。实施例6梯度稀释模拟带菌大肠杆菌0157:H7本检测试剂盒IC-PCR研究实验按照国 标GB/T4789.36-2008《食品卫生微生物学检验大肠埃希氏菌0157:H7/NM检验》，取食样25g(mL)加入到225mL生理盐水中，在拍击式均质器上均质2 3min,作为食品匀浆，然后对匀浆液人工污染不同浓度梯度的大肠杆菌0157:H7纯菌液，人工污染的食品匀浆液中大肠杆菌0157:H7菌液浓度依次为:1.04X IO8 1.04X 102cfu/mL。取不同梯度的人工污染的食品匀浆液各200 μ L加入PCR管中，放置于37°C孵育2h，然后用移液器小心吸去菌液，用PBST洗三次，在无菌滤纸上扣干残液，然后在PCR管内加入本实用新型试剂盒内的4号试剂5 μ L，5号试剂2 μ L，8号试剂2 μ L，9号试剂2 μ L，6号试剂I μ L，7号试剂补足体积至50 μ L0 PCR的扩增条件为950C 5min ；35个循环(95°C 15s ；55°C 30s ；72 °C lmin)，72°C 5min，4°C保存。取IOyL的PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳来检测目标条带并且凝胶成像分析。研究结果得到大肠杆菌0157:H7免疫捕捉PCR检测试剂盒研究食品样本模拟带菌的灵敏度可达到1.04X IO3 1.04X 104cfu/mL。大肠杆菌0157:H7免疫捕获PCR检测试剂盒操作简便，检测快速，高灵敏度和高特异性，不需提取DNA。在实验中人工污染食品样本无需增菌直接进行检测，检测限可达到104cfu/mL，有的样品达到103cfu/mL，灵敏度是直接PCR的10 100倍。本试剂盒能直接对样品进行检测，具有较大的推广应用基础。以上所叙述仅为本实用新型的较佳实施例，并不用以限制本实用新型，凡在本实用新型的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内 。
权利要求1.一种大肠杆菌0157:H7的免疫PCR基因检测试剂盒，其特征在于包括盒盖(I)、盒体(2)、塑料底板(3)、第一试剂单元、第二试剂单元、自封袋(12);第一试剂单元是分子生物学试剂，EP管内分别装的为10XPCR Buffer (4)、dNTP (5)、TaqDNA聚合酶(6)、ddH20双蒸水(7)、正向引物(8)、反向引物(9);第二试剂单元试剂瓶内分别装有的是阳性对照溶液(10)、阴性对照溶液(11);自封袋内装有的是包被了大肠杆菌0157:H7单克隆抗体的检测免疫PCR管；盒盖和盒体相连接，第一试剂单元和第二试剂单元依次镶嵌于塑料底板上，自封袋放置于塑料底板上，塑料底板放置于盒体内。
2.根据权利要求1所述的大肠杆菌0157:H7的免疫PCR基因检测试剂盒，其特征在于:所述的分子生物学试剂中，10XPCR Buffer装量为300 μ L ；dNTP的装量为150 μ L ；TaqDNA聚合酶装量为60 μ L ;正向引物装量为150 μ L ;反向引物装量为150 μ L。
3.根据权利要求1所述的大肠杆菌0157:Η7的免疫PCR基因检测试剂盒，其特征在于:所述的阳性对照溶液为灭活的大肠杆菌0157:Η7菌液，阴性对照溶液为灭菌的改良Ε.C新生霉素增菌肉 汤。
专利摘要本实用新型涉及一种大肠杆菌O157H7(Escherichia coli O157H7)的免疫PCR基因检测试剂盒，属于食源性致病菌检测领域，适用于各种食品中大肠杆菌O157H7的快速检测。检测试剂盒包括盒盖(1)、盒体(2)、塑料底板(3)、第一试剂单元、第二试剂单元、自封袋(12)。第一试剂单元是分子生物学试剂，EP管内分别装的为10×PCR Buffer(4)、dNTP(5)、TaqDNA聚合酶(6)、ddH2O双蒸水(7)、正向引物(8)、反向引物(9)；第二试剂单元试剂瓶内分别装有的是阳性对照溶液(10)、阴性对照溶液(11)；自封袋内装有的是包被了大肠杆菌O157H7单克隆抗体的检测免疫PCR管。盒盖和盒体相连接，第一试剂单元和第二试剂单元依次镶嵌于塑料底板上，自封袋放置于塑料底板上，塑料底板放置于盒体内。本实用新型大肠杆菌O157H7免疫捕捉PCR检测试剂盒结合了免疫和分子技术原理能快速、准确、灵敏的从食品中直接检测到病原菌。
文档编号C12Q1/68GK203144418SQ201220684769
公开日2013年8月21日 申请日期2012年12月11日 优先权日2012年12月11日
发明者刘箐, 陈艳 申请人:上海慧耘生物科技有限公司