新城疫病毒耐热活疫苗载体系统及其应用的制作方法

新城疫病毒耐热活疫苗载体系统及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属病毒遗传操作领域，具体涉及一种新城疫病毒（NDV）耐热活疫苗载体系统及其应用。本发明的新城疫病毒耐热活疫苗载体系统包括：a)转录质粒，通过将NDV耐热疫苗株的基因组全长cDNA克隆至pBR322载体中获得；b)三个辅助质粒，分别将NDV耐热疫苗株的核蛋白、磷蛋白和大聚合酶蛋白基因克隆至pcDNA3.1载体中获得；c)宿主细胞。本发明人工获得的重组新城疫病毒具有耐热特性，也是首次建立的具有耐热特性的新城疫病毒活疫苗载体系统。本发明将在新城疫、禽流感等禽类主要疫病的多联（多价）耐热基因工程活疫苗的研发、病毒耐热机理的研究等方面具有极大的应用前景。
【专利说明】新城疫病毒耐热活疫苗载体系统及其应用

【技术领域】
[0001] 本发明属于病毒遗传操作领域，涉及一种活病毒载体系统，更具体地，本发明涉及 新城疫病毒耐热活疫苗载体系统及其应用。

【背景技术】
[0002] 新城疫（Newcastle Disease, ND)又称亚洲鸡瘟，是一种由新城疫病毒 (Newcastle Disease Virus, NDV)引起的极易传染的毁灭性疾病，有较高的发病死亡率， 被国际兽疫局（0ΙΕ)列为两种A类禽病之一(另一种为禽流感)，属于国家强制性免疫疫病。 鸡新城疫自1926年在印尼的爪哇和英国的新城首次暴发以后，一直在除大洋洲以外的全 世界范围内流行，给全球造成了巨大的经济损失。在我国，新城疫也是危害最为严重的禽病 之一，我国许多地区一直都有该病流行。新城疫的控制以免疫预防为主。近年来随着疫苗 的广泛应用，新城疫的大规模暴发流行已受到明显控制，但由于存在疫苗冷链系统不完善、 使用方法不当、免疫程序不科学等问题，导致典型和非典型新城疫不断发生。而新城疫宿主 范围的不断扩大和变异毒株的出现和流行，都使新城疫的防制工作复杂化。
[0003]目前，国际上生产和使用的新城疫疫苗有两大类，即活疫苗和灭活疫苗。活疫苗 包括低毒力株疫苗和中等毒力株疫苗，低毒力株疫苗包括Π 系苗（Bl)、III系苗（LaSota 株)、clone 30、V4等；中等毒力疫苗包括I系苗、Roskin株、Komorov株、Hert 33株和 Mukteswar株等。有些低毒力活疫苗具有独特的耐热特性，称之为耐热活疫苗，代表株有 V4、I-2、HB92和TS09-C株等。此类疫苗具有耐热、低毒性、免疫效果好、可同群感染、多途 径免疫(拌料、喷雾等)等优点，适用于鸡、鸽、鹌鹑等多种禽类的新城疫防控。与其他非耐热 疫苗相比，该疫苗在气温普遍较高的南方地区和冷链条件较差的农村推广应用更有优势， 在新城疫的防控中发挥了重要作用。
[0004] 随着分子生物学的飞速发展，NDV的分子基础研究工作取得了较大进展。NDV的 基因组RNA通过与其编码的核蛋白（NP)、磷蛋白（P)和大聚合酶蛋白（L) 一起构成核蛋白 复合体，启动RNA的首轮转录及病毒蛋白的翻译合成，病毒的各个组份通过自包装产生具 有感染性的子代病毒。根据这一原理，1999年欧洲学者建立了第一个高致病性NDV的反向 遗传操作系统。研究表明，NDV基因组可在不同位点插入并表达外源报告基因或免疫源性 基因，经细胞或鸡胚连续高代次传代仍保持高度的遗传和表达稳定性。
[0005] 以NDV耐热弱毒株作为活病毒疫苗载体具有极为突出的优点：1)可常温保存运 输，降低对冷链系统的依赖，更适宜在气温较高的地区使用；2)有较高的同群感染率，免疫 效果更佳确实；3)疫苗毒力极低，对鸡胚不致死，可鸡胚免疫或0日龄免疫；4)复制过程为 从RNA到RNA，不存在DNA阶段及与细胞基因组整合的可能性；5河同时诱导体液免疫、粘 膜免疫及细胞免疫，产生更加全面的免疫保护；6)可通过拌料、饮水、喷雾等多种方式给苗， 使用方便；7) NDV弱毒具有高滴度的鸡胚生长特性，生长成本低廉。在我国采用NDV弱毒 疫苗对新生雏鸡进行免疫是必不可少的，每年用于新城疫防制的弱毒疫苗至少在百亿羽份 以上。因此，NDV耐热弱毒株作为活病毒疫苗载体应用的经济意义十分巨大。
[0006] 从1966年第一株NDV耐热株V4株被分离得到至今，已有多株NDV耐热株被选育、 分离得到，如I-2、HB92、TS09-C株等。有些课题组尝试把耐热株改造为耐热载体，但一直未 见有成功的研究报道。如：文献"新城疫病毒V4株全基因组测序及全长cDNA克隆的构建" (姜延龙，东北农业大学，博士学位论文，2010年)公开了 V4耐热株的转录质粒和辅助质粒的 构建，但未能人工拯救出重组的V4耐热株；文献"Plasmids driven minigenome rescure system for Newcastle disease virus V4 strain^CMol Biol Rep, 2009,36:1909-1914) 公开了 V4耐热株的微基因组转录质粒和辅助质粒的构建，实现了外源基因在细胞中的表 达，但仍未能获得重组耐热病毒。
[0007] 现有关于新城疫活疫苗的文献也较多，但均未见涉及到具有耐热特性的新城疫活 疫苗载体的报道。例如：专利号为200510097997.8的文献"新城疫LaSota疫苗株反向遗 传操作系统及其应用"公开了以新城疫病毒LaSota疫苗株为基础的非耐热活疫苗载体，但 未涉及耐热活疫苗载体；专利号为200610075781. 6的文献"表达禽流感病毒H5亚型HA蛋 白的重组新城疫LaSota弱毒疫苗株"公开了以新城疫LaSota疫苗株载体构建的禽流感、新 城疫二联基因工程活疫苗，也未涉及到耐热活疫苗载体。


【发明内容】

[0008] 本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种具有耐热特性的新 城疫病毒活疫苗载体系统及其应用。
[0009] 为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下： 新城疫病毒耐热活疫苗载体系统，该系统包含：a)转录质粒，所述的转录质粒能够表 达新城疫病毒耐热株的基因组全长cDNA序列，通过将新城疫病毒耐热疫苗株的基因组全 长cDNA克隆至pBR322载体中获得；b)三个辅助质粒，所述的三个辅助质粒能够分别表达 新城疫病毒耐热株的核蛋白、磷蛋白和大聚合酶蛋白，通过将新城疫病毒耐热疫苗株的核 蛋白、磷蛋白和大聚合酶蛋白基因分别克隆至pcDNA3. 1载体中获得；c)新城疫病毒耐热 株复制许可的宿主细胞。优选BHK-21细胞。
[0010] 按上述方案，所述的新城疫病毒耐热株是耐热疫苗株，为新城疫病毒TS09-C耐热 疫苗株。
[0011] 按上述方案，所述宿主细胞为BHK-21细胞。
[0012] 按上述方案，所述转录质粒中的新城疫病毒耐热株的基因组cDNA序列位于T7启 动子之后，在编码自我剪切的丁型肝炎核酶序列和T7终止子之前。
[0013] 按上述方案，所述的转录质粒插入并表达有外源基因，所述的外源基因在所述转 录质粒中的插入位点在磷蛋白基因和基质蛋白基因之间。
[0014] 按上述方案，所述外源基因包括标记基因或病毒的抗原基因。
[0015] 按上述方案，所述标记基因为绿色荧光蛋白基因。
[0016] 应用上述耐热活疫苗载体系统人工获得重组新城疫病毒耐热株的方法，其特征在 于，其包括以下步骤：1)将所述耐热活疫苗载体系统中的转录质粒和辅助质粒共转染新城 疫病毒耐热株复制许可的宿主细胞，培养转染后的宿主细胞；2)收获细胞液，过滤后在宿 主细胞或SPF鸡胚上进行传代培养，即可人工获得重组新城疫病毒耐热株。
[0017] 按上述方案，所述步骤1)中的转染采用磷酸钙转染法。
[0018] 按上述方案，所述重组新城疫病毒耐热株在56度热处理1小时后，耐热株的血凝 素活性无明显下降。
[0019] TS09-C耐热疫苗株参照中国专利201110163109. 3获得。
[0020] 本发明的技术原理在于：转录质粒包含有新城疫病毒耐热株的全长基因组序列， 三个辅助质粒能够分别表达新城疫病毒耐热株的核蛋白、磷蛋白和大聚合酶蛋白。将能够 表达T7 RNA聚合酶的痘苗病毒预感染宿主细胞，再将转录质粒和三个辅助质粒共转染至 该细胞。首先，痘苗病毒能够在宿主细胞内表达T7 RNA聚合酶；然后，T7 RNA聚合酶识别 转录质粒上的T7启动子序列，并启动RNA的复制过程，在T7终止子处终止复制，复制出的 RNA序列即为新城疫病毒耐热株的全基因组RNA序列；病毒基因组RNA与三个辅助质粒表 达出的核蛋白、磷蛋白和大聚合酶蛋白一起构成核蛋白复合体，启动病毒RNA的首轮转录 及病毒蛋白的翻译合成，病毒的各个组份通过自包装产生具有感染性的子代病毒。如果在 转录质粒中插入了绿色荧光蛋白等外源基因，那么外源基因将伴随着转录质粒中的新城疫 全基因组序列进行复制、转录与表达，并被包装到病毒粒子里面。随着病毒粒子的释放、再 次感染与增殖，外源基因将在宿主细胞内大量复制与表达。本发明采用了更为高效的磷酸 钙转染法，提高了质粒对细胞的转染效率。本发明对表达NP基因的辅助质粒的序列进行了 修饰，提高了 NP基因在细胞内的表达效率。而且，以新选育的、能在BHK-21细胞上高效增 殖的TS09-C耐热株为基础，增加了病毒成功拯救的几率。
[0021] 本发明的有益效果为： 1)本研究以新城疫病毒耐热疫苗株TS09-C株(本 申请人:于中国专利201110163109. 3 中公开)为基础，构建了出了 TS09-C株的转录质粒和辅助质粒，功构建出了新城疫病毒耐热 活疫苗载体系统，并成功获得了具有耐热特性的重组病毒。耐热试验结果表明，重组耐热病 毒的耐热特性明显高于TS09-C亲本株。在此基础上还构建了插入有绿色荧光蛋白基因的 转录质粒，并成功拯救出了能够表达绿色荧光蛋白的具有耐热性的新城疫病毒耐热毒株， 证实了该载体表达外源基因的能力。利用本发明建立的新城疫病毒耐热活疫苗载体系统， 可构建出能够表达其他病原的主要抗原基因的重组新城疫耐热活疫苗。
[0022] 2)相对于传统的新城疫疫苗，此类疫苗具有如下优点：a)可同时预防两种疾病； b)可4° C甚至常温保存，极大地降低运输成本；c)同群感染率高；d)使用方便，可通过 拌料、喷雾、点眼、滴鼻等方式免疫。

【专利附图】

【附图说明】
[0023] 图1是新城疫耐热活疫苗载体系统中的转录质粒的构建示意图。
[0024] 图2是新城疫耐热活疫苗载体系统中的转录质粒的酶切鉴定图。Μ代表DNA分子 量标准；1、2、3和4分别代表了 Notl、BamHI、XhoI和EcoRI的酶切鉴定结果。
[0025] 图3是重组新城疫病毒耐热株的间接免疫荧光检测结果。（a)代表重组病毒的检 测结果；（b)代表阴性细胞的检测结果。
[0026] 图4是重组新城疫病毒耐热株的透射电镜检测结果。箭头所标注的是典型的新城 疫病毒颗粒。
[0027] 图5是重组新城疫病毒耐热株的细胞生长曲线图。纵坐标代表病毒滴度，以 lgTCID5(l/ml为单位；横坐标代表培养时间，以小时为单位。
[0028] 图6是插入有绿色荧光蛋白基因的转录质粒的构建示意图。pGFP2AUBI-M代表插 入有GFP基因的转录质粒；pTS09-C代表未插入外源基因的转录质粒。
[0029] 图7是重组新城疫病毒耐热株在BHK-21细胞中表达GFP蛋白的荧光图片。

【具体实施方式】
[0030] 以下结合附图和实施例进一步对本发明进行说明，但本发明的内容不仅仅局限于 下面的实施例。
[0031] 实施例1 新城疫病毒耐热活疫苗载体系统的构建 新城疫病毒耐热活疫苗载体系统主要由能够表达新城疫病毒耐热株的基因组全长序 列的转录质粒、能够分别表达新城疫病毒耐热株的核蛋白、磷蛋白和大聚合酶蛋白的三个 辅助质粒和宿主细胞组成，下面主要阐述转录质粒和三个辅助质粒的构建。
[0032] 1.转录质粒的构建 转录质粒的构建策略如图1所示，首先是分片段扩增全基因组序列，共分为A-G 7个片 段扩增全基因组序列。其中在A片段的上游加入了 T7启动子，G片段的下游加入了丁型肝 炎病毒核酶序列和T7终止子。通过普通PCR、融合PCR和引物自延伸的方法扩增获得7个 片段后，先构建3个中间质粒pBR-ABC、pBR-DE和pBR-FG。再将ABC片段和DE片段切割下 来插入到PBR-FG片段的前面，形成转录质粒。
[0033] 1. 1病毒RNA的提取及RT反应 参照试剂盒说明书进行NDV TS09-C株的基因组RNA提取，提取的RNA溶解于17--1 DEPC水，加入1--1随机引物，75°C 5min，立即冰浴，然后加入逆转录反应液：5XRT Buffer 5--l，dNTPs (10mmol/L) 1--1 和 M-MLV 1--1。42°C 60min，95°C 5min，-20°C保存待进行 PCR反应。
[0034] 1· 2七个片段的PCR扩增及克隆 PCR 反应体系由 10 X Buf f er、MgCl2 (25mmo 1/L)、dNTPs、上、下游引物（lOmmo 1/L)、Taq 酶、RT产物和水组成。其中上、下游引物由于扩增片段的不同而不同，具体序列见表1。常规 的 PCR 扩增条件为：95°C 5min;30 X (94°C 30sec，55°C 2min，72°C 5min);72°C lOmin。 以琼脂糖凝胶电泳检测目的条带。将特异的阳性条带以DNA纯化试剂盒进行纯化回收，以 相应的内切酶进行双酶切，连入已经酶切处理的克隆载体中，转化DH5a感受态细菌，挑选 菌斑进行PCR及酶切鉴定。
[0035] 表1.用于构建转录质粒的引物信息表

【权利要求】
1. 新城疫病毒耐热活疫苗载体系统，所述系统包含：a)转录质粒，所述的转录质粒能 够表达新城疫病毒耐热株的基因组全长cDNA序列；b)三个辅助质粒，所述的三个辅助质 粒能够分别表达新城疫病毒耐热株的核蛋白、磷蛋白和大聚合酶蛋白；及c)新城疫病毒 耐热株复制许可的宿主细胞。
2. 根据权利要求1所述的新城疫病毒耐热活疫苗载体系统，其特征在于，所述的新城 疫病毒耐热株是耐热疫苗株，为新城疫病毒TS09-C耐热疫苗株。
3. 根据权利要求1所述的新城疫病毒耐热活疫苗载体系统，其特征在于，所述宿主细 胞为BHK-21细胞。
4. 根据权利要求1所述的新城疫病毒耐热活疫苗载体系统，其特征在于，所述转录质 粒中的新城疫病毒耐热株的基因组cDNA序列位于T7启动子之后，在编码自我剪切的丁型 肝炎核酶序列和T7终止子之前。
5. 根据权利要求1所述的新城疫病毒耐热活疫苗载体系统，其特征在于，所述的转录 质粒插入并表达有外源基因，所述的外源基因在所述转录质粒中的插入位点在磷蛋白基因 和基质蛋白基因之间。
6. 根据权利要求5所述的新城疫病毒耐热活疫苗载体系统，其特征在于，所述外源基 因包括标记基因或病毒的抗原基因。
7. 根据权利要求6所述的新城疫病毒耐热活疫苗载体系统，其特征在于，所述标记基 因为绿色荧光蛋白基因。
8. 应用权利要求1-7任一项所述的耐热活疫苗载体系统人工获得重组新城疫病毒耐 热株的方法，其特征在于，其包括以下步骤：1)将所述耐热活疫苗载体系统中的转录质粒 和辅助质粒共转染新城疫病毒耐热株复制许可的宿主细胞，培养转染后的宿主细胞；2)收 获细胞液，过滤后在宿主细胞或SPF鸡胚上进行传代培养，即可人工获得重组新城疫病毒 耐热株。
9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述步骤1)中的转染采用磷酸钙转染法。
10. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述重组新城疫病毒耐热株在56度热处 理1小时后，耐热株的血凝素活性无明显下降。
【文档编号】C12R1/93GK104059942SQ201310090099
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2013年3月20日 优先权日:2013年3月20日
【发明者】温国元, 邵华斌, 杨峻, 王红琳, 罗青平, 张蓉蓉, 艾地云, 罗玲, 商雨, 郭静, 陈晨 申请人:湖北省农业科学院畜牧兽医研究所