专利名称：间质肺病毒pcr检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明属于生物技术及医学检测领域，尤其涉及一种间质肺病毒PCR检测试剂盒及其检测方法。
背景技术：
人间质肺病毒又称偏肺病毒(human metapneumovirus, hMPV),为单负链RNA病毒，属于副粘病毒科肺病毒亚科，是2001年由荷兰学者首先发现的一种新的呼吸道病原。hMPV感染的病人表现从上呼吸道感染症状到急性支气管炎和肺炎，症状和体征主要包括咳嗽、咽痛、流涕和发热等，严重者可出现气喘、呼吸困难等。hMPV呈全球性分布，荷兰、美国、加拿大、法国、澳大利亚、中国等国家均有检出报道。对于hMPV的检测及鉴定对于该病毒的研究及预防有重要的作用。·细胞接种培养是目前国际上通用的鉴定病毒的方法，利用细胞接种培养方法鉴定间质肺病毒过程如下:( I)样本处理将样本拭子(鼻拭子、咽拭子)用灭菌生理盐水中均质，制成KT1稀释液。室温静置30min,4°C 3000rpm/min离心5min,去上清液为接种材料。(2 ) Vero E6细胞培养与接种采用DMEM培养基I (每IOOml含DMEM88ml，胎牛血清10ml，HEPES缓冲盐(100X) lml，抗生素Iml)培养Vero E6细胞，于5%的CO2培养箱中37°C培养2-3天。接种当天细胞约长满培养瓶的70% 90%，弃上清，用PBS清洗2次，加入Iml病毒稀释液，37°C培养lh-2h，之后弃接种液，加入12mlDMEM培养基2 (每IOOml含DMEM94ml，胎牛血清3ml，HEPES缓冲盐(100X) 1ml，抗生素Iml, 2.5%胰酶Iml)，培养3-6天，期间观察细胞病变(CPE)的形成情况。(3)结果判断CPE (Cytopathic effect 或者 cytopathogenic effect)病变情况为:细胞变大、变圆，胞浆颗粒增多，细胞核增大，病毒芽殖，细胞逐渐裂解脱落，说明此样本含有间质肺病毒。若Vero E6细胞无此变化则说明样本未检出间质肺病毒。(4)亚型鉴定将产生CPE病变的样本加入间质肺病毒A型或B型的抗血清，观察是否浑浊，依据浑浊的情况判断是A型或者B型间质肺病毒。细胞培养法检测间质肺病毒(A、B型)的周期长(至少5天)、操作烦琐、易污染、程序复杂等缺点已远远不能满足快速检测间质肺病毒(A、B型)的要求。因此需要开发针对间质肺病毒的操作简便，快速灵敏的检测方法。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种针对A、B型间质肺病毒的PCR检测试剂盒，旨在解决现有技术中针对间质肺病毒检测方法手续繁多、准确度不高的问题。本发明实施例是这样实现的，一种间质肺病毒PCR检测试剂盒，包含第一反应液和第二反应液，其中该第一反应液包含第一引物对(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)、第一探针 SEQ ID NO:3、第二引物对(SEQ ID NO:4 和 SEQ ID NO:5)以及第二探针 SEQ ID NO:6,该第二反应液包含逆转录酶和DNA聚合酶。本发明实施例的另一目的在于提供一种间质肺病毒检测方法，该检测方法利用本发明提供的检测试剂盒通过荧光定量PCR反应进行。本发明实施例提供的间质肺病毒的PCR检测试剂盒可针对A型和B型间质肺病毒进行检测，该试剂盒利用一步法荧光定量PCR技术对间质肺病毒进行检测。本发明实施例提供的检测方法操作简便，可快速读取结果，相对于现有技术中的检测方法具有快速、灵敏、安全和方便等优点。
图1为现有技术提供的荧光定量PCR的Ct值判定示意图；图2为本发明实施例提供的间质肺病毒检测方法流程图；图3为本发明实施例提供的间质肺病毒检测的阳性结果荧光曲线图；图4为本发明实施例提供的间质肺病毒检测的阴性结果荧光曲线图。
具体实施例方式为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明 进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本发明实施例提供一种可针对A型和B型间质肺病毒的PCR检测试剂盒，其包含第一反应液和第二反应液，其中该第一反应液包含针对A型间质肺病毒的第一引物对(SEQID NO:1和SEQ ID NO:2)、第一探针SEQ ID NO:3、针对B型间质肺病毒的第二引物对(SEQID NO:4和SEQ ID NO:5)以及第二探针SEQ ID NO:6，该第二反应液包含逆转录酶和DNA聚合酶，其中上述引物对和探针序列具体为:针对A型间质肺病毒的第一引物对:正向引物:5’-GACCATCTACACACAGGGACAA-3’SEQ ID NO:1，反向引物:5’-GTGCTCGTCTGTGGTTTGC-3’SEQ ID NO:2，针对A型间质肺病毒的第一探针:5’-TCCAACACCAGATGCAACAGTCTCCC-3’SEQ ID NO:3 ；针对B型间质肺病毒的第二引物对:正向引物:5’-CTAAATGTTGTGCGGCAATTTTC-3’ SEQ ID NO:4，反向引物:5，-ACATGCCAACATCTGCAGGAC-3，SEQ ID NO:5，针对B型间质肺病毒的第二探针:5’-TAATGACAGATGCTGAAC-3’SEQ ID NO:6。本发明实施例利用荧光定量PCR技术，其基本原理为:在PCR反应体系中引入一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断积累，荧光信号强度也等比例增力口。每经过一个循环，收集一个荧光信号强度，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，得到一条荧光扩增曲线图，如图1所示，Ct值为每个PCR反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数，而在曲线指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可据此进行定量分析。具体地，本发明的检测试剂盒中，第一反应液还包含PCR反应缓冲液，MgCl2, dNTP等PCR反应所必需的组分，且可以添加灭菌超纯水以使第一反应液以及第二反应液的体积分别达到一定数量。具体地，本发明的检测试剂盒中，该第一反应液与第二反应液通过石蜡分隔开，在具体操作中可先将第一反应液加入至PCR反应管中，然后加入液态的石腊，待石腊凝固后在其上面加入第二反应液。两种反应液的添加顺序可以替换。利用石蜡将第一反应液和第二反应液分隔开，以减少保存过程中两者的相互影响，提高了检测的精确度和灵敏度。该石蜡的优选用量为1.5-2微升。具体地，本发明的检测试剂盒采用的探针SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:6的5’端分别连接有荧光基团，3’端分别连接有淬灭基团。荧光基团可发出荧光信号，淬灭基团可以抑制荧光基团发出的荧光信号，而在荧光定量PCR反应过程中，探针与DNA序列结合后通过DNA聚合酶的剪切作用使荧光基团可以发出荧光信号，通过检测荧光信号的积累可以对未知模板进行定量分析。本发明实施例中使用的荧光基团可以为FAM或HEX，其中FAM为Carboxyfluorescein,中文名 称为竣基突光素，HEX 为 hexachloro-fIuorescein,中文名称为六氯荧光素。两种荧光基团发出的荧光不同，因此两种探针分别使用不同的荧光基团以使检测结果容易判断。本发明实施例中使用的淬灭基团为DABCYL，即4，4-Dimethylamino-azobenzene-4’ -carboxylic acid,中文名称为 4_ 二甲胺偶氣苯-4’ -竣酸。具体地，本发明实施例的检测试剂盒中使用的引物和探针在母液中储存，储存时的浓度为45-55 μ M0优选地，该储存浓度为50 μ M0在制备试剂盒时将各种母液加入至PCR反应管中相互混合并与其它组分混合以获得第一反应液。具体地，本发明的检测试剂盒中，第二反应液还包含显色剂，显色剂在该试剂盒中起到指示的作用，通过其指示可防止加样时出现错误，而其自身不参与PCR反应。在优选的实施例中，该显色剂为溴酚蓝。优选地，在本发明的检测试剂盒中还可包含RNA酶抑制剂，RNA酶抑制剂可以为本领域常用的任意类型，RNA酶抑制剂浓度为5-10U/反应，加入RNA酶抑制剂以防止待检测病毒RNA的降解，使检测结果更准确。具体地，在本发明的检测试剂盒中，该DNA聚合酶可以为任何适用于荧光定量PCR反应的Taq酶，优选地，该DNA聚合酶为Ex Taq酶，该Ex Taq酶可用于热启动PCR反应，热启动PCR反应可以优化目标扩增产物，同时也抑制非特异性扩增，以增强特异性，提高检测准确度。在优选的实施例中，本发明的检测试剂盒还可包括阴性对照液和阳性对照液，其中阴性对照液中含有不具有间质肺病毒RNA的其他RNA病毒基因组，如人流感病毒，人副流感病毒，呼吸道合胞病毒，冠状病毒RNA，也可以不包含任何RNA基因组；阳性对照中含有间质肺病毒(Α、Β型)基因组RNA。在对检测过程中，向检测反应管中加入待检测样品，同时向阴性对照反应管中加入阴性对照液，并向阳性对照反应管中加入阳性对照液。
具体地，本发明实施例的检测试剂盒可包含用于提取间质肺病毒样品RNA基因组的制剂，在该方案中，本发明的检测试剂盒中含有Trizol试剂、氯仿/异戊醇(24:1)、异丙醇、DEPC-H2Otj在一可选方案中，本发明实施例的检测试剂盒直接对间质肺病毒样品的RNA基因组进行检测，即本发明实施例的检测试剂盒中不包含提取hMPV病毒。因此在检测前需提取病毒RNA，提取RNA通常使用Trizol及相关试剂进行，具体操作步骤可按照Trizol试剂的说明书执行。具体地，本发明的检测试剂盒可配置成20μ L反应体系或者其他合适的反应体系。对于20 μ L反应体系,第一反应液体积为18 μ L，第二反应液体积为2 μ L。可按照该比例(第一反应液:第二反应液=18:2)将反应体系放大。本发明实施例还提供一种间质肺病毒检测方法，该检测方法利用本发明提供的检测试剂盒通过荧光定量PCR反应进行，检测流程如图2所示。具体地，在上述间质肺病毒检测方法中，可以对待测样品提取RNA后进行荧光定量PCR检测，如果已经提取出病毒RNA，则可以直接进行荧光定量PCR检测。
具体地，在利用本发明的检测试剂盒进行检测过程中，PCR反应条件为:42-50°C:10-15min ；92-95 °C:2_3min ；92-95°C:5-10s,55-60°C:40_80s ;40 个循环。具体地，在PCR反应结束后可获得荧光定量PCR反应结果，通过对该反应结果分析，可得到检测结果，分析依据如下:阳性结果:扩增曲线图Ct值< 35，并有明显指数增长，如图3所示。阴性结果:扩增曲线图Ct值> 35或无Ct值，后者如图4所示。以下通过具体实施例对本发明进行进一步描述。实施例一检测试剂盒的制备1.按照如下序列合成引物和探针:针对A型间质肺病毒的弓丨物对:正向引物:5，-GACCATCTACACACAGGGACAA-3’SEQ ID NO:1，反向引物:5，-GTGCTCGTCTGTGGTTTGC-3，SEQ ID NO:2，针对A型间质肺病毒的探针:5’-TCCAACACCAGATGCAACAGTCTCCC-3’SEQ ID NO:3 ；针对B型间质肺病毒的弓丨物对:正向引物:5’-CTAAATGTTGTGCGGCAATTTTC-3’SEQ ID NO:4，反向引物:5’-ACATGCCAACATCTGCAGGAC-3’SEQ ID NO:5，针对B型间质肺病毒的探针:5’-TAATGACAGATGCTGAAC-3’SEQ ID NO:6。在探针的合成过程中，在上述针对A型间质肺病毒的探针(SEQ ID NO:3)的5’端连接有HEX荧光基团，3’端连接有DABCYL淬灭基团，在上述针对B型间质肺病毒的探针(SEQ ID NO:6)的5’端连接有FAM荧光基团，3’端连接有DABCYL淬灭基团。上述探针及引物合成后配制成50 μ M的母液储存。
2.制备PCR反应液按如下组分配制第一反应液:在PCR反应管中按如下组分配制本发明检测试剂盒的第一反应液:10 X buffer (不含镁离子)2.5微升MgCl2 (25mM)2 微升dNTPs2 微升A 型 hMPV 正向引物(SEQ ID NO:1)0.1 微升A 型 hMPV 反向引物(SEQ ID NO: 2)0.1 微升A 型 hMPV 探针(SEQ ID NO: 3)0.1 微升B 型 hMPV 正向引物(SEQ ID NO:4)0.1 微升B 型 hMPV 反向引物(SEQ ID NO:5)0.1 微升B 型 hMPV 探针(SEQ ID NO:6)0.1 微升，然后加入灭菌超纯水使总体积达到18微升，其中上述两对引物和两种探针混合之前的浓度均为50 μ M。在上述总体积为18微升的第一反应液上加入2微升液态石蜡，待该石蜡凝固后在石蜡上面加入以下组分的第二反应液:Ex Taq 酶0.15 微升M-MLV逆转录酶0.1微升溴酚蓝0.01微升RNA酶抑制剂0.2微升最后加灭菌超纯水使体积达到2微升，即获得PCR反应液。3.制备阴性对照和阳性对照阴性对照液:人流感病毒(Α、Β型)基因组RNA的Tris-EDTA缓冲液(0.01ΜρΗ8.0)。该阴性对照液置于0.6mL普通带盖离心管(紫色透明)中。阳性对照液:先分离出A、B型间质肺病毒并提取总RNA做为阳性模板，使用Tris-EDTA缓冲液(0.0lM pH8.0)稀释后冷冻保存。该阳性对照液置于0.6mL普通带盖离心管(橙红色透明)中。4.RNA提取试剂每份RNA提取试剂包括以下组分:13ml Trizol,置于30mL棕色平口瓶(配棕色盖)中；氯仿/异戊醇(24:1)，总体积为3mL，置于SmL棕色平口瓶(配绿色盖)中；9mL异丙醇，置于20mL棕色平口瓶(配黄色盖)中；DEPC水，置于两支1.5mL普通冻存管(配黄色盖)中，每支含有I。5mLDEPC水。5.试剂盒组装每份试剂盒中包含3条PCR反应八联管，每个八联管中含有步骤2制备的由第一反应液、第二反应液和石蜡组成的组合物。每份试剂盒中还包含步骤3和4中制得的组分。实施例二不含RNA提取试剂的检测试剂盒1.合成引物和探针序列，同实施例一步骤I。2. 制备PCR反应液
按如下组分配制第一反应液:在PCR反应管中按如下组分配制本发明检测试剂盒的第一反应液:IOXbuffer (不含镁离子)2.5微升MgCl2 (25mM)4 微升dNTPs4 微升A 型 hMPV 正向引物(SEQ ID NO:1)0.2 微升A 型 hMPV 反向引物(SEQ ID NO:2)0.2 微升A 型 hMPV 探针(SEQ ID NO: 3)0.2 微升B 型 hMPV 正向引物(SEQ ID N0:4)0.2 微升B 型 hMPV 反向引物(SEQ ID NO:5)0.2 微升B 型 hMPV 探针(SEQ ID NO:6)0.2 微 升，然后加入灭菌超纯水使总体积达到18微升，其中上述两对引物和两种探针混合之前的浓度均为50 μ M。在上述总体积为18微升的第一反应液上加入液态石蜡，待该石蜡凝固后在石蜡上面加入以下组分的第二反应液:Ex Taq 酶0.3 微升M-MLV逆转录酶0.3微升溴酚蓝0.02微升RNA酶抑制剂0.2微升，最后加灭菌超纯水使体积达到2微升。3.制备阴性对照和阳性对照阴性对照:冠状病毒RNA病毒基因组的Tris-EDTA缓冲液(0.01ΜρΗ8.0)。该阴性对照液置于0.6mL普通带盖离心管(紫色透明)中。阳性对照:使用间质肺病毒(A、B型)基因组RNA为阳性模板，使用Tris-EDTA缓冲液(0.0lMpHS.0)稀释后冷冻保存。该阳性对照液置于0.6mL普通带盖离心管(橙红色透明)中。4.试剂盒组装每份试剂盒中包含3条PCR反应八联管，每个八联管中留出阴性对照孔和阳性对照孔，其余为步骤2制备的由第一反应液、第二反应液和石蜡组成的PCR反应液。实施例三间质肺病毒检测1.样本获得:样品取咽喉拭子，采集方法如下:将拭子深入喉头及上颚裂来回刮3次 5次，取咽喉分泌液；将咽喉拭子放入盛有
1.0mL生理盐水的离心管中备用，应避免标本间交叉污染，共取20例样本进行检测。2.利用实施例一制备的检测试剂盒提取RNA:取上述样品100 μ L于1.5mL离心管中，加入500 μ LTrizol试剂，室温剧烈震荡15秒，静置5分钟，再加入120 μ L氯仿/异戊醇(24:1)，用手剧烈震荡15秒，室温静置5分钟；12000rpm4°C离心15分钟，取上清置于另一新离心管中(不能吸出中间白色层);加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温静置10分钟；12000rpm4°C离心10分钟，弃上清，用75%的冰乙醇洗涤沉淀，12000rpm4°C离心5分钟，弃乙醇；沉淀室温干燥除去乙醇，用20 50 μ L DEPC-H2O溶解沉淀即得样本RNA。3.利用实施例一制备的检测试剂盒进行PCR检测:取5 μ L上述步骤2获得的样本RNA，加入实施例一步骤2制得的PCR反应液中进行PCR检测，同时在阴性对照管中加入阴性对照液，阳性对照管中加入阳性对照液；PCR反应条件如下:42-50 0C:10min ；92-95 0C:2min ；92-95°C:5s，55。。:40s ;40 个循环。4.结果判断在阴性对照结果和阳性对照结果符合要求的情况下，根据扩增图谱判定结果是阴性还是阳性，判定依据如下:阳性结果:扩增曲线图Ct值< 35，并有明显指数增长，如图3所示；阴性结果:扩增曲线图Ct值> 35或无Ct值，如图4所示。5.检测结果以细胞培养法作为参照，实施例一制备的检测试剂盒的检测结果如表I所示。表I间质肺病毒(A、B型)检测结果
权利要求
1.一种间质肺病毒PCR检测试剂盒，包含第一反应液和第二反应液，其中所述第一反应液包含第一引物对SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、第一探针SEQ ID NO:3、第二引物对SEQID NO:4和SEQ ID NO:5以及第二探针SEQ ID NO:6，所述第二反应液包含逆转录酶和DNA聚合酶。
2.如权利要求1所述的间质肺病毒PCR检测试剂盒，其特征在于，所述第一反应液和所述第二反应液通过石蜡分隔开。
3.如权利要求1所述的间质肺病毒PCR检测试剂盒，其特征在于，所述第一探针SEQIDNO:3和第二探针SEQ ID NO:6的5’端分别连接有荧光基团，3’端分别连接有淬灭基团。
4.如权利要求1所述的间质肺病毒PCR检测试剂盒，其特征在于，所述第二反应液还包含显色剂。
5.如权利要求1所述的间质肺病毒PCR检测试剂盒，其特征在于，所述第二反应液还包含RNA酶抑制剂。
6.如权利要求1所述的间质肺病毒PCR检测试剂盒，其特征在于，还包含阴性对照和阳性对照。
7.如权利要求1所述的间质肺病毒PCR检测试剂盒，其特征在于，还包含RNA提取试剂。
8.如权利要求1所述的间质肺病毒PCR检测试剂盒，其特征在于，还包含PCR反应缓冲液，MgCl2, dNTP。
9.一种间质肺病毒检测方法，所述检测方法利用权利要求1-8中任一项所述的检测试剂盒通过PCR反应进行。
10.如权利要求 9所述的间质肺病毒检测方法，其特征在于，所述PCR反应的条件为: 42-50 0C:10-15min ；92-95°C:2-3min ；92-95°C:5-10s,55-60°C:40-80s ；40 个循环。
全文摘要
本发明适用于生物技术及医学检测领域，提供了一种间质肺病毒PCR检测试剂盒，包含第一反应液和第二反应液，该第一反应液包含第一引物对(SEQ ID NO1和SEQ ID NO2)、第一探针(SEQ ID NO3)、第二引物对(SEQ ID NO4和SEQ ID NO5)以及第二探针(SEQ ID NO6)，该第二反应液包含逆转录酶和DNA聚合酶。本发明还提供间质肺病毒检测方法，其利用本发明的检测试剂盒通过荧光定量PCR进行。本发明的检测方法操作简便，可快速读取结果，相对于现有技术中的检测方法具有快速、灵敏、安全和方便等优点。
文档编号C12Q1/68GK103243174SQ20131014494
公开日2013年8月14日 申请日期2013年4月24日 优先权日2013年4月24日
发明者卢柳燕, 田仁鹏, 吴成贡, 王茵茵 申请人:深圳市生科源技术有限公司