选择性合成1,3-甘油二酯的黑曲霉的发酵生产培养基及培养方法
【专利摘要】本发明公开了一种选择性合成1,3-甘油二酯的黑曲霉的发酵生产培养基，其特征在于：各组分质量分数为：葡萄糖1.030%、豆饼粉1.785%、氯化钾0.0441%、磷酸氢二钠0.044%、氯化钙0.044%、磷酸氢二钾0.044%和硫酸锌0.044%，其余为水。本发明提供的培养基，可使脂肪酶催化甘油与甘油三酯发生甘油解反应的能力有很大的提高，使得1,3-甘油二酯得率达到最高为26.887%。与优化前相比提高了2.7倍。1,3-甘油二酯在甘油二酯中所占的比例增加了88.253%，与优化前相比提高了1.26倍。
【专利说明】选择性合成1, 3-甘油二酯的黑曲霉的发酵生产培养基及培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一株高选择性合成1，3-甘油二酯的黑曲霉CCTCC N0.2012538的发酵
生产培养基及方法。
【背景技术】
[0002]I, 3-甘油二酯是油脂的天然成分，是理想的健康油脂。其原因有二:一是1，3-甘油二酯在人体内代谢方式不同于1，2-甘油二酯和甘油三酯，食用1，3-甘油二酯可以降低血脂、减少内脏脂肪以及有效预防肥胖与主要由肥胖引起的多种疾病等作用；二是1，3_甘油二酯在口感、风味等方面与甘油三酯无异。研究表明，近几年来1，3_甘油二酯还被广泛应用于食品加工和作为医药中间体等方面，其研究已受到广泛的关注。
[0003]虽然1，3-甘油二酯的优点很多，但其在天然油脂的含量很低，所以开辟新途径制备1，3-甘油二酯尤显重要。而脂肪酶(lipase，EC3.1.1.3)作为一类特殊的酯键水解酶，在1.3-甘油二酯的合成中相对于化学法表现出的优势越来越得到广大学者的认可。不仅高效、节能，而且不易产生副产物，避免使用有毒化学催化剂，符合人们对绿色食品的要求。然而我国对高选择性合成1，3-甘油二酯脂肪酶产生菌的研究还非常少见。本实验室基于高选择性合成1，3-甘油二酯脂肪酶产生菌的重要意义，前期筛选到一株能产高选择性合成1，3-甘油二酯的胞内脂肪酶的黑曲霉CCTCC N0.2012538 (已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏编号为:CCTCC N0.M2012538)。由于是胞内脂肪酶，就直接由全细胞脂肪酶作催化剂，不过此全细胞脂肪酶的催化效率不高(约11%)。推测其一个主要原因是该黑曲霉的胞内脂肪酶产量不高 ，所以本技术旨在通过优化黑曲霉CCTCC N0.2012538的培养基以提高其胞内脂肪酶产量，进而提高该黑曲霉的全细胞脂肪酶催化合成1，3_甘油二酯的能力。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是:提供一株高选择性合成1，3-甘油二酯的黑曲霉的发酵生产培养基及方法。
[0005]本发明的技术方案是:
一种选择性合成1，3-甘油二酯的黑曲霉的发酵生产培养基，各组分质量分数为:葡萄糖1.030%、豆饼粉1.785%、氯化钾0.0441%、磷酸氢二钠0.044%、氯化钙0.044%、磷酸氢二钾0.044%和硫酸锌0.044%,其余为水。
[0006]一种选择性合成1，3-甘油二酯的黑曲霉的发酵生产培养方法，包含以下步骤: Ca)将黑曲霉接种于种子培养基，于30°C，180r/min下培养24h制得发酵用种子液； (b)将步骤(a)中制得的发酵种子液按照2%的接种量接种于上述发酵生产培养基中，
在30°C、180r/min下培养72h,即得。
[0007]种子培养基:质量分数为:牛肉膏0.3、蛋白胨0.5、葡萄糖0.5和NaCl 0.5，其余为水，pH 7.0，于 121 °C灭菌 20 min。
[0008]本发明的有益效果:
本发明的目的在于提供一株高选择性合成1，3-甘油二酯的黑曲霉的发酵生产培养基及方法，该培养基发酵生产的脂肪酶可高效的催化甘油与甘油三酯发生甘油解反应合成1，3-甘油二酯，且发酵方法条件温和，易于控制，有利于工业化生产。
[0009]培养基发酵生产的脂肪酶可高效的催化甘油与甘油三酯发生甘油解反应合成I，3-甘油二酯，且发酵方法条件温和，易于控制，有利于工业化生产。
[0010]采用本发明优化后的培养基，发酵周期72小时，离心的菌体经冷冻干燥，液氮保护研磨后制得全细胞脂肪酶，用于合成时，1，3-甘油二酯得率达到最高为26.887%，与优化前相比提高了 2.7倍；1，3-甘油二酯在甘油二酯中所占的比例增加了 88.253%，与优化前相比提高了 1.26倍；
脂肪酶对1，3-甘油二酯的选择性(简称1，3-甘油二酯的选择性)计算公式:U -=这:遍藉憂”+西二；
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[0011]生物样品保藏:黑曲霉CCTCC N0.M2012538已于2012年12月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址:中国武汉市武汉大学，其保藏编号为=CCTCC N0.M2012538,分类命名:黑曲霉(Aspergillus niger) GZUF36。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1为葡萄糖和豆饼粉对黑曲霉CCTCC N0.M2012538全细胞脂肪酶合成1，3_甘油二酯得率交互影响的响应面面图(左)和等高线图(右)；` 图2为葡萄糖和氯化钾对黑曲霉CCTCC N0.M2012538全细胞脂肪酶合成1，3-甘油二酯得率交互影响的响应面面图(左)和等高线图(右)；
图3为豆饼粉和氯化钾对黑曲霉CCTCC N0.M2012538全细胞脂肪酶合成1，3-甘油二酯得率交互影响的响应面面图(左)和等高线图(右)。
【具体实施方式】
[0013]本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但是本发明的保护范围并不限于下列实施例。
[0014]实施例1
以下为本发明所涉及到的培养基及方法
(I)种子培养基:种子培养基(质量百分数):牛肉膏0.3 ;蛋白胨0.5 ;葡萄糖0.5 ;NaCl
0.5 ;其余为水，pH 7.0,250mL的三角瓶，装液量为20%，121 °C灭菌20 min。
[0015](2)发酵种子液的制备:将斜面黑曲霉接种于种子培养基，30°C，180r/min培养24小时，即为发酵种子液。
[0016](3)发酵生产培养基(质量百分数):豆饼粉2 ;玉米浆2 ；K2HPO4 0.5 ；NaN03 0.5 ;其余为水，pH 7.0，250mL的三角瓶，装液量为20%，121 °C灭菌20 min。[0017](4)全细胞脂肪酶的制备:将发酵种子液按2%的接种量接种于发酵生产培养基中300C、180r/min下培养72h，然后在4°C，10000r/min的条件下离心IOmin得菌体，经冷冻干燥，液氮保护研磨后即为全细胞脂肪酶。
[0018](5)甘油解反应:甘油解反应体系由全细胞冻干粉、甘油三酯、甘油、有机溶剂组成，全细胞脂肪酶冻干粉浓度20 mg/mL~60 mg/mL,甘油三酯与甘油的摩尔比为4:1"!: 2,甘油三酯摩尔浓度:10 mmol/^300 mmol/L，混合溶剂的比例(正己烷:叔丁醇)范围49:1~20:1，反应温度30~501:，转速 100~250 r/min，时间 12-48 h。
[0019](6)高效液相色谱分析:吸取Iml的反应液，过0.45um的有机膜后准备高效液相检测。检测条件为:0分钟时，乙腈:异丙醇(％) =80:20^60:40 ；27分钟时，乙腈:异丙醇(％)=40:60^20:80 ?’温度 300C ;流速:0.6~lmL/min。
[0020]实施例2 Box-Behnken 设计
Box-Behnken设计是一种适用于对2_5个 因素进行优化的试验方法。以PB实验筛选到的影响黑曲霉CCTCC N0.M2012538全细胞脂肪酶合成对1，3_甘油二酯得率影响显著的几个因素作为设计因素，以最陡爬坡试验得出的浓度作为中心点，以1，3-甘油二酯得率作为响应值，通过响应面分析对培养基成分进行优化。实验设计见表1，实验结果表2，实验结果分析见表3。
[0021],
【权利要求】
1.一种选择性合成1，3-甘油二酯的黑曲霉的发酵生产培养基，其特征在于:各组分质量分数为:葡萄糖1.030%、豆饼粉1.785%、氯化钾0.0441%、磷酸氢二钠0.044%、氯化钙0.044%、磷酸氢二钾0.044%和硫酸锌0.044%，其余为水。
2.如权利要求1所述的一种选择性合成1，3-甘油二酯的黑曲霉的发酵生产培养方法，其特征在于:包含以下步骤: 将黑曲霉接种于种子培养基，于30°C，180r/min下培养24h制得发酵用种子液； 将步骤(a)中制得的发酵种子液按照2%的接种量接种于上述发酵生产培养基中，在30°C、180r/min 下培养 72h，即得。
3.根据权利要求2所述的选择性合成1，3-甘油二酯的黑曲霉的发酵生产培养方法，其特征在于:种子培养基:质量分数为:牛肉膏0.3、蛋白胨0.5、葡萄糖0.5和NaCl 0.5，其余为水，pH 7.0，于121 °C灭菌 20 min。
【文档编号】C12R1/685GK103484507SQ201310324471
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年7月30日 优先权日:2013年7月30日
【发明者】何腊平, 周换景, 李翠芹, 张义明 申请人:贵州大学