一种用于预测干扰素治疗慢性hbv疗效的微小核糖核酸及其应用的制作方法

一种用于预测干扰素治疗慢性hbv疗效的微小核糖核酸及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物【技术领域】，涉及一种用于预测干扰素治疗慢性HBV疗效的微小核糖核酸及其应用。一种血清miRNA组合，该miRNA组合主要由人巨细胞病毒源的hcmv-mir-US4和hcmv-mir-UL148D两种成熟体miRNA组成。所筛选出的HCMV miRNA组合对干扰素治疗慢性乙型病毒性肝炎病人疗效预测的特异性和灵敏度显著高于目前临床上的经验预测，提高了预测的准确性。
【专利说明】-种用于预测干扰素治疗慢性HBV疗效的微小核糖核酸及 其应用

【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，涉及一种用于预测干扰素治疗慢性HBV疗效的微小核 糖核酸及其应用。

【背景技术】
[0002] 乙型肝炎是一种呈世界性分布、危害严重的传染病。据世界性卫生组织报道，全球 约20亿人曾感染过乙型肝炎病毒（h印atitis B virus，HBV)，其中3. 5亿人为慢性感染者， 每年约有100万人死于HBV感染所致肝衰竭、肝硬化和原发性肝癌（HCC)。我国现有的慢性 HBV感染者约9300万人，其中有症状需要治疗的活动性乙型肝炎患者约为2000多万。加之 HBV的传染性强，治疗乙肝无疑是十分重要的。
[0003] 目前治疗慢性乙肝的抗病毒疗法主要依靠两种药物：α干扰素和核苷类似物类 药物。干扰素（interferon，IFN)是一种具有广谱抗病毒、抗肿瘤、抑制细胞增长和免疫调 节作用的细胞因子。然而，和许多其他药物一样，α干扰素的疗效并不是对于所有病患的 疗效都非常理想。由于干扰素在治疗过程中常常伴随着发热、寒战、头痛、肌肉酸痛和乏力 等不良反应，如果有一种有效方便的方法能够在病人用药之前就对其疗效进行预测，那将 是慢性乙肝病人的一大福音。临床上主要用短期用药后乙肝表面抗原（HBsAg)与HBV-DNA 相结合的方法来观察干扰素对乙肝病人的疗效。但HBsAg与HBV-DNA的检测依然避免不了 短时间的用药，病人仍然需要一个短期的干扰素试验过程。并且，该方法的特异性和灵敏度 明显偏低，对干扰素药物的疗效预测并没有很大帮助。
[0004] 综上所述，我国慢性乙肝患者数目众多，且该病传染性强，而干扰素作为一种经典 抗病毒药物，其治疗周期长，副作用明显，且统计显示干扰素对部分乙肝病人无效。因此，寻 找一种预测干扰素疗效的有效方便的生物标志物能够避免错过无效人群的最佳治疗时期， 从而提高慢性乙肝的治愈率，对指导临床慢性乙肝的个体化治疗有着重要意义。
[0005] 微小核糖核酸（microRNA，miRNA)是近年的一个研究热点，它是一类长约19-23 个核苷酸的单链RNA分子，位于基因组非编码区，进化上高度保守，可在翻译水平对基因表 达进行调节，并与动物的许多正常生理活动及许多疾病的发生及发展存在着紧密的联系。 近来研究表明血清/血浆微小核糖核酸可以用于多种癌症的前期诊断和治疗指导，但还 没有关于血清/血浆微小核糖核酸用于预测干扰素治疗慢性乙型病毒性肝炎病人疗效的 报道。


【发明内容】

[0006] 本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种用于预测干扰素治疗慢性乙型 病毒性肝炎病人疗效的血清中巨细胞病毒源的miRNA。
[0007] 本发明的另一目的是提供一种用于预测干扰素治疗慢性乙型病毒性肝炎病人疗 效的TaqMan探针。
[0008] 本发明的又一目的是提供所述miRNA和TaqMan探针的应用。
[0009] 本发明的目的可通过如下技术方案实现：
[0010] -种血清miRNA组合，该miRNA组合主要由人巨细胞病毒源的hcmv-mir_US4和 hcmv-mir_UL148D 两种成熟体 miRNA 组成，或者由 hcmv-mir_US4 和 hcmv-mir_UL148D 及 hsa-miR-16 三种 hcmv-miR-US4miRNA 组成。所述的 hcmv-mir_US4 序列如 SEQ ID NO. 1 所 不，所述的hcmv-mir-UL148D序列如SEQIDN0·2所不，所述的hsa-miR-16序列如SEQID NO. 3所示。
[0011] 一种用于预测干扰素治疗慢性乙型病毒性肝炎病人疗效的TaqMan探针组合 物，由hcmv-mir_US4的TaqMan探针和hcmv-mir_UL148D的TaqMan探针组成；或者由 hcmv-mir-US4 的 TaqMan 探针、hcmv-mir-UL148D 的 TaqMan 探针以及 hsa-miR-16 的 TaqMan 探针组成。
[0012] 所述的TaqMan探针组合物，所述的hcmv-mir_US4的TaqMan探针优选为ABI 公司生产的货号为197236的TaqMan探针，或者SEQ ID NO. 4所示的TaqMan探针； hcmv-mir_UL148D的TaqMan探针优选为ABI公司生产的货号为197215的TaqMan探针，或 者SEQ ID NO. 5所示的TaqMan探针；hsa-miR-16的TaqMan探针优选为ABI公司生产的货 号为000391的TaqMan探针，或者SEQ ID NO. 6所示的TaqMan探针。
[0013] 本发明所述的血清miRNA组合在制备预测干扰素治疗慢性乙型病毒性肝炎病人 疗效的试剂或工具中的应用。
[0014] 本发明所述的TaqMan探针组合物在制备预测干扰素治疗慢性乙型病毒性肝炎病 人疗效的试剂或工具中的应用。
[0015] 一种用于预测干扰素治疗慢性乙型病毒性肝炎病人疗效的TaqMan探针，为 hcmv-mir_US4的TaqMan探针，优选ABI公司生产的货号为197236的hcmv-mir_US4的 TaqMan探针或者SEQ ID NO. 4所示的TaqMan探针。
[0016] 所述的hcmv-mir-US4的TaqMan探针在制备预测干扰素治疗慢性乙型病毒性肝炎 病人疗效的试剂或工具中的应用。
[0017] 一种用于预测干扰素治疗慢性乙型病毒性肝炎病人疗效的试剂盒，该试剂盒包含 本发明所述的TaqMan探针组合物或者hcmv-mir-US4的TaqMan探针。
[0018] 所述试剂盒还包括Taq酶、dNTP、氯化镁和不含Mg2+的PCR缓冲液。
[0019] 本发明所述miRNA或miRNA组合的筛选方法包括以下步骤：
[0020] (1)收集干扰素治疗乙肝有效和无效患者的混合血清或血浆，提取总RNA ;
[0021] (2)用定量PCR方法（TaqMan探针）对干扰素治疗乙肝有效和无效患者进行逐个 检测，初筛出在两组样品中稳定的表达差异显著的HCMV miRNA ;
[0022] (3)扩大标本量对干扰素治疗乙肝有效和无效患者进行逐个验证，筛选出稳定的 表达差异显著的一组miRNA。
[0023] (4)进一步扩大标本量，收集进行过干扰素治疗乙肝患者血清或血浆。进行双盲实 验，通过检测步骤（1) (2) (3)筛选得到的miRNA在血清中的表达量，判断干扰素治疗乙肝 的疗效并验证其正确率。
[0024] 具体来说，上述筛选方法包括以下步骤：（1)分别收集干扰素治疗有效的乙肝患 者和干扰素治疗无效的乙肝患者的混合血清或血浆，并提取总RNA ; (2)将抽提的RNA逆转 录为cDNA，采用荧光实时定量PCR(TaqMan探针）对HCMV miRNA在干扰素治疗乙肝有效患 者、干扰素治疗乙肝无效患者中进行初筛和复筛，挑选出在干扰素治疗乙肝有效患者、干扰 素治疗乙肝无效患者血清或血浆中稳定、特异表达的一组HCMV miRNA。（3)收集干扰素治 疗效果未知的乙肝患者的血清或血浆，并提取总RNA ; (4)将抽提的RNA逆转录为cDNA，采 用荧光实时定量PCRCTaqMan探针）对挑选出的一组HCMV miRNA在乙肝患者的血清中的含 量进行检测，预测各个患者经干扰素治疗有无疗效，并取得临床数据验证正确率。
[0025] 本发明使用的检测方法可以选自：RT-PCR方法、Solexa测序技术（Solexa sequencing technology)、Real_time PCR法或低密度芯片几种方法中的一种或几种。例 如，血清中miRNA分子的检测方法包括以下步骤：
[0026] (1)使用 miRNeasy Mini Kit (Qiagen)提取血清总 RNA ;
[0027] (2)通过RNA逆转录反应得到cDNA ;
[0028] (3)根据HCMV miRNA设计引物进行Real-time PCR反应，比较各组血清中HCMV miRNA的量的变化。
[0029] 本发明的有益效果：
[0030] 首先，血清相对容易获得，不仅稳定、微创、易于检测，且定量精确，将大大提高疾 病诊断的敏感性和特异性，该类小分子RNA生物标志物的成功开发是对以蛋白为主的传统 生物标志物的颠覆，将为干扰素治疗慢性乙型病毒性肝炎病人疗效预测开创全新局面，为 其他药物实现个体化差异治疗提供借鉴。
[0031] 其次，血清miRNA反映的是机体整体的病理、生理情况，以其作为分子标志物具有 一定的准确性和特异性。血清miRNA检测试剂盒是一种系统、全面的试剂盒，血清miRNA检 测试剂盒能够明确接受干扰素治疗的慢性乙型病毒性肝炎患者的个体差异，反映患者是否 适合干扰素治疗，避免既往繁杂检测，节约了成本和时间，为临床医生快速准确掌握患者病 情、及时采取更具个性化的防治方案提供支持。所述试剂盒简化了引物库，减少制作成本和 生产时间，增加了针对性和实用性，提高了检测的灵敏度和特异性。
[0032] 第三，所筛选出的HCMV miRNA组合对干扰素治疗慢性乙型病毒性肝炎病人疗效预 测的特异性和灵敏度显著高于目前临床上的经验预测，提高了预测的准确性。此外，血清 HCMV miRNA检测能在分子水平上反映乙肝发生发展过程中人类巨细胞病毒的活动状态，为 慢性乙型病毒性肝炎病人的治疗提供了新的治疗思路。
[0033] 第四，本发明的试剂盒所包含的引物同样是基于定量PCR技术筛选出的在干扰 素治疗有效的乙肝患者、干扰素治疗有效的乙肝患者之间表达差异显著的一组血清HCMV miRNA引物，这样可以增加检测的灵敏度和特异性，提高检测水平。
[0034] 综上所述，本发明提供的特异的HCMV miRNA组合作为预测干扰素治疗慢性乙型病 毒性肝炎疗效的指标，有助于医师结合临床症状、病史或其他检查信息对乙肝病患制定适 当的治疗方案。检测血清中的HCMV miRNA简单易行且疗效优越。基于此制备的用于检测 血清miRNA的试剂盒投入实践使用，仅仅需要病人的血清或血浆而不需要任何其它组织通 过最精简的探针库来检测血清miRNA水平能拓展干扰素治疗慢性乙型病毒性肝炎疗效的 预测指标，提高检测的灵敏度，丰富预测干扰素治疗乙肝疗效的手段，具有极重要的临床应 用潜力和价值。

【专利附图】

【附图说明】
[0035] 图1显示初筛病人的13种miRNA的条形统计图。横轴代表不同的miRNA，纵轴为 每种miRNA的绝对含量（fmol/L)。*代表t检验p〈0. 05,亦即有显著差异；**代表t检验 p〈0. 01，亦即有极显著差异。
[0036] 图2显示初筛有显著差异的5种miRNA的散点图。其中a, b, c, d分别为hcmv-mi R-US4, hcmv-miR-UL148D, hcmv-miR-UL112, hcmv_miR-US5 四种 miRNA。纵坐标为绝对含量 (fmol/L)。两组散点纵向位置分布的差异显示了 miRNA在不同群体中含量有差异，可以作 为标志物。
[0037] 图3显示复筛病人的5种miRNA的条形统计图。横轴代表不同的miRNA，纵轴为 每种miRNA的绝对含量（fmol/L)。**代表t检验p〈0. 01，亦即有极显著差异。
[0038] 图4显示复筛有显著差异的2种miRNA的散点图。其中a)为hcmv-miR_US4, b) 为hcmv-miR-UL148D。纵坐标为绝对含量（fmol/L)。两组散点纵向位置分布的差异显示了 在不同群体中miRNA含量有差异，可以作为标志物。
[0039] 图5显示以hcmv-miR_US4作为marker时的ROC曲线。曲线下面积越趋近于1表 明该标志物的灵敏性和特异性越高（图中AUC=L 00)。
[0040] 图6显不以hcmv_miR-UL148D作为marker时的ROC曲线。曲线下面积越趋近于 1表明该标志物的灵敏性和特异性越高（图中AUC=O. 96)。
[0041] 图 7 显不以 hcmv_miR-US4 和 hcmv_miR-UL148D 作为 marker 联用时的 ROC 曲线。 曲线下面积越趋近于1表明该标志物的灵敏性和特异性越高（图中AUC=L 00)。
[0042] 图8显示以hcmv-miR-US4作为marker预测干扰素疗效的102例病人的散点图。

【具体实施方式】
[0043] 以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。
[0044] 本发明所用的标本是本发明人于2009年7月到2011年10月间从南京市传染病医 院搜集了一定量的血清样品，通过对样品资料的整理，本发明人从中选择了 28例干扰素 治疗有效的乙肝患者(平均年龄：28. 89± 1. 79,年龄跨度：4-52,男性：20,女性：8)、28例干 扰素治疗无效的乙肝患者(平均年龄：29. 89±1.22,年龄跨度：19-42,男性：18,女性：10)、 102例正在进行干扰素治疗，实验开始前疗效未知的乙肝患者(平均年龄：30. 78±0. 92,年 龄跨度：7_56,男性：77,女性：25)作为q-PCR筛选、验证的实验样品。具体的样品归类标准 如下：
[0045] 干扰素治疗有效的乙肝患者：
[0046] 1.治疗前 HBV-DNA 滴度大于 500IU/ml。
[0047] 2.治疗后HBV-DNA滴度降低到少于治疗前的10%。
[0048] 3.治疗后没有进行HBV-DNA检测的患者，其HBsAg由阳转阴。
[0049] 4.治疗后没有进行HBV-DNA检测的患者，其HBeAg由阳转阴。
[0050] 5.治疗后没有进行HBV-DNA检测的患者，其ALT、ASIX40U/L。
[0051] 干扰素治疗无效的乙肝患者：
[0052] 1.治疗前 HBV-DNA 滴度大于 500IU/ml。
[0053] 2.治疗后HBV-DNA滴度高于治疗前的10%。
[0054] 3.治疗后没有进行HBV-DNA检测的患者，其ALT或AST>80U/L。
[0055] 4.治疗后没有进行HBV-DNA检测的患者，其HBsAg保持阳性。
[0056] 5.治疗后没有进行HBV-DNA检测的患者，其HBeAg保持阳性。
[0057] 干扰素治疗乙肝疗效未知患者：
[0058] 1.治疗前 HBV-DNA 滴度大于 500IU/ml。
[0059] 2.取样时正在进行干扰素治疗,疗效未知。
[0060] 实施例1慢性乙肝患者特异性HCMV miRNA表达谱初筛
[0061] 使用定量PCR方法发现并证明10个干扰素治疗有效的乙肝患者和10个干扰素治 疗无效的乙肝患者血清/血浆中稳定存在5种差异表达的人类巨细胞病毒的微小核糖核 酸。具体步骤为：
[0062] (1)收集干扰素治疗有效和无效的乙肝患者的血清/血浆
[0063] (2)制备cDNA样品：a)收集干扰素治疗有效和无效的乙肝患者的血清/血浆；b) 分别取每个患者IOOml的血清，加入Iml的QIAzol lysis Reagent,混勻；c)相分离：室温放 置5min，然后每份加入200ul氯仿，剧烈震荡15s，室温2-3min，12, 000g，4°C，离心15min ; d)将水相转移到新的2ml的离心管，再加入I. 5倍体积的无水乙醇，混匀，过RNA吸附柱，并 用RTW缓冲液和PRE缓冲液洗涤除去蛋白质等杂质；e)RNA收集：每份用30ul DEPC水将吸 附柱上的RNA洗脱下来；f)通过RNA逆转录反应得到cDNA。逆转录的反应体系包括4. 5ul 样品 RNA 溶液、2μ15ΧΑΜν bufTer、l μ IlOmM each dNTP mixture (Takara 公司）、0·5μ1 RNase Inhibitor (Takara公司）、1μ I AMV (Takara公司）以及1μ I基因特异性反向引 物。反应步骤为16°C孵育15分钟，42°C反应1小时，85°C孵育5分钟。
[0064] (3)real time PCR:取 1μ I cDNA，加入 0·3μ I Taq 酶（Takara 公司），0·33μ 1 Taqman 探针（ΑΒΙ 公司），1.2 μ 125mM MgCl2,0.4yl2.5mM dNTP mixture (Takara 公司）， 2 4 110父卩0?1311打61'，14.77以1!120,2(^1体系进行9-?0?。仪器使用的是六81?1^81117300 荧光定量PCR仪，PCR的反应条件是：95°C、5分钟进行I个循环一95°C、15秒，60°C、I分钟 进行40个循环。两组样品血清microRNA的表达量使用人工合成的已知浓度的miR-16标 准品的CT值绘制的标准曲线进行定量分析，并算出比值。初筛出在两组样品中有显著差异 的5种HCMV microRNA。五种HCMV microRNA对应的核苷酸序列及ABI公司的Taqman探针 货号见表1。
[0065] 表 1
[0066]

【权利要求】
1. 一种血清miRNA组合，其特征在于该miRNA组合主要由人巨细胞病毒源 的 hcmv-mir_US4 和 hcmv-mir_UL148D 两种 miRNA 组成，或者由 hcmv-mir_US4 和 hcmv-mir_UL148D 及 hsa-miR-16 三种 miRNA 组成。
2. 权利要求1所述的血清miRNA组合在制备预测干扰素治疗慢性乙型病毒性肝炎病人 疗效的试剂或工具中的应用。
3. -种用于预测干扰素治疗慢性乙型病毒性肝炎病人疗效的TaqMan探针组合物，其 特征在于由hcmv-mir_US4的TaqMan探针和hcmv-mir_UL148D的TaqMan探针组成；或者由 hcmv-mir-US4 的 TaqMan 探针、hcmv-mir-UL148D 的 TaqMan 探针以及 hsa-miR-16 的 TaqMan 探针组成。
4. 根据权利要求3所述的TaqMan探针组合物，其特征在于所述的hcmv-mir-US4的 TaqMan探针为ABI公司生产的货号为197236的TaqMan探针，或者SEQ ID NO. 4所示的 TaqMan探针；hcmv-mir_UL148D的TaqMan探针为ABI公司生产的货号为197215的TaqMan 探针，或者SEQ ID NO. 5所示的TaqMan探针；hsa-miR-16的TaqMan探针为ABI公司生产 的货号为000391的TaqMan探针，或者SEQ ID NO. 6所示的TaqMan探针。
5. 权利要求3或4所述的TaqMan探针组合物在制备预测干扰素治疗慢性乙型病毒性 肝炎病人疗效的试剂或工具中的应用。
6. -种用于预测干扰素治疗慢性乙型病毒性肝炎病人疗效的TaqMan探针，其特征在 于为hcmv-mir_US4的TaqMan探针，优选ABI公司生产的货号为197236的hcmv-mir_US4 的TaqMan探针或者SEQ ID NO. 4所示的TaqMan探针。
7. 权利要求6所述的TaqMan探针在制备预测干扰素治疗慢性乙型病毒性肝炎病人疗 效的试剂或工具中的应用。
8. -种用于预测干扰素治疗慢性乙型病毒性肝炎病人疗效的试剂盒，其特征在于该试 剂盒包含权利要求3或4所述的TaqMan探针组合物或者权利要求6所述的TaqMan探针。
9. 根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括Taq酶、dNTP、氯化镁 和不含Mg2+的PCR缓冲液。
【文档编号】C12N15/11GK104419749SQ201310371324
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年8月22日 优先权日:2013年8月22日
【发明者】曾科, 潘怡, 王楠, 李丽民, 张辰宇 申请人:江苏命码生物科技有限公司