高基因敲除效率的谢瓦氏曲霉间型变种工程菌株的构建方法
【专利摘要】本发明公开了一种高基因敲除效率的谢瓦氏曲霉间型变种工程菌株的构建方法，本发明由克隆ku70基因3’端和5’端DNA片段，构建ku70基因敲除载体，根癌农杆菌介导的转化，ku70基因敲除突变菌株的鉴定，本发明获得的谢瓦氏曲霉间型变种的工程菌株与亲本谢瓦氏曲霉间型变种相比，生长速率略慢，其他表型未见明显变化，并且遗传稳定，可以作为受体菌株进行基因功能的敲除验证。本发明的谢瓦氏曲霉间型变种的工程菌株作为受体菌株，基因敲除效率较高，易于获得基因敲除突变菌株，减少了繁重的筛选工作。
【专利说明】高基因敲除效率的谢瓦氏曲霉间型变种工程菌株的构建方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种生物技术，尤其是一种高基因敲除效率的谢瓦氏曲霉间型变种工程菌株的构建方法。
【背景技术】
[0002]谢瓦氏曲霉间型变种俗称“金花”菌，是茯砖茶发花过程中的优势菌种，其闭囊壳即“金花”数量决定着茯砖茶的品质(彭小赞，赵运林，何小书，雷存喜，刘石泉，周晓梅，董萌，胡志远2011)。目前，谢瓦氏曲霉间型变种的命名还存在争议，这可能是由于取材和鉴定方法的差异造成的(丁婷，吕嘉枥2012;胡治远，赵运林，刘石泉，李燕子，许永立2012)，其中1990年刘作易等采用电镜的方法将“金花”菌鉴定为谢瓦氏曲霉间型变种(刘作易，秦京，王迺亮1990)。茯砖茶是一种重要的“边销茶”，在西南和西北少数民族地区很受欢迎。谢瓦氏曲霉间型变种在茯砖茶上生长使茯砖茶具有一定的保健功能，主要体现在降脂减肥、促进消化、抗肿瘤功能和安全性可靠等方面(邓放明，龚舒莉，杨伟丽2007;黄群，陈林杰，李颜坡， 车科2007; 丁婷，吕嘉枥，侯蓓2011;袁勇2011)。谢瓦氏曲霉间型变种在低渗条件下培养只产生子囊孢子，在高渗条件下培养只产生分生孢子，是研究丝状真菌有性繁殖和无性繁殖发生机制的良好材料(刘作易，秦京，李乃亮1991)。因此，对谢瓦氏曲霉间型变种展开分子生物学研究既具有生产价值有具有理论意义。目前，谢瓦氏曲霉间型变种的分子生物学研究工作主要包括构建了根癌农杆菌介导的遗传转化体系和基因表达的差减文库以及产孢相关基因的克隆(马权，刘永翔，刘作易2011;王海，谭玉梅，刘永翔，王阶平，刘作易2012;谭玉梅，王海，刘永翔，刘作易2013)。谢瓦氏曲霉间型变种有性产孢相关基因功能的研究工作以及全基因组和转录组测序工作已经开展。然而，较低的基因敲除效率阻碍了谢瓦氏曲霉间型变种的基因功能的研究工作。
[0003]作为外源DNA片段，基因敲除盒是通过DSBs修复机制整合到宿主细胞基因组上的。真核细胞的DSBs修复主要有两个途径:同源重组(homologous recombination,HR)和非同源末端交联(non-homologous end joining, NHEJ)。HR需要同源序列，当基因敲除盒通过HR途径整合到宿主细胞基因组上时便发生基因敲除。NHEJ不依赖同源序列，基因敲除盒通过NHEJ随机整合到宿主细胞基因组。一般认为，NHEJ与HR是竞争的，主要体现在Ku蛋白对HR的抑制(Krappmann 2007; Kass and Jasin 2010)。丝状真菌偏爱NHEJ途径，因此基因敲除效率较低。为提高HR的频率，得到较高的基因敲除效率，通常采用阻断NHEJ途径的策略，主要是敲除NHEJ途径的关键基因ku70或ku80。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是:提供一种高基因敲除效率的谢瓦氏曲霉间型变种工程菌株的构建方法，通过本发明获得的工程菌株的基因敲除效率较高，能减少从大量转化子中获得基因敲除突变菌株的筛选工作。[0005]本发明是这样实现的:高基因敲除效率的谢瓦氏曲霉间型变种工程菌株的构建方法，具体包括以下步骤:
步骤(1):以谢瓦氏曲霉间型变种基因组DNA为模板，采用引物P12和P13扩增Ku70基因3’端DNA片段D，用引物PlO和Pll扩增Ku70基因5’端DNA片段U ;引物对P12的序列为 5’ -CTAGTCTAGACCCGACAAGCCTGAGGACAA-3’；引物对 P13 的序列为 5’ -TCCTGAGCTCACGCTCTCTTCTATCAGACCCT-3’；引物 PlO 的序列为 5’ -CCCAAGCTTTCAACCACCACCATCCGTCTC-3’ ；引物Pll 的序列为 5’ -CGGAATTCAATGTGACCTGCTCGCCTCC-3’ ；
步骤(2):Xba I和Sac I双酶切DNA片段D和质粒pDHt/sknt，纯化后连接得到重组质粒pDHt/sknt-D ；Hind III和EcoR I双酶切DNA片段U和质粒pDHt/sknt_D，纯化后连接得到重组质粒pDHt/sknt-D-U，即为ku70基因敲除载体；
步骤(3):将Ku70基因敲除载体通过冻融法转入根癌农杆菌LBA4404菌株；含正确Ku70基因敲除载体的根癌农杆菌LBA4404菌株在含50 μ g/ml卡那霉素的LB平板上划线，在28°C下培养48h ;挑取根癌农杆菌单菌落接种于含50 μ g/ml卡那霉素的基础培养基中，在28°C下，220r/min培养48h ;取l_2ml菌液用诱导培养基稀释到吸光度为0.15，然后在28°C下，220 r/min诱导培养至0D600为0.45-0.50 ;取100 μ I诱导活化的根癌农杆菌菌液和100 μ I IX IO6个/ml的分生孢子液混匀，涂布在共培养培养基平板上，在28°C下共培养48h ;将融化的MYA固体培养基，MYA固体培养基含8 μ g/ml的G418以及300 μ g/ml的氨苄青霉素，均匀倒在共培养平板上，在28°C下培养至出现抗性菌落；挑取转化子单菌落转接到含200 μ g/ml G418的固体培养基平板上，MYA培养基中NaCl的质量百分比为5%，在28°C下培养5天，然后收集转化子菌丝；
步骤(4):提取G418抗性转化子基因组DNA，用引物P14和P15进行PCR验证，引物P14的序列为5’ -GCGAAGAGCCTCAGATTGC-3’，引物P15的序列为5’ -GCCACTGCTTACCTTGTCTATC-3’ ；筛选出PCR产物为2611bp的转化子菌株，初步鉴定为Ku70基因敲除突变菌株；筛选出PCR产物为261 Ibp的治/70基因敲除突变菌株；
步骤(5)制备初步鉴定为治/70基因敲除突变菌株；的分生孢子，进行单孢分离；提取单孢分离后菌株的基因组DNA，用引物P14和P15进行PCR验证；PCR产物为2611bp的菌株初步鉴定为治/沿基因敲除突变菌株，提取基因组DNA，分别用EcoR I和Sac I酶切，然后电泳并进行 southern blot 验证；采用弓 I物 nptF( 5，-ATCGACTCGAGATGATTGAACAAGATGGATTG-3’)和 nptRV (5，- GACGATATCTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC-3> )，以质粒 pUR5750 为模板，制备southern blot探针；采用CTAB法提取基因组DNA，分别用EcoR I和Sac I酶切酶切基因组DNA，并进行琼脂糖凝胶电泳；EcoR I和Sac I分别酶切基因组DNA的southern blot条带均为一条带，表明再次鉴定的治/沿基因敲除突变菌株为治/沿基因敲除突变菌株。
[0006]为了验证本发明的效果进行了如下实验:
1、材料与方法
材料:谢瓦氏曲霉间型变种菌株(GZAAS20.1004)由本实验室分离保存。根癌农杆菌菌株LBA4404和大肠杆菌DH5 α菌株由本实验室保存。质粒fIbA基因敲除载体pDHt/sk_FA和veA基因敲除载体pDHt/sk-VF由本实验室保存。
[0007]方法:1根癌农杆菌介导的基因敲除
取-70°C保存的含基因敲除载体的根癌农杆菌LBA4404菌株，在含50 μ g/mL kan的LB平板上划线，28°C培养48 h ;挑取根癌农杆菌单菌落接种于含50 μ g/mL kan的丽培养基中，28°C 220 r/min培养48h ;取l_2ml菌液用IM培养基稀释到0D600=0.15，28°C 220r/min诱导培养至0D600=0.4-0.5 ;取100 μ L诱导活化的根癌农杆菌菌液和100 μ L浓度为每毫升I X IO6个的分生孢子液混匀，涂布在共培养培养基平板上，28°C共培养48h ;采用MYA培养基(60 yg/mL HygB, 300 μ g/mL Amp)做选择培养基；将融化的选择培养基均匀倒在共培养平板上，28°C培养至出现HygB抗性菌落；挑取转化子单菌落转接到含含60μ g/mL HygB的MYA (5% NaCl)平板上，28°C培养5天，收集菌丝。
[0008]2 veA和f IbA基因敲除菌株的鉴定
采用CTAB法提取转化子基因组DNA，veA基因敲除菌株PCR验证引物为P16和P17，野生型菌株的PCR产物为715bp，veA基因敲除菌株PCR产物为2153bp。flbA基因敲除菌株PCR验证引物为P27和P28，野生型菌株的PCR产物为897bp，flbA基因敲除菌株的PCR产物为2236bp。引物P16的序列为:5，-GTCTCAGGCTGGCTACTTCA-3’ ；引物P17的序列为:5’ -TGACAGATGAGGCGAGTATGG-3’ ；引物 P27 的序列为:5’ -GCGTGCGATTCACCCGTTATG-3’ ；弓丨物 P28 的序列为:5’ -TGCTGGAGACGGGCGTTGTTC-3’。
[0009]3基因敲除效率的验证
采用方法2中的根癌农杆菌介导的基因敲除法，分别以野生型谢瓦氏曲霉间型变种菌株和Ku70基因敲除突变菌株为受体菌株敲除veA基因和flbA菌株，并采用方法3中的方法鉴定veA基因敲除菌株和flbA基因敲除菌株。
[0010]4基因敲除效率的比较
【权利要求】
1.一种高基因敲除效率的谢瓦氏曲霉间型变种工程菌株的构建方法，其特征在于:具体包括以下步骤: 步骤(1):以谢瓦氏曲霉间型变种基因组DNA为模板，采用引物P12和P13扩增Ku70基因3’端DNA片段D，用引物PlO和Pll扩增Ku70基因5’端DNA片段U ;引物对P12的序列为 5’ -CTAGTCTAGACCCGACAAGCCTGAGGACAA-3’；引物对 P13 的序列为 5’ -TCCTGAGCTCACGCTCTCTTCTATCAGACCCT-3’；引物 PlO 的序列为 5’ -CCCAAGCTTTCAACCACCACCATCCGTCTC-3’ ；引物Pll 的序列为 5’ -CGGAATTCAATGTGACCTGCTCGCCTCC-3’ ； 步骤(2):Xba I和Sac I双酶切DNA片段D和质粒pDHt/sknt，纯化后连接得到重组质粒pDHt/sknt-D ；Hind III和EcoR I双酶切DNA片段U和质粒pDHt/sknt_D，纯化后连接得到重组质粒pDHt/sknt-D-U，即为ku70基因敲除载体； 步骤(3):将Ku70基因敲除载体通过冻融法转入根癌农杆菌LBA4404菌株；含正确Ku70基因敲除载体的根癌农杆菌LBA4404菌株在含50 μ g/ml卡那霉素的LB平板上划线，在28°C下培养48h ;挑取根癌农杆菌单菌落接种于含50 μ g/ml卡那霉素的基础培养基中，在28°C下，220r/min培养48h ;取l_2ml菌液用诱导培养基稀释到吸光度为0.15，然后在28°C下，220 r/min诱导培养至0D600为0.45-0.50 ;取100 μ I诱导活化的根癌农杆菌菌液和100 μ I IX IO6个/ml的分生孢子液混匀，涂布在共培养培养基平板上，在28°C下共培养48h ;将融化的MYA固体培养基，MYA固体培养基含8 μ g/ml的G418以及300 μ g/ml的氨苄青霉素，均匀倒在共培养平板上，在28°C下培养至出现抗性菌落；挑取转化子单菌落转接到含200 μ g/ml G418的固体培养基平板上，MYA培养基中NaCl的质量百分比为5%，在28°C下培养5天，然后收集转化子菌丝； 步骤(4):提取G418抗性转化子基因组DNA，用引物P14和P15进行PCR验证，引物P14的序列为5’ -GCGAAGAGCCTCAGATTGC-3’，引物P15的序列为5’ -GCCACTGCTTACCTTGTCTATC-3’ ；筛选出PCR产物为2611bp的转化子菌株，初步鉴定为Ku70基因敲除突变菌株；筛选出PCR产物为261 Ibp的治/70基因敲除突变菌株； 步骤(5)制备初步鉴定为治/70基因敲除突变菌株；的分生孢子，进行单孢分离；提取单孢分离后菌株的基因组DNA，用引物P14和P15进行PCR验证；PCR产物为261 Ibp的菌株初步鉴定为治/沿基因敲除突变菌株，提取基因组DNA，分别用EcoR I和Sac I酶切，然后电泳并进行southern blot验证；米用引物nptF和nptRV,以质粒pUR5750为模板，制备southern blot探针；采用CTAB法提取基因组DNA，分别用EcoR I和Sac I酶切酶切基因组DNA,并进行琼脂糖凝胶电泳；EcoR I和Sac I分别酶切基因组DNA的southern blot条带均为一条带，表明再次鉴定的治/沿基因敲除突变菌株为治/沿基因敲除突变菌株。
【文档编号】C12N1/15GK103525854SQ201310467876
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年10月10日 优先权日:2013年10月10日
【发明者】刘作易, 曹旸, 刘永翔 申请人:贵州省生物技术研究所