一种中链烷烃的生产方法
【专利摘要】本发明属于生物化工领域，特别涉及一种中碳链烷烃的生产方法。烷烃主要来源于石油和天然气，也可以通过自然界中一些物种的新陈代谢产生，但是这些微生物生产烷烃的量很低。随着现代分子生物学尤其是合成生物学的飞速发展，调控烷烃合成过程中相关酶的表达，使微生物细胞只需通过简单的代谢就可以产生烷烃，是生产可再生能源的前沿技术。该方法为传统石化燃料供给不足、新型生物燃料不能完全替代石化燃料等问题提供了一个绝佳的解决方案。与其他菌株相比，大肠杆菌具有遗传背景清楚、易于改造、生长速度快、适合高密度发酵等优点，是微生物法合成化学品和燃料的理想菌株。利用大肠杆菌生产生物烷烃是一种不争地、不靠天、可持续生产的新途径。
【专利说明】一种中链烷烃的生产方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物化工领域，特别涉及一种中碳链烷烃的生产方法。
【背景技术】
[0002]烷烃，是化石能源的主要组分，比如石油的分离产物汽油、柴油以及航空燃油等，都是由不同碳链长度的烷烃组成的。而近年来，随着化石能源的日趋枯竭，以及原油消耗量的激增，化石能源供给量不足和怎样实现可持续发展，已经成为人类所必须关注的问题。因此，关于如何利用可再生能源替代化石燃料的研究，逐渐成为新生的热点课题。
[0003]目前应用最为广泛的化石能源替代品，主要包括燃料乙醇、燃料丁醇以及生物柴油等。但是这几种替代物在应用过程中，都存在许多问题，比如醇类汽油极易形成分层并且腐蚀发动机橡胶、生物柴油原料成本及生产工艺能耗均较高等，致使它们不可能完全替代汽油、柴油等烃类物质。所以，为化石能源寻求一种更好的可再生替代物，即一种低成本、高效率的烷烃生产方法，可谓迫在眉睫。 [0004]烷烃主要来源于石油和天然气，也可以通过自然界中一些物种的新陈代谢产生，比如植物的角质层蜡、昆虫的信息素等，但是学术界对于利用微生物这一“细胞工厂”来生产烷烃的研究却少之又少。随着现代分子生物学尤其是合成生物学的飞速发展，利用基因工程的手段，调控烷烃合成过程中相关酶的表达，使微生物细胞只需通过简单的代谢就可以产生烷烃，是生产可再生能源的前沿技术。该方法为传统石化燃料供给不足、新型生物燃料不能完全替代石化燃料等问题提供了一个绝佳的解决方案。与其他菌株相比，大肠杆菌具有遗传背景清楚、易于改造、生长速度快、适合高密度发酵等优点，是微生物法合成化学品和燃料的理想菌株。利用大肠杆菌生产生物烷烃是一种不争地、不靠天、可持续生产的新途径。
[0005]与公知技术相比，本发明具有以下优点:
[0006](I)直接利用微生物以可再生生物质为原料代谢得到的烷烃，可大大缓解化石能源供给不足的问题。
[0007](2)通过本发明得到的烷烃，与石油中的烷烃无异，更接近化石燃料本身的性质，克服了燃料乙醇、燃料丁醇、生物柴油等存在的一系列问题，利用率极高。
[0008](3)微生物只需通过简单的代谢便可产生烷烃，生产周期短，不受场地、季节等因素影响，不占用耕地资源，容易实现工业化生产。
【发明内容】
[0009]本发明的目的在于提供一种在重组大肠杆菌(Escherichia coli)，以自然界中大量存在并可再生的脂肪酸为原料，合成烷烃的可再生能源工艺路线，使微生物可以作为细胞工厂，发酵生产烷烃。
[0010]本发明首先对来自大肠杆菌K12菌株中的酰基辅酶A合成酶基因进行过表达，构建基因工程菌，即将基因fadD克隆至原核表达载体pACY⑶uet-Ι中，得到重组质粒pACY⑶uet-fadD，质粒I。表达的酰基辅酶A合成酶可以通过外源性流加C14:0/C16:0等中链脂肪酸的方式，催化脂肪酸生成代谢产物酯酰辅酶A，并使这一前体物质在宿主细胞中得到积累。
[0011]再异源表达来自不动杆菌ADPl (Acinetobacter baylyi)中的酰基辅酶A还原酶。具体为将不动杆菌中酰基辅酶A还原酶基因acr克隆至原核表达载体pETDuet-Ι中，得到重组质粒pETDuet-acr，质粒2。表达的酰基辅酶A还原酶可以催化细胞中积累的酯酰辅酶A还原为C14/C16的脂肪醛。
[0012]最后,异源表达来自念珠藻(Nostoc punctiforme)中的醒脱羰基酶。即将醒脱羰基酶基因dc克隆至原核表达载体质粒2中，得到重组质粒pETDuet-acr-dc,质粒3。表达的醛脱羰基酶可以催化脂肪醛脱去羰基，生成烷烃。
[0013]将重组质粒I/质粒3共同转入大肠杆菌BL21 (DE3)中，IPTG诱导重组质粒进行共表达，即可通过外源性流加C14:0/C16:0脂肪酸的方式，使脂肪酸逐步代谢生成C13/C15等碳链长度不等的烷烃，其中外源性流加C14:0脂肪酸得到的烷烃产量为2.17mg/L，外源性流加C16:0脂肪酸得到的烷烃产量为1.81mg/L，从而得到利用重组大肠杆菌直接合成烷烃的可再生资源工艺路线。
[0014]本发明提供的方法，在大肠杆菌中表达特异性调控酰基辅酶A合成、酰基辅酶A还原以及醛脱羰基反应的关键酶基因，可以利用微生物代谢天然脂肪酸得到的烷烃，并进行高密度发酵，为可再生烷烃的合成开辟一条新的途径。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1:DNA琼脂糖凝胶电泳。右侧为纯化后的大肠杆菌中酰基辅酶A合成酶基因PCR产物，1686bp。左侧为DNA大小标准品。
[0016]图2:构建的重组载体pACYCDuet-fadD的图谱，fadD基因克隆于pACYCDuet-Ι载体，基因两端带有NCO I和EcoR I位点。将其编号为质粒I。
[0017]图3:DNA琼脂糖凝胶电泳。右侧为纯化后的不动杆菌中酰基辅酶A还原酶基因PCR产物，888bp。左侧为DNA大小标准品。
[0018]图4:构建的重组载体pETDuet-acr的图谱,acr基因克隆于pETDuet-Ι载体,基因两端带有NCO I和BamH I位点。将其编号为质粒2。
[0019]图5:DNA琼脂糖凝胶电泳。右侧为纯化后的念珠藻中醛脱羰基酶基因PCR产物，699bp。左侧为DNA大小标准品。
[0020]图6:构建的重组载体pETDuet-acr-dc的图谱，dc基因克隆于pETDuet-acr载体，基因两端带有Bgl II和Hind III位点。将其编号为质粒3。
[0021]图7:含有质粒I/质粒3的工程大肠杆菌经诱导后，外源性流加C14:0脂肪酸，其培养液中烧烃的生产情况；C13表示tridecane ；C15表示pentadecane。
[0022]图8:含有质粒I/质粒3的工程大肠杆菌经诱导后，外源性流加C16:0脂肪酸，其培养液中烧烃的生产情况；C13表示tridecane ；C15表示pentadecane。
【具体实施方式】
[0023]本发明提供的一种利用重组大肠杆菌直接合成烷烃的可再生能源工艺路线，使天然脂肪酸得到有效利用。本发明通过以下方案解决这一技术问题:首先以大肠杆菌基因组DNA为模板，设计相应的引物并添加相应克隆酶切位点，扩增fadD基因，其核酸序列如序列I所示，各自所编码的氨基酸序列如序列2所示。PCR扩增后回收获得目的基因DNA片段，酶切后连接至原核表达载体pACY⑶uet-Ι的相应酶切位点上，将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞中，筛选获得阳性重组质粒pACY⑶uet-fadD(质粒I),其质粒图谱如图2所示。质粒经纯化、电泳检测、测序鉴定目的基因。
[0024]再利用全基因合成的方法分别合成acr基因，其核酸序列如序列3所示，各自所编码的氨基酸序列如序列4所示，并添加相应克隆酶切位点，酶切后连接至原核表达载体pETDuet-Ι的相应酶切位点上，将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞中，筛选获得阳性重组质粒pETDuet-acr (质粒2)，其质粒图谱如图4所示，并以同样的方法鉴定目的基因。
[0025]最后，利用全基因合成的方法分别合成dc基因，其核酸序列如序列5所示，各自所编码的氨基酸序列如序列6所示，并添加相应克隆酶切位点，酶切后连接至原核表达载体pETDuet-acr的相应酶切位点上，将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞中，筛选获得阳性重组质粒pETDuet-acr-dc (质粒3),其质粒图谱如图4所示，并以同样的方法鉴定目的基因。
[0026]将重组质粒1/3在大肠杆菌BL21 (DE3)中共同诱导表达与外源性流加脂肪酸后，继续培养，在重组大肠杆菌细胞内即可获得C13/C15等碳链长度不等的烷烃。
[0027]实验步骤
[0028]I)采用的菌种
[0029]大肠杆菌BL21(DE3)
[0030]2)采用的培养基
[0031]LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaC15g/L，121°C湿热灭菌20min)，若配制平板培养基，则需加入1.5%琼脂粉；选择性LB培养基:50ml的LB培养基中加入50 μ L左右0.1 %的氨苄青霉素溶液与氯霉素溶液。
[0032]3)实验方法:
[0033]分别以,利用博迈德试剂盒法所提取的大肠杆菌(Escherichia coli)K12菌株基因组、利用全基因合成技术合成的一个来自不动杆菌ADPl (Acinetobacter baylyi)中的酰基辅酶A还原酶[acyl-CoA reductase]基因DNA和一个来自念珠藻(Nostoc punctiforme)中的醒脱羰基酶[aldehyde decarboxylase]基因DNA为模板，PCR扩增获得带有相应克隆酶切位点的酰基辅酶A合成酶[acyl-CoA synthetase]基因、酰基辅酶A还原酶基因以及醛脱擬基酶基因。
[0034]用胶回收试剂盒回收目的片段，用相应的限制性内切酶分别酶切酰基辅酶A合成酶基因fadD片段和原核表达载体pACY⑶uet-Ι，并于16°C过夜连接，即为构建好的原核表达载体质粒I ;再用相同的方法将酰基辅酶A还原酶基因acr片段与原核表达载体pETDuet-Ι连接，即为构建好的原核表达载体质粒2 ;最后用相同的方法将醛脱羰基酶基因dc片段与质粒2连接，即为构建好的原核表达载体质粒3。
[0035]将构建好的重组质粒I/质粒3利用电转化方法，共同转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中，即可获得产酰基辅酶A合成酶、酰基辅酶A还原酶和醛脱羰基酶的工程大肠杆菌。将工程大肠杆菌按I %的接种量接种到50mL LB液体培养基中，37°C快速振荡培养，在培养液中加入诱导剂IPTG与外源性流加脂肪酸后继续在30°C培养48h，诱导表达目的蛋白；提取发酵液中的烷烃，测定C13/C15等烷烃的产量，即为制备好的不同碳链长度的烷烃。
[0036]下面结合实施例对本发明的具体方法做进一步的说明:
[0037]实施例1
[0038]I大肠杆菌中酰基辅酶A合成酶的克隆与重组载体的构建
[0039]1.1大肠杆菌中酰基辅酶A合成酶的克隆
[0040]利用博迈德试剂盒法提取大肠杆菌(Escherichia coli)K12菌株基因组，以大肠杆菌基因组DNA为模板，根据GenBank序列设计引物，并添加相应的酶切位点(NC0 I和EcoR I )和保护碱基，PCR扩增fadD编码的酰基辅酶A合成酶[acyl-CoA synthetase]基因，该基因诱导表达的酰基辅酶A合成酶可使脂肪酸通过代谢生成酯酰辅酶A。
[0041]PCR扩增酰基辅酶A合成酶基因fadD所用引物如下:
[0042]上游引物:5’ -CATGCCATGGGCAAGAAGGTTTGGCTTAACC-3 ’ [0043]下游引物:5’ -CGGAATTCCGGCTCAGGCTTTATTGTCCACT-3 ’
[0044]PCR反应体系含有0.2 μ L基因组DNA，上下游引物各0.25 μ L，dNTPs混合液1.6 μ L, 10XBuffer2 μ L,pyrobest聚合酶0.4 μ L,加双蒸水补至20 μ L。反应条件为预变性 94°C 4min，变性 94°C lmin，退火 55°C lmin，延伸 72°C lmin50s，循环 30 次，72。。IOmin,4°C保存。
[0045]这样即可PCR扩增克隆到目的酰基辅酶A合成酶基因fadD:
[0046]该基因序列长度为1686bp，PCR扩增结束后利用PCR回收试剂盒回收目的基因，并利用I %的琼脂糖凝胶电泳检测，所得到的目的DNA条带为1686bp (如图1所示)。
[0047]1.2重组载体质粒I的构建
[0048]将克隆的fadD基因与pACYCDuet-Ι载体(购于Novagen公司)用相同的酶(NC0 I和EcoR I )进行双酶切，37°C酶切4小时，载体与外源基因片段按摩尔比1:3-1:10的比例，利用NEB的T4DNA连接酶16°C连接过夜，用该连接产物转化大肠杆菌ToplO感受态细胞，涂布带有氯霉素抗性LB琼脂平板，37°C过夜培养后，挑取适量单菌落，在LB培养基中过夜培养，并进行菌落PCR。用试剂盒提取质粒，进行质粒酶切验证，测序结果正确即获得阳性重组载体。测定其序列如序列I所示，编码如序列2所示的氨基酸序列。由于该基因的起始密码子为稀有起始密码子TTG，故在PCR扩增基因时将其改为常见起始密码子ATG，特此说明。
[0049]所构建的重组载体质粒I的图谱(见图2)。
[0050]实施例2
[0051]I不动杆菌中酰基辅酶A还原酶的克隆与重组载体的构建
[0052]1.1不动杆菌中酰基辅酶A还原酶的克隆
[0053]利用全基因合成的方法合成不动杆菌(Acinetobacterbaylyi)中的酰基辅酶A还原酶[acyl-CoA reductase]基因DNA。该基因诱导表达的酰基辅酶A还原酶可以催化细胞中积累的酯酰辅酶A发生还原反应，生成C14/C16的脂肪醛。
[0054]以上述合成的不动杆菌中酰基辅酶A还原酶基因DNA为模板，根据GenBank序列设计引物，并添加相应的酶切位点(NC0 I和BamH I )与保护碱基。
[0055]PCR扩增酰基辅酶A还原酶基因acr所用引物如下:
[0056]上游引物:5’ -GCAGCCCATGGCTAGCATGAACGCTAAAC-3 ’[0057]下游引物:5，-CCGCTGGATCCTTACCAGTGTTCACCTGG-3’
[0058]PCR反应体系含有0.2 μ L基因组DNA，上下游引物各0.25 μ L，dNTPs混合液
1.6 μ L, 10XBuffer2 μ L,pyrobest聚合酶0.4 μ L,加双蒸水补至20 μ L。反应条件为预变性 94°C 4min，变性 94°C lmin，退火 55°C lmin，延伸 72°C lmin，循环 30 次，72°C 10min,4°C保存。
[0059]这样即可PCR扩增克隆到目的酰基辅酶A还原酶基因acr:
[0060]该基因序列长度为888bp，PCR扩增结束后利用PCR回收试剂盒回收目的基因，并利用I %的琼脂糖凝胶电泳检测，所得到的目的DNA条带为888bp (如图3所示)。
[0061]1.2重组载体质粒2的构建
[0062]将克隆的acr基因与pETDuet_l载体(购于Novagen公司)用相同的酶(NC0 I和BamH I )进行双酶切，37°C酶切4小时，载体与外源基因片段按摩尔比1:3_1:10的比例，利用NEB的T4DNA连接酶16°C连接过夜，用该连接产物转化大肠杆菌ToplO感受态细胞，涂布带有氨苄青霉素抗性LB琼脂平板，37°C过夜培养后，挑取适量单菌落，在LB培养基中过夜培养，并进行菌落PCR。用试剂盒提取质粒，进行质粒酶切验证，测序结果正确即获得阳性重组载体。测定其序列如序列3所示，编码如序列4所示的氨基酸序列。由于该基因的起始密码子为稀有起始密码子GTG，故在合成该基因时将其改为常见起始密码子ATG，特此说明。 [0063]所构建的重组载体质粒2的图谱(见图4)。
[0064]实施例3
[0065]I念珠藻中醛脱羰基酶的克隆与重组载体的构建
[0066]1.1念珠藻中醛脱羰基酶的克隆
[0067]利用全基因合成的方法合成念珠藻(Nostocpunctiforme)中的醒脱羰基酶[aldehyde decarboxylase]基因DNA。该基因诱导表达的醒脱羰基酶可以催化脂肪醒脱去羰基，生成烷烃。
[0068]该基因交予公司合成，合成后为pUCE-dc质粒和含有该质粒的菌株。将菌株甘油管接种到LB液体培养基中进行培养，并用omega试剂盒提取质粒，这样即可克隆到含有醛脱擬基酶基因dc的质粒:
[0069]该基因序列长度为699bp，利用I %的琼脂糖凝胶电泳检测，所得到的目的DNA条带为699bp (如图5所示)ο
[0070]1.2重组载体质粒3的构建
[0071]将克隆的dc基因与重组载体质粒2用相同的酶(Bgl II和Hind III)进行双酶切，37°C酶切4小时，载体与外源基因片段按摩尔比1:3-1:10的比例，利用NEB的T4DNA连接酶16°C连接过夜，用该连接产物转化大肠杆菌ToplO感受态细胞，涂布带有氨苄青霉素抗性LB琼脂平板，37°C过夜培养后，挑取适量单菌落，在LB培养基中过夜培养，并进行菌落PCR0用试剂盒提取质粒，进行质粒酶切验证，测序结果正确即获得阳性重组载体。测定其序列如序列5所示，编码如序列6所示的氨基酸序列。
[0072]所构建的重组载体质粒3的图谱(见图6)。
[0073]实施例4
[0074]I含有acr/dc基因工程大肠杆菌的构建[0075]将构建好的含有酰基辅酶A还原酶acr/醛脱羰基酶dc的重组载体质粒3，通过化学转化(即42°C热激)的方法，转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，涂布带有氨苄青霉素抗性LB琼脂平板，37°C过夜培养后，挑取阳性菌落，即获得了含有acr/dc所表达的酰基辅酶A还原酶/醛脱氢酶的工程大肠杆菌质粒3，-80°C保存该菌株。
[0076]实施例5
[0077]I含有fadD/acr/dc基因工程大肠杆菌的构建
[0078]1.1含有acr/dc大肠杆菌感受态细胞的制作
[0079]将含有质粒3的大肠杆菌BL21 (DE3)菌株按照1%。的接种量接种到LB液体试管培养基中，37°C，160rpm振荡过夜，制作一级种子液。将此一级种子液按照1%的接种量接种到50mL LB液体培养基中(内含50 μ L氨苄青霉素)，37°C，160rpm振荡培养约2.5h，当OD600约为0.5时，将菌液置于冰上冷却30min。于4°C，以4000rpm,离心5min,收集菌体，并用预冷的10%的甘油重悬细胞，重复此过程4-5次，最后用预冷的ImLlO %的甘油重悬细胞，并于冰上分装，便制得含有质粒3的大肠杆菌感受态细胞，_80°C保存该细胞。
[0080]1.2含有fadD/acr/dc基因工程大肠杆菌的构建
[0081]将构建好的含有酰基辅酶A合成酶基因fadD的重组载体质粒1，通过电转化的方法，转化到含有质粒3的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，涂布带有氨苄青霉素与氯霉素的双重抗性LB琼脂平板，37 °C过夜培养后，挑取阳性菌落，即获得了含有fadD/acr/dc所表达的酰基辅酶A合成 酶/酰基辅酶A还原酶/醛脱氢酶的工程大肠杆菌质粒I/质粒3，_80°C保存该菌株。
[0082]实施例6
[0083]I烷烃的气相色谱-质谱联用检测方法
[0084]对甲基叔丁醚所萃取的烷烃进行气相色谱-质谱联用检测，气相色谱-质谱条件如下:岛津GCMS-QP2010，HP_5ms色谱柱，载气:高纯氦气(99.999% )，进样口温度:280°C，载气柱头压:100.2kPa，分流比10:1 ;程序升温:起始60。。，维持4min ；5°C /min升温至160°C ；80°C /min升温至300°C，保持3min ;质谱运行时间:2.5_25min，扫描片段:80_800amuo
[0085]实施例7
[0086]外源性流加C14:0脂肪酸生产烷烃
[0087]I中链烷烃的合成
[0088]将工程大肠杆菌质粒I/质粒3按I %的接种量接种到50mL LB液体培养液中(内含50 μ L的氨苄青霉素与50 μ L的氯霉素)，37°C，160rpm振荡培养约3h，当OD6tltl约为0.6时，在菌液中加入0.4mM诱导剂IPTG，同时外源性流加C14:0脂肪酸，至终浓度为培养液的1%。，继续在30°C条件下振荡培养48h，培养过程中每隔12h外源性流加葡萄糖至终浓度为培养液的1%。培养液在8000rpm条件下，离心10min，并在工作3s、间歇3s、工作70次的条件下进行细胞破碎。取含有烷烃的细胞破碎液保存，为后续检测工作做准备。
[0089]2中链烷烃的提取
[0090]取1.5mL细胞破碎液,加入400 μ L甲基叔丁醚,在振荡仪上振荡lmin,并上下颠倒摇匀，充分进行萃取，SOOOrpm离心2min，分离并收集有机层。这样即可获得一定浓度的中链烷烃。[0091]3中链烷烃的气质检测
[0092]对甲基叔丁醚萃取的烷烃进行气相色谱-质谱联用检测，气相色谱条件如实施例6所示，结果见图7。从最终气相图谱中可分析得出:质粒I/质粒3重组大肠杆菌所产生的C13/C15的烷烃产量为2.17mg/L。
[0093]实施例8
[0094]外源性流加C16:0脂肪酸生产烷烃
[0095]I中链烷烃的合成
[0096]将工程大肠杆菌质粒I/质粒3按I %的接种量接种到50mL LB液体培养液中(内含50 μ L的氨苄青霉素与50 μ L的氯霉素)，37°C，160rpm振荡培养约3h，当0D600约为0.6时，在菌液中加入0.4mM诱导剂IPTG，同时外源性流加C16:0脂肪酸，至终浓度为培养液的1%。，继续在30°C条件下振荡培养48h，培养过程中每隔12h外源性流加葡萄糖至终浓度为培养液的1%。培养液在8000rpm条件下，离心10min，并在工作3s、间歇3s、工作70次的条件下进行细胞破碎。取含有烷烃的细胞破碎液保存，为后续检测工作做准备。
[0097]2中链烷烃的提取
[0098]取1.5mL细胞破碎液,加入400 μ L甲基叔丁醚,在振荡仪上振荡lmin,并上下颠倒摇匀，充分进行萃取，SOOOrpm离心2min，分离并收集有机层。这样即可获得一定浓度的中链烷烃。
[0099]3中链烷烃的气质检测
[0100]对甲基叔丁醚萃取的烷烃进行气相色谱-质谱联用检测，气相色谱条件如实施例6所示，结果见图8。从最终气相图谱中可分析得出:质粒I/质粒3重组大肠杆菌所产生的C13/C15的烷烃产量为1.81mg/L。
【权利要求】
1.一种中链烷烃的生产方法，其特征在于，包括: 步骤1、首先将来自大肠杆菌K12菌株中的酰基辅酶A合成酶基因fadD克隆至原核表达载体，得到重组质粒1，经IPTG诱导，可以通过外源性流加C14:0/C16:0等中链脂肪酸的方式，催化脂肪酸生成代谢产物酯酰辅酶A。 步骤2、再将不动杆菌中的酰基辅酶A还原酶基因acr克隆至原核表达载体，得到重组质粒2，经IPTG诱导，可以催化细胞中积累的酯酰辅酶A还原为C14/C16的脂肪醛。 步骤3、最后将念珠藻中的醛脱羰基酶基因dc克隆至原核表达载体，得到重组质粒3，经IPTG诱导，可以催化脂肪醛脱去羰基，生成烷烃。 步骤4、将得到的重组质粒1/3共同转至BL21 (DE3)中，经外源性流加C14:0/C16:0等中链脂肪酸与IPTG诱导表达后，可以生产中链烷烃。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的来自大肠杆菌中酰基辅酶A合成酶基因fadD的核酸序列如序列I所示，各自所编码的氨基酸序列如序列2所示。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将fadD基因克隆至双启动子表达载体pACY⑶uet-Ι，得到重组质粒pACY⑶uet-f adD，质粒I，其中酰基辅酶A合成酶基因置于T7promoterl下游，由T7启动子驱动表达。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述的来自不动杆菌中酰基辅酶A还原酶基因acr的核酸序列如序列3所示，各自所编码的氨基酸序列如序列4所示。
5.根据权利 要求1所述的方法，其特征在于，所述acr基因克隆至双启动子表达载体pETDue t-1，得到重组质粒pETDue t-acr，质粒2，其中酰基辅酶A还原酶基因置于T7promoterl下游，由T7启动子驱动表达。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述的来自念珠藻中醛脱羰基酶基因dc的核酸序列如序列5所示，各自所编码的氨基酸序列如序列6所示。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述dc基因克隆至双启动子表达载体pETDuet-acr,得到重组质粒pETDuet-acr-dc,质粒3,其中醒脱羰基酶基因置于T7promoterl下游，由T7启动子驱动表达。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，已转入重组质粒1/3的重组大肠杆菌，经添加0.4mM IPTG诱导酰基辅酶A合成酶、酰基辅酶A还原酶、醛脱氢酶表达后，可经外源性流加C14:0/C16:0等中链脂肪酸的方式，催化脂肪酸代谢生成C13/C15等碳链长度不等的中链烷烃。
【文档编号】C12R1/01GK104004790SQ201410271433
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年6月18日 优先权日:2013年12月23日
【发明者】刘珞, 颜红, 王芳, 谭天伟, 邓利 申请人:北京化工大学