拟香味类香味菌及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种拟香味类香味菌T45菌株及其制备方和用途，本发明提供的拟香味类香味菌T45菌株产挥发性抑菌物质，对烟草赤星病菌有抑制生长的作用，主要通过抑制分生孢子形成、孢子萌发、菌丝生长以及破坏菌丝形态的方式。CGMCC No.91162014.04.30
【专利说明】拟香味类香味菌及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物菌种【技术领域】，尤其是一种拟香味类香味菌，及其制备方法和应 用。
【背景技术】
[0002] 链格抱菌（Alternaria alternate (Fries) Keissler)是一类重要的植物病原菌， 寄主范围广，危害重，其引起的烟草赤星病是烟叶成熟后期重要的叶部病害，在我国各烟区 均有发生，直接影响了烟叶的产量和质量。关于烟草赤星病的防治，目前国内主要以化学防 治为主，但使用化学农药防治赤星病既导致农药残留、环境污染，又可引起病菌产生抗药性 以及严重的烟株药害。生物防治由于其对环境友好而被认为是替代化学杀菌剂防治植物病 害的良好途径，因此生防资源的筛选、利用和创新对于植物病害的生物防治具有重要意义。
[0003] 微生物代谢产生的挥发性产物常具有抑菌、防病或兼具促生及诱导抗性等作 用，是一类重要的生防资源。McCain于1966年最早报道了灰色链霉菌（Streptomyces griseus)对Gleospriumaridum孢子形成具有抑制作用；Chen等研究发现枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)产生的挥发物能强烈抑制灰霉病菌（Botrytis cinerea)孢子萌发 和萌发管伸长；Koitabashi分离到的Irpexlacteus产生的挥发物对Oiduim sp.引起的温 室欧疗白粉病防治效果良好；Zhang等发现枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)GB03的挥 发物能通过增强拟南芥（Arabidopsis)的光合作用对其产生促生作用。与非挥发性抗菌物 质相比，挥发性抗菌物质具有渗透力强、分布均匀等优点，防治作物病害效果更为突出、应 用领域更为广阔；已有研究表明，包括真菌、细菌在内的很多微生物都能产生挥发性抗菌物 质。
[0004] 生物防治由于其对环境友好，且具有良好的防治效果，近年来成为防治植物病害 的研究热点。拮抗微生物是一类重要的生防资源，其产生的拮抗物质主要包括非挥发性代 谢产物和挥发性代谢产物两种。目前，对于烟草赤星病菌的生物防治大多集中在产非挥发 性抗菌物质微生物的筛选和利用，而对于产挥发性抗烟草赤星病菌代谢产物微生物的研究 则较少。
【发明内容】
[0005] 本发明针对现有技术的不足，提出一种拟香味类香味菌，对烟草赤星病有较好的 抑制和治疗效果。
[0006] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：一种拟香味类香味菌 (Myroidesodoratimimus)的T45菌株，2014年4月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC9116。
[0007] -种如上所述拟香味类香味菌T45菌株的制备方法，包括以下步骤：
[0008] (1)取烟草根际土壤，加入蒸馏水，摇动片刻，吸取上层液加入到无菌水中，制成悬 液；
[0009] (2)取步骤（1) 土壤悬浊液滴加到含2?5%利福平的LB固体培养基平板上，用 涂布棒均匀涂布，并将培养基倒置于28°C恒温培养箱培养1?2天。
[0010] 优选的，所述LB固体培养基配方为：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠 10g/L和琼脂粉15g/L。
[0011] 优选的，（3)步骤（2)培养液涂布于LB固体培养基上28°C培养24h活化，划线于 LB肉汤培养液中28°C，150rpm震荡培养24h。
[0012] -种如上所述拟香味类香味菌T45菌株在对烟草赤星病菌的抑制方面的应用。
[0013] 优选的，包括以下步骤：
[0014] ①.T45菌株的培养：取烟草根际土壤，加入蒸馏水，摇动片刻，吸取上层液加入到 无菌水中，制成悬液；取土壤悬浊液滴加到含2?5%利福平的LB固体培养基平板上，用涂 布棒均勻涂布，并将培养基倒置于28°C恒温培养箱培养1?2天；分离到67株细菌，编号 T1-T67,涂布于LB培养基上28°C培养24h活化，划线获得单菌落，挑取单菌落于LB肉汤培 养液中28°C，150rpm震荡培养24h ;
[0015] ②.病原菌培养：烟草赤星病菌边缘的菌丝块置于新鲜PDA培养基上25°C培养7d 进行活化；
[0016] ③.接种：在步骤②长满烟草赤星病菌的培养基上获得菌丝块，将其接种到PDA 培养基平板上25°C培养12h ;吸取步骤①细菌培养液均匀涂布于LB固体培养基平板上；将 PDA培养基平板对扣置于LB固体培养基平板上方，并用封口膜密封两块平板边缘，于25°C 下培养5-7天。
[0017] 优选的，所述LB固体培养基配方为：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠 10g/L和琼脂粉15g/L。
[0018] 优选的，所述PDA培养基组成为：马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂15克和水1000 晕升。
[0019] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：拟香味类香味菌T45菌株产生的挥发性 代谢物能强烈抑制烟草赤星病菌的生长，主要通过抑制分生孢子形成、孢子萌发、菌丝生长 以及破坏菌丝形态的方式。
【专利附图】
【附图说明】
[0020] 图1为烟草根际细菌对烟草赤星病菌生长不同抑制率的数量统计；
[0021] 图2为细菌T45基于16S rDNA基因序列的分子系统发育树；
[0022] 图3为T45对烟草赤星病菌的抑制作用图；
[0023] 图片依从上至下从左至右排列顺序编号为A :正常生长的烟草赤星病菌，B :挥发 物作用下赤星病菌生长缓慢，C :正常的孢子和菌丝，D :挥发物处理后，未见分生孢子，E :扫 描电镜下正常的菌丝和孢子，F :挥发物处理后未见分生孢子，菌丝断裂、表面皱缩，G :对照 分生孢子正常萌发长成菌落，H :分生孢子萌发受挥发物抑制，未见菌落形成。
[0024] 图4为T45产生的3种挥发物对烟草赤星病菌的抑制作用图
[0025] 其中，图片依从左至右排列顺序为水、异戊醇、异丁酸、异戊酸对病原菌的作用效 果图。
【具体实施方式】
[0026] 下面结合具体实施例对本发明进行详细描述，本部分的描述仅是示范性和解释 性，不应对本发明的保护范围有任何的限制作用。
[0027] 实施例1
[0028] 培养基：PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，水1000mL。
[0029] LB固体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂15g，水1000mL。
[0030] 供试病原菌：烟草赤星病菌（Alternaria alternate)由中国农业科学院烟草研 究所植保科室提供。试验前，挑取冰箱中保存的病原菌边缘的菌丝块置于新鲜PDA培养基 上25°C培养7d进行活化。
[0031] 供试细菌菌株：采用土壤稀释法，从湖南省采集到的烟草根际土壤中分离到67株 细菌，编号T1-T67，-20°C甘油保存。使用前，吸取刚解冻的细菌培养液涂布于LB培养基上 28°C培养24h活化，划线获得单菌落。对扣试验前，挑取单菌落于LB肉汤培养液中28°C， 150rpm震荡培养24h。
[0032] 实施例2拮抗细菌初筛
[0033] 用平板对扣法测试67株细菌对烟草赤星病菌的抑制作用。用直径5_打孔器在 长满烟草赤星病菌的培养基上打孔获得菌丝块，将其接种到新的PDA平板上25°C培养12h， 使其固着在培养基上。吸取震荡培养24h的细菌培养液100 μ L均匀涂布于LB平板上，将 含有赤星病菌的PDA平板对扣置于LB平板上方，并用Parafilm封口膜密封。以未涂布菌液 的LB平板作为对照。将不同处理的对扣平板用保鲜袋密封，于25°C下培养5-7天，至对照 组赤星病菌菌丝长满2/3平板时，用十字交叉法测量赤星病菌菌落直径，计算细菌挥发物 质对其抑制率。每个处理5个平板，实验重复两次。选取抑制率最高的菌株进行下一步研 究。
[0034] 生长抑制率（％ )=(对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径X 100 %
[0035] 从烟草根际土壤中分离获得67株细菌，平板对扣试验发现，分离细菌所产挥发物 对烟草赤星病菌产生不同程度的抑制作用（图1)。42株细菌对赤星病菌的抑制率达30%以 上，19株细菌的抑制率达到50%以上，4株细菌抑制率达70%以上，分别为T46 (71. 19% )、 Τ57(72·83% )、Τ64(76·56% )、Τ45(78·89% )，选取抑制率最高的菌株T45做进一步研究。
[0036] 实施例3细菌的16S rDNA鉴定
[0037] 采用16S rDNA序列测定以及构建进化树的方法对筛得的高抑制率细菌进行 分子鉴定。利用细菌基因组提取试剂盒（上海生工）提取细菌基因组DNA，以此为模 板，用弓丨物 27F : (5,-AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGCT-3'）和 1492R : (5, -TACGGCTACCT TGTTACGACTTCACCCC-3'）对菌株16SrDNA进行扩增。获得的PCR产物经纯化后送往生工生 物工程上海有限公司进行序列测定，见下方序列表。测序结果于NCBI数据库中进行BLAST 同源性比对分析，用ClustalL 83进行多重序列对比，用Mega4. 0中Neighbor-Joining法 构建系统发育树。
[0038] GCCAACCGGCAGCTACACATGCAAGTCGAGGGGTAGAAAGAGCTTGCTTTTTTGAGACCGGCGCACGGG TGAGTAACGCGTATGCAACCTACCTTATACAGGGGAATAGCCCGAAGAAATTCGGATTAATGCTCCATGGTTTATCG ATATGGCATCGTATTGATAATAAAGATTTATCGGTATAAGATGGGCATGCGTATCATTAGCTAGTTGGTGTGGTAAC GGCATACCAAGGCAACGATGATTAGGGGTCCTGAGAGGGAGATCCCCCACACTGGTACTGAGACACGGACCAGACTC CTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGTCAATGGAGGCAACTCTGAACCAGCCATGCCGCGTGCAGGATGACGGT CCTATGGATTGTAAACTGCTTTTGTACAGGAAGAAACCTCCCTACGAGTAGGGACTTGACGGTACTGTAAGAATAAG GATCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGATCCGAGCGTTATCCGGAATTATTGGGTTTAAAGGG TTCGTAGGCGGCTTTGTAAGTCAGTGGTGAAATTTCCTAGCTTAACTAGGACACTGCCATTGATACTGCAGAGCTTG AATAATATGGAAGTAACTAGAATATGTAGTGTAGCGGTGAAATGCTTAGATATTACATGGAATACCAATTGCGAAGG CAGGTTACTACGTATTTATTGACGCTGATGAACGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCAC GCCGTAAACGATGGATACTAGCTGTTCGGTTTTCGGACTGAGTGGCTAAGCGAAAGTGATAAGTATCCCACCTGGGG AGTACGTTCGCAAGAATGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAT GATACGCGAGGAACCTTACCAGGGCTTAAATGTAGATTGACAGATTTGGAAACAGATTTTTCTTCGGACAATTTACA AGGTGCTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGCCGTGAGGTGTCAGGTTAAGTCCTATAACGAGCGCAACCCCTATTGTT AGTTACCAGCGCGTAGTGGCGGGGACTCTAGCAAGACTGCCGGTGCAAACCGTGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAA TCATCACGGCCCTTACGTCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGCAAGTACAGAAAGCAGCTACCTGGCAACAGGAT GCGAATCTCCAAAGCTTGTCTCAGTTCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCTATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCG GATATCAGCCATGATCCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGCCATGGAAGCTGGGGGTAC CTGAAGTCGGTGACCGCAAGGAGCTGCCTAGGGTAAAGCTTG
[0039] 提取细菌基因组DNA，扩增后送测序获得其16S rDNA序列，提交NCBI数据库进行 比对，其序列与拟香味类香味菌（Myroidesodoratimimus)相似性达99%，构建系统进化 树，如图2所示，确定其分类地位为拟香味类香味菌，获得Genbank登录号KF758445。
[0040] 实施例4筛得细菌对烟草赤星病菌的抑制作用
[0041] 对菌丝生长的影响：将获得的高抑制率细菌按1. 3中方法与烟草赤星病菌对扣培 养至对照组病菌菌丝长至2/3平板。从培养平板边缘切取病原菌菌落，3%戊二醛固定4h， 0. IM磷酸缓冲液漂洗。1 %锇酸固定90min，0. IM磷酸缓冲液漂洗，酒精梯度脱水，在30%、 50%、70%、80%、100%依次脱水，其中100%酒精2次，每次1011^11。乙酸异戊脂置换，50% 一次，100%两次。Eiko公司XD-I型二氧化碳临界点干燥器干燥，Eiko公司IB-3型离子镀 金仪喷金镀膜。JEOL公司JSM-840扫描电镜观察。同时，用无菌接种针挑取边缘菌丝均匀 涂布于无菌载玻片中央的无菌水中，光学显微镜下观察菌丝形态变化，每个处理至少观察5 个视野。
[0042] 对分生孢子的影响：接种烟草赤星病菌在PDA培养基上26°C培养5?7d，用无菌 水洗下，3000r/min离心3min去除菌丝，取上清液即为孢子悬液，稀释至浓度为102个/mL。 吸取100 μ L孢子悬液均匀涂布于PDA培养基上，将筛得细菌的培养液涂布于LB平板上，两 平板按按1. 3中方法进行对扣培养，以不接种细菌的LB平板作为对照。
[0043] 如图3所示的菌株T45对烟草赤星病菌的抑制效果图。培养5d时，对照组烟草赤 星病菌长满2/3皿（图3-A)，而与T45菌株对扣培养的PDA平板中，赤星病菌生长缓慢，菌 落呈黄白色，抑制效果明显（图3-B)。挑取两培养皿中病原菌边缘菌丝于显微镜下镜检观 察，发现对照赤星病菌产生大量分生孢子，菌丝透明均匀细长（图3-C)，而经挥发物处理的 赤星病菌在镜检时未发现有分生孢子，由于放大倍数较低菌丝形态变化不直观（图3-D)。 扫描电镜镜检则可以明显观察到正常生长的赤星病菌孢子呈倒棒锤形，菌丝细长均匀、表 面光滑（图3-E)，挥发物处理后则观察不到任何孢子，菌丝断裂、表面发生皱缩，菌丝形态 遭到破坏（图3-F)。孢子涂布实验显示对照孢子萌发长成菌落（图3-G)，而经挥发物处理 的平板上无菌落形成（图3-F)，说明挥发物对病菌孢子萌发也具有一定抑制作用。因此，菌 株T45产生的挥发性物质主要通过抑制烟草赤星病菌孢子产生、孢子萌发，菌丝生长以及 破坏菌丝形态的方式对病原菌产生抑制作用。
[0044] 实施例5挥发性抑菌物质的GC/MS分析
[0045] 利用顶空固相微萃取-气相色谱/质谱联用法测定细菌产生的挥发性化合物。在 15mL顶空样品瓶中加入9ml细菌培养液和0. Ig硫酸钠，放入磁力搅拌子，将小瓶固定在恒 温水浴池中，将75 μ m CAR/PDMS纤维头穿透样品瓶胶塞，压下活塞使纤维头伸出不锈钢套 管暴露于样品上层空气中，于50°C中速磁力搅拌平衡lh，以LB培养液的挥发物作为对照。 萃取后，迅速将纤维头缩回并拔出针头，立即插入气相色谱的气化室，推出纤维，250°C解吸 2min。GC/MS条件参考文献中做法。采用NIST08谱库进行检索，相似度> 80%鉴定为同种 化合物。
[0046] 实施例6化合物单体试验
[0047] 根据GC/MS分析结果，购买相应化合物的纯品试剂，用分隔平板法测试其对烟草 赤星病菌的抑制效果：在一个两分格的塑料平板中一侧倒入PDA培养基，接种直径为5mm的 赤星病菌菌饼，另一侧加入100 μ L纯品试剂，以无菌水作为对照。封口膜密封，置于25°C培 养5-7天至对照组菌丝长满2/3平板，用十字交叉法计算生长抑制率。
[0048] 用SPME-GC/MS对菌株T45以及LB液体培养基产生的挥发性化合物进行分析。所 得质谱图经NIST08质谱数据库检索并与标准图谱对比，在T45挥发物中共鉴定出24种化 合物，对照中检出19种化合物，分别属于醛类、酮类、烷烃类、醚类、醇类、酯类、酸类物质， 其中十六酸和十八酸在T45和对照中含量均较高，因此共选定仅在T45中检出的化合物以 及十六酸和十八酸，购买其纯品试剂进行测试。除6种未获得纯品试剂外，共测试了 10种 挥发物对烟草赤星病菌的抑菌效果（表1)。由于十五酸、十六酸、十八酸为固体，故用甲醇 溶解后配成lOmg/mL的溶剂进行试验。在测试的十种化合物中异戊醇、异丁酸、异戊酸对病 原菌的作用效果十分显著，几乎完全抑制了病原菌的生长（图4)，苯甲醇对病原菌具有显 著抑制作用，而八甲基环四硅氧烷、2_十三烷酮、δ-十二内酯则无明显抑菌活性。
[0049] 表1细菌挥发物纯品的抑菌作用
[0050]
【权利要求】
1. 一种拟香味类香味菌（Myroidesodoratimimus)的T45菌株，2014年4月30日保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3 号，保藏号为CGMCC9116。
2. -种如权利要求1所述拟香味类香味菌T45菌株的制备方法，包括以下步骤： (1) 取烟草根际土壤，加入蒸馏水，摇动片刻，吸取上层液加入到无菌水中，制成悬液； (2) 取步骤（1) 土壤悬浊液滴加到含2?5%利福平的LB固体培养基平板上，用涂布 棒均匀涂布，并将培养基倒置于28°C恒温培养箱培养1?2天。
3. 如权利要求2所述制备方法，其特征在于：所述LB固体培养基配方为：胰蛋白胨 l〇g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L和琼脂粉15g/L。
4. 如权利要求2所述制备方法，其特征在于：（3)步骤（2)培养液涂布于LB固体培养 基上28°C培养24h活化，划线于LB肉汤培养液中28°C，150rpm震荡培养24h。
5. -种如权利要求1所述拟香味类香味菌T45菌株在对烟草赤星病菌的抑制方面的应 用。
6. 如权利要求5所述应用，包括以下步骤： ① .T45菌株的培养：取烟草根际土壤，加入蒸馏水，摇动片刻，吸取上层液加入到无 菌水中，制成悬液；取土壤悬浊液滴加到含2?5%利福平的LB固体培养基平板上，用涂 布棒均勻涂布，并将培养基倒置于28°C恒温培养箱培养1?2天；分离到67株细菌，编号 T1-T67,涂布于LB培养基上28°C培养24h活化，划线获得单菌落，挑取单菌落于LB肉汤培 养液中28°C，150rpm震荡培养24h ; ② .病原菌培养：烟草赤星病菌边缘的菌丝块置于新鲜PDA培养基上25°C培养7d进 行活化； ③ .接种：在步骤②长满烟草赤星病菌的培养基上获得菌丝块，将其接种到PDA培养基 平板上25°C培养12h ;吸取步骤①细菌培养液均匀涂布于LB固体培养基平板上；将PDA培 养基平板对扣置于LB固体培养基平板上方，并用封口膜密封两块平板边缘，于25°C下培养 5-7 天。
7. 如权利要求6所述应用，其特征在于：所述LB固体培养基配方为：胰蛋白胨10g/L、 酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L和琼脂粉15g/L。
8. 如权利要求6所述应用，其特征在于：所述PDA培养基组成为：马铃薯200克、葡萄 糖20克、琼脂15克和水1000毫升。
【文档编号】C12N1/20GK104263668SQ201410318125
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年10月22日 优先权日:2014年10月22日
【发明者】孔凡玉, 黄树立, 游偲, 李锡宏, 张成省, 李青诚, 陈德鑫, 高加明, 冯超, 王静 申请人:中国农业科学院烟草研究所, 中国烟草总公司湖北省公司