检测cyp2c19*2突变位点的方法和寡核苷酸的制作方法
【专利摘要】本发明提供利用荧光实时PCR技术高灵敏度检测CYP2C19*2突变位点的方法和寡核苷酸，所述寡核苷酸包括一对扩增引物SEQNO1和SEQNO2，以及检测探针SEQNO3和SEQNO4，且将MGB基团修饰于两条探针的3端，以增加特异性。本发明具有检测周期短，特异性高，准确度高，灵敏度高，条件依赖少，污染风险低等优点。
【专利说明】检测CYP2G19*2突变位点的方法和寡核苷酸
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因突变检测领域，具体涉及利用荧光实时PCR技术高灵敏度检测 CYP2C1W2突变位点的方法和寡核苷酸。
【背景技术】
[0002] 氯吡格雷（clopidogrel)是心血管疾病中广泛用于抗血小板的药物。血 小板激活和聚集是急性冠状动脉综合征和冠状动脉介入（percutaneous coronary intervention, PCI)术后引发动脉血栓形成的关键因素。将两种药物氯吡格雷和阿司匹林 联用的抗血小板疗法对于急性冠状动脉综合征和PCI术后患者至关重要，可以有效预防缺 血事件的发生。然而，接受这种抗血小板疗法的治疗后，仍有约10%的患者发生支架内血 栓、死亡、卒中等心血管事件，主要由于不同患者个体对于氯吡格雷的反应存在差异，其影 响因素是多方面的，其中基因多态性起着决定性作用。
[0003] 研究发现氯吡格雷在体内通过氧化、水解两步连锁反应后形成一种硫醇衍生物， 此衍生物与位于血小板上的二磷酸腺苷（ADP)受体P2Y12不可逆结合，从而阻止ADP对腺 苷酸环化酶的抑制作用，促进血管扩张剂刺激磷蛋白（VASP)的磷酸化，从而起到抑制血小 板聚集的作用。这一过程受细胞色素 P450同工酶系统的调控，包括同工酶CYP1A2、CYP3A 4、CYP2C19等，而CYP2C19在这一过程中起主要作用。同时目前的研究也证实了 CYP2C19存 在基因多态性，并直接影响该酶的活性，因此CYP2C19的基因多态性被认为是氯吡格雷反 应个体差异性的重要决定因素，也是氯吡格雷耐药性产生的可能机制之一。
[0004] CYP2C19基因位于人类10号染色体上（10q24. 1?10q24. 3)，编码含450个氨基 酸残基的CYP2C19同工酶。现已发现CYP2C19至少含有25个等位基因，其中CYP2C19*1为 编码正常活性酶的基因，编码的酶缺失活性的等位基因被称为失功能（loss-of-function) 等位基因。作为最为常见的失功能等位基因，CYP2C19*2是由于CYP2C19基因的5号外显 子第681位点上的碱基G突变为A而产生的，这一突变导致所编码酶发生剪接缺陷，丧失活 性。CYP2C19*2在白种人群的基因频率约为0. 13,非洲人群0. 18,亚洲人群0. 30。
[0005] 目前，按氯吡格雷的药效差异可将患者分为超速代谢（UM)型、广泛代谢（EM)型、 中间代谢（IM)型以及低代谢（PM)型4种。IM及PM类型的患者接受氯吡格雷治疗后获得的 疗效最差，因而一般而言，这两类类患者均应该接其它药物替代的治疗方案，例如普拉格 雷，替卡格雷等，而产生这种现象的主要原因就是由于这些患者自身携带了 CYP2C19*2突 变基因，从而导致CYP2C19酶活性丧失，影响药效。
[0006] 因此，了解患者的CYP2C19*2突变位点情况，将有助于临床医生判断是否使用氯 吡格雷进行相关后续治疗。
[0007] 目前，临床对于检测CYP2C19*2突变位点的方法一般为传统的DNA测序、荧光实时 PCR和等位基因特异性扩增（ARMS-PCR)。但是传统的DNA测序方法如Sanger测序和焦磷 酸测序，检测周期较长，通常需要1?2天，操作复杂，容易污染，而且测序设备昂贵，一般实 验室难以配置。ARMS-PCR虽然提高了检测特异性，但是检测条件要求严格，在实际操作中， 容易容易出现引物错配而产生假阳性。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供检测CYP2C19*2突变位点的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括 一对扩增引物SEQ NO 1和SEQ N0 2,以及检测探针SEQ N0 3和SEQ N0 4,其碱基序列如 下所示：
[0009] SEQ NO 1 :5, -GTATMTCAGAGMTTACTACACATG-3' ；
[0010] SEQ N0 2 :5' -GTTGATGTCCATCGATTCTTGGTG-3' ；
[0011] SEQ NO 3：FAM-CCACTATCATTGATTATTTCCCG-MGB ；
[0012] SEQ NO 4 :HEX-CCACTATCATTGATTATTTCCCA-MGB。
[0013] 进一步地，SEQ NO 1、SEQ NO 2、SEQ NO 3以及SEQ NO 4的使用浓度之比为 2:2:l:l〇
[0014] 进一步地，所述一对扩增引物的扩增条件为：95 °C 5min预变性；95 °C 15s， 62°C 30s，40 个循环。
[0015] 本发明的目的还在于提供一种检测CYP2C19*2突变位点的方法，包括：
[0016] (1)提取样本中的DNA ;
[0017] ⑵荧光实时PCR扩增反应：在同一个反应管中加入⑴中提取的样本DNA、一对 扩增引物SEQ NO 1和SEQ N0 2,以及检测探针SEQ N0 3和SEQ N0 4,进行扩增；
[0018] (3)结果分析：根据扩增反应结果，判断样本是否存在CYP2C19*2突变位点，其中，
[0019] SEQ NO 1 :5, -GTATAATCAGAGAATTACTACACATG-3,；
[0020] SEQ N0 2 :5, -GTTGATGTCCATCGATTCTTGGTG-3' ；
[0021] SEQ NO 3 :FAM-CCACTATCATTGATTATTTCCCG-MGB ;
[0022] SEQ NO 4:HEX-CCACTATCATTGATTATTTCCCA-MGB。
[0023] 进一步地，步骤（2)中的扩增反应条件为：95°C 5min预变性；95°C 15s，62°C 30s， 40个循环。
[0024] 进一步地，SEQ NO 1、SEQ NO 2、SEQ NO 3以及SEQ NO 4的使用浓度之比为 2:2:1: l〇
[0025] 进一步地，在步骤（3)结果分析中，若样本只产生一条扩增曲线，则根据相对应的 探针判断其基因型；若样本产生两条扩增曲线，则判定样本为杂合突变型。
[0026]本发明的目的还在于提供一种检测CYP2C19*2突变位点的试剂盒，所述试剂盒包 括样本DNA抽提试剂、检测体系PCR反应液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，所述检 测体系PCR反应液包括一对扩增引物SEQ NO 1和SEQ Ν0 2,以及检测探针SEQ Ν0 3和SEQ N0 4,其中，
[0027] SEQ NO 1 :5' -GTATAATCAGAGAATTACTACACATG-3,；
[0028] SEQ N0 2 :5' -GTTGATGTCCATCGATTCTTGGTG-3,；
[0029] SEQ NO 3 :FAM-CCACTATCATTGATTATTTCCCG-MGB ;
[0030] SEQ NO 4 :HEX-CCACTATCATTGATTATTTCCCA-MGB。
[0031] 本发明的有益效果：本发明通过设计一对特异性扩增引物及两条MGB探针， 利用荧光实时PCR(Real-time PCR)技术进行CYP2C19*2突变类型的检测，并直接根据 Real-time PCR结果图谱分析该位点基因型，可在同一 PCR反应管中检测纯合突变型，杂合 型，野生型，避免了临床漏检，同时将本发明检测结果与DNA测序结果对比，发现两者结果 一致，说明本发明具有较高的准确性。
[0032] 此外，MGB探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团（Non-Fluorescent Quencher)，本 身不产生荧光，这使得本底信号产生的荧光干扰大大降低，同时探针上还连接有MGB (Minor Groove Binder)修饰基团，可以将探针的Tm值提高l〇°C左右，所以在Tm值相同的条件下， MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更短，既降低了合成成本，也使得探针特异性及与 模板的结合成功率大为提高。同时依据3'端末位碱基必须与其模板DNA互补时才能有效 扩增的原理，将MGB探针的3'端设计在CYP2C19*2突变位点上，进一步增强了探针的特异 性和准确性。
[0033] 因此，本发明具有检测周期短，特异性高，准确度高，条件依赖少，污染风险低等优 点。检测结果将有助于临床医生更好地根据个体差异判断是否使用氯吡格雷进行相关后续 治疗。
【专利附图】
【附图说明】
[0034] 图1是样本A的Real-time PCR检测结果。
[0035] 图2是样本B的Real-time PCR检测结果。
[0036] 图3是样本C的Real-time PCR检测结果。
[0037] 图4是样本A的Sanger测序图谱。
[0038] 图5是样本B的Sanger测序图谱。
[0039] 图6是样本C的Sanger测序图谱。
[0040] 图7是MGB探针和常规探针（TAMARA探针）的检测对比结果。
【具体实施方式】
[0041] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规 条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精 编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
[0042] 实施例1 :检测CYP2C19*2突变位点的寡核苷酸和试剂盒
[0043] 检测CYP2C19*2突变位点的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸包括一对扩增 引物SEQ NO 1和SEQ N0 2,以及检测探针SEQ N0 3和SEQ N0 4,其碱基序列如下所示：
[0044] SEQ NO 1 :5, -GTATMTCAGAGMTTACTACACATG-3,；
[0045] SEQ N0 2 :5, -GTTGATGTCCATCGATTCTTGGTG-3,；
[0046] SEQ NO 3 :FAM-CCACTATCATTGATTATTTCCCG-MGB ;
[0047] SEQ NO 4 ：HEX-CCACTATCATTGATTATTTCCCA-MGB〇
[0048] 其中SEQ NO 3只能结合野生型CYP2C19*2样本的DNA模板，SEQ NO 4只能结合 突变型CYP2C19*2样本的DNA模板。
[0049] 一种检测CYP2C19*2突变位点的试剂盒，包括样本DNA抽提试剂、检测体系PCR反 应液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品。
[0050] 样本DNA抽提试剂：可以选择业内技术人员熟知的提取试剂进行DNA抽提,也可使 用生物技术公司开发的试剂盒（如天根生化科技（北京）有限公司的DNA提取试剂盒）来 进打DNA抽提。
[0051] 检测体系PCR反应液包括2*qPCR MIX(购自τ〇γ〇Β〇生物科技有限公司）、 5〇*ROX(购自ΤΟΥΟΒΟ生物科技有限公司）、ddH2〇、一对扩增引物SEq NO 1 (1〇禮）和SEQ N〇2(10mM)以及两条检测探针 SEQ NO 3(10mM)和 SEQ NO 4a〇mMh
[0052] 阳性对照品：含有CYP2C19*2突变位点的DNA序列溶液。
[0053]阴性对照品：不含有CYP2C19*2突变位点的DNA序列溶液。
[0054] 空白对照品：2 μ 1生理盐水或不加任何物质。
[0055] 检测体系PCR反应液试剂配制如下：
[0056]
[0057]
【权利要求】
1. 检测CYP2C19*2突变位点的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸包括一对扩增引 物SEQ NO 1和SEQ NO 2,以及检测探针SEQ NO 3和SEQ NO 4,其碱基序列如下所示： SEQ NO 1 ：5, - GTATAATCAGAGAATTACTACACATG -3,； SEQ NO 2 ：5, -GTTGATGTCCATCGATTCTTGGTG-3,； SEQ NO 3 ：FAM-CCACTATCATTGATTATTTCCCG-MGB ； SEQ NO 4 :HEX-CCACTATCATTGATTATTTCCCA-MGB。
2. 如权利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于，SEQ NO 1、SEQ NO 2、SEQ NO 3以及SEQ NO 4的使用浓度之比为2:2:1:1。
3. 如权利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于，所述一对扩增引物的扩增条件为：95°C 5min 预变性；95°C 15s，62°C 30s，40 个循环。
4. 一种检测CYP2C19*2突变位点的方法，包括： (1) 提取样本中的DNA ; (2) 荧光实时PCR扩增反应：在同一个反应管中加入（1)中提取的样本DNA、一对扩增 引物SEQ NO 1和SEQ NO 2,以及检测探针SEQ NO 3和SEQ NO 4,进行扩增； (3) 结果分析：根据扩增反应结果，判断样本是否存在CYP2C19*2突变位点，其特征在 于： SEQ NO 1 ：5, - GTATAATCAGAGAATTACTACACATG -3,； SEQ NO 2 ：5, -GTTGATGTCCATCGATTCTTGGTG-3,； SEQ NO 3 ：FAM-CCACTATCATTGATTATTTCCCG-MGB ； SEQ NO 4 :HEX-CCACTATCATTGATTATTTCCCA-MGB。
5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（2)中的扩增反应条件为：95°C 5min 预变性；95°C 15s，62°C 30s，40 个循环。
6. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，SEQ NO 1、SEQ NO 2、SEQ NO 3以及SEQ NO 4的使用浓度之比为2:2:1:1。
7. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤（3)结果分析中，若样本只产生一条 扩增曲线，则根据相对应的探针判断其基因型；若样本产生两条扩增曲线，则判定样本为杂 合突变型。
8. -种检测CYP2C19*2突变位点的试剂盒，所述试剂盒包括样本DNA抽提试剂、检测体 系PCR反应液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，所述检测体系PCR反应液包括一对 扩增引物SEQ NO 1和SEQ NO 2,以及检测探针SEQ NO 3和SEQ NO 4,其特征在于， SEQ NO 1：5, - GTATAATCAGAGAATTACTACACATG -3,； SEQ NO 2 ：5, -GTTGATGTCCATCGATTCTTGGTG-3,； SEQ NO 3 ：FAM-CCACTATCATTGATTATTTCCCG-MGB ； SEQ NO 4 :HEX-CCACTATCATTGATTATTTCCCA-MGB。
【文档编号】C12N15/11GK104232757SQ201410366181
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年7月29日 优先权日:2014年7月29日
【发明者】陈奕磊, 周晓犊 申请人:杭州艾迪康医学检验中心有限公司