一种香石竹PS1基因ihpRNA载体的构建方法
【专利摘要】本发明公开了一种香石竹PS1基因ihpRNA表达载体的构建方法，本发明首次从香石竹中获得一个与2n配子形成相关的PS1基因，该基因cDNA全长3423bp，编码1140个氨基酸。以香石竹DNA为模板，扩增PS1基因466bp外显子和85bp内含子序列，然后扩增466bp外显子反义片断，将正义和内含子片断以及反义片断同时插入到pCAMBIA1301-220.6表达载体中，从而构成反向互补发卡结构的RNAi(ihpRNA)表达载体，本发明简化了构建的步骤，且无需专门的RNAi载体，具有简单、快速、高效和成本低等优点，为大规模的植物功能基因研究提供了一个高通量的平台。
【专利说明】-种香石竹PS1基因 ihpRNA载体的构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物基因工程【技术领域】，特别涉及一种香石竹PS1基因和香石竹PS1 基因 ihpRNA载体及其构建方法。
【背景技术】
[0002] RNA 干扰（RNA interference，RNAi)是通过双链 RNA (double-stranded RNA, dsRNA)介导，特异性地降解靶mRNA，使同源的靶基因发生沉默，即序列特异性转录后基因 沉默（Post-Transcriptional Gene Silencing,PTGS)，从而诱使细胞表现出特定基因缺失 的表型。RNAi现象普遍存在于从真菌到植物、从无脊椎动物到哺乳动物的各种生物中。RNAi 已成为分析基因功能的重要工具之一。随着RNAi技术在植物基因功能分析上的广泛应用， 迫切需要一种高通量构建含内含子发夹结构RNA (ihpRNA)表达载体的新方法。
[0003] 多倍体植物因其花大、花色浓艳等特点而具有重要的观赏价值。2n配子是多倍 体产生的主要途径，多倍化是真菌、植物、无脊椎动物、脊椎动物，尤其是植物进化的主要途 径。2n配子是植物育种的重要工具，2n配子在花卉育种如百合、香石竹、红三叶草和报春等 也得到了广泛的应用。
[0004] 拟南芥中AtPSl基因与减数分裂II纺綞体的方向有关，Atpsl基因突变产生平行、 融合和三级纺綞体，形成二分体、三分体和四分体，导致2n花粉产生。AtPSl基因包含7个 外显子和6个内含子，编码1477个氨基酸，N端具有FHA结构域，C端具有PINc结构域。在 土豆中，ps/ps 基因型能形成 FDR-C0 型（first-division restitution with crossover)2n 配子，能传递亲本80%左右的杂合性。纯合的ps/ps基因突变，在第二次减数分裂产生平行 纺綞体和三极纺綞体，导致2n花粉的产生，提示香石竹中PS1基因可能与2n配子的形成有 关。
[0005] 因此，采有RNAi技术沉默与香石竹PS1基因，不仅有利于揭示香石竹PS1基因的 功能，得出PS1与2n配子形成的相关性，为香石竹利用2n配子进行多倍体育种奠定基础。
【发明内容】
[0006] 本发明目的在于提供一种香石竹PS1基因 ihpRNA载体及其构建方法，为功能基因 的研究打下基础。本发明还提供了一个与香石竹（Dianthus caryophyllus L.)减数分裂 相关PS1基因。
[0007] 本发明的技术方案如下：
[0008] 1、一个与香石竹（Dianthus caryophyllusL.)减数分裂相关PS1基因，该基因的 核苷酸序列如SEQ ID N0 :1所示。
[0009] 2. -种香石竹PS1基因 ihpRNA载体的构建方法，包括以下步骤：
[0010] (1)香石竹PS1基因正义和内含子片段的克隆及连接、测序和转化
[0011] 以香石竹总 DNA 为模版，用 PS1RNAI-2259F 和 PSlRNAI-2259-579introR 引物对进 行PCR扩增，得到香石竹PS1基因正义和内含子片段PCR产物，该PCR产物经琼脂糖凝胶纯 化后，连接克隆载体PMD18-T，连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，重组子经PCR鉴 定后测序，得到目的正义内含子片段重组子，命名为PMD-F-INTRO,正义和内含子片段的序 列如SEQ ID NO :2所示；是所述PS1RNAI-2259F引物的碱基序列如SEQ ID NO :6所示的， PSlRNAI-2259-579introR 引物的碱基序列如 SEQ ID NO :7 所示；
[0012] (2)香石竹PS1基因反义片断的克隆及连接、测序和转化
[0013] 以香石竹总 DNA 为模版，用 PS1RNAI-INVERSE-F 和 PS1RNAI-INVERSE-R 引物对进 行PCR扩增，得到香石竹PS1基因反义片断PCR产物，该PCR产物经琼脂糖凝胶纯化后，连 接克隆载体PMD18-T，连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，重组子经PCR鉴定后测 序，得到目的反义片断重组子，命名为PMD-R，反义片断的序列如SEQ ID Ν0 :3所示；所述 PS1RNAI-INVERSE-F引物的碱基序列如SEQ ID N0 :8所示，PS1RNAI-INVERSE-R引物的碱基 序列如SEQ ID N0 :9所示的是；
[0014] (3)表达载体 pCAMBIA1301-220. 6 的构建
[0015] Hind III/EcoR I 双酶切 pCAMBIA1301，Hind III/EcoR I 双酶切 ρΒΙ220· 6,回收 PCAMBIA1301的大片段和pBI220. 6的小片段，T4DNA连接酶连接，连接产物转化DH5 α感受 态细胞，提取质粒，进行双酶切验证，得到改造好的表达载体PCAMBIA1301-220. 6 ;
[0016] ⑷重组载体的双酶切和回收
[0017] 提取含有pMD-F-INTR0重组子质粒和pMD-R重组子质粒，pMD-F-INTR0重组子质粒 用BamH I /Κρη I双酶切，回收香石竹PS1基因正义和内含子片段片段，pMD-R重组子质 粒用Κρη I /Sac I双酶切，回收香石竹PS1基因反义片断，表达载体pCAMBIA1301-220.6 用 BamH I /Sac I 双酶切，回收 pCAMBIA1301-220. 6 片段；
[0018] (5)回收片段的连接
[0019] 将步骤（4)回收的香石竹PS1基因正义和内含子片段、香石竹PS1基因反义片和 PCAMBIA1301-220. 6片段用T4DNA连接酶连接连接即得香石竹PS1基因 ihpRNA载体。
[0020] 3.根据技术方案2所述的香石竹PS1基因 ihpRNA载体的构建方法，步 骤（5)所述的载体构建方法为正义和内含子片断以及反义片断同时连接到表达载体 PCAMBIA1301-220. 6中，表达载体pCAMBIA1301-220. 6 :香石竹PS1基因正义和内含子片断： 香石竹PS1基因反义片断的摩尔比为1 :3 :3?3 :1 :1。
[0021] 4. 一种香石竹PS1基因 ihpRNA载体，所述香石竹PS1基因 ihpRNA载体含有香石 竹PS1基因的正义和内含子片段及反义片断；所述的香石竹PS1基因的正义和内含子片段 的碱基序列如SEQ ID N0 :2所示，所述的香石竹PS1基因的反义片断的碱基序列如SEQ ID NO :3所示。
[0022] 5.根据技术方案2所述的一种香石竹PS1基因 ihpRNA表达载体的构建方法，所述 的内含子片断为PS1基因本身的内含子。
[0023] 6. -种香石竹PS1基因 ihpRNA载体是用技术方案2或3所述的一种香石竹PS1 基因 ihpRNA载体的构建方法构建得到。
[0024] 7.技术方案4或6所述的香石竹PS1基因 ihpRNA载体在提高香石竹2n配子频率 方面的应用。
[0025] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0026] 1、本发明首次从香石竹中获得一个与2n配子形成相关的PS1基因，为揭示2n配 子形成的遗传因素及多倍体种质的创新打下基础；
[0027] 2、本发明所构建的香石竹PS1基因 ihpRNA载体及其构建方法用所述香石竹PS1 基因本身的内含子作为间隔区，能够提高基因沉默的效率。
[0028] 3.本发明所述载体的构建方法，将正义和内含子片段、反义片断和表达载体片段 同时连接，一步即可构建成香石竹PS1基因 ihpRNA载体，具有简单、快速、高效和成本低等 优点，为大规模的植物功能基因研究提供了一个高通量的平台。
[0029] 序列表中SEQ ID N0 :1所示的是与香石竹（Dianthus caryophyllus L.)减数分 裂相关PS1基因的核苷酸序列。
[0030] 序列表中SEQ ID N0 :2所示的是香石竹PS1基因正义和内含子片段的核苷酸序 列。
[0031] 序列表中SEQ ID N0 :3所示的是香石竹PS1基因反义片断的核苷酸序列。
[0032] 序列表中SEQ ID N0 :4所示的是PS1-LEN-117F引物的碱基序列。
[0033] 序列表中SEQ ID N0 :5所示的是PS1-LEN-3509R引物的碱基序列。
[0034] 序列表中SEQ ID N0 :6所示的是PS1RNAI-2259F引物的碱基序列。
[0035] 序列表中SEQ ID N0 :7所示的是PSlRNAI-2259-579introR引物的碱基序列。
[0036] 序列表中SEQ ID N0 :8所示的是PS1RNAI-INVERSE-F引物的碱基序列。
[0037] 序列表中SEQ ID N0 :9所示的是PS1RNAI-INVERSE-R引物的碱基序列。
【专利附图】
【附图说明】
[0038] 图1是香石竹PS1基因全长cDNA电泳图。泳道M :DNA marker ;1 :香石竹PS1基 因全长cDNA PCR产物。
[0039] 图2是香石竹PS1基因 ihpRNA载体构建示意图。
[0040] 图3是香石竹PS1基因正义和内含子片断，以及香石竹PS1基因反义片断电泳图。 1-4 :香石竹PS1基因正义和内含子片断PCR产物；5-8 :香石竹PS1基因反义片断PCR产物； M:DNA marker。
[0041] 图4是pCAMBIA1301-220. 6表达载体及香石竹PS1基因正义和内含子片断及香石 竹PS1基因反义片断双酶切图。图A:M:DNA marker ;1 :
[0042] pCAMBIA1301-22(X 6表达载体BamH I /Sac I双酶切产物；2.含香石竹PS1基因 正义和内含子片断重组质粒的BamH I /Κρη I双酶切产物；图B :M1和M2 :DNA marker ;1 香石竹PS1基因正义和内含子片断重组质粒的BamH Ι/Κρη I双酶切产物；2-4.含香石 竹PS1基因反义片断重组质粒的Κρη I /Sac I。
[0043] 图5是香石竹PS1基因 ihpRNA载体PCR鉴定图。M :DNA marker ; 1-4 :香石竹PS1 基因正义和内含子片断PCR产物；5-8 :香石竹PS1基因反义片断PCR产物。
[0044] 图6是香石竹PS1基因 ihpRNA载体酶切鉴定图。M :DNA marker ;泳道1:香石竹 PS1基因 ihpRNA载体BamH I /Κρη I双酶切产物，泳道1箭头所指的酶切条带是香石竹 PS1基因正义和内含子片断条带；泳道2:香石竹PS1基因 ihpRNA载体Κρη I /Sac I双酶 切产物，泳道2箭头所指的酶切条带是香石竹PS1基因反义片断条带；泳道3 :香石竹PS1 基因 ihpRNA载体BamH I /Sac I双酶切产物，酶切条后带较小的片断包含香石竹PS1基 因正义和内含子片断，以及香石竹PS1基因反义片断。
【具体实施方式】
[0045] 下面结合附图对本发明作进一步的详细说明：下述实例中所用方法如无特别说 明，均为常规方法。
[0046] 试验材料
[0047] 1.菌株与载体：大肠杆菌菌株DH5 α购自北京全式金生物技术有限公司；表达载 体PCAMBIA1301-220. 6由南京农业大学农学院细胞研究所惠赠；克隆载体PMD18-T购自 Takara 公司。
[0048] 2.主要试剂：Taq DNA聚合酶、DNA Marker、限制性内切酶、T4DNA连接酶、M-MLV 反转录酶购自Takara公司；TRIZ0L购自Invitrogen公司；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒 购自北京全式金生物技术有限公司；其它化学试剂均为国产分析纯。
[0049] 3.本发明设计了三对引物对：PS1-LEN-117F 和 PS1-LEN-3509R ;
[0050] PS1RNAI-2259F 和 PSlRNAI-2259-579introR ;PS1RNAI-INVERSE-F 和
[0051] PS1RNAI-INVERSE-R ;各引物上海捷瑞生物工程有限公司合成。
[0052] PS1-LEN-117F引物的碱基序列如序列表中SEQ ID N0 :4所示。
[0053] PS1-LEN-3509R引物的碱基序列如序列表中SEQ ID N0 :5所示。
[0054] PS1RNAI-2259F引物的碱基序列如序列表中SEQ ID N0 :6所示。
[0055] PSlRNAI-2259-579introR引物的碱基序列如序列表中SEQ ID N0 :7所示。
[0056] PS1RNAI-INVERSE-F引物的碱基序列如序列表中SEQ ID N0 :8所示。
[0057] PS1RNAI-INVERSE-R引物的碱基序列如序列表中SEQ ID N0 :9所示。
[0058] 4.植物材料：香石竹（Dianthus caryophyllusL.)为市售。
[0059] 实施例1香石竹PS 1基因的克隆 [0060] 1.香石竹总RNA的提取及纯化
[0061] (1)提取RNA所用的枪头、离心管、镊子、剪刀、小钢勺、研钵、量筒等用0. 1%的 DEPC于37°C恒温箱中处理至少12h后进行高压灭菌。
[0062] (2)取香石竹1. 1-1. 2cm长的花蕾置于研钵中，加液氮充分研磨后分装于加有 lmlTRIZOL的1. 5ml离心管中，漩涡震荡15sec，室温静置5min ;
[0063] (3)4°C、12, OOOrpm离心15min，小心将上清液移入新的1. 5ml离心管，加入等体积 的酸酚：氯仿：异戊醇（25:24:1)混合液，漩涡震荡15sec后室温静置10min ;
[0064] (4)4°C、12, OOOrpm离心10min，将上清液移至新的1. 5ml离心管，加入等体积的氯 仿：异戊醇（24:1)混合液，漩涡震荡15sec后室温静置10min ;
[0065] (5)4°C、12, OOOrpm离心10min，将上清液移至新的1. 5ml离心管，加入等体积异丙 醇，室温下静置l〇min ;
[0066] (6) 4°C、12, OOOrpm 离心 15min，去除上清，RNase-free 水配制的 75% 乙醇洗漆；
[0067] (7) 4°C、12, OOOrpm 离心 5min，去除上清，加适量 RNase-free 水（20-40 μ 1)溶解 总 RNA。
[0068] 2. cDNA 合成
[0069] (1)在Microtube管中配制下列模板RNA/引物混合液。
[0070]
【权利要求】
1. 一个与香石竹（Dianthus caryophyllusL.)减数分裂相关PS1基因，其核苷酸序列 如 SEQ ID NO :1 所示。
2. -种香石竹PS1基因 ihpRNA载体的构建方法，包括以下步骤： (1) 香石竹PS1基因正义和内含子片段的克隆及连接、测序和转化 以香石竹总DNA为模版，用PS1RNAI-2259F和PSlRNAI-2259-579introR引物对进行 PCR扩增，得到香石竹PS1基因正义和内含子片段PCR产物，该PCR产物经琼脂糖凝胶纯 化后，连接克隆载体PMD18-T，连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，重组子经PCR鉴 定后测序，得到目的正义内含子片段重组子，命名为PMD-F-INTRO,正义和内含子片段的 序列如SEQ ID NO :2所示；所述PS1RNAI-2259F引物的碱基序列如SEQ ID NO :6所示， PSlRNAI-2259-579introR 引物的碱基序列如 SEQ ID NO :7 所示； (2) 香石竹PS1基因反义片断的克隆及连接、测序和转化 以香石竹总DNA为模版，用PS1RNAI-INVERSE-F和PS1RNAI-INVERSE-R引物对进行 PCR扩增，得到香石竹PS1基因反义片断PCR产物，该PCR产物经琼脂糖凝胶纯化后，连 接克隆载体PMD18-T，连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，重组子经PCR鉴定后测 序，得到目的反义片断重组子，命名为PMD-R，反义片断的序列如SEQ ID NO :3所示；所述 PS1RNAI-INVERSE-F引物的碱基序列如SEQ ID NO :8所示，PS1RNAI-INVERSE-R引物的碱基 序列如SEQ ID NO :9所示； (3) 表达载体pCAMBIA1301-220. 6的构建 Hind III/EcoR I 双酶切 pCAMBIA1301，Hind III/EcoR I 双酶切 ρΒΙ220·6,回收 PCAMBIA1301的大片段和pBI220. 6的小片段，T4DNA连接酶连接，连接产物转化DH5 α感受 态细胞，提取质粒，进行双酶切验证，得到改造好的表达载体PCAMBIA1301-220. 6 ; (4) 重组载体的双酶切和回收 提取含有PMD-F-INTRO重组子质粒和pMD-R重组子质粒，pMD-F-INTRO重组子质粒用 BamH Ι/Κρη I双酶切，回收香石竹PS1基因正义和内含子片段，pMD-R重组子质粒用Κρη I /Sac I双酶切，回收香石竹PS1基因反义片断，表达载体pCAMBIA1301-220. 6用BamH I /Sac I 双酶切，回收 pCAMBIA1301-220. 6 片段； (5) 回收片段的连接 将步骤（4)回收的香石竹PS1基因正义和内含子片段、香石竹PS1基因反义片段和 PCAMBIA1301-220. 6片段用T4DNA连接酶连接即得香石竹PS1基因 ihpRNA载体。
3. 根据权利要求2香石竹PS1基因 ihpRNA载体的构建方法，其特征在于：步 骤（5)所述的载体构建方法为正义和内含子片断及反义片断同时连接到表达载体 PCAMBIA1301-220. 6中，pCAMBIA1301-220. 6表达载体：香石竹PS1基因正义和内含子片断： 香石竹PS1基因反义片断的摩尔比为1 :3 :3?3 :1 :1。
4. 一种香石竹PS1基因 ihpRNA载体，其特征在于：ihpRNA载体含有香石竹PS1基因的 正义和内含子片段及反义片断；所述的香石竹PS1基因的正义和内含子片段的碱基序列如 SEQ ID N0:2所示，所述的香石竹PS1基因的反义片断的碱基序列如SEQ ID N0:3所示。
5. 根据权利要求2所述的一种香石竹PS1基因 ihpRNA表达载体的构建方法，其特征在 于所述的内含子片断为PS1基因本身的内含子。
6. 权利要求4所述香石竹PS1基因 ihpRNA载体在提高香石竹2n配子频率方面的应 用。
【文档编号】C12N15/82GK104195142SQ201410431244
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年8月29日 优先权日:2014年8月29日
【发明者】周旭红, 莫锡君, 马璐琳, 苏艳, 施自明, 蒋亚莲, 桂敏, 田敏 申请人:云南省农业科学院花卉研究所