一种枯草芽孢杆菌菌株、生防菌剂及其制备方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物材料制备【技术领域】，提供一种枯草芽孢杆菌wdcjxq2266，利用该菌株生产的生防菌剂，及该菌株和生防菌剂的应用。枯草芽孢杆菌wdcjxq2266，于2014年4月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号CGMCC NO.8993，通过将该菌株在LB培养液28℃ 180rpm振荡培养12～24小时，制成活菌总浓度为1×109～1×1010CFU/mL的菌剂成品，将菌剂成品稀释10-100倍后在辣椒种植时浸种处理，或在移栽时进行灌根处理。其抑菌效果非常明显，经过试验证明，生防菌剂在温室条件下对辣椒疫病的防效可以达到69.06％，对辣椒的增产幅度达到38.5％。CGMCC NO.89932014.04.03
【专利说明】-种枯草芽抱杆菌菌株、生防菌剂及其制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物保护技术【技术领域】，涉及一种枯草芽抱杆菌菌Wdcjxq2266,利用 该菌株生产的生防菌剂，W及该菌株和生防菌剂在防治辣椒疫病中的应用。
【背景技术】
[0002] 辣椒疫病是由辣椒疫霉菌（Phyto地thora capsici Leonian)引起的一种细菌性 病害。辣椒疫霉菌的寄主范围较广，除辣椒外还能寄生番茄、茄子和一些瓜类作物。病菌W 卵抱子在±壤中或病残体中越冬，借风、雨、灌水及其他农事活动传播。发病后可产生新的 抱子囊，形成游动抱子进行再侵染。病菌生育温度范围为10?37C，最适宜温度为20? 3(TC。空气相对湿度达90% W上时发病迅速運巷、低注地、排水不良，氮服使用偏多、密度 过大、植株衰弱均有利于该病的发生和蔓延。该种病害由于地理分布范围广，寄主范围广， 所W-旦侵染非常容易造成毁灭性打击，到目前为止还没有有效的防治手段。
[0003] 辣椒是我国重要的经济作物，疫病一直是辣椒上的重要病害，近年来，随着设施蔬 菜种植面积的扩大和连作密度的加大，发病趋势更加严重，据调查，严重时减产50% W上， 甚至造成毁灭性的危害。
[0004] 长期W来，国内外对辣椒疫病的防治多从农业防治和化学防治出发，虽然取得了 一定的防效，但始终未能很好控制该病害的发生，且造成了一定程度的环境污染。生物防治 由于其自身的优点开始受到越来越多的重视，利用微生物制剂防治辣椒疫病取得了一些进 展，但效果并不理想。综上所述，开发新的、更为高效和安全的微生物杀菌剂控制辣椒疫病 的发生是实现农业安全可持续发展的需要，符合社会发展要求。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是解决现有技术中防治辣椒疫病的制剂防治效果不理想，易造成环 境污染的问题，提供一种枯草芽抱杆菌菌株、包括该菌株的生防菌剂及该菌剂的制备，W及 二者在防治辣椒疫病上的应用。
[0006] 本发明的目的通过W下技术方案实现
[0007] 1.本发明提供一种枯草芽抱杆菌菌株，所述枯草芽抱杆菌菌株炬acillus subtilis)的名称为wdcjxq2266,于2014年4月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中也，菌种保藏号为CGMCC NO. 8993,地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3 号。菌落特征：单个细胞0.7?0.8X2?3微米，着色均匀。无芙膜，周生鞭毛，能运动。 革兰氏阳性菌，芽抱0. 6?0. 9 X 1. 0?1. 5微米，楠圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽抱 形成后菌体不膨大。菌落表面粗趟不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形 成皱贈。需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成剛巧。
[000引2.本发明还提供一种生防菌剂，所述的生防菌剂包括上述1提供的枯草芽抱杆菌 菌株 wdcjxq2266。
[000引 3.上述2提供的生防菌剂，其中，菌剂成品中活菌总浓度为IX IO9?IX 101化即/ mL。
[0010] 4.上述3提供的生防菌剂，该生防菌剂主要由上述I提供的枯草芽抱杆菌菌株 wdcjxq2266经菌体活化、种子培养、扩大培养后得到的。
[0011] 5.上述2-4任一项所述的生防菌剂的制备方法，其中，将上述1提供防治辣椒疫 病的生防菌株wdcjxq2266在LB培养液28C 180巧m振荡培养12-2化，然后4000巧m离也 lOmin，用灭菌水进行稀释制成菌剂，菌剂成品中活菌总浓度为lXl〇9?lXl(TCFU/mL。
[0012] 6.上述1提供的枯草芽抱杆菌菌株在防治辣椒疫病中的应用。
[0013] 7.上述2提供的生防菌剂在防治辣椒疫病中的应用。
[0014] 8.上述7提供的应化该应用方法为，在使用前，将该菌剂成品稀释10-100倍，在 辣椒种植时浸种处理或在移栽时进行灌根处理达到防治辣椒疫病的作用。
[0015] 9.上述2提供的生防菌剂在辣椒促生增产中的应用
[0016] 本发明的有益效果：
[0017] 1.生防制剂中含有抑制辣椒疫病病原菌生长的专一性菌株枯草芽抱杆菌菌株 wdcjxq2266,其抑菌效果非常明显，经过试验证明，本发明提供的生防制剂在室温条件下对 辣椒疫病的防效可W达到69.06%，施入±壤中可W形成优势群，并能保持活性存活下来。
[0018] 2.本发明的芽抱杆菌菌株wdcjxq2266,生产工艺简单、培养时间短、成本低，且该 菌株可W通过简单、快捷低成本的制备方法获得防治辣椒疫病的生防制剂。
[0019] 3.本发明提供的生防制剂为微生物防治剂，无公害，不产生环境污染，可W不用或 减少其他相应化学农药的用量，不仅节省农民开支，而且有利于蔬菜的出口。
[0020] 4.经过试验证明，本发明提供的生防制剂，具有抗病、增产作用，可为农民增加收 入。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照本领域的公知手段。
[0022] 实施例1
[002引 1. wdcjxq2266生防菌剂的制备
[0024] 本发明涉及一种防治辣椒疫病的生防菌株wdcjxq2266,为2013年在江苏南京市 郊病田健株上分离得到。
[00巧]分离方法；采用5点取样法将生长至成熟期的整株番茄（连根、茎、叶和粘附± ) 装入灭菌的封口塑料袋中，立即带回实验室。在分离番茄生境相关细菌前用自来水冲洗采 集到的番茄根，直到冲洗干净，然后在灭菌水中润洗3遍。采集到的茎和叶采取同样的处理 方法。分别称取植物的根、茎、叶放入含有27血无菌0. 85%化CI溶液的H角瓶中，加入少 许直径2mm的玻璃珠，200rpm 3(TC振荡30min后，分别移于灭菌培养皿中，先用1.5%次氯 酸轴溶液（化CIO)浸泡5min，灭菌水润洗5次，将组织剪成2-3cm长的小块，用綴子把根、茎 和叶分别接入RZA及邸A平板上，置于3(TC培养箱中培养，5d后把没有任何污染的组织用 剪刀剪碎后研细，浸软组织，灭菌棉布过滤，再用无菌0. 85%化CI溶液W 10倍梯度稀释，分 别取梯度稀释液0. 1血涂在RZA平板及邸A平板上（根部稀释液涂10气10气ICT4和ICT5四 个浓度，茎、叶部稀释液涂1〇^1、1〇气1〇^3和IO^ 4四个浓度），3(TC培养箱中培养，进行根内、 茎内、叶内细菌的分离。根据平板上菌落大小及形态进行分离纯化。细菌种群密度WC即/ g表示。将纯化好的细菌进行编号，用80%灭菌甘油保存，放入-7(TC备用。
[0026] 按照平板枯抗活性、蛋白酶活性、几下质酶活性、纤维素酶活性、葡聚糖酶活性W 及产嗜铁素活性，采用赋值法，选择出综合得分较高菌株，通过温室试验最终筛选出防治效 果最好的wdcjxq2266。
[0027] 菌落特征：单个细胞0. 7?0. 8X2?3微米，着色均匀。无芙膜，周生鞭毛，能运 动。革兰氏阳性菌，芽抱0. 6?0. 9X 1. 0?1. 5微米，楠圆到柱状，位于菌体中央或稍偏， 芽抱形成后菌体不膨大。菌落表面粗趟不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时， 常形成皱贈。需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成剛巧。
[0028] 将分离出的wdcjxq2266单菌落于LB液体培养基，28C 18化pm摇床振荡培养12h， 获得种子液。将种子液W 1%的接种量接种于发酵培养基，于3(TC 18化pm摇床振荡培养 5山菌剂成品中活菌总浓度为lX108-lX109CFU/mL。LB培养基为；酵母粉5g/L、膜蛋白腺 lOg/U氯化轴lOg/L。发酵培养液为：藏糖2g/L、玉米粉20g/L、黄豆粉lOg/L、磯酸氨二钟 0. 5g/L、走水硫酸镇0. 2g/L、酵母膏0. 4g/L、碳酸巧Ig/L、氯化铁0. 005g/L。
[0029] 2温室盆鉢试验检测wdcjxq2266生防菌剂对辣椒疫霉的防效
[0030] 移栽之前，用生防菌wdcjxq2266 (10?即/mL)浸种处理辣椒幼苗30min ;移栽时采 用20mL IO7C即/mL菌剂灌根处理，移栽7天后接种1000个/mL辣椒疫霉病菌^^ophthora capsici Leonian游动抱子息液20mL。另外不用生防菌wdcjxq2266处理，直接接种辣椒疫 霉病菌游动抱子息液的处理作为对照Control。每个处理组24株，H次重复。在温度25? 28C，相对湿度50 %，光照1化/1化条件下，培养3周后调查病级数，计算病害严重度和防 效。
[0031] 灌根接种法的分级标准：
[0032] DI 0,无任何症状；
[0033] DI 1，幼苗根茎部稍有变黑，叶片不萎慧或可恢复性萎慧；
[0034] DI 2,幼苗根茎部变黑达1?2cm，叶片不可恢复性萎慧，下部叶片偶有脱落；
[00巧]DI 3,幼苗根茎部变黑超过1?2cm，叶片明显萎慧或落叶明显；
[0036] DI 4,幼苗根茎部变黑、皱缩，生长点外部叶脱落或整株萎慧；
[0037] DI 5,植株枯死.
[0038] 注：本标准经中华人民共和国农业部1999-01-25批准
【权利要求】
1. 一种枯草芽孢杆菌菌株，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌菌株（Bacillus subtilis)的名称为wdcjxq2266,于2014年4月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO. 8993。
2. -种生防菌剂，其特征在于：所述的生防菌剂包括权利要求1所述的枯草芽孢杆菌 菌株 wdcjxq2266。
3. 权利要求2所述的生防菌剂，其特征在于：菌剂成品中活菌总浓度为IX 109? lX1010CFU/mL。
4. 权利要求3所述的生防菌剂，其特征在于：该生防菌剂主要由权利要求1所述的枯 草芽孢杆菌菌株WdcjXq2266经菌体活化、种子培养、扩大培养后得到的。
5. 权利要求2-4任一项所述的生防菌剂的制备方法，其特征在于：将权利要求1所 述防治辣椒疫病的生防菌株wdcjXq2266在LB培养液28°C 180rpm振荡培养12-24h，然 后4000rpm离心lOmin，用灭菌水进行稀释制成菌剂，菌剂成品中活菌总浓度为1X109? lX1010CFU/mL。
6. 权利要求1所述的枯草芽孢杆菌菌株在防治辣椒疫病中的应用。
7. 权利要求2所述的生防菌剂在防治辣椒疫病中的应用。
8. 权利要求7所述的应用，其特征在于：在使用前，将该菌剂成品稀释10-100倍，在辣 椒种植时浸种处理或在移栽时进行灌根处理达到防治辣椒疫病的作用。
9. 权利要求2所述的生防菌剂在辣椒促生增产中的应用。
【文档编号】C12N1/20GK104357351SQ201410568661
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年10月22日 优先权日:2014年10月22日
【发明者】许泉, 吴强, 许嘉臻, 刘欣 申请人:南京农业大学