专利名称：试剂级高活性胰脂酶粉剂提取和保存方法
技术领域：
本发明是试剂级高活性胰脂酶粉剂提取和保存方法，属于酶制剂提取和保存领域。以新鲜动物胰脏为原料，控制操作温度和条件，首先低温胰脏组织净化分离及高速组织粉碎破坏细胞结构，然后以丙硐、乙醚等溶剂或者混合物进行脱水、脱脂处理、并以低温(冲氮)真空脱溶，研磨筛分后即得胰脂酶粉剂。该粉剂脱气、冲氮、低温干燥储存，活度保持期可达数年。
动物胰脏是动物屠宰工业的副产品，本发明利用的是猪胰脏、狗胰脏和鼠胰脏，人胰脂酶也具有相同的特性，但产量较大具有开发价值的主要是猪胰脏。目前中国猪胰产量很大，大部分低价就近销出作为食用，少数用于生产胰酶片，活度极低，只能用于医药。还有极少数用于提取其它的活性成份，未形成生产规模。
从胰脏中提取胰脂酶国外早有研究。本世纪三十年代科学家即发现动物胰脏中有脂肪酶存在，六十年代至八十年代前后对此类脂肪酶的特性进行了系统的研究。科学家发现动物胰脏中的脂肪酶特别是猪胰脂肪酶具有特殊的位置选择性，即该脂肪酶选择性地水解甘油酯的1位和3位脂肪酸，而保留2位不水解。这一特性被广泛用于油脂结构、油脂生物代谢和合成、油脂消化和吸收、油脂营养、油脂改性以及油脂加工和应用等领域的研究中。
胰脂酶在工业中的应用包括医药、食品、皮毛、洗涤剂以及油脂加工等行业中。胰脂酶医药上作为助消化胃药，食品上用于奶油增香，皮毛上作为脱脂剂，肥皂上作为增香剂，洗衣粉中填加胰脂酶也可提高洗涤效果。油脂工业利用更多，可用于水解产生脂肪酸、酯交换油脂改性以及生产单甘酯乳化剂等。
胰脂酶提取方面的报导不多，一般也极简略，国内尚未见报导和生产。美国学者H.Brockerhoff和R.G.Jensn所著“脂肪水解酶(Lipolytic Enzymes，Academic Press，New York，1974)”一书详细论述了胰脂肪酶的提取和特性，其提取方法主要是涉及胰脂肪酶晶体的提取过程，过程非常复杂，涉及吸附过滤、沉淀离析、色谱提纯等多个过程，其产品呈结晶状态可用于自身结构性质研究，作为试剂或工业用成本太高。
H.L.Brockman在酶学方法(Methods in Enzymology，vol.71，Academic Press Inc.，1981)一书中(PP619-627)论述了猪胰中的甘三酯脂肪酶，在提取方法中该文作者首先用氯仿/丁醇作提取液，通过研究本文作者认为其最终产品活性偏低，-20℃下储存期只有几个月，远远达不到使用要求。
IUPAC标准方法委员会推荐了一种提取方法(Standard Methods for the Analysis of Oils，Fats and Derivatives，6th ed.，Part 1，Method 2.210，Pergamon Press，1979)，该方法仅给出提取过程，对于提取条件和要求没有给出，采用此方法提取的酶活性偏低，储存期短，仅适于短期使用，给使用带来不便。
美国Sigma公司有胰脂酶粉剂生产，同类产品在本试验条件下活度小于10单位/mg，相当于本发明副产品活度，而且该产品质量低，储存期也仅半年左右，使用十分不便。特别是我国使用者目前一般从美国sigma公司进口，从订货到进货时间为2-5个月，产品到达使用者手中时已接近报废期，影响科研和使用。
根据上述情况，本发明详细研究了胰脂肪酶的提取条件和储存方法。影响酶活的因素很多，每一步加工都对酶活度产生作用。加工中作用较大的是温度、空气氧、溶剂和纯度。储存中作用较大的是温度、含水量和空气氧。
加工中温度易控制在-10℃～10℃，其中-5℃～5℃更好一些，温度太低，萃取过程变慢，而且在水和溶剂存在的情况下，温度太低对酶结构也会有所影响，降低活性，温度升高，酶活降低更快。
储存中温度控制在-5℃～-35℃较为合适，一般为-10℃～-25℃，成品试剂含水量很低，在此温度下可完全抑制酶的变化，保持酶的活性。如果含水量较高，则在此低温下酶结构易发生变化，降低酶活度。因此本发明在脱水阶段可得到较好控制，含水量在100ppm以下。
与空气接触影响途经有二一是空气中的氧气使酶变化，降低活性;二是空气中的水份易被酶粉吸附，使酶活降低加快。解决的方法一是减压脱气(轻度减压即可，压力为400～600mmHg)，二是充氮排气，最好二者结合。
选择溶剂是提纯的关键，目前工业及文献中使用的溶剂有氯仿、丁醇、乙醇、丙酮、乙醚、石油醚、水、缓冲液等，一般溶剂均使酶活降低，但溶剂不同，降低的幅度不同。另外还要考虑所选择的溶剂是否容易低温真空脱去，否则会增大酶活的失活速度。在保持纯度相近的情况下，加工过程越短越好。
本发明选择丙酮、乙醚及其混合物进行提纯分离，首先以丙酮然后以丙酮/乙醚混合物，最后以乙醚提取。溶剂加入量为胰脏浆液重量的0.5～3倍(体积ml/g)，丙酮/乙醚的比例为1～2∶2～1。溶剂提取时间分别为4～18小时、4～8小时和6～16小时。提取搅拌速度为30-120rpm。
根据胰脏的种类不同，其选用溶剂的种类和比例略有不同，提取时间也有差异。
纯度对活度的影响很大，在相同加工条件下纯度越高，活度也越大。本发明充分脱脂、脱水和去除纤维素等碳水化合物，提高酶活度。本发明产品主要用于油脂研究和工业用，并未完全提纯到结晶状态，以减少成本，也减少提取过程。
酶粉含水量的控制一是脱水要完全，二是储存中要保持干燥，干燥剂可选用无水氯水钙、五氧化二磷、变色硅胶等。
本发明溶剂提取过程中固体物与溶剂的分离采用离心分离法，转速1000-5000rpm，时间为5～10分钟。最后固体物质的残溶脱除采用真空干燥法，真空度为600-750mmHg，时间为6-48小时。
本发明处理后的新鲜胰脏粉碎采用高速组织捣碎机或类似设备，转速为每分钟1万～2万转。时间为2-6分钟，其目的是破坏胰脏组织，有利于胰脂酶分离。
本发明的目的就是利用廉价的动物胰脏生产活性较高的试剂级或工业级胰脂酶粉剂，满足目前科学研究和工业生产的需要，本发明采用严格的条件和简单过程，制出了活性较高的胰脂酶试剂，其特征是工艺简单而产品活性高于同类产品。本发明还提出一种有效的保存方法，在此条件下，本发明产品存放四年仍未失效，附
图1是本产品活性变化过程，经过四年存放酶活仍为14.4单位/mg。
本发明根据附图2说明详细实施过程如下新鲜胰脏速冷至-20℃，手工去除其它非胰脏组织，解冻后胰脏粉碎成流体状浆液，并立即装入萃取罐中，调节罐体于-5℃～5℃，在萃取罐中加入适量丙酮并以30～120rpm搅拌4-18小时，离心分离后固体部分继续以丙酮萃取二次，过程同上(批量生产中溶剂可循环使用)。然后以丙酮/乙醚(1∶1)同样萃取二次，再以适量乙醚萃取二次。最后取得的固体于0℃下真空脱溶，真空度为600-750mmHg，时间为6-48小时。脱溶后的固体物研碎筛分，采用不同筛子得三个组份。分别装瓶、抽气后充氮气密封，然后以干燥剂干燥存放于-10℃～-35℃下。
实施例一新鲜猪胰脏迅速以干冰或低温冰箱冷至-20℃以下，然后以手工去除胰脏外围的脂肪和肉组织，缓慢解冻，然后以高速组织捣碎机处理3分钟，取出称重。称250g浆液于1000ml三口烧瓶中，加入150ml丙酮，插入搅拌器以60rpm进行搅拌，另外两瓶口分别接氮气瓶和真空泵并且间歇抽气和充氮。三口瓶置于冰水浴中保持0℃。连续搅拌4小时，取出进行离心分离，转速为3000rpm，时间3min，固体物同样步骤用丙酮再提取二次，然后以丙酮/乙醚(1∶1V/V)混合液同样提取二次，再以乙醚提取二次，条件同上。固形物置于干燥器中，保持温度0℃，连接真空泵抽真空48小时，真空度为700mmHg。固形物轻轻研碎并以60目筛分得11g细粉，活度为17.8单位/mg，剩余部分以8目筛分得19g粗粉，活度为11.2单位/mg，最后剩余物质粉碎后共8克，活度为6.8单位/mg。
实施例二取实施例一中胰脏浆液4kg于反应罐中，夹层通入0℃冷冻水调温，加入2升丙酮，以30rpm速度搅拌6小时，泵入卧式离心机离心3分钟，固体装入反应罐再加入2升丙酮搅拌4小时，同样步骤二次。然后加入丙酮/乙醚(1∶1)3升提取二次，再以乙醚2升提取二次，搅拌时间分别为4小时和6小时。离心后固体物装入低温(-5℃)真空箱，真空40小时，真空度为740mmHg。最后转入振动筛分离，60目分出166克细粉，活度为17.1单位/mg，再以8目筛分离并以研磨器研磨固体物得粗粉326克，活度为9.8单/mg，剩余固形物粉碎后共90克，酶活为4.6单位/mg。
实施例三按照实施例一方法，以狗胰脏提取，最后得细粉8克，粗粉20克，酶活分别为16.2单位/mg和12.4单位/mg。
实施例四将实施例一所得细粉装于广口瓶中，将该广口瓶真空脱气后充入氮气，然后以封口胶封好放于干燥器中，干燥器中放入变色硅胶和五氧化二磷，然后存放于-20℃下，存放四年酶活仍为14.4单位/mg。
权利要求
1.一种高活性胰脂酶粉剂的生产方法和保存方法，其特征是将新鲜胰脏速冷至-10℃～-12℃，然后将胰脏外围的脂肪组织和肉组织去除，解冻后高速捣碎，破坏胰脏细胞结构，再以溶剂低温脱水、脱脂，然后真空脱溶，以研磨筛分离得高活性胰酶粉，剩余部分进一步分离得中活性胰酶粉和低活性胰酶粉。该酶粉在低温脱气、充氮及控制水分的条件下可保存多年。
2.根据权利要求1所述的方法，其中新鲜胰脏包括猪胰脏、狗胰脏、鼠胰脏、人胰脏等。
3.根据权利要求1所述的方法，其中新鲜胰脏必须立即于低温冰箱或低温冷库中冷冻，去除胰脏以外的组织须在此温度下进行。
4.根据权利要求1所述的方法，其中解冻后的胰脏应立即进行组织粉碎，粉碎手段可采用高速捣碎机或类似设备。捣碎后的胰脏应立即进行脱水处理。
5.根据权利要求1所述的方法，其中溶剂选用丙酮、丙酮/乙醚、乙醚、甲乙醚、石油醚等，溶剂与胰脏浆液比例为0.5～3∶1(V/W)，丙酮/乙醚混合溶剂的比例为1∶0.5～2，脱水时间4-18小时，脱脂时间6-16小时，过渡时间4-8小时，搅拌速度30-120rpm。
6.根据权利要求1所述的方法，真空脱溶时间6-48小时，真空度600-750mmHg。
7.根据权利要求1所述的方法，其中筛分可采用振动研磨筛或手工研磨筛分。分离筛要求10～90目/英寸。
8.根据权利要求1所述的方法，其中操作过程中要求控制温度在-5℃～5℃，并隔绝空气接触，隔绝方法可采用充氮方法或真空法。
9.根据权利要求1所述的方法，其中储存方法采用低温(-5℃～-35℃)、脱气、冲氮气和干燥(酶粉含水要小于50～100ppm)，干燥剂采用无水氯化钙、变色硅胶、五氧化二磷等。
10.根据权利要求1所述的方法，其中溶剂脱水脱脂顺序为A→B→CA丙酮B丙酮/乙醚混合液、丙酮/乙醚/石油醚或丙酮/甲乙醚混合液C乙醚、甲乙醚、石油醚、己烷或其混合物
全文摘要
本发明涉及一种具有较高活性胰脂酶粉剂的生产和保存方法。属于酶制剂提取和保存领域。该胰脂酶粉剂主要用于生物、化学实验，也可用于食品、医药之用。该胰脂酶属于脂肪水解酶(EC3，1，1，3)主要对酯键具有催化水解作用。本发明以猪胰脏、狗胰脏、鼠胰脏、人胰脏等为原料，采用特殊条件和工艺，通过脱脂、脱水、脱纤维素等过程，制得胰脂酶粉剂，该粉剂具有特殊的位置选择性。在本发明保存条件下，储存多年仍具有很高的活性。
文档编号C12N9/16GK1092465SQ93102929
公开日1994年9月21日 申请日期1993年3月19日 优先权日1993年3月19日
发明者徐学兵, 韩国麒 申请人:郑州粮食学院