专利名称：色谱纯化病毒的方法
技术领域：
本发明涉及病毒的纯化领域，更具体地说涉及纯化在细胞系中培养获得的病毒。
从细胞系例如Vero细胞中培养收集到的病毒不仅含有所需的病毒，而且含有来自于培养细胞的蛋白质和DNA。此外，当计划将病毒用于某种目的时，例如用于制备疫苗时尽可能地纯化是必要的。实际上，对于含从连续传代和异倍体细胞系获得的产品的疫苗而言，其中允许的细胞DNA最大限制量是100×10-12克/疫苗剂量。
先有技术中已知病毒的纯化方法。例如，美国专利4,664,912特别公开了通过在蔗糖梯度中区带离心纯化狂犬病毒的方法。但是，这样的一种方法具有难于自动化完成的缺点；另外，必须有一个预先的失活步骤，该步骤可能导致病毒和细胞DNA之间相互作用，然后导致去除所述DNA更加困难。
该文献还公开了凝胶过滤步骤与离子交换色谱结合的纯化方法。但是，所述纯化方法不能够最大程度地去除细胞DNA。
本发明的一个目的是提供了用于非常高产量地纯化病毒的新的方法，该方法易于自动化。
本发明的另一个目的是提供了能够获得完整的，未降解的病毒的纯化方法。
为了达到所述目的，本发明的一个主题是从细胞系培养物获得的病毒进行纯化的方法，该方法包括通过离子交换色谱将病毒与来源于培养物的细胞蛋白质和DNA分离，其特征在于包括至少一个阳离子交换色谱步骤和一个阴离子交换色谱步骤。
根据本发明方法的一个特定的特性，阳离子交换色谱步骤是在阴离子交换色谱步骤之后完成的。因此，与按与所述顺序的步骤相反进行的方法相比，该顺序获得了最大的纯化产量。
根据特定的实施例，本发明方法还包括金属螯合的亲和色谱步骤。因此，能够真正地将残留的DNA的量降低到最小。
根据另一个优选的实施例，本发明方法还包括所有的色谱步骤在相同的pH值完成。因此可以使该方法自动化，并且在保持其效果的条件下大大降低其成本。
通过阅读下面的详细说明书能够更好地理解本发明。
本发明方法纯化的病毒是借助于细胞系，特别是连续传代的和异倍体的细胞系获得的病毒，所述的病毒趋向于与细胞DNA结合。这些病毒特别是狂犬病毒，日本脑炎病毒或流感病毒。这些要纯化的病毒可以通过在微支撑物上的非洲绿猴肾异倍体细胞中培养获得。例如通过培养获得狂犬病毒，如美国专利4,664,912中所述。
将这些病毒培养物过滤，然后根据本发明，通过阴离子交换色谱和通过阳离子交换色谱对病毒进行处理。
阴离子交换色谱可以是弱离子交换色谱，例如利用含有二乙氨基乙基的凝胶由Sepracor出售的DEAE Spherodex凝胶，由Pharmacia出售的DEAE Sepharose凝胶，由E.Merck出售的EMD DEAE凝胶进行。虽然不经常用于去除核酸，但是优选的是利用强阴离子交换剂例如下列凝胶之一由Bio-Rad出售的高Q凝胶，由Pharmacia出售的Q Sepharose凝胶，由E.Merck出售的EMD TMAE凝胶进行。
所有这些凝胶可以在Tris缓冲液中或在磷酸盐缓冲液中使用。优选的是，使用具有最大可能获得阳离子基团的凝胶，如对于E.Merck出售的EMD DEAE，具有15-25个单位的下列通式单体的链CH2＝CHCONH(CH2)2N+(CH3)3类似地，根据本发明的方法，优选的阳离子交换色谱是利用具有最大可能与阴离子基团接近的凝胶进行的，如E.Merck出售的EMD SO3，具有15-25个单位的下列通式单体的链CH2＝CHCONH-C(CH3)2CH2SO3-也可以利用Tris缓冲液或磷酸盐缓冲液平衡该凝胶。
根据本发明的一个优选的实施方案，阴离子交换色谱是在阳离子交换色谱之前进行的，从第一次色谱获得的洗脱液，任选地经过稀释之后，直接引入到第二个色谱柱。该操作顺序可以最大程度地去除获得的细胞DNA。
通过洗脱阳离子交换色谱柱获得的病毒悬浮液已经满足用于制造疫苗的病毒的纯度标准。
而且，根据本发明的一个优选的实施方案，可以在上述描述的纯化方法中加入利用例如Ca2+离子作为金属离子的金属螯合亲和色谱的额外步骤。该色谱步骤可以利用琼脂糖凝胶作为螯合支撑物，例如由Pharmacia出售的SepharoseFF螯合凝胶，它具有下列结构
根据本发明的方法，该螯合步骤与前面所述的离子交换色谱步骤在线(en ligne)进行，从阳离子交换器获得的洗脱液直接导入到螯合色谱柱。
在该步骤期间，细胞DNA被结合留下，而病毒没有保留地穿过凝胶。
该额外步骤使得至少残留DNA的又一半被结合，而所述DNA被公认其量已经非常低，但是另一方面在该阶段，去除该剩余DNA是十分困难的。
用稳定剂稀释由此纯化的病毒悬浮液，然后根据本领域内技术人员已知的任一种方法使之失活，例如用β-丙醇酸内酯，之后进行浓缩，冷冻干燥，然后与其它来自于相同的非洲绿猴肾异倍体细胞的培养物的收集物混合，它们构成了相同的制造批号。
将从所述病毒制造的疫苗注射到人，由较好的忍受性。另外，借助于在小鼠中进行试验验证它们在动物中的保护活性，结果是阳性。
根据本发明，令人惊奇的和非常有利的是，可能将整个纯化过程在室温下依次进行，总在相同pH值进行，这使得该方法简单化，易于自动化和具有可靠性；尤其是整个方法可能在良好的无菌条件下进行。
借助于该纯化方法，获得非常高的纯度的完整的非降解病毒，通过电子显微镜可以观测到它的针状体。
实施例1通过将由E.Merck出售的EMD TEAE凝胶导入到一个柱制备阴离子交换色谱柱，首先将1M的氢氧化钠通过该柱以进行消毒，随后用20mMTris缓冲液平衡柱直到pH为7.5。
通过将由E.Merck出售的EMS SO3凝胶加入到一个柱中制备阳离子交换色谱柱，同样通过1M的氢氧化钠，然后用20mM Tris缓冲液调pH为7.5。
通过将由Pharmacia出售的SepharoseFF螯合凝胶导入到一个柱制备金属螯合的亲和色谱柱，用1M的氢氧化钠，然后用水通过该柱，随后用CaCl2，以3克/升负载到该柱；然后用水洗涤该柱，之后用0.5M的氯化钠，20mM Tris缓冲液，pH7.5通过该柱。
实施例2利用截止界限是0.65微米的膜，然后在截止界限是0.45微米的膜上过滤在非洲绿猴肾异倍体细胞中培养的狂犬病毒收集物。
该收集物由培养基中的病毒悬浮液组成，它还包括来源于非洲绿猴肾异倍体细胞和来源于培养基的细胞DNA和蛋白质。将经过滤的粗收集物通过如实施例1制备的阴离子交换色谱柱。在柱的出口收集含有蛋白质和DNA的未结合的部分，以用于分析目的。用0.1M的氯化钠，20mM Tris缓冲液，pH7.5洗涤该柱，然后将0.4M的氯化钠，20mM Tris缓冲液，pH7.5通过该柱洗脱结合的病毒，直到对应于病毒的特征峰通过。有秩序地用20mM Tris缓冲液，pH7.5将来源于第一柱的洗脱液稀释到1/4，然后导入到根据实施例1制备的阳离子交换色谱柱。
收集该第二柱的未结合部分以用于分析目的。当所有来自于第一柱的含有病毒的洗脱液已经通过第二柱，用0.1M的氯化钠，20mM Tris缓冲液，pH7.5洗涤该柱，然后将0.5M的氯化钠，20mM Tris缓冲液通过该柱洗脱结合的病毒，直到对应于病毒的特征峰通过。
将来自于第二柱的洗脱液，不加稀释，直接导入到根据实施例1制备的金属螯合的亲和色谱柱。这时，具有Ca2+离子的DNA络合物存在于柱，而病毒穿过柱，在出口收集，以便与稳定剂结合并且失活。通过将50mM的EDTA溶液通过该柱，洗脱与Ca2+离子复合的DNA。
通过将1M的氯化钠，20mM Tris缓冲液，pH7.5通过该柱，使离子交换色谱柱再生，用1M氢氧化钠消毒，然后用于纯化来源于相同培养物的其它收集物，将其合并以构成单个生产批号。
实施例3对于每个收集物在每个色谱步骤后检测纯化的细胞蛋白质和DNA的量。
借助于Lowry方法分析总蛋白质，利用来自于Molecular Device的Threshold机器分析总DNA。
对于每个收集的培养物取每个步骤的平均产量，获得的结果以该纯化方法的每个步骤的残留百分数表示，结果如下
总之，借助于本发明的纯化方法，仅留下存在于粗收集物中细胞DNA的0.004％和蛋白质的1.4％。
因此所进行的纯化是非常满意的。
借助于检测CCID50的感染效价并且通过电子显微镜观察，可以证实每个步骤获得的病毒的感染性。在该方法进行期间观察到较好地保存了病毒的完整性。
当将由此产生的病毒用于制备抗狂犬病的疫苗时，可以制备每剂疫苗含有不超过30-40×10-12克细胞DNA的疫苗制剂，与限制标准的100×10-12克相比，该剂量是相当小的量。
权利要求
1.纯化从细胞系培养物获得的病毒的方法，该方法包括通过离子交换色谱将病毒与来源于培养物的细胞蛋白质和DNA分离，其特征在于包括至少一个阴离子交换色谱步骤和一个阳离子交换色谱步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于阴离子是强阴离子。
3.根据前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于阳离子是强阳离子。
4.根据前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于阳离子交换在阴离子交换之后进行。
5.根据前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于它还包括通过金属螯合的亲和色谱。
6.根据前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于金属螯合是利用钙离子进行的。
7.根据前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于通过培养连续传代的和异倍体细胞系获得待纯化的病毒。
8.根据前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于通过在非洲绿猴肾异倍体细胞中培养获得待纯化的病毒。
9.根据前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于待纯化的病毒是狂犬病毒。
10.根据权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于待纯化的病毒是日本流脑病毒。
11.根据权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于待纯化的病毒是流感病毒。
12.根据前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于该方法包括所有色谱步骤在相同pH值进行。
13.根据前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于该方法是在线进行的方法(procédéen ligne)。
14.根据前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于该方法是在室温下进行的。
15.根据前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于该方法是在无菌条件下进行的。
全文摘要
通过色谱从细胞系培养物中纯化病毒的方法,该方法包括顺序进行阴离子交换色谱步骤,随后进行阳离子交换色谱步骤,和任选地包括金属螯合的亲和色谱步骤。该方法特别适用于生产用于制备疫苗的病毒。
文档编号C12P19/26GK1199419SQ96197568
公开日1998年11月18日 申请日期1996年7月8日 优先权日1995年8月10日
发明者B·芬格特, A·弗兰肯 申请人:巴斯德梅里厄血清及疫苗公司