专利名称：人mcp－1的抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及人单核细胞趋化蛋白(MCP)-1的抗体和该抗体在治疗涉及单核细胞和T细胞的迁移和活化的疾病和紊乱，如炎症中的用途。
公开的日本专利申请JP 05276986(Sumitomo Electric Co.)描述了人MCP-1的啮齿类动物单克隆抗体的制备，该抗体可用于确定MCP-1和治疗及诊断涉及巨嗜细胞浸润的疾病。公开的日本专利申请JP 09067399(Mitsui Toatsu)描述了从EBV转化的人外周血细胞进行的人MCP-1的人单克隆抗体的制备，该抗体可以用于治疗炎症。公开的日本专利申请JP11060502(Teijin)描述了MCP-1抑制剂，尤其是人抗MCP-1抗体在治疗大脑梗塞中的用途。
目前我们已制备了人MCP-1的改良抗体，该抗体可以用于治疗涉及单核细胞和T细胞迁移和活化的疾病和紊乱。
因此，本发明提供包含抗原结合位点的MCP-1结合分子，所述抗原结合位点包含至少一个顺次含有高变区CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白重链可变区(VH)，所述CDR1具有氨基酸序列His-Tyr-Trp-Met-Ser，所述CDR2具有氨基酸序列Asn-Ile-Glu-Gln-Asp-Gly-Ser-Glu-Lys-Tyr-Tyr-Val-Asp-Ser-Val-Lys-Gly，而所述CDR3具有氨基酸序列Asp-Leu-Glu-Gly-Leu-His-Gly-Asp-Gly-Tyr-Phe-Asp-Leu；以及其直接等价物。
因此，本发明还提供包含抗原结合位点的MCP-1结合分子，所述抗原结合位点包含至少一个顺次含有高变区CDR1’、CDR2’和CDR3’的免疫球蛋白轻链可变区(VL)，所述CDR1’具有氨基酸序列Arg-Ala-Ser-Gln-Gly-Val-Ser-Ser-Ala-Leu-Ala，所述CDR2’具有氨基酸序列Asp-Ala-Ser-Ser-Leu-Glu-Ser，而所述CDR3’具有氨基酸序列Gln-Gln-Phe-Asn-Ser-Tyr-Pro；以及其直接等价物。
第一方面，本发明提供单结构域的MCP-1结合分子，该分子中包括含有以上定义的重链可变区(VH)的分离的免疫球蛋白重链。
第二方面，本发明还提供包含重链(VH)和轻链(VL)可变区的MCP-1结合分子及其直接等价物，其中所述MCP-1结合分子含有至少一个抗原结合位点，而所述抗原结合位点包含a)顺次含有高变区CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白重链可变区(VH)，所述CDR1具有氨基酸序列His-Tyr-Trp-Met-Ser，所述CDR2具有氨基酸序列Asn-Ile-Glu-Gln-Asp-Gly-Ser-Glu-Lys-Tyr-Tyr-Val-Asp-Ser-Val-Lys-Gly，而所述CDR3具有氨基酸序列Asp-Leu-Glu-Gly-Leu-His-Gly-Asp-Gly-Tyr-Phe-Asp-Leu，和b)顺次含有高变区CDR1’、CDR2’和CDR3’的免疫球蛋白轻链可变区(VL)，所述CDR1’具有氨基酸序列Arg-Ala-Ser-Gln-Gly-Val-Ser-Ser-Ala-Leu-Ala，所述CDR2’具有氨基酸序列Asp-Ala-Ser-Ser-Leu-Glu-Ser，而所述CDR3’具有氨基酸序列Gln-Gln-Phe-Asn-Ser-Tyr-Pro。
除非另行指明，否则本文中所有的多肽链均以具有起始于N末端并终止于C末端的氨基酸序列来描述。
当抗原结合位点包含VH和VL域时，这些域可以定位在相同的多肽分子上，或者优选地，每个域可以定位在不同的链上，即VH域是免疫球蛋白重链或其片段的一部分，而VL是免疫球蛋白轻链或其片段的一部分。
“MCP-1结合分子”是指能够与单独的或连接其它分子的MCP-1抗原结合的任何分子。通过标准方法(定性测定)可以反映结合反应，包括例如参照阴性对照试验(其中使用具有无关特异性但优选具有相同的同种型的抗体)用于确定对MCP-1和其受体(即趋化因子受体(CCR)-2，如CCR2B)结合的抑制作用的生物测定方法，或任何类型的结合试验。有利的是，可以在例如BIAcore试验中证实本发明的MCP-1结合分子与MCP-1的结合。
抗原结合分子的实例包括B细胞或杂交瘤产生的抗体以及嵌合的、CDR嫁接的或人的抗体，或其任何片段如F(ab’)2和Fab片段，以及单链或单结构域抗体。
单链抗体由抗体的重链和轻链的可变区组成，这些可变区通过常常由10至30个氨基酸，优选15至25个氨基酸组成的肽接头共价结合在一起。因此，该结构不包括重链和轻链的恒定部分，而且小的间隔肽的抗原性被认为应比整个恒定部分的抗原性小。“嵌合抗体”是指这样的抗体，其中重链恒定区或轻链恒定区或两者来源于人，而重链和轻链的可变区均是非人(如鼠)来源的或来源人但来自不同人的抗体。“CDR嫁接的抗体”是指这样的抗体，其中高变区(CDR)来自供体抗体，如非人(如鼠源)抗体或不同人的抗体，而免疫球蛋白的所有的或基本上所有的其它部分，例如恒定区和可变区的高度保守部分(即构架区)均来自受体抗体，如人源抗体。然而，CDR嫁接的抗体可以在构架区中，例如在与高变区相邻的构架区部分含有少许供体序列的氨基酸。“人抗体”是指这样的抗体，其中重链和轻链的恒定区和可变区均来源于人，或与来源于人的序列基本上一致，但不一定来自相同抗体，这样的抗体包括其中鼠源的免疫球蛋白可变部分和恒定部分的基因已被其人来源的对等物替代的小鼠所产生的抗体，见例如EP 0546073 B1，USP 5545806，USP 5569825，USP 5625126，USP 5633425，USP 5661016，USP 5770429，EP 0 438474 B1和EP 0 463151 B1中一般术语的描述。
尤其优选的本发明MCP-1结合分子是人抗体，尤其是AAV293，AAV294和ABN912抗体，描述于下文的实施例中。(AAV293抗体是人IgG3/κ抗体，而ABN912是人IgG4/κ抗体，但两者在其它方面基本一致。AAV294抗体是人IgG1/κ抗体，其可变区与AAV293可变区相比除了在VH的FR1、CDR2和FR3以及VL的CDR1’和FR3’中有单氨基酸改变外，两者是一致的，描述在下文实施例中。)因此，在优选的嵌合抗体中，重链和轻链的可变区均来源于人，例如Seq.Id.No.1和Seq.Id.No.2中显示的ABN912抗体的可变区。恒定区优选也包含适宜的人恒定区结构域，参见例如“具有免疫学意义的蛋白质的序列”，Kabat，E.A.等，US Department of Health and Human Services，Public Health Service，National Institute of Health。
可以使高变区与任何类型的构架区连接，但优选构架区来源于人。适宜的构架区描述在Kabat E.A.等，同上。优选的重链构架是人的重链构架，例如Seq.Id.No.1中显示的ABN912抗体的重链构架。它由FR1、FR2、FR3和FR4区顺次组成。以相似方式，Seq.Id.No.2显示了顺次由FR1’、FR2’、FR3’和FR4’区组成的优选的ABN912轻链构架。可以使用另外的构架区，优选人构架区来代替Seq.Id.No.1和Seq.Id.No.2中显示的那些，例如参见Kabat等，同上。构架区，尤其是与高变区相邻的构架部分的少许氨基酸残基可以不同于相应定义的构架区中的那些，以便例如影响结合性质。
因此，本发明还提供包含至少一个抗原结合位点的MCP-1结合分子，所述抗原结合位点包含具有与Seq.Id.No.1所示起始于第1位氨基酸并终止于第122位氨基酸的序列基本一致的氨基酸序列的第一域或上述第一域和具有与Seq.Id.No.2所示起始于第1位氨基酸并终止于第109位氨基酸的序列基本一致的氨基酸序列的第二域。
针对天然存在于所有人体中的蛋白质的单克隆抗体典型地是在非人系统如小鼠中产生的。这直接导致，当将杂交瘤产生的异种抗体施用于人时引起主要由异种免疫球蛋白的恒定区介导的不良免疫应答。由于不能长期施用这类抗体，因此这显然限制了这类抗体的用途。因此，尤其优选施用在用于人后不可能引起实质性同种异型应答的单链的、单结构域的、嵌合的、CDR嫁接的抗体，或特别是人抗体。
鉴于前述，更优选的本发明MCP-1结合分子选自如下人抗MCP-1抗体和其直接等价物，其中所述人抗MCP-1抗体包含至少a)包含(i)顺次含有高变区CDR1、CDR2和CDR3的可变区和(ii)人重链的恒定部分或其片段的免疫球蛋白重链或其片段；所述CDR1具有氨基酸序列His-Tyr-Trp-Met-Ser，所述CDR2具有氨基酸序列Asn-Ile-Glu-Gln-Asp-Gly-Ser-Glu-Lys-Tyr-Tyr-Val-Asp-Ser-Val-Lys-Gly，而所述CDR3具有氨基酸序列Asp-Leu-Glu-Gly-Leu-His-Gly-Asp-Gly-Tyr-Phe-Asp-Leu，和b)包含(i)含有CDR3’高变区及任选地还含有CDR1’、CDR2’高变区的可变区和(ii)人轻链的恒定部分或其片段的免疫球蛋白轻链或其片段，所述CDR1’具有氨基酸序列Arg-Ala-Ser-Gln-Gly-Val-Ser-Ser-Ala-Leu-Ala，所述CDR2’具有氨基酸序列Asp-Ala-Ser-Ser-Leu-Glu-Ser，而所述CDR3’具有氨基酸序列Gln-Gln-Phe-Asn-Ser-Tyr-Pro。
或者，本发明MCP-1结合分子可以选自包含抗原结合位点的单链结合分子和其直接等价物，其中所述抗原结合位点包含a)顺次含有高变区CDR1、CDR2和CDR3的第一域，所述高变区具有Seq.Id.No.1所示氨基酸序列，b)含有高变区CDR1’、CDR2’和CDR3’的第二域，所述高变区具有Seq.Id.No.2所示氨基酸序列，和c)与所述第一域的N末端及所述第二域的C末端或者与所述第一域的C末端及所述第二域的N末端结合的肽接头。
正如熟知的，氨基酸序列中的微小变化，如缺失、插入或替代一个、几个或甚至多个氨基酸可以导致具有实质上相同性质的原蛋白质的等位形式。
因此，术语“其直接等价物”是指任何如下单结构域的MCP-1结合分子(分子X)，(i)其中高变区CDR1、CDR2和CDR3作为整体与Seq.Id.No.1所示高变区至少80％同源、优选至少90％同源、更优选至少95％同源，且(ii)其能够和参考分子基本上以相同的程度抑制MCP-1与其受体的结合，所述参考分子具有和分子X相同的构架区但具有和Seq.Id.No.1所示相同的高变区CDR1、CDR2和CDR3；或指每个结合位点具有至少两个域的任何如下MCP-1结合分子(分子X’)，(i)其中高变区CDR1、CDR2、CDR3、CDR1’、CDR2’和CDR3’作为整体与Seq.Id.No.1和2所示高变区至少80％同源、优选至少90％同源、更优选至少95％同源，且(ii)其能够和参考分子基本上以相同的程度抑制MCP-1与其受体的结合，所述参考分子具有和分子X’相同的构架区和恒定部分但具有和Seq.Id.No.1和2所示相同的高变区CDR1、CDR2、CDR3、CDR1’、CDR2’和CDR3’。
在本发明说明书中，如果两个氨基酸序列在最佳比对时在同样的位置上具有至少80％相同的氨基酸残基(氨基酸序列中的缺口或插入被计为不相同的残基)，则它们相互有至少80％同源性。
对MCP-1与其受体结合的抑制可以方便地在多种试验中进行测试，这些试验包括下文中描述的那些试验。术语“以相同的程度”是指在上述一个试验中参考分子和等价分子在统计学基础上表现出基本上相似的MCP-1结合抑制曲线。例如，当按上述进行测定时，对MCP-1和其受体(CCR2B)结合的抑制，典型地本发明的MCP-1结合分子具有的IC50S在相应参考分子的IC50的+/-×5范围内，优选与之基本相同。
例如，所用试验可以是通过膜结合MCP-1受体(CCR2B)和本发明MCP-1结合分子进行的MCP-1结合竞争抑制试验，该试验可以使用例如下文实施例中所述的SPA技术进行。
最优选地，人MCP-1抗体包含至少a)一条含有如下可变区和人重链恒定部分的重链，所述可变区具有与Seq.Id.No.1所示起始于第1位氨基酸终止于第122位氨基酸的序列基本一致的氨基酸序列；和b)一条含有如下可变区和人轻链恒定部分的轻链，所述可变区具有与Seq.Id.No.2所示起始于第1位氨基酸终止于第109位氨基酸的序列基本一致的氨基酸序列。
人重链恒定部分可以是γ1、γ2、γ3、γ4、μ、α1、α2、δ或ε型，优选γ型，更优选γ4型，而人轻链恒定部分可以是κ或λ型(其包括λ1、λ2和λ3亚型)但优选κ型。所有这些恒定部分的氨基酸序列均可参见Kabat等，同上。
本发明MCP-1结合分子可以通过重组DNA技术制备。鉴于此，必须构建编码该结合分子的一个或多个DNA分子、将其置于适当的控制序列之下并转移至适宜的宿主生物中用于表达。
因此，在非常一般的意义上本发明提供(i)编码本发明的单结构域的MCP-1结合分子、本发明的单链MCP-1结合分子、本发明的MCP-1结合分子或其重链或轻链或片段的DNA分子，和(ii)本发明DNA分子在通过重组方式制备本发明MCP-1结合分子中的用途。
本领域现状是本领域技术人员能够根据本文提供的信息，即高变区的氨基酸序列和编码它们的DNA序列，合成本发明DNA分子。构建可变区基因的方法描述在例如EPA 239 400中，并可以简单地总结如下克隆编码具有任何特异性的MAb的可变区的基因。确定编码构架区和高变区的DNA区段，并将编码高变区的DNA区段从中除去以便编码构架区的DNA区段与接点处的适宜限制性位点融合在一起。可以通过标准方法诱变DNA分子的方式在适当的位置产生这些限制性位点。根据Seq.Id.No.1或2所示序列通过DNA合成制备合成的双链CDR盒。使这些盒具有粘性末端，以便可以将它们连接在构架的接点处。
而且，为了获得编码本发明MCP-1结合分子的DNA构建体，并不需要从生产杂交瘤细胞系获取mRNA。因此，对于在仅有关于抗体基因的核苷酸序列的书面信息时如何通过重组DNA技术制备抗体，PCT申请WO90/07861给出了完全的教导。该方法包括合成大量的寡核苷酸、通过PCR方法对其进行扩增、和将它们拼接成期望的DNA序列。
包含适宜启动子或编码重链和轻链恒定部分的基因的表达载体可通过公共渠道获得。因此，一旦制备了本发明的DNA分子，就可以方便地将其转移至适当的表达载体中。编码单链抗体的DNA分子也可以通过标准方法，如WO 88/1649中的描述来制备。
鉴于上面的描述，对于本申请来讲，不必为满足说明书充分公开的要求而进行杂交瘤或细胞系的保藏。
在一个具体实施方案中，本发明包括如下描述的用于制备MCP-1结合分子的第一和第二DNA构建体第一DNA构建体编码重链或其片段并包含a)编码交替地包含高变区和构架区的可变区的第一部分，所述高变区顺次是氨基酸序列显示在Seq.Id.No.1中的CDR1、CDR2和CDR3；该第一部分起始于编码可变区的第一个氨基酸的密码子并终止于编码可变区的最后一个氨基酸的密码子，和b)编码重链恒定部分或其片段的第二部分，其起始于编码重链恒定部分的第一个氨基酸的密码子并终止于编码该恒定部分或其片段的最后一个氨基酸的密码子，之后接终止密码子。
优选地，该第一部分编码具有与Seq.Id.No.1所示起始于第1位氨基酸并终止于第122位氨基酸的序列基本一致的氨基酸序列的可变区。更优选，该第一部分具有Seq.Id.No.1所示起始于第1位核苷酸并终止于第366位核苷酸的核苷酸序列。而且优选地，该第二部分编码人重链的恒定部分，更优选人γ4链的恒定部分。该第二部分可以是基因组来源的DNA片段(包含内含子)或cDNA片段(无内含子)。
第二DNA构建体编码轻链或其片段并包含a)编码交替地包含高变区和构架区的可变区的第一部分；所述高变区是氨基酸序列显示在Seq.Id.No.2中的CDR1’、CDR2’和CDR3’；该第一部分起始于编码可变区的第一个氨基酸的密码子并终止于编码可变区的最后一个氨基酸的密码子，和b)编码轻链恒定部分或其片段的第二部分，其起始于编码轻链恒定部分的第一个氨基酸的密码子并终止于编码该恒定部分或其片段的最后一个氨基酸的密码子，之后接终止密码子。
优选地，该第一部分编码具有与Seq.Id.No.2所示起始于第1位氨基酸并终止于第109位氨基酸的氨基酸序列基本一致的氨基酸序列的可变区。更优选，该第一部分具有Seq.Id.No.2所示起始于第1位核苷酸并终止于第327位核苷酸的核苷酸序列。而且优选地，该第二部分编码人轻链的恒定部分，更优选人κ链的恒定部分。
本发明还包括这样的MCP-1结合分子，在该分子中一个或多个，典型地仅少许CDR1、CDR2、CDR3、CDR1’、CDR2’或CDR3’残基与Seq.Id.No.1和Seq.Id.No.2所示残基相比发生了改变；例如可以通过突变，如定点诱变相应的DNA序列来实现此改变。本发明包括编码此改变的MCP-1结合分子的DNA序列。本发明还包括这样的结合分子，该分子中一个或多个，典型地仅少许构架区残基与Seq.Id.No.1和Seq.Id.No.2所示残基相比发生了改变。
在第一和第二DNA构建体中，第一和第二部分可以通过内含子分隔开，并且可以方便地将增强子放置在第一和第二部分之间的内含子中。该增强子转录但不翻译，其存在可以帮助转录的有效进行。在特定实施方案中，第一和第二DNA构建体包含有利地来源于人的重链基因的增强子。
将各DNA构建体置于适宜的表达控制序列的控制下，尤其是适宜的启动子的控制下。任何类型的启动子均可以使用，只要它适合DNA构建体将要转移至其中进行表达的宿主生物即可。然而，如果表达发生在哺乳动物细胞中，则尤其优选使用免疫球蛋白基因的启动子。
可以在细胞培养物或在转基因动物中制备期望的抗体。适宜的转基因动物可以根据标准方法得到，所述方法包括将置于适宜的控制序列之下的第一和第二DNA构建体显微注射至卵中、将如此制备的卵转移至适宜的假孕雌性个体中并选择表达期望抗体的后代。
当在细胞培养物中制备抗体链时，必须首先将这些DNA构建体插入一个单一表达载体中，或插入两个分离的但相容的表达载体中，后一种可能性是优选的。
因此，本发明还提供能够在原核或真核细胞系中复制并包含至少一个上述DNA构建体的表达载体。
然后将含有DNA构建体的各表达载体转移至适宜的宿主生物中。当DNA构建体被分别地插在两个表达载体上时，可以将它们单独地转移，即每个细胞一种类型的载体，或共转移，此后一种可能性是优选的。适宜的宿主生物可以是细菌、酵母或哺乳动物细胞系，后者是优选的。更优选地，该哺乳动物细胞系是淋巴来源的，例如骨髓瘤、杂交瘤或正常的永生化B细胞，它有利地不表达任何内源性抗体重链或轻链，如SP2/0细胞系。
为了在哺乳动物细胞中表达，优选将MCP-1结合分子的编码序列整合在宿主细胞DNA中允许或利于该MCP-1结合分子高水平表达的座位上。可以基于表达的MCP-1结合分子的水平，鉴定和选择其中MCP-1结合分子的编码序列整合在此类有利的座位上的细胞。任何适宜的选择标记均可以用于制备含有MCP-1结合分子编码序列的宿主细胞；例如，可以使用dhfr基因/氨甲蝶呤或等价选择系统。用于本发明MCP-1结合分子表达的系统包括基于GS的扩增/选择系统，如EP 0256055 B，EP 0323997 B和欧洲专利申请89303964.4中描述的那些。
在本发明的再一方面，提供制备MCP-1结合分子的方法，包括(i)培养用上述表达载体转化的生物和(ii)从培养物中回收MCP-1结合分子。
最优选地，本发明MCP-1结合分子是人抗体，如AAV293、AAV294或ABN912抗体，而且其可以通过培养相应的杂交瘤细胞系制备，或优选从含有编码该人抗体的DNA(包括经改变而使抗体同种型或其它抗体功能或性质发生变化的DNA)的重组细胞系中制备。
根据本发明，已发现AAV294及更特别地AAV293和ABN912抗体与重组人伊奥他新-1(eotaxin-1)有交叉反应。这样，这些抗体可以有利地与伊奥他新-1及MCP-1相互作用，并可以用于抑制伊奥他新-1和其受体的结合，以及抑制MCP-1和其受体的结合。过敏性疾病和病症，包括过敏性和炎性呼吸道疾病，如哮喘涉及到伊奥他新分泌。对MCP-1和伊奥他新，例如人MCP-1和人伊奥他新具有结合特异性的抗体，尤其是嵌合和CDR嫁接的抗体且特别是人抗体，以及这些抗体在治疗MCP-1或伊奥他新介导的疾病中的用途均包括在本发明的范围内。
因此，再一方面，本发明包括与伊奥他新有交叉反应的MCP-1的抗体。
有利地，本发明此方面的抗体是能够抑制MCP-1和其受体的结合并能够抑制伊奥他新和其受体的结合的抗体。
其它方面，本发明包括i)可与伊奥他新-1发生交叉反应且能够抑制MCP-1和伊奥他新-1与其受体结合的抗MCP-1抗体在治疗MCP-1或伊奥他新-1介导的疾病或病症中的用途；ii)给患者治疗MCP-1或伊奥他新介导的疾病或病症的方法，所述方法包括给患者施用有效量的可与伊奥他新发生交叉反应且能够抑制MCP-1和伊奥他新与其受体结合的抗MCP-1抗体；iii)含有可与伊奥他新发生交叉反应且能够抑制MCP-1和伊奥他新与其受体结合的抗MCP抗体、以及可药用赋形剂、稀释剂或载体的药物组合物；和iv)可与伊奥他新发生交叉反应且能够抑制MCP-1和伊奥他新与其受体结合的抗MCP-1抗体在制备用于治疗MCP-1或伊奥他新介导的疾病或病症的药物中用途。
在这些其它方面中，所述MCP-1抗体优选与伊奥他新-1发生交叉反应，而所述伊奥他新介导的疾病优选是伊奥他新-1介导的疾病。
为了本说明书的目的，如果一个抗体与AAV294、AAV293或ABN912抗体相比能够基本上以相同的程度抑制MCP-1和伊奥他新与其受体结合，则该抗体“能够抑制MCP-1和伊奥他新与其受体结合”，其中“以相同程度”具有以上定义的含义。
在本说明书中，术语“MCP-1介导的疾病”和“伊奥他新介导的疾病”包括MCP-1或伊奥他新，尤其是伊奥他新-1在其中对疾病或病况(包括疾病或病况的引起、发展、进程、持续或病理)直接地或间接地起作用的所有疾病和病况。
在本说明书中，术语“治疗”是指预防性或防止性治疗以及治愈性或疾病改善性治疗，包括对易于感染疾病或被怀疑已感染疾病的患者、以及患病的或已被诊断患有疾病或病况的患者的治疗，并包括对临床复发的抑制。
AAV293和ABN912抗体对MCP-1的结合亲和力比以前报道的抗MCP-1抗体，如抗人MCP-1抗体对MCP-1的结合亲和力高。因此，ABN912与MCP-1结合的解离平衡常数KD小于约50pM，例如约43pM。此高结合亲和力使得ABN912尤其适用于治疗性应用。
因此，再一方面，本发明提供与MCP-1结合的KD为约50pM或更少的抗MCP-1抗体。如上面就与伊奥他新有交叉反应的抗MCP-1抗体描述的用途、方法和组合物一样，本发明此方面也包括涉及这些高亲和抗体的用途、方法和组合物。
而且，根据本发明，已发现ABN912抗体和包括MCP-1第24位的精氨酸残基的MCP-1抗原性表位结合。因此，有利地，ABN912抗体能够直接干扰MCP-1和其受体(CCR2B)的结合；对于MCP-1和CCR2B的结合而言，Arg24是MCP-1的一个重要残基。此外，ABN912的结合位点包括MCP-1的Arg18和Lys49残基。
因此，再一方面，本发明包括与含有MCP-1第24位的精氨酸残基的MCP-1抗原性表位结合的抗MCP-1抗体。优选地，该抗原性表位还包括MCP-1的第18位精氨酸残基和第49位赖氨酸残基。类似地，本发明此方面包括如同上面就可与伊奥他新交叉反应的抗MCP-1抗体描述的用途、方法和组合物。
上述MCP-1结合分子，尤其是根据本发明第一和第二方面的MCP-1结合分子；可与伊奥他新交叉反应的抗MCP-1抗体，尤其是能够抑制MCP-1和伊奥他新与它们的受体结合的抗体；对于与MCP-1的结合而言具有约50pM或更少的KD的抗MCP-1抗体；和可与包括MCP-1第24位精氨基酸残基的MCP-1抗原性表位结合的抗体在下文中均称作“本发明的抗体”。
优选地，本发明抗体是根据本发明第一和第二方面的MCP-1结合分子。有利地，本发明抗体是人抗体，最优选ABN912抗体或其直接等价物。
本发明抗体可以抑制MCP-1对其靶细胞的作用，因此适用于治疗MCP-1介导的疾病和病症。本发明抗体的这些和其它药理学活性可以在标准试验方法，例如下述方法中得以证实1.对MCP-1与CCR2B表达细胞结合的抑制MCP-1实现信号转导和效应子功能的先决条件是MCP-1与受体CCR2B的相互作用。闪烁亲近测定法(SPA)技术被用于证实本发明抗体可抑制MCP-1和表达所述受体的细胞膜的结合。
将表达CCR2B的CHO细胞的细胞膜与一组浓度的靶抗体(例如10-14M至10-8M)一起孵育，使用麦胚凝集素小珠通过SPA测量(125-I)-MCP-1的残留结合。当在此试验中进行测试时，本发明抗体典型地具有约0.1至约10nM，特别是约0.5nM(如461±206pM)的IC50S。
2.对MCP-1介导的信号转导的抑制本发明抗体抑制MCP-1引起的生理学作用的潜力通过在有和无抗体的情况下测量MCP-1诱导的细胞内Ca2+动员来确定。
使用稳定转染的表达CCR2B的CHO细胞系和THP-1细胞通过荧光染色和FACS分析测量钙应答，见下文实施例中的描述。当在此试验中进行测定时，本发明抗体典型地具有约0.05至约10nM，特别是约0.5nM(例如，390±20pM)IC50S。
本发明抗体有利地与伊奥他新，尤其是伊奥他新-1发生交叉反应，因此可以有利地抑制伊奥他新对其靶细胞的作用，并由此还适用于治疗伊奥他新介导的疾病和病症。本发明抗体和伊奥他新的交叉反应性可以使用光生物传感技术，如BIAcore(Karlsson等，J.Immunol.Meth.1991；145229-240)来测定。
正如上述试验中指出的，本发明抗体可以有力地阻断MCP-1的作用，并优选与exotaxin发生交叉反应。因此，本发明抗体具有如下药物用途本发明抗体可以用于预防和治疗MCP-1或伊奥他新介导的疾病或病况。MCP-1在白细胞运输，尤其是单核细胞向炎症部位的迁移中有重要作用，因此本发明抗体可以用于抑制单核细胞迁移，例如以治疗炎症、过敏反应和过敏性疾病、自身免疫病、移植排斥、涉及白细胞浸润的癌症、狭窄或再狭窄、动脉粥样硬化、类风湿性关节炎和骨关节炎。
可以用本发明抗体治疗的疾病或病况包括炎症或过敏性疾病，包括呼吸道过敏性疾病如哮喘、过敏性鼻炎、COPD、超敏性肺病、超敏性肺炎、间质性肺病(ILD)(例如特发性肺纤维化、或与自身免疫病如RA、SLE等有关的ILD)；过敏反应或超敏反应，药物过敏(例如对青霉素或头孢菌素)和昆虫叮咬过敏；炎症性肠病，如局限性回肠病和溃疡性结肠炎；脊椎关节病、硬皮病；银屑病和炎性皮肤病，如皮炎、湿疹、特应性皮炎、变应性接触性皮炎、荨麻疹；脉管炎；自身免疫病，尤其是病因包括炎性成分在内的自身免疫病，如关节炎(例如类风湿性关节炎、慢性进行性关节炎、银屑病关节炎和变形性关节炎)和风湿性疾病，包括涉及骨丧失、炎性疼痛、超敏反应(包括呼吸道超敏反应和皮肤超敏反应)和过敏的炎症和风湿性疾病。可以应用本发明抗体的具体自身免疫病包括自身免疫性血液病(包括如溶血性贫血、再生障碍性贫血、纯红细胞贫血和特发性血小板减少)、系统性红斑狼疮、多发性软骨病、硬皮病、韦格纳肉芽肿病、皮肤癣菌病、慢性活动性肝炎、重症肌无力、银屑病、斯-约综合征、特发性口炎性腹泻、自身免疫性炎症性肠病(包括例如溃疡性结肠炎、局限性回肠病和肠易激惹综合征)、自身免疫性甲状腺炎、贝赫切特病、内分泌性眼病、格雷夫斯病、肉样瘤病、多发性硬化、原发性胆汁性肝硬化、幼年型糖尿病(I型糖尿病)、眼色素层炎(前和后色素层炎)、干燥性角结膜炎和春季性角结膜炎、间质性肺纤维化、和肾小球性肾炎(伴有或不伴有肾病综合征，例如包括特发性肾病综合征或微小病变肾病)；移植排斥(例如移植中，包括心脏、肺、心肺联合、肝脏、肾脏、胰脏、皮肤或角膜移植中)，包括同种异体移植排斥或异种移植排斥或移植物抗宿主疾病，和与动脉粥样硬化有关的器官移植；动脉粥样硬化；
伴有皮肤或器官的白细胞浸润的癌症；脉管系统，尤其是动脉，如冠状动脉的狭窄或再狭窄，包括由对脉管的干涉以及新血管内膜(neointimal)增生导致的狭窄或再狭窄；和涉及炎性反应的其它疾病或病况，包括再灌注损伤、血癌、细胞因子诱导的毒性(例如败血症性休克或内毒素性休克)、多发性肌炎、皮肌炎和肉芽肿性疾病，包括肉样瘤病。
对于治疗骨和软骨代谢疾病，包括骨关节炎、骨质疏松和其它炎症性关节炎如类风湿性关节炎，以及一般性骨丧失，包括老化相关的骨丧失，尤其是牙周病，本发明抗体尤其有用。
对于上述适应症，当然，适当的剂量将随例如待施用的具体的本发明抗体、宿主、给药模式和所治疗疾病的性质及严重性而改变。然而，在预防应用中，一般，在每千克体重约0.05mg至约10mg、更通常在每千克体重约0.1mg至约5mg的剂量下，显示出可获得满意的结果。对于预防性应用，给药频率正常为约每周一次至不超过约每3个月一次，更通常是约每2周一次至不超过约每10周1次，例如每4或8周一次。本发明抗体可以方便地通过肠胃外、静脉内(例如进入肘前或其它外周静脉内)、肌内或皮下途径给药。例如，预防性治疗典型地包括每月一次至每2至3个月一次，或频率更低地施用本发明抗体。
本发明药物组合物可以按常规方式制备。优选提供冻干形式的本发明组合物。对于直接给药，可以将其溶解在适宜的含水载体，如注射用无菌水或无菌缓冲生理盐水中。如果期望配制成大体积溶液用于灌注，更确切地用于快速注射给药时，则有利的是在配制时将人血清白蛋白或患者自身的肝素化血液加入此盐水中。存在过量的此类生理惰性蛋白质可以防止由于灌注溶液使用的容器和管子的壁的吸附而引起的抗体丢失。如果使用白蛋白，则适宜的浓度为0.5至4.5％重量盐溶液。
在如下实施例中参照附图仅通过举例说明的方式对本发明作进一步描述
图1A-显示来自经处理的和未经处理的恒河猴的各种穿刺活检组织的嗜酸性过氧化物酶(eosinophilperoxidase，EPO)活性的柱形图；B-显示这些活检组织的髓过氧化物酶(MPO)活性的类似柱形图；图2-显示来自ABN912和CGP44290(对照抗体)处理前和后的4只恒河猴的组织学样品的嗜酸性染色的照片；图3-显示在各种处理方案中人皮肤移植物中的Th细胞迁移(％)的柱形图；和图4-显示ABN912突变体与MCP-1结合的相对结合亲和力的柱形图。
实施例我们用构建的转基因小鼠(表达人IgG/κ的所有组成成份而非鼠免疫球的所有组成成份)(Fishwild等，1996，Nat Biotechnol.，第14卷，第845-851页)制备抗人MCP-1的抗体。通过标准杂交瘤技术使这些小鼠的B细胞永生化，并得到分泌人IgG3/κ抗体AAV293的鼠杂交瘤细胞。
实施例1小鼠的免疫和杂交瘤细胞系的产生免疫用包含在完全弗氏佐剂中的重组人MCP-1(R&D Systems，Minneapolis，MN，美国)，以每只小鼠100μg蛋白的剂量，在第0天和第14天(腹膜内)及第26天(静脉内)免疫四只Medarex小鼠(小鼠号16194-16197，Medarex公司.Annadale，NJ，美国)。在第41天，没有一只小鼠显示出有能探测到的血清抗体。在第49天和65天，用包含在不完全弗氏佐剂中的rhMCP-1，剂量是100μg蛋白每只小鼠，皮下对小鼠进行进一步的免疫。
当在第106天进行检测时，在其中一只小鼠(小鼠号16194)的血清中探测到相当可观的抗MCP-1抗体效价。在融合之前，这只小鼠再接受7次加强免疫在第106天(腹膜内)、119天(皮下)和135天(腹膜内)用100μg蛋白(于盐水中)每只小鼠的剂量来免疫，在融合前的第4天(x2-静脉内和腹膜内)和第3天及第2天(均为腹膜内)用25μg蛋白(于盐水中)每只小鼠的剂量进行免疫。
融合及杂交瘤的筛选在融合当天，用CO2吸入法处死小鼠16194，用PEG 4000通过常规方法使全部脾脏细胞(4.8×107个)与小鼠骨髓瘤细胞系PAI-O细胞(5×107个)融合。在含有一层小鼠腹膜细胞(Balb/c小鼠)饲养层的720个孔中接种融合细胞(1ml/孔)，所述孔中有补加了HAT的RPMI 1640培养基、10％热灭活的胎牛血清、5×10-5Mβ-巯基乙醇、50μg/ml庆大霉素。每4天更换一次培养基，在14天后，将HAT培养基换成HT培养基，即，把氨基蝶呤去除。在接种的最初720个孔中，461个孔(64％)呈杂交瘤生长阳性。收集上清液，用酶联免疫吸附测定方法(ELISA)筛选MCP-1反应性单克隆抗体。鉴定出7个IgG亚型的单克隆抗体。用4×96孔微量滴定板，按每个孔0.5个细胞/100μl接种进行克隆。在8天后用显微镜来检测这些克隆，加入生长培养基100μl，并在第二天用酶联免疫吸附测定方法检测上清液。选出具有最高反应性的杂交瘤，克隆149，用于进一步克隆及表征。基于依赖rhMCP-1的钙动员实验中杂交瘤亚克隆的IgG3/κ单克隆抗体产物AAV293的抑制活性，筛选出杂交瘤亚克隆149-12。
重链及轻链的纯化和部分氨基酸序列氨基酸测序用SDS-PAGE分离已经纯化的抗体AAV293的轻链和重链，并用Edman降解法测出氨基端的氨基酸。从克隆的杂交瘤细胞中得到mRNA，进而得到cDNA，用PCR扩增此cDNA得到编码重链可变区和轻链可变区的cDNA序列，对其进行全测序。在以下的Seq.Id No.1和Seq Id No.2中给出了重链可变区和轻链可变区的氨基端氨基酸序列及相应的DNA序列，其中粗体显示了CDR。Seq.Id no.130 60GAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGG GGA GGC TTG GTC CAG CCT GGG GGG TCC CTG AGA CTCGlu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu10 2090 120TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTT AGT TGG GTC CGC CAG GCTSer Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Trp Val Arg Gln Ala30 40150 180CCA GGG AAA GGG CTG GAG TGG CTG GCC Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala 5060210 240 CGA TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAC GCC AAG AAT TCA CTG TAT Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr70 80270 300CTG CAA ATG AAC AGT CTG AGA GCC GAG GAC ACG GCT GTG TAT TTC TGT GCG AGG Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg 90 100330 360 TGG GGC CGT GGC ACC CTG GTC ACC GTC Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val110 120TCT TCASer SerSeq.Id no.230 60GCC ATC CAG TTG ACA CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCA TCT GTA GGA GAC AGA GTC ATCAla Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Ile10 20 90 120CTC ATC TGC TGG TAT CAG CAG AAA CCALeu Thr Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro30 40150 180GGG AAA GCT CCT AAG CTC CTG ATC TAT GGG GTC CCA TCAGly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Val Pro Ser50 60210240AGG TTC AGC GGC AGT GGA TCT GGG CCA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGC CTG CAG CCTArg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Pro Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro70 80270 300GAA GAT TTT GCA ACT TAT TTC TGT CTC ACT TTC GGC GGAGlu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Leu Thr Phe Gly Gly90100GGG ACC AAG GTG GAA ATC AAA CGA ACTGly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr用上述的方法还得到另一个抗MCP-1单克隆抗体，IgGl/κ单克隆抗体产物，AAV294。这种抗体与MCP-1的结合亲和力大约比AAV293抗体的亲和力的1/3还弱，并且发现，除了如下替代外，该抗体的VH和VL的氨基酸序列与AAV293抗体的VH和VL的序列相同，这些替代是在VH，AAV294在第24位用Val替代Ala，在第60位用Phe替代Tyr，在第74位用Ser替代Asn，而在VL，AAV294在第30位用Tyr替代Ser，在第69位用Thr替代Pro。
重链和轻链表达载体的构建用PCR扩增克隆的VL和VH的编码序列，通过适当的限制性位点将它们插入到盒式载体中，这种载体提供了免疫球蛋白启动子、来自RFT2抗体的前导序列(Heinrich等.(1989)J.Immunol.第143卷，第3589-97页)、J片段的一部分和剪接供体位点。将含有完整VL区、启动子和分泌前导序列的轻链盒转移到表达载体中，所述载体含有人的Ck基因、免疫球蛋白重链增强子以及用于氨甲蝶呤选择的修饰过的鼠源dhfr cDNA。
相应地，重链盒转移到含有人IgG4基因、免疫球蛋白重链增强子和新霉素抗性选择基因的表达载体中。
在表达载体中，重链和轻链的构型都与基因组中重排的免疫球蛋白基因的构型类似，这种构型据认为对于高水平表达是至关重要的。
为了制备抗体，将以上的载体共转染进入适当的寄主细胞系，例如SP2/0细胞系。含有载体序列的细胞可以通过氨甲喋呤进行筛选，培养筛选出的细胞系，用以表达ABN912抗体(人IgG4/κ抗人MCP-1抗体)。
对分别载有NVP-ABN912的重链和轻链基因的表达载体进行线性化，通过电穿孔的方法转染入Sp2/0细胞。转染后的细胞在含有胎牛血清(FCS)的非选择性RPMI培养基上生长20小时，然后以1.4mg/ml使用G41848-72小时。使转染后的细胞库适应没有FCS但含有通常使用的添加剂(丙酮酸盐、谷氨酰胺、人血清白蛋白、转铁蛋白、胰岛素)的RPMI培养基。用200nM氨甲喋呤和1μM氨甲喋呤进行两步扩增后，分离出高产者克隆。用辅助的旋转培养实验(additional spinner exprimant)，通过在T175培养基上连续培养4-5个月，评价克隆和亚克隆的产量稳定性。对于高产者克隆，从实验室规模放大到生物反应器培养。得到几个对ABN912的生产有用的高产者细胞系。在过度生长的培养物中得到的累积产物的最大量是504mg/l。
实施例2生物化学和生物学数据在体外人单克隆抗体ABN912结合人MCP-1并抑制其作用。该单克隆抗体与重组人MCP-1的结合通过两种独立的生物化学方法来进一步表征，即Biacore分析和闪烁亲近测定法(SPA)分析。用BIAcore评价ABN912抗体对其它CC趋化因子或非人MCP-1的特异性，用闪烁亲近测定法展示ABN912对MCP-1与表达CCR2B的细胞的结合的抑制。在表达CCR2B的细胞中通过Ca2+动员实验展示ABN912对重组和天然产生的MCP-1的生物学活性。而用MCP-1诱导的趋化性分析试验展示ABN912对其天然靶细胞(外周血单核细胞，hPBMC)的活性。2.1 BIAcore分析用BIAcore分析测定出重组人MCP-1与固定化ABN912结合的结合与解离速率常数，并得出KD值。把ABN912固定在传感芯片表面，通过表面等离子体共振(Surface plasmon resonance)测量出它与重组MCP-1的结合(BIACORE 2000仪器手册，1999年三月(AC版本)；httpwww.biacore.com)。得出的实验结果如下表所示。
ABN912与重组人MCP-1的结合有很高的亲和力。2.2趋化因子选择性和物种特异性情况为了确定MCP-1与ABN912相互作用的特异性，我们用BIAcore评价了一系列非人MCP-1和CC-趋化因子与ABN912相互作用的潜力。2.2.1与非灵长类MCP-1的相互作用我们评价了一系列MCP-1与ABN912抗体的结合，这些MCP-1来自实验室常用的物种。这个测定的作法是把5nM趋化因子溶液注射入预先加载有ABN912的BIAcore流过池(flowcell)中。8分钟后测定对于每种被调查的趋化因子而言发生结合的趋化因子数量。得到的实验结果显示于下表中，表示为与重组人MCP-1(100％)相比每种趋化因子的结合百分数。
ABN912对人MCP-1是特异的，并且与任何其它被测物种的MCP-1没有交叉反应。2.2.2与重组趋化因子的相互作用为了测定ABN912与其它CC-趋化因子的交叉反应性情况，我们用上述方法评价它们与抗体的结合潜力。每种趋化因子与重组人源MCP-1相比的结合百分数如下表所示。
ABN912对人MCP-1是特异的，不与MCP-2、MCP-3、MCP-4、LEC、RANTES、MIP-lα和MIP-1β发生交叉反应，但与人伊奥他新，即人伊奥他新-1，有显著的交叉反应。并且发现AAV294与伊奥他新也有显著的交叉反应。2.3对MCP-1与CCR2B表达细胞的结合的抑制作用用SPA(闪烁亲近测定法)技术显示ABN912抗体可以阻止MCP-1与表达CCR2B受体的细胞膜结合。把表达CCR2B的CHO细胞(CHO#84-见下)的细胞膜与一系列浓度的ABN912(10-14M至10-8M)一起孵育，用麦胚凝集素珠通过闪烁亲近测定法测定放射性(125-I)MCP-1的残留结合。来自三个独立实验的平均IC50[M]是(461±206)×10-12。ABN912阻止MCP-1与表达CCR2B受体的细胞膜结合。2.4对MCP-1介导的信号传导的抑制作用MCP-1诱导的信号传导的早期事件是胞内Ca2+的动员，这可以利用荧光染料来测定。
对钙应答的测定是通过利用细胞系CHO#84来实现的，该CHO细胞系是一个经稳定转染而表达趋化因子受体CCR2B的细胞系。将CHO#84细胞培养在没有RNA酶和DNA酶的MEMα培养基中进行，其中所述培养基含有glutamax-1并补充有10％透析的胎牛血清、200U/ml青霉素/链霉素和作为选择剂的80nM氨甲蝶呤。在细胞培养物生长至密集但未达到汇合之前，用PBS洗细胞并且通过与胰蛋白酶-EDTA短时间孵育(最多1分钟)剥离细胞。
在RPMI中洗一次CHO#84细胞，在250g下离心7分钟，在含有0.04％pluronic acid、1.0μM fura red和0.3μM fluo-3的Hepes缓冲液0.5％BSA中重悬，达到3.5×106个细胞/毫升。在暗处室温下用这些荧光钙探测加载细胞，此过程持续1小时且其间不时地轻轻搅拌(6-8次)。然后在Hepes缓冲液0.5％BSA中离心两次，收获细胞，沉淀在Hepes缓冲液0.5％BSA中重悬，达到1.5-2×106个细胞/毫升。细胞至此即可用于刺激和钙测定，并于使用前在室温下暗处保存。
抗体和趋化因子(MCP-1，R&D Systems，Minneapolis，MN，美国)均配制成20倍浓度的溶液，在加入细胞之前，把这两种溶液在室温下混合在一起5-8分钟。用流式细胞仪(FACS，Becton Dickinson)相对时间测定绿色和红色荧光的值。对于每个细胞样本，为了获得基线值，首先对预先加载了荧光Ca-针的细胞中的荧光进行为期15秒的记录。暂时中断数据的获取，通过加入小体积的刺激物(10倍浓度的趋化因子，其中有或者没有抗体)刺激细胞，然后恢复荧光测定。全部荧光测定持续51秒。
所用Ca2+指示剂在结合钙时表现出荧光强度的相反迁移；fura red荧光下降而fluo-3荧光上升。每个实验中，对红色荧光和绿色荧光进行纪录，算出绿色荧光和红色荧光的比率，并对时间作图。“基线比率”和“刺激比率”分别定义为仅在刺激前获得的比率的平均值和刺激后获得的最大比率的平均值。我们用刺激指数(S.I.)来定量应答强度，刺激指数是指“刺激比率”除以“基线比率”的值。把有抗体时获得的刺激指数表示成只有溶剂时获得的刺激指数的百分数。溶解在溶剂S1中的抗体Al的抑制作用(％)通过下式计算100-[S.I.Al×100]/S.I.s1]
对ABN912和前体抗体AAV293及商购得到的无关抗MCP-1鼠源抗体(R&D Systems)的抑制作用进行比较。而且由于用于产生AAV293的免疫原是来自大肠杆菌的未糖基化的重组人MCP-1，故还使用来自TNFα刺激的HUVEC(人脐静脉内皮细胞)的MCP-1上清液来刺激CHO#84细胞，并按上述测量ABN912对Ca2+动员的拮抗作用。所获结果见下表。
ABN912特异地抑制CHO#84细胞中由MCP-1诱导的Ca2+动员，且对来自大肠杆菌的和来自人脐静脉内皮细胞的MCP-1具有相似效果。2.5对MCP-1诱导的趋化性的抑制作用用基于Boyden室的趋化性分析方法测定ABN912抑制MCP-1对人外周血单核细胞(hPBMC)的趋化作用的能力。由LymphoprepTM制备HPBMC，并将2×106个单核细胞/毫升用作输入量。按指定的摩尔比将ABN912或无关抗体(阴性对照)加入Boyden室的底部和顶部区室中。在底部区室中用5.7nM重组人MCP-1或1nM fMIPL(阴性对照)诱导趋化性。在室温下，允许细胞从顶部区室向底部区室迁移90分钟。通过染色和计数测定出发生迁移的细胞的数目。结果发现，ABN912以剂量依赖性方式抑制MCP-1诱导的人外周血单核细胞的趋化性。ABN912对MCP-1诱导的趋化性的作用是特异的，无关抗体无此作用，并且ABN912对fMIFL诱导的趋化性也无此作用。2.6对恒河猴中白细胞迁移的抑制作用这个机制性模型用于测试当给恒河猴静脉内快速注射NVP-ABN912时，MCP-1诱导的白细胞向恒河猴皮肤的迁移能否被NVP-ABN912所抑制。
为了增加白细胞数目以及致敏内皮细胞以实现最佳的白细胞募集，对成年雄性恒河猴进行为期13天(每天两次，静脉内)、剂量为30μg/kg的IL-3注射。在第13天，麻醉猴子，在右侧胸部和腹部皮内注射MCP-1(10μg)，一式三份。四小时后，再次麻醉猴子，并从MCP-1注射点对其进行穿刺活检。然后，用NVP-ABN912或者同种型匹配的直接抗人癌胚抗原的人源化阴性对照抗体(CGP44290)对猴子进行静脉内快速注射以达到5mg/kg的剂量。最后，在左侧胸部和腹部皮内再次注射MCP-1(10μg)，一式三份。这些注射位点与先前的注射位点是对称位点关系。四小时后，麻醉猴子，从MCP-1注射点进行穿刺活检。然后，将所有的穿刺活检物切成两半，一半冻在液氮中留作酶分析。另一半保留在福尔马林里留作以后的组织学分析。对嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞的酶分析分别是测其嗜酸性过氧化物酶(EPO)活性和髓过氧化物酶(MPO)活性。对每只猴子都要做进行PBS注射和不进行注射以刺激细胞浸润的平行对照。每个对照都没发现显著的抗体介导效应。
分别用NVP-ABN912和CGP44290(IgG4，同种型匹配的阴性对照)处理之前和之后在MCP-1注射位点的酶促活性显示为平均值±SD。对于每种条件，每只猴子身上均使用多个注射位点(3)。在图1.A-嗜酸性粒细胞迁移和图1.B-嗜中性粒细胞迁移中，显示了来自两个独立进行的实验的联合数据。
用抗体处理之前(MCP-1未处理，100％)和之后，穿刺活检组织中的标化EPO(A)或MPO(B)活性表示为平均值±SD。
当用10μgMCP-1在恒河猴皮肤中诱导白细胞迁移时，与抗体处理前的白细胞迁移相比，在有NVP-ABN912时观察到85.5％嗜酸性粒细胞和81.4％嗜中性粒细胞的迁移受到抑制。在应用CGP44290时，对这两种细胞而言仅测定到大约20％的抑制作用。考虑到单独的PBS注射导致与用10μgMCP-1时所观察到的应答相比13.0％(嗜酸性粒细胞)和22.7％(嗜中性粒细胞)的募集，因此NVP-ABN912的施用把白细胞迁移数目减少到用PBS刺激时所观察到的背景水平。
在统计学上，在NVP-ABN912与对照抗体之间观察到的差异是极显著差异(p＜0.01)，考虑到此作用的大小，这似乎也具有生物学上的相关性。在图2中显示了嗜酸性粒细胞迁移的典型组织学。
本说明书展示了对于四只猴子(2279，2280，2281和2282)来自于MCP-1诱导的嗜酸性粒细胞迁移实验的穿刺活检组织的组织学。
(A)，(B)，(E)，(F)各是在抗体处理前猴子2279，2280，2281和2282的嗜酸性粒细胞染色。
(C)，(D)，(G)，(H)各是在抗体处理后猴子2279，2280，2281和2282的嗜酸性粒细胞染色。
猴子2279和2280是用同种型匹配的阴性对照抗体CGP44290(5mg/kg)处理的，猴子2281和2282是用NVP-ABN912(5mg/kg)处理的。
嗜酸性粒细胞染成红色(在黑白色图中显示为暗点)，在(G)和(H)区用箭头示出在这两只NVP-ABN912处理的猴子中存在的少数嗜酸性粒细胞。
用CGP44290处理时，没有观察到处理前后有差异；然而用NVP-ABN912处理猴子时，观察到嗜酸性粒细胞的迁移几乎完全被抑制。2.7对SCID-hu小鼠中T细胞浸润的抑制作用这个机制性模型用于测试MCP-1诱导的Th细胞向SCID-hu小鼠皮肤的浸润能否被腹膜内注射的NVP-ABN912所抑制。
把两小片成人皮肤(SCID-hu皮肤)移植到SCID小鼠上。在移植后的5-6周对移植物的质量进行监测，然后选择成功移植的小鼠(通常＞85％)用于体内迁移实验。对于趋化因子诱导的迁移，用标准密度梯度分离的方法从白细胞层样品中分离出PBMC并且将其过继转移(腹膜内1×108个细胞/小鼠，500μl体积)到先前移植(5-8周)了两块人皮肤(在背部上方的左侧和右侧)的SCID-hu皮肤小鼠中。在第0天完成细胞转移。在实验第1、2、4和6天，把MCP-1(R&D Systems，Minneapolis，MN)和PBS经皮内途径施用到人移植物中。对照小鼠(CGP44290处理)在右侧皮肤移植物中接受500ngMCP-1，在左侧皮肤移植物中接受等体积(30μ1)PBS。NVP-ABN912处理的小鼠在其左右两侧皮肤移植物中均注入500ngMCP-1。在第0天(细胞转移前5小时)和实验第2天和第5天，腹膜内(100μg/小鼠，4mg/kg，500μl体积)施用NVP-ABN912和同种型对照CGP44290。在第8天，处死所有小鼠并收集人皮肤移植物，用于进一步分析。
用DAKO Medimachine，按照制造商的说明书制备每块人皮肤移植物的单细胞悬液。用偶联有FITC和PE的人抗-CD3和抗-CD4单克隆抗体(mAb)对这些细胞悬液进行染色，并用FACSCalibur流式细胞仪(BectonDickinson，San Jose，CA)进行分析。图3显示了结果。CPG44290处理组(3只小鼠，n＝3)中有3.73±1.03％注入的人Th细胞浸润皮肤移植物，与之相比，在相应的ABN912处理组(5只小鼠，n＝10)中为0.73±0.15％。
在用PBS诱导细胞迁移的小鼠中，0.34±0.17％的Th细胞浸润人皮肤移植物(3只小鼠，n＝3)。
作方差单向分析的统计分析，然后进行Dunnett′s多重比较检验posthoc。相对于CGP44290处理的动物，用ABN912处理的动物中Th细胞浸润的降低是非常显著的(p＜0.01，**)。2.8对人MCP-1上的ABN912结合表位及作用方式的特征通过X-射线晶体学测定MCP-1和NVP-ABN912的Fab片段的复合体的三维结构。
用蛋白酶解法从整个抗体上得到NVP-ABN912的Fab片段，用蛋白质A层析及随后用大小排阻层析对Fab片段进行纯化。
用蛋白质G层析及大小排阻层析纯化Fab与重组人MCP-1的复合体，并通过超滤浓缩至50mM Tris-HCI(pH8.0)，0.1M NaCl中的26mg/ml。在悬浮液滴(20％(w/v)PEG 4,000、10％(v/v)异丙醇、0.1M Na HepespH7.5)中通过气相扩散技术在室温下生长晶体。这些晶体在空间群P212121中，晶胞尺寸a＝63.90、b＝86.08、c＝321.64，每个不对称晶胞中有三个复合体。在收集数据前，将一个晶体在17％(w/v)PEG 4,000、8.5％(v/v)异丙醇、15％甘油、85mM Na Hepes pH7.5中浸泡约3分钟。然后，将晶体放置在尼龙CryoLoop中，并在120K氮流中直接冷冻。在EuropeanSyncrotron Radiation Facility的SNBL光束(λ＝0.90)下，用MAR345图像信号板系统测量衍射数据。在20.0到2.33分辨率收集到总共242，617次观察(89.3％完整性)，相当于68，948次独特反射(Rsym＝0.050)。用3D6单克隆抗体的Fab片段(RCSB entry 1DFB；He等，1992)和人MCP-1(RCSB entry 1DOL；Lubkowski等，1997)的X射线结构作为初始模型，通过分子替换法测定晶体结构。用CNX程序通过扭转角动力学和能量最低原理改进所述结构，对在20到2.33之间的所有反射，达到最终的R-因子为0.224(Rfree＝0.261)。最终模型包括ABN912的L1到L214和H1到H222以及人MCP-1的第10到71位残基。这个模型有良好的几何形状，键长的rms偏差为0.006而键角的rms偏差为1.36°。
NVP-ABN912 Fab/人MCP-1复合体显示出一个大的结合表面(1,5902的结合隐蔽表面)，涉及许多疏水和极性相互作用以及几个关键性的静电相互作用。与抗原的主要接触是由NVP-ABN912的长H-CDR3环介导的，这个环折叠在抗原结合位点的中心上并大部分被包埋在复合体中。人MCP-1上的结合表位包含氨基酸残基Asn 14，Thr 16，Asn 17，Arg 18，Lys 19，Ile 20，Ser 21，Gln 23，Arg 24，Lys 49，Glu 50，Ile 51和Cys 52。Arg18，Arg 24和Lys 49参与了与抗体残基Glu L55，Asp H99和Glu H101的静电相互作用，并参与了与Tyr L94，Trp H33，Asn H50，Gln H53，Asp H99和Tyr H108的氢键相互作用。另外，MCP-1的Arg 18和Arg 24的胍基部分分别与Trp H33和Tyr H32的芳环发生π堆积。NVP-ABN912与抗原的Tyr 13，Gln 17，Ser 21，Lys 19，Arg 24和Glu 50的其它相互作用由包埋在蛋白质接触面中的8个水分子介导。既然MCP-1的Tyr 13和Arg 24参与和CCR2B趋化因子受体的结合(Hemmerich等，1999，Biochemistry，第38卷；第13013-13025页)，这样看起来，NVP-ABN912与拮抗物直接竞争与受体结合。2.9通过定点诱变对MCP-1上的ABN912表位作图为了确定对于NVP-ABN912的识别而言MCP-1上的功能性重要残基，进行丙氨酸扫描诱变研究(Cunningham，B.C.和Wells，J.A.(1989)Science第244卷，第1081-1085页)。首先，为了确认表面暴露残基，用WebLab Viewer软件对MCP-1的三维结构(Handel，T.M.和Domaille，P.J.(1996)Biochemistry第35卷，第6569-6584页；Lubkowski，J.，Bujacz，G.，Boqué，L.，Domaille，P.J.，Handel，T.M.和Wlodawer，A.(1997)NatureStruct.Biol.第4卷，第64-69页)进行目测检查。用QuikChange定点诱变试剂盒(Papworth，C.，Bauer，J.C.，Braman，J.和Wright，D.A.(1996)Strategies 9(3)，3-4)对有潜在可能与ABN912相互作用的全部39个残基单个地突变为丙氨酸或赖氨酸(D3K，A48K)。首先通过用两微克载有获得的MCP-1突变序列的表达质粒和Geneporter转染试剂(Gene TherapySystems)转染细胞，在HEK.EBNA细胞中表达该突变基因。转染后，细胞在37℃培养3天，收集上清液，离心5分钟，用亲和层析进行纯化。以纯化的MCP-1为标准，用蛋白分析法(Biorad)测定突变型MCP-1的浓度。典型地，从3ml培养物中获得40μg纯化的人MCP-1或突变型MCP-1。
用BIAcore仪器(BIAcore)通过表面等离子体共振测定NVP-ABN912与MCP-1以及突变型MCP-1的亲和力。首先，活化仪器的传感芯片表面并注射30μg/ml抗-Fcγ溶液以便与芯片共价结合。通过注射5μg/ml溶液，使NVP-ABN912抗体聚集在抗-Fcγ修饰的表面上。稀释MCP-1或突变型MCP-1，使终浓度为0.75到4nM，注射稀释物以使之与传感芯片表面固定的NVP-ABN912结合。随后有5分钟的结合和解离，在此期间记录表面等离子体共振信号。然后用BIAevaluation 3.0软件(仪器安装的软件部分；手册Cat.No.BR 1002-29；7-97版)来分析系列滴定物。结果见于图4，图中显示NVP-ABN912与MCP-1以及突变型MCP-1的结合。
根据上述确定出的MCP-1上供NVP-ABN912识别的主要决定簇是残基T16，R18，R24和K49。T16，R18和R24突变成丙氨酸可以导致完全不能与NVP-ABN912结合；而K49突变成丙氨酸导致亲和力下降为原来的1/133。
权利要求
1.MCP-1结合分子和其直接等价物，其中所述MCP-1结合分子包括含有至少一个顺次包含高变区CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白重链可变区(VH)的抗原结合位点，所述CDR1具有氨基酸序列His-Tyr-Trp-Met-Ser，所述CDR2具有氨基酸序列Asn-Ile-Glu-Gln-Asp-Gly-Ser-Glu-Lys-Tyr-Tyr-Val-Asp-Ser-Val-Lys-Gly，而所述CDR3具有氨基酸序列Asp-Leu-Glu-Gly-Leu-His-Gly-Asp-Gly-Tyr-Phe-Asp-Leu。
2.MCP-1结合分子和其直接等价物，其中所述MCP-1结合分子包括含有至少一个顺次包含高变区CDR1’、CDR2’和CDR3’的免疫球蛋白轻链可变区(VL)的抗原结合位点，所述CDR1’具有氨基酸序列Arg-Ala-Ser-Gln-Gly-Val-Ser-Ser-Ala-Leu-Ala，所述CDR2’具有氨基酸序列Asp-Ala-Ser-Ser-Leu-Glu-Ser，而所述CDR3’具有氨基酸序列Gln-Gln-Phe-Asn-Ser-Tyr-Pro。
3.包含重链(VH)和轻链(VL)可变区的MCP-1结合分子及其直接等价物，其中所述MCP-1结合分子含有至少一个抗原结合位点，而所述抗原结合位点包含a)顺次含有高变区CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白重链可变区(VH)，所述CDR1具有氨基酸序列His-Tyr-Trp-Met-Ser，所述CDR2具有氨基酸序列Asn-Ile-Glu-Gln-Asp-Gly-Ser-Glu-Lys-Tyr-Tyr-Val-Asp-Ser-Val-Lys-Gly，而所述CDR3具有氨基酸序列Asp-Leu-Glu-Gly-Leu-His-Gly-Asp-Gly-Tyr-Phe-Asp-Leu，和b)顺次含有高变区CDR1’、CDR2’和CDR3’的免疫球蛋白轻链可变区(VL)，所述CDR1’具有氨基酸序列Arg-Ala-Ser-Gln-Gly-Val-Ser-Ser-Ala-Leu-Ala，所述CDR2’具有氨基酸序列Asp-Ala-Ser-Ser-Leu-Glu-Ser，而所述CDR3’具有氨基酸序列Gln-Gln-Phe-Asn-Ser-Tyr-Pro。
4.根据权利要求1、2或3的MCP-1结合分子，其是人抗体。
5.包含至少一个抗原结合位点的MCP-1结合分子，其中所述抗原结合位点包含具有与Seq.Id.No.1所示起始于第1位氨基酸并终止于第122位氨基酸的序列基本一致的氨基酸序列的第一域或上述第一域和具有与Seq.Id.No.2所示起始于第1位氨基酸并终止于第109位氨基酸的序列基本一致的氨基酸序列的第二域。
6.编码重链或其片段的第一DNA构建体，其包含a)编码交替地包含高变区和构架区的可变区的第一部分，所述高变区顺次是氨基酸序列显示在Seq.Id.No.1中的CDR1、CDR2和CDR3；该第一部分起始于编码可变区的第一个氨基酸的密码子并终止于编码可变区的最后一个氨基酸的密码子，和b)编码重链恒定部分或其片段的第二部分，其起始于编码重链恒定部分的第一个氨基酸的密码子并终止于编码该恒定部分或其片段的最后一个氨基酸的密码子，之后接终止密码子。
7.编码轻链或其片段的第二DNA构建体，其包含a)编码交替地包含高变区和构架区的可变区的第一部分；所述高变区是氨基酸序列显示在Seq.Id.No.2中的CDR1’、CDR2’和CDR3’；该第一部分起始于编码可变区的第一个氨基酸的密码子并终止于编码可变区的最后一个氨基酸的密码子，和b)编码轻链恒定部分或其片段的第二部分，其起始于编码轻链恒定部分的第一个氨基酸的密码子并终止于编码该恒定部分或其片段的最后一个氨基酸的密码子，之后接终止密码子。
8.能够在原核或真核细胞系中复制的表达载体，其包含至少一个根据权利要求6或权利要求7的DNA构建体。
9.制备MCP-1结合分子的方法，其包括(i)培养用根据权利要求8的表达载体转化的生物和(ii)从该培养物中回收MCP-1结合分子。
10.与伊奥他新发生交叉反应的抗MCP-1抗体。
11.i)可与伊奥他新发生交叉反应且能够抑制MCP-1和伊奥他新与其受体结合的抗MCP-1抗体在治疗MCP-1或伊奥他新介导的疾病或病症中的用途；ii)给患者治疗MCP-1或伊奥他新介导的疾病或病症的方法，所述方法包括给患者施用有效量的可与伊奥他新发生交叉反应且能够抑制MCP-1和伊奥他新与其受体结合的抗MCP-1抗体；iii)含有可与伊奥他新发生交叉反应且能够抑制MCP-1和伊奥他新与其受体结合的抗MCP-1抗体、以及可药用赋形剂、稀释剂或载体的药物组合物；和iv)可与伊奥他新发生交叉反应且能够抑制MCP-1和伊奥他新与其受体结合的抗MCP-1抗体在制备用于治疗MCP-1或伊奥他新介导的疾病或病症的药物中的用途。
12.MCP-1的抗体，对于和MCP-1的结合而言其具有约50pM或更小的KD。
13.MCP-1的抗体，其与包括MCP-1第24位精氨酸残基的MCP-1抗原性表位结合。
14.尤其是参考实施例实质上如前文所述的所有新化合物、工艺、方法和用途。
全文摘要
本发明提供包含至少一个含有序列如本文中定义的高变区CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白重链可变区(V
文档编号A61P11/00GK1443199SQ01812065
公开日2003年9月17日 申请日期2001年6月29日 优先权日2000年6月30日
发明者P·希斯坦德, H·霍夫施泰特尔, T·G·佩恩, R·乌费尔, F·E·迪帕多瓦 申请人:诺瓦提斯公司