专利名称：非肽类ccr1受体拮抗剂联合环孢菌素a治疗心脏移植排异反应的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于治疗哺乳动物心脏移植排异反应的药物组合物，其中包括药学可接受的赋形剂、治疗有效剂量的非肽类CCR1受体拮抗剂和亚肾毒性剂量的环孢菌素A。本发明还涉及使用该药物组合物治疗哺乳动物心脏移植排异反应的方法。
背景技术：
炎症过程中的一个重要环节是选定的白细胞群从循环系统中的迁移和激活以及在感染组织中的积蓄。虽然白细胞移动的想法并不新鲜，但近期随着选择素和粘附分子的整合素家族以及被称为趋化因子的选择性趋化趋化因子大家族被发现和表征，这种想法开始重新兴起。趋化因子受体在白细胞上被表达并处理趋化因子结合后的信号，由此这些信号被最终转导成白细胞向趋化因子源的迁移或激活。因此，通过调节白细胞从外周血液向器官、皮肤、关节或连接结构、组织中血管外位点的迁移和激活，趋化因子在宿主防御反应的维持和免疫反应的发展过程中起着关键性的作用。
趋化因子分子家族最初被划分为两个组“C-X-C”亚家族和“C-C”亚家族。这两个亚家族的特征是在分子内的高度保守区中存在四个半胱氨酸残基。在“C-C”趋化因子亚家族中，前两个残基是相互邻近的，而在“C-X-C”亚家族中，半胱氨酸残基被一个氨基酸残基所分隔。最近报道的“-C-”趋化因子似乎代表了一个新的趋化因子家族，与“C-C”亚家族和“C-X-C”亚家族中的四个半胱氨酸残基相比，“-C”趋化因子少了两个半胱氨酸残基。
“C-C”趋化因子亚家族中的一个成员是巨噬细胞炎症蛋白-1α(“MIP-1α”)。它由诸如巨噬细胞、T和B淋巴细胞、嗜中性粒细胞和成纤维细胞等细胞表达。近期有关MIP-1α在多发性硬化症的自免疫脑脊髓炎实验(EAE)小鼠模型中作用的研究(见Karpus，W.J.等人，J.Immunnol.(1995)，第155卷，5003-5010页)有力地确认了MIP-1α在体内的作用概念。多发性硬化症是由T和B淋巴细胞以及巨噬细胞介导的自身免疫疾病，导致中枢神经系统中的严重炎症和白质的脱鞘膜。该研究表明MIP-1α的抗体不但防止了初期和复发性疾病的发展，而且防止了单核细胞向中枢神经系统中的浸润。采用这些抗体进行治疗也可以缓解正在发病的疾病的严重程度。这些结果使研究者得出MIP-1α在多发性硬化症的病因学中扮演了一个重要角色的结论。另一个研究(见Godiska，R.等人，J.Neutroimmunol.(1995)，第58卷，167-176页)证实在急性EAE中，在SJL小鼠(一种易感于Th1疾病如EAE的小鼠)的损伤和脊髓中存在包括MIP-1α在内的一些趋化因子的mRNA向上调节。
RANTES是C-C趋化因子亚家族的另一个成员(RANTES是这种蛋白及其基因最初所观察和预测的特性的字首组合Regulated uponActivation Normal T cell Expressed presumed Secreted，即由细胞激活调节，在正常T细胞表达和分泌的)。已经发现在多种组织中RANTES按照MIP-1α类似的方式进行表达。从多个研究(见Rathanswami，P.等人，J.Biol.Chem.(1993)，第268卷，5834-5839页；以及Snowden，N.等人，Lancet(1994)，第343卷，547-548页)中得出的证据暗示在类风湿性关节炎发展过程中RANTES非正常产生。类风湿性关节炎是一种慢性炎症性疾病，其特征部分在于记忆T淋巴细胞和单核细胞浸润，据信这是由炎症组织中释放的趋化因子介导的。其它研究所得到的有力证据暗示了RANTES在类风湿性关节炎病理生理学中的作用(见Barnes，D.A.等人，J.Clin.Invest.(1998)，第101卷，2910-2919页；以及Plater-Zyberk，C.A.等人，Immunol.Lett.(1 997)，第57卷，117-120页)。例如，在大鼠佐剂诱导的关节炎(AIA)模型中，RANTES的抗体大大缓解了疾病的发展。
这些研究及其它研究所得出的有力证据证明，在多发性硬化症的EAE模型中MIP-1α水平增高，在类风湿性关节炎中RANTES的水平增高(例如参见，Glabinski，A.R.等人，Am.J.Pathol.(1997)，第150卷，617-630页；Glabinski，A.R.等人，Methods Enzymol.(1997)，第288卷，182-190页；和Miyagishi，R.S.等人，J.Neuroimmunol.(1997)，第77卷，17-26页)。此外，如上所述，这些趋化因子是这些疾病病理生理学中所涉及的主要细胞类型-T淋巴细胞和单核细胞的化学引诱物。因此，所有可抑制这些趋化因子活性的分子都将有益于这些疾病的治疗，并因此可用作抗炎剂。
同样也存在RANTES与器官移植排异反应有关的有力证据。单核细胞浸润器官移植体的细胞间隙是急性细胞排异反应的特点。细胞浸润主要由T细胞、巨噬细胞和嗜曙红细胞组成。在急性肾同种异体移植排异反应中对RANTES表达所进行的研究发现，RANTES mRNA在浸润单核细胞和肾小管上皮细胞中表达，同时在排异性移植中RANTES自身结合至微脉管系统的内皮表面(见Pattison，J.等人，Lancet(1994)，第343卷，209-211页；以及Wiedermann，C.J.等人，Curr.Biol.(1993)，第3卷，735-739页)。近期的研究(见Pattison，J.M.等人，J.Heart LungTransplant.(1996)，第15卷，1194-1199页)提出了RANTES可能在移植动脉硬化症中起作用的观点。与正常冠状动脉相比，在加速动脉硬化病中，在单核细胞、肌成纤维细胞和动脉内皮细胞中检测到RANTES，包括mNRA和蛋白两者水平的增加。
由于RANTES是趋化因子受体CCR1和CCR5的配体，因此这些位于循环系统中单核细胞之上的受体可能作为移植生物学中有用的治疗靶点。在定向缺失CCR1基因的小鼠的心脏移植模型中检验了CCR1受体的重要性(见Gao，W.等人，J.Clin.Invest.(2000)，第105卷，35-44页)。在该项研究中，同种异体移植存活的四个单独模型表明CCR1(-/-)受体组显著延长了存活期。在其中一个模型中，对于CCR1(+/+)小鼠组几乎无效的环孢菌素A水平在CCR1(-/-)受体组中却产生了同种异体移植的永久接受性。
近期发现某些小分子能抑制RANTES和MIP-1α的活性而作为非肽类CCR1受体拮抗剂并因此被用作抗炎剂。参见PCT专利申请公布WO98/56771；第09/094,397号美国专利申请(1998年6月9日申请)；第6,207,665号美国专利申请(2001年3月27日授权)；Hesselgesser，J.等人，J.Biol.Chem.(1998)，第273卷，15687-15692页；Ng，H.P等人，J.Med.Chem.(1999)，第42卷，4680-4694页；Liang，M.等人，Eur.J.Pharmacol.(2000a)，第389卷，41-49页；以及Liang，M.等人，J.Biol.Chem.(2000b)，第275卷，19000-19008页。此处这些专利公开和期刊文章被全文引用作为参考。
环孢菌素是一类中性亲脂性环状寡肽(11肽)，它们由真菌Tolypocladium inflatum Gams和其它一些不完全真菌产生。其主要成分是环孢菌素A，它是一个众所周知的商品免疫抑制剂，通过阻碍T细胞激活选择性地抑制适应性免疫反应(见Kahan，B.D.等人，New Engl.J.Med.(1989)，第321卷，1725-1738页；Valantine，H.等人，Transplant.Proc.(2000)，第32卷，27S-44S页)。虽然环孢菌素A已经成为决定器官是否成功的一个关键因素，但仍存在与环孢菌素免疫抑制直接相关的长期安全性问题，包括肾毒性、高血压、糖尿病和移植后淋巴增生性疾病。因此，理想的情况可能是使用亚肾毒性剂量的环孢菌素A，以此来减少不期望的副反应，同时保持为避免慢性排异反应所需的免疫抑制活性，对于心脏移植来说，这些慢性排异反应就是众所周知的慢性同种异体移植血管病，主要表现为加速动脉硬化症。
在近期的肾脏移植研究中，当给予低剂量的环孢菌素A时，肽类趋化因子受体拮抗剂Met-RANTES可显著地减少肾损伤，包括细胞间隙炎症，这种效应主要是通过减少浸润单核细胞的数目而达到的(Grne，H.J.等人，FASEB.J.(1999)，第13卷，1371-1383页)。该项研究支持了以下理论通过激活单核细胞上特定的趋化因子受体，RANTES在同种异体移植排异反应中起到重要的作用。
已公开的欧洲专利申请1 000 626(应用研究体系)公开了肽类趋化因子受体拮抗剂(Met-RANTES)与环孢菌素联用在治疗或预防移植器官、组织和细胞的排异作用中的应用。
发明内容
本发明涉及用于治疗哺乳动物心脏移植排异反应的药物组合物，所述组合物包含一种或多种药学可接受的赋形剂、治疗有效剂量的非肽类CCR1受体拮抗剂和亚肾毒性剂量的环孢菌素A。具体而言，本发明涉及用于治疗哺乳动物移植排异反应的药物组合物，所述组合物包含一种或多种药学可接受的赋形剂、亚肾毒性剂量的环孢菌素A以及治疗有效剂量的非肽类CCR1受体拮抗剂，其中该非肽类CCR1受体拮抗剂选自第6,207,665号美国专利所公开的化合物。
本发明还涉及对需要治疗心脏移植排异反应的哺乳动物给药药物组合物的方法，其中所述组合物包含一种或多种药学可接受的赋形剂、治疗有效剂量的非肽类CCR1受体拮抗剂和亚肾毒性剂量的环孢菌素A。具体而言，本发明涉及对需要治疗心脏移植排异反应的哺乳动物给药药物组合物的方法，其中所述组合物包含一种或多种药学可接受的赋形剂、亚肾毒性剂量的环孢菌素A以及治疗有效剂量的非肽类CCR1受体拮抗剂，其中该非肽类CCR1受体拮抗剂选自第6,207,665号美国专利所公开的化合物。
本发明还涉及治疗哺乳动物心脏移植排异反应的方法，所述方法包含对需要此等治疗的哺乳动物给药一种药物组合物，所述组合物包含一种或多种药学可接受的赋形剂、治疗有效剂量的非肽类CCR1受体拮抗剂和亚肾毒性剂量的环孢菌素A。具体而言，本发明还涉及治疗哺乳动物心脏移植排异反应的方法，所述方法包括对需要此等治疗的哺乳动物给药一种药物组合物，所述组合物包含一种或多种药学可接受的赋形剂、亚肾毒性剂量的环孢菌素A以及治疗有效剂量的非肽类CCR1受体拮抗剂，其中该非肽类CCR1受体拮抗剂选自第6,207,665号美国专利所公开的化合物。
图1显示了本发明非肽类CCR1受体拮抗剂对于放射性标记的MIP-1α与大鼠CCR1表达细胞结合的影响作用。
图2显示了本发明非肽类CCR1受体拮抗剂对于MIP-1α诱导的大鼠CCR1表达细胞内Ca2+升高的影响作用。
图3显示了大鼠皮下长期给药时本发明非肽类CCR1受体拮抗剂的血浆浓度。
图4显示了联合使用本发明非肽类CCR1受体拮抗剂和环孢菌素A对于大鼠同种异体心脏移植存活率的影响作用。
图5显示了接受同种异体心脏移植3天后，联合使用本发明非肽类CCR1受体拮抗剂和环孢菌素A对排异反应分值的影响作用。
图6显示了本发明非肽类CCR1受体拮抗剂对大鼠环孢菌素A血浆浓度的影响作用。
图7显示了本发明非肽类CCR1受体拮抗剂对于单核细胞与激活内皮细胞粘附的影响作用。
具体实施例方式
A、定义如专利说明书和所附权利要求中所采用的，除非另有说明，下列术语具有以下所示的含义“氨羰基”指基团-C(O)NH2。
“苯基”指任选地被一或多个取代基取代的苯基，取代基选自羟基、卤素、烷基、卤代烷基、烷氧基、链烯基、硝基、氰基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、烷基羰基、羧基、烷氧基羰基和氨羰基。
“药学可接受盐”包括酸和碱加成盐。
“药学可接受的酸加成盐”指那些保持游离碱的生物效应和性质的盐，它不具有生物不可接受性，由无机酸，如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等，以及有机酸，如醋酸、丙酸、丁酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等形成。
“药学可接受的碱加成盐”指那些保持游离酸的生物效应和性质的盐，它不具有生物性不可接受性。这些盐可以通过向游离酸中添加一种无机碱或有机碱进行制备。由无机碱得到的盐包括但不限于钠、钾、锂、铵、钙、镁、锌、铝等的盐。优选的无机盐为铵、钠、钾、钙和镁盐。由有机碱得到的盐包括但不限于伯、仲和叔胺，取代的胺，包括天然取代胺、环胺和碱性离子交换树脂，如异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、2-二甲胺基乙醇、2-二乙胺基乙醇、trimethamine、二环己基胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、羟氨、胆碱、甜菜碱、乙二胺、葡糖胺、甲基葡糖氨、可可碱、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、聚胺树脂等形成的盐。特别优选的有机碱为异丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二环己基胺、胆碱和咖啡因。
“脲基”指式-N(H)-C(O)-NH2所示的基团。
从以上定义可以理解，对于含有取代烷基的基团来说，取代可发生在烷基的任何碳上。
“心脏移植排异反应”指这样一些作为本发明目的的疾态，其特征为心脏移植术后急性或慢性排异，包括早期移植失败、早期急性排异、早期系统排异和晚期慢性同种异体移植血管病变(早期和晚期分别以少于或多于六个月至一年来确定)。
“哺乳动物”包括人和家养动物，如猫、狗、猪、牛、绵羊、山羊、马、兔等。
“亚肾毒性剂量”指在既治疗人心脏移植排异反应有效，又不产生肾毒性这种不期望作用的环孢菌素A的剂量，其中肾毒性的特征为血清肌氨酸增高、蛋白尿增加、液体潴留增加、肾小球渗透率下降和钠钾排泄下降。
“同时地”指使用包含两种活性成分的药物组合物，其中在一种或多种药学可接受的赋形剂存在下，在一个配方中包含了有效治疗剂量的本发明非肽类CCR1受体拮抗剂和亚肾毒性剂量的环孢菌素A。
“顺序地”指本发明药物组合物以两个不同的配方进行使用，配方中各自包含一种或两种活性组分，即本发明中有效治疗剂量的非肽类CCR1受体拮抗剂或亚肾毒性剂量的环孢菌素A，以及一种或多种药学可接受的赋形剂。两种不同的配方在不同的时间给药于需要治疗的患者。
本发明非肽类CCR1受体拮抗剂在其结构中可能含有不对称碳原子。因此，非肽类CCR1受体拮抗剂可以以单一立体异构体、消旋体或对映体或非对映体的混合物形式存在。所有这些单一立体异构体、消旋体及其混合物都在本发明范围之内。非肽类CCR1受体拮抗剂中的某些碳原子的绝对构型如果已知，可采用适当的绝对构型描述符R或S来标示。描述符“trans”用于表示R1a取代基在哌嗪面的反面。描述符“cis”用于表示R1a取代基在哌嗪平面的同侧。
本发明所采用的非肽类CCR1受体拮抗剂命名法是I.U.P.A.C.命名体系修改形式，其中如第6,207,665号美国专利所述，本发明所讨论的非肽类CCR1受体拮抗剂被命名为哌嗪衍生物。
“治疗有效剂量”指非肽类CCR1受体拮抗剂，特别是以下式(I)所示的非肽类CCR1受体拮抗剂的剂量，当对需要治疗的哺乳动物、优选为人进行给药时，如下所述该剂量足以治疗心脏移植排异反应。本发明非肽类CCR1受体拮抗剂的“有效治疗剂量”依据所采用的非肽类CCR1受体拮抗剂、排异反应的严重程度以及被治疗病人的年龄而改变，但是对本领域的普通技术人员来说，依据其知识背景和本发明公开确定剂量是常规的事情。
此处采用“治疗”用于涵盖对哺乳动物，尤其是人心脏移植排异反应的治疗，并包括(i)在心脏移植之前或之后防止哺乳动物，优选为人体内出现排异反应；(ii)抑制病情，即、限制排异反应的发展；或(iii)缓解病情，即、缓解排异反应。
B、优选实施方案在以上发明内容中所述及的药物组合物中，优选的药物组合物中包含选自式(I)所示化合物的非肽类CCR1受体拮抗剂 其中R1a为相互独立的一个或多个选自烷基或羟烷基的取代基；R2为4位的氟；R3为4位被氯取代且2位被氨羰基、脲基或甘氨酰胺基取代的苯基；R4为-O-；R5为亚甲基；R6为-C(O)-；其中化合物可为单一立体异构体或其混合物，或其一种药学可接受的盐。
在这组药物组合物中，药物组合物的优选亚组包含选自下列化合物的非肽类CCR1受体拮抗剂(2R，5S)-1-((4-氯-2-(氨羰基)苯氧基)甲基)羰基-2，5-二甲基-4-(4-氟苄基)哌嗪；(trans)-1-((4-氯-2-(甘氨酰胺基)苯氧基)甲基)羰基-2，5-二甲基-4-(4-氟苄基)哌嗪；(2R)-1-((4-氯-2-(脲基)苯氧基)甲基)羰基-2-甲基-4-(4-氟苄基)哌嗪；(trans)-1-((4-氯-2-(脲基)苯氧基)甲基)羰基-2，5-二甲基-4-(4-氟苄基)哌嗪；(2R，5S)-1-((4-氯-2-(脲基)苯氧基)甲基)羰基-2，5-二甲基-4-(4-氟苄基)哌嗪；和(2R，5S)-1-((4-氯-2-(甘氨酰胺基)苯氧基)甲基)羰基-2，5-二甲基-4-(4-氟苄基)哌嗪。
在这组药物组合物中，另一个优选的药物组合物亚组中非肽类CCR1受体拮抗剂为(2R)-1-((4-氯-2-(脲基)苯氧基)甲基)羰基-2-甲基-4-(4-氟苄基)哌嗪。
在这一药物组合物亚组中，优选的一类药物组合物为需要治疗的哺乳动物为人的药物组合物。
在以上发明内容中所述及的方法中，优选的使用方法组包括非肽类CCR1受体拮抗剂和环孢菌素A同时地或顺序地对需要治疗的哺乳动物进行给药的方法。
在这组方法中，方法的优选亚组包括采用选自式(I)所示化合物的非肽类CCR1受体拮抗剂的方法 其中R1a为相互独立的一个或多个选自烷基或羟烷基的取代基；R2为4位的氟；R3为4位被氯取代且2位被氨羰基、脲基或甘氨酰胺基取代的苯基；R4为-O-；R5为亚甲基；R6为-C(O)-；其中化合物可为单一立体异构体或其混合物，或其一种药学可接受的盐。
在这组方法中，方法的优选亚组包含采用选自下列化合物的非肽类CCR1受体拮抗剂的方法(2R，5S)-1-((4-氯-2-(氨羰基)苯氧基)甲基)羰基-2，5-二甲基-4-(4-氟苄基)哌嗪；
(trans)-1-((4-氯-2-(甘氨酰胺基)苯氧基)甲基)羰基-2，5-二甲基-4-(4-氟苄基)哌嗪；(2R)-1-((4-氯-2-(脲基)苯氧基)甲基)羰基-2-甲基-4-(4-氟苄基)哌嗪；(trans)-1-((4-氯-2-(脲基)苯氧基)甲基)羰基-2，5-二甲基-4-(4-氟苄基)哌嗪；(2R，5S)-1-((4-氯-2-(脲基)苯氧基)甲基)羰基-2，5-二甲基-4-(4-氟苄基)哌嗪；和(2R，5S)-1-((4-氯-2-(甘氨酰胺基)苯氧基)甲基)羰基-2，5-二甲基-4-(4-氟苄基)哌嗪。
在这组方法中，另一个优选的方法亚组中非肽类CCR1受体拮抗剂为(2R)-1-((4-氯-2-(脲基)苯氧基)甲基)羰基-2-甲基-4-(4-氟苄基)哌嗪。
在这一组方法中，优选的一类方法为需要治疗的哺乳动物为人。
在以上发明内容中所述及的治疗方法中，方法的优选组包括采用选自式(I)所示化合物的非肽类CCR1受体拮抗剂的方法 其中R1a为相互独立的一个或多个选自烷基或羟烷基的取代基；R2为4位的氟；R3为4位被氯取代且2位被氨羰基、脲基或甘氨酰胺基取代的苯基；R4为-O-；R5为亚甲基；R6为-C(O)-；其中化合物可为单一立体异构体或其混合物，或其一种药学可接受的盐。
在这组方法中，方法的优选亚组包含采用选自下列化合物的非肽类CCR1受体拮抗剂的方法(2R，5S)-1-((4-氯-2-(氨羰基)苯氧基)甲基)羰基-2，5-二甲基-4-(4-氟苄基)哌嗪；(trans)-1-((4-氯-2-(甘氨酰胺基)苯氧基)甲基)羰基-2，5-二甲基-4-(4-氟苄基)哌嗪；(2R)-1-((4-氯-2-(脲基)苯氧基)甲基)羰基-2-甲基-4-(4-氟苄基)哌嗪；(trans)-1-((4-氯-2-(脲基)苯氧基)甲基)羰基-2，5-二甲基-4-(4-氟苄基)哌嗪；(2R，5S)-1-((4-氯-2-(脲基)苯氧基)甲基)羰基-2，5-二甲基-4-(4-氟苄基)哌嗪；和(2R，5S)-1-((4-氯-2-(甘氨酰胺基)苯氧基)甲基)羰基-2，5-二甲基-4-(4-氟苄基)哌嗪。
在这组方法中，另一个优选的方法亚组中非肽类CCR1受体拮抗剂为(2R)-1-((4-氯-2-(脲基)苯氧基)甲基)羰基-2-甲基-4-(4-氟苄基)哌嗪。
在该方法亚组中，优选的一类方法为需要治疗的哺乳动物为人。
在该方法亚组中，优选的另一类方法包括非肽类CCR1受体拮抗剂和环孢菌素A同时地或顺序地对需要治疗的哺乳动物进行给药的方法。
C、本发明组合物的用途本发明的药物组合物适用于治疗哺乳动物、优选人的心脏移植排异反应。
已知环孢菌素A在心脏移植最初的一年中对于移植失败、急性排异和系统排异的治疗非常有效。但是，尽管对于慢性同种异体移植血管病变有效，长期使用环孢菌素A与副作用直接相关，其中包括肾毒性、高血压、糖尿病和移植后淋巴增生性疾病。
已知某些趋化因子或其受体活性的抑制对器官移植的动物模型有效。如上所述，在近期的大鼠肾脏移植研究中，当给予低剂量的环孢菌素A时，趋化因子受体拮抗剂Met-RANTES通过减少浸润单核细胞的数目可显著降低肾损伤，包括细胞间隙炎症的目的(Grne，H.J.等人，(1999)，同上)。在另一项研究中，在定向缺失CCR1基因小鼠的心脏移植模型中检测了CCR1受体的重要性(见Gao，W等人，(2000)，同上)。在该项研究中，同种异体移植存活的四个单独模型中CCR1(-/-)受体组显著延长了存活期。在其中一个模型中，对于CCR1(+/+)小鼠组几乎无效的环孢菌素A浓度在CCR1(-/-)受体组中却产生了同种异体移植的永久接受性。
这些研究所得出的有力证据支持了趋化因子RANTES通过CCR1受体起作用，在器官移植排异反应中扮演着重要角色的理论。本发明的非肽类CCR1受体拮抗剂显示出了抑制RANTES活性的作用。因此，本发明的非肽类CCR1受体拮抗剂适用于器官移植排异反应、特别是心脏移植排异反应的治疗。
如以下更为详细的讨论所述，本发明的非肽类CCR1受体拮抗剂与环孢菌素A联合使用时在哺乳动物心脏移植排异反应治疗中取得了令人意想不到的效果。具体而言，治疗有效剂量的非肽类CCR1受体拮抗剂和亚肾毒性剂量的环孢菌素A联合使用显示了既治疗心脏移植排异反应，同时又避免了不期望的环孢菌素A肾毒性的效能。
D、本发明化合物的测试为证明本发明非肽类CCR1受体拮抗剂通过作用于CCR1受体抑制趋化因子MIP-1α或RANTE的活性，本发明采用了几个此前已被提出的体外评价实验。参见，如第6,207,665号美国专利；Hesselgesser，J.等人，(1998)，同上；Ng，H.P.等人，(1999)，同上；Liang，M.等人，(2002a)，同上；以及Liang，M.等人，(2002b)，同上。
如实施例1所述，对于第6,207,665号美国专利中公开的一个非肽类CCR1受体拮抗剂，即(2R)-1-((4-氯-2-(脲基)苯氧基)甲基)羰基-2-甲基-4-(4-氟苄基)哌嗪，通过体外结合试验评价了与大鼠CCR1受体的结合能力，试验结果见附图1。置换结合研究的斯卡查德分析表明，该非肽类CCR1受体拮抗剂的亲和力为121±60nM(参见附图1)，与人CCR1受体(Kj=1nM)相比，对于大鼠CCR1受体其活性约低100倍。此外，该非肽类CCR1受体拮抗剂可以以相似的Kj值从大鼠CCR1受体上竞争性置换放射标记的RANTES。如以下实施例2和附图2所述的钙离子流试验所示，该非肽类CCR1受体拮抗剂可以作为大鼠CCR1受体的功能性体外抑制剂。由50nM MIP-1α所诱导出的细胞内Ca2+离子浓度的暂时性增加，可以通过100nM该非肽类CCR1受体拮抗剂(附图2中所示的“化合物”)与大鼠CCR1受体表达细胞的预温育而被抑制。这些数据表明，该非肽类CCR1受体拮抗剂对于大鼠CCR1受体的作用虽没有人CCR1受体强，该非肽类CCR1受体拮抗剂可以有效地竞争结合，在体外是一种大鼠CCR1受体的强效功能性拮抗剂。
如实施例3和附图3所示，对本发明非肽类CCR1受体拮抗剂进行了药代动力学研究。在1、4和7天的皮下给药中，非肽类CCR1受体拮抗剂血药峰浓度在12至27μM之间(参见附图3)。吸收相对快速，在药物暴露12分钟后即可观察到显著的血药浓度。8小时后血药浓度约为1至2μM。血药半衰期在2至3小时之间。虽然重复皮下给药未显示出促进非肽类CCR1受体拮抗剂清除或累积的迹象，在所有被测量的一天中药物吸收的速度和程度发生了明显的变化。这些研究表明为在24小时中获得足够的药物浓度，本发明非肽类CCR1受体拮抗剂皮下给药的剂量为50mg/kg，每天三次。
可以用于验证本发明药物组合物治疗哺乳动物心脏移植排异反应效能的体内试验是大鼠异种心脏移植排异模型(例如参见Nisco，S.等人，J.Immunol.(1994)，第152卷，3786-3792页；以及Ono，K.等人，J.Thorac.Cardiovasc.Surg.，(1969)，第57卷，225-229页)。本发明药物组合物在以下所述实施例4中的体内试验中进行了测试，试验结果如附图4所示。在这项试验中，相应于心脏移植排异反应程度减轻，在移植有ACI大鼠心脏的Lewis大鼠中观察到了同种异体移植存活时间的增加。仅给药非肽类CCR1受体拮抗剂，即(2R)-1-((4-氯-2-(脲基)苯氧基)甲基)羰基-2-甲基-4-(4-氟苄基)哌嗪(附图4中的“化合物”)时，动物同种异体移植平均存活时间由载体给药组(附图4中的“对照”)的6.8±0.8天增加至8.8±1.2天。与对照组平均存活时间相比，在0.05水平上经非肽类CCR1受体拮抗剂处理的动物的同种异体移植平均存活时间具有统计显著性，与对照组相比，对接受非肽类CCR1受体拮抗剂处理的动物存活时间进行对数秩分析，结果表明p＝0.0048。
进行试验，其中动物接受治疗有效剂量的非肽类CCR1受体拮抗剂，即(2R)-1-((4-氯-2-(脲基)苯氧基)甲基)羰基-2-甲基-4-(4-氟苄基)哌嗪以及亚肾毒性剂量(2.5mg/kg)的环孢菌素A处理。仅给药环孢菌素A的动物同种异体移植平均存活时间为7.3±0.5天(附图4中的“CS2.5”)，与之相对应，在相同用药方案中再加入非肽类CCR1受体拮抗剂进行处理则平均存活时间达17.5±5.9天(附图4中的“CS2.5+化合物”)。给药治疗有效剂量-10mg/kg环孢菌素A的动物同种异体移植平均存活时间为12.9±0.7天(附图4中的“CS10”)，与之相对应，在相同用药方案中再加入非肽类CCR1受体拮抗剂进行处理则平均存活时间达18.4±5.4天(附图4中的“CS10+化合物”)。与单独使用2.5mg/kg或10mg/kg环孢菌素A相比，2.5mg/kg或10mg/kg环孢菌素A与非肽类CCR1受体拮抗剂联合使用均可统计显著性地增加平均存活时间，p值分别为0.0009和0.0148。
下列实施例5和附图5中所述的浸润细胞的光学显微镜和免疫组织性检查进一步证实了这些存活时间数据。联合使用上述本发明非肽类CCR1受体拮抗剂与环孢菌素A进行治疗时(附图5中“化合物-环孢菌素A”)，移植3天后排异反应分值明显降低。在非免疫抑制移植中可以观察到致密的单核细胞浸润。许多心肌细胞出现空泡或坏死。细胞间质水肿明显。在环孢菌素A处理的大鼠中，炎性细胞浸润减少，但仍旧明显，主要集中于小静脉周围并伴随心肌细胞病灶性坏死。仅采用非肽类CCR1受体拮抗剂处理的大鼠显示出类似非免疫抑制移植中所观察到的形态学，单核细胞浸润明显。采用非肽类CCR1受体拮抗剂和环孢菌素A共同处理的动物心脏形态学得到了好的保护，仅出现零星的单核细胞浸润。在非免疫抑制移植中，致密的单核细胞浸润中许多细胞为单核细胞/巨噬细胞，它们与心肌细胞紧密并列排列。在环孢菌素A处理的大鼠中，炎性细胞浸润是病灶性的，并主要由ED-1阳性细胞构成。在采用非肽类CCR1受体拮抗剂处理的动物中，单核细胞浸润变化明显；在小静脉周围观察到中等密度的单核细胞浸润。联合使用非肽类CCR1受体拮抗剂和环孢菌素A处理导致单核细胞/巨噬细胞浸润进大鼠同种异体移植心脏的情况明显减少。基于这些研究的实验结果可以发现，与单独使用非肽类CCR1受体拮抗剂或环孢菌素A相比，联合使用非肽类CCR1受体拮抗剂和环孢菌素A在增加心脏移植排异反应疗效方面具有明显的协同效应。
虽然联合使用非肽类CCR1受体拮抗剂和环孢菌素A在心脏移植存活期增加方面具有明显协同效应，但仍然存在这样一种可能性，即由于药物/药物相互作用稳定了环孢菌素A的血药浓度，而不是由于药物的协同效应所产生的结果。在以下实施例6和附图6中叙述了有关药代动力学的研究，其中测量在非肽类CCR1受体拮抗剂即(2R)-1-((4-氯-2-(脲基)苯氧基)甲基)羰基-2-甲基-4-(4-氟苄基)哌嗪存在或不存在下大鼠中环孢菌素A的血药浓度。对时间-浓度曲线进行目视观察，发现非肽类CCR1受体拮抗剂处理(附图6中“化合物”)略微延长了环孢菌素A的半衰期。但是两组数据的统计学分析表明所计算的两个参数间不存在统计学显著性差异(对于AUC和T1/2来说，p值分别为0.224和0.317)。因此，在联合使用非肽类CCR1受体拮抗剂和环孢菌素A协同性显著增加心脏移植存活期这一现象中，药物/药物相互作用的机理可以被排除。
进行体外粘附和滚动(rolling)试验以确定是否单核细胞/巨噬细胞对同种异体移植心脏浸润的显著减少是因为或至少部分因为通过作用于CCR1受体抑制趋化因子的结果。之前的研究工作表明与外源性RANTES预温育30分钟后，单核细胞对结合RANTES的IL-1β激活的内皮细胞粘附增加(Grne，H.等人，(1999)，同上)。采用增加用量的本发明非肽类CCR1受体拮抗剂，即(2R)-1-((4-氯-2-(脲基)苯氧基)甲基)羰基-2-甲基-4-(4-氟苄基)哌嗪处理分离的人血单核细胞，按实施例7和附图7所述进行微血管内皮细胞粘附试验。单核细胞对于IL-1β激活的微血管内皮细胞经由RANTES介导的和抗剪切的粘附被非肽类CCR1受体拮抗剂剂量依赖性地抑制(附图7A中“化合物”)。进行滚动或维持滚动相互作用的单核细胞的百分比，与单核细胞捕获成反比，也被非肽类CCR1受体拮抗剂剂量依赖性地抑制(附图7B中“化合物”)。这些数据有力地说明了在治疗哺乳动物心脏移植排异反应中，非肽类CCR1受体拮抗剂和环孢菌素A具有真正意义上的协同效应。
E、本发明组合物的给药本发明的药物组合物可以采用类似应用中任何可接受的给药方式或剂型进行使用。因此，药物组合物可以例如以固体、半固体、冻干粉或液体剂型，如片剂、栓剂、丸剂、软弹性和硬质明胶胶囊、粉末、溶液、混悬液或气雾剂等剂型，经口、鼻、非肠胃、局部、透皮或直肠给药，其中优选方便于剂量精确控制的单元剂量剂型。这些组合物包含常规的药用载体或辅料以及作为活性成分的本发明的化合物，此外，组合物中还可包含治疗剂、药剂、载体、佐剂等。
一般地，依据预定的给药方式，药物组合物中包含约1重量％至99重量％的活性成分，即非肽类CCR1受体拮抗剂或其药学可接受的盐以及环孢菌素A，同时包含99重量％至1重量％的适用药用辅料。优选地，药物组合物中包含约5重量％至75重量％的活性成分，其余为适用的药用辅料。
优选的给药途径为口服，可采用常规的每日服药的给药方法，剂量依据心脏移植排异反应的严重程度可以进行调整。对于口服给药来说，本发明药物组合物可以通过添加一种或多种常用药用赋形剂，如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、预明胶化淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素醚类衍生物、葡萄糖、明胶、蔗糖、柠檬酸盐、没食子酸丙酯等构成。组合物可制成溶液、混悬液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、缓释制剂等剂型。
优选地，药物组合物可制成胶囊、囊片或片剂，因此可能还含有稀释剂如乳糖、蔗糖、磷酸二钙等；崩解剂如交联羧甲基纤维素钠及其衍生物；润滑剂如硬脂酸镁等；粘合剂如淀粉、阿拉伯树胶、聚乙烯吡咯酮、明胶、纤维素醚类衍生物等。
本发明的药物组合物也可以制成栓剂，如将约0.5％至约50％的活性成分置于在体内缓慢溶解的载体中进行制备，例如，所述载体可以是聚乙二醇(PEG)，如PEG 1000(96％)和PEG 4000(4％)。
将本发明药物组合物(约0.5％至约20％)和任选的药用佐剂通过例如溶解或分散等手段混入载体如水、生理盐水、糊精水溶液、甘油、乙醇等中构成溶液或混悬液，由此制备液体药物组合物。
如果需要，本发明药物组合物也可包含少量辅助性物质，如湿润剂或乳化剂、pH缓冲试剂、抗氧剂等，如柠檬酸、失水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、丁基化羟基甲苯等。
用于制备上述组合物的实际方法是众所周知的，或对于本领域技术人员来说是显而易见的；例如，可参见Remington′s PharmaceuticalSciences，18th Ed.，(Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania，1990)。为治疗心脏移植排异反应，所采用的药物组合物必须包含一种或多种药学可接受的辅料、有效治疗剂量的本发明非肽类CCR1受体拮抗剂和亚肾毒性剂量的环孢菌素A。
非肽类CCR1受体拮抗剂、优选为式(I)所示的非肽类CCR1受体拮抗剂的有效治疗剂量依据多种因素而变化，包括所采用的特定化合物的活性；化合物代谢稳定性和作用时间；病人的年龄、体重、健康状况、性别和饮食；给药的方式和时间；排泄速率；排异反应的严重程度以及接受治疗的宿主。一般而言，式(I)所示的非肽类CCR1受体拮抗剂的日有效治疗剂量在约0.14mg/kg至14.3mg/kg体重；优选为约0.7mg/kg至10mg/kg体重；最优选为约1.4mg/kg至7.2mg/kg体重。例如，对于体重70kg的人给药时，非肽类CCR1受体拮抗剂的日剂量范围为约10mg至1.0克；优选为约50mg至700mg；最优选为约100mg至500mg。
F、本发明组合物的制备依据第6,207,665号美国专利所述方法制备本发明的非肽类CCR1受体拮抗剂。
本发明的环孢菌素是一类中性亲脂性环状寡肽(11肽)，它们由真菌Tolypocladium inflatum Gams和其它一些不完全真菌产生。可以得到它们用于研究目的，两种环孢菌素A的制剂，Sandimmune和Neoral(Novartis)现用于治疗人体器官移植排异反应。
*****以下所提供的实施例可以作为实践本发明指南，它们不起到界定本实施例1体外试验非肽类CCR1受体拮抗剂的体外结合评价该试验证实了本发明非肽类CCR1受体拮抗剂，优选为式(I)所示的非肽类CCR1受体拮抗剂与大鼠CCR1受体结合的亲和性。
试剂和溶液趋化因子 MIP-1α和RANTES(Peprotech Inc.)细胞 鼠外周血液单核细胞(PBMC)，采用Accu-paqueTM(Accurate Chemical&Scientific Corp)密度离心从Lewis大鼠全血中分离得到。
配体 来自New England Nuclear的125I-MIP-1α和125I-RANTES(比活性分别为2200 Ci/mmol，25μCi/vial)被重新溶于1mL水中。
试验缓冲液130mM NaCl，5mM KCl，1mM MnCl2，50mMTris，30μg/mL杆菌肽，0.1％BSA，pH7.4。
洗涤缓冲液磷酸缓冲液(PBS)本发明的化合物化合物的储液为1mM的100％DMSO溶液。试验中最高浓度为10μM并且可依据化合物活性大小作调整。采用试验缓冲液从最高浓度开始按1∶3的稀释率顺序稀释。对于各化合物按典型方法筛选六种浓度以获得剂量曲线，以此确定Ki值。
试验步骤试验在总体积为100μL的96孔v型底微孔板上进行。
大鼠PBMC在PBS中洗一次并重新悬浮于试验缓冲液中，浓度约0.2至1.0×106细胞/mL。于4℃，在不同浓度未标记的MIP-1α、RANTES或化合物存在或不存在的条件下，将细胞与125I-MIP-1α和125I-RANTES温育30分钟。
如Hesselgesser等人，(1998)，(同上)所述，移出几等份细胞混悬液并使其离心通过二氧化硅/石蜡油混合物分离细胞以终止反应。
在100nM或1μM未标记MIP-1α或RANTES存在下，确定非特异性结合。典型地，试验中化合物的浓度按1∶3的稀释率稀释至10μM至30nM，对于活性更高的化合物依据其活性浓度还可以更低。
计算绘制各化合物的6点剂量曲线并采用计算机程序IGOR(Wavemetrics)对结合数据进行曲线拟合以确定亲和力和位点数目。
通过试验证明，本发明非肽类CCR1受体拮抗剂对大鼠CCR1受体的亲和力。
实施例2体外试验钙离子流非肽类CCR1受体拮抗剂的功能性体外试验由于CCR1受体通过转移细胞内游离钙离子对配体MIP-1α或RANTES的结合发生反应，因此可以通过采用荧光染料Fura-2的钙离子流试验测量其生物活性。在以下试验中测量了本发明非肽类CCR1受体拮抗剂阻断这种生物学效应的能力。
试验方法1)按实施例1中方法分离大鼠PBMC，离心沉淀，然后重新悬浮在Hanks Ca2+溶液(50mL Hanks，1.0mL 1M Hepes，1.6mL 500mM CaCl2，pH7.4)中。细胞在该介质中清洗两次。
2)将细胞重新悬浮于介质中，浓度为1.0×106细胞/mL，体系中同时存在最终浓度为1.25μM的Fura-2 AM(Molecular Probes)(将50μgFura-2溶于DMSO制备储液)。
3)于37℃，在不同浓度的本发明非肽类CCR1受体拮抗剂存在或不存在的条件下，将细胞温育30分钟。如上所述通过离心清洗细胞，除去游离的Fura-2。将细胞重新悬浮，浓度为1.0×106细胞/mL。然后将细胞等份(2.0mL)地转移到样品池中并置于PTI Deltascan Model 4000分光荧光仪中。细胞用50nM MIP-1α刺激，以时间为函数在分光荧光仪中测量Ca2+释放。
4)通过添加100μL的0.1％Triton X-100(用于最大值)然后添加100μL的500mM EGTA，pH 8.5(用于最小值)，将数据校正为nM Ca2+释放。
通过试验证明，本发明非肽类CCR1受体拮抗剂具有抑制响应于CCR1受体和MIP-1α结合而出现的Ca2+流动的能力。
实施例3体内试验Lewis大鼠的药代动力学研究试验中采用重量为200至250g无特定病原体的成年雄性Lewis(RT11)大鼠(Charles River，Boston)。
将环糊精(400g，Aldrich)加到1L灭菌塑料瓶中制备40％的环糊精溶液。加入仅含有氯化钠和氯化钾的未缓冲的盐水，将混合物振摇和混合过夜进行溶解。加入盐水使总体积达1L。通过0.45μm滤膜将溶液滤至灭菌瓶中，贴标签并于4℃下贮存。将化合物溶于40％环糊精盐水溶液中制备25mg/ml的化合物环糊精溶液。加入230μL浓盐酸后振摇混合液。混合液搅拌进行溶解。溶解完全后(1小时)测量溶液的pH并利用1M KOH将pH升至4.5。溶液滤过0.45μm滤膜并于4℃下贮存。
本发明非肽类CCR1受体拮抗剂以40％环糊精/盐水为药物载体，对大鼠皮下给药(s.c.)(剂量为50mg/kg，每天三次)共7天。在不同时间内心脏穿刺将血样收集在含EDTA的管中，离心，进行药物浓度分析之前将血浆冻存。
血浆样品通过HPLC-UV检测或HPLC-MS(在正离子操作模式下进行电喷雾)检测进行分析。采用化合物/血浆标准溶液绘制标准曲线并在同样条件下进行样品测试，检测本发明非肽类CCR1受体拮抗剂的浓度。分析中采用相关化合物作为内标。
HPLC-UV法1)将100μL血浆样品加到冰冷却的200μL含固定量内标的酸性甲醇(1％乙酸)中并混合均匀。
2)在5000g离心力下离心除去所得的蛋白沉淀，收集上清液。
3)进行平行实验，将不同量本发明非肽类CCR1受体拮抗剂加到对照血浆中，典型浓度为0.3至25μM之间，然后按上述方法进行处理。
4)在真空蒸发器中将上清液蒸干，采用1/2的甲醇/水溶液(含1.0％TFA)重新配样，涡旋混合30秒并离心除去沉淀。
5)所得上清液注入YMC AQ ODS反相柱中，以梯度淋洗的HPLC条件进行分析，流速为1.0ml/min。UV检测器波长设为230nm。
6)梯度淋洗条件为起始，溶剂A 22％/溶剂B 78％；2分钟，溶剂A 22％/溶剂B 78％；33分钟，溶剂A 45％/溶剂B 55％；37分钟，溶剂A 80％/溶剂B 20％；47分钟，溶剂A 80％/溶剂B 20％；47分钟，回到起始条件。
7)在标准曲线浓度范围内计算内标和化合物的峰面积比并采用峰面积比绘制标准曲线。通过计算化合物和内标的峰面积比从标准曲线上求取所测化合物的浓度。
HPLC-MS法1)实验方法类似上述方法，样品制备仅进行至乙醇沉淀步骤上，采用耗时较短的恒梯度法代替梯度淋洗法。
2)采用FISON VG单四极杆质谱仪，该仪器带有一个操作电压为3.57kV的电喷雾接口。采用YMC AQ ODS反相柱，流速1ml/min，流出液全部通过一个检测波长设在214nm的UV检测器。
3)对流出液进行分流，使50μL/min液体进入质谱仪。进样量为50μL，每个样品的色谱分析时间为7.5分钟。离子按单离子正离子化模式进行收集。
4)对离子流图峰面积(本发明非肽类CCR1受体拮抗剂和内标)进行积分，并如上所述绘制标准曲线，由此进行定量分析。
通过试验证明，在24小时中本发明非肽类CCR1受体拮抗剂的大鼠血药浓度被保持在一个适当的水平上。
实施例4体内试验异体心脏移植排异(Lewis或ACI大鼠)试验中分别采用重量为200至250g无特定病原体的成年雄性ACI(RT1a)和Lewis(RT11)大鼠(Charles River，Boston)作为供体和受体。利用Ono和Lindsay法(Ono，K.等人，(1969)，同上)的改良方法(Nisco，S.等人，(1994)，同上)将血管化的心脏异体移植入受体大鼠的腹腔中。在供体心脏的腔静脉和肺静脉连接后，将供体心脏的升主动脉和受体的腹主动脉，供体的肺动脉和受体的下腔静脉尾-壁吻合。每天触摸腹腔中的移植体以评价其功能，当触摸可感受到的心室收缩停止时认为排异反应达到完全。
将ACI大鼠心脏异体移植入Lewis大鼠腹腔中，对这些动物进行给药40％环糊精(皮下)，每天三次；50mg/kg本发明非肽类CCR1受体拮抗剂在40％环糊精中的溶液(皮下)，每天三次；环孢菌素A在橄榄油中的混合物(管饲)，10mg/kg，每天一次，共计四天；环孢菌素A在橄榄油中的混合物(管饲)，2.5mg/kg，每天一次，持续整个试验期间；环孢菌素A在橄榄油中的混合物(管饲)，10mg/kg，每天一次，共计四天，同时50mg/kg本发明非肽类CCR1受体拮抗剂在40％环糊精中的溶液(皮下)，每天三次；环孢菌素A在橄榄油中的混合物(管饲)，2.5mg/kg，每天一次，持续整个试验期间，同时50mg/kg本发明非肽类CCR1受体拮抗剂在40％环糊精中的溶液(皮下)，每天三次。在整个试验期间每天评价移植心脏的排异现象。
通过试验证明，当同时给药环孢菌素A时，本发明非肽类CCR1受体拮抗剂具有显著延长心脏移植存活期的功能。
实施例5体内试验组织学、免疫组织化学和形态测量在深度麻醉下将移植心脏取出，快速吸除血液，称重，然后按组织学和免疫组织化学的要求进行处理。将器官切成1mm的薄片，浸泡在4％甲醛/磷酸盐缓冲盐水(PBS溶液)(PBS99mM NaH2PO4，108mMNaH2PO4，248mM NaCl)中固定24小时，或浸泡在methacarn中固定8小时，然后包埋在石蜡中。切成厚度为3μm的片，过碘酸希夫碱或Goldner-Elastica染色后采用光学显微镜进行显微检查。在同种异体心脏移植3天后进行显微检查。
对于methacarn固定并包埋在石蜡中的组织(厚度为3μm)，采用ED-1单克隆抗体(Serotec/Camon)对单核细胞/巨噬细胞进行染色。采用碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶检测系统进行显色(Dako)。将不使用第一或第二抗体的对照进行负染色。在同种异体心脏移植3天后检测ED-1阳性单核细胞/巨噬细胞的免疫组织学染色。
依据Billingham的方法(Billingham，M.E.Cardiac transplantation，133-152页，Butterworths，Boston，1990)对同种异体移植大鼠心脏的排异反应进行组织病理学的分级。中等程度的急性排异(分值2)表现为中等密度的肌细胞周围单核细胞浸润，伴随某些肌细胞坏死。严重的急性排异(分值3)表现为致密的单核细胞浸润，伴随病灶性出血和肌细胞置换，有时还出现壁间动脉内皮细胞炎。对于每块组织进行排异反应打分，由于排异反应倾向于成病灶性，所以对于各移植心脏来说，排异反应分值为各块组织的平均值。
通过试验证明，当同时给药环孢菌素A时，本发明非肽类CCR1受体拮抗剂使得排异反应分值和移植体单核细胞浸润程度明显降低。
实施例6体内试验大鼠体内环孢菌素A血药浓度对于插管的Lewis大鼠(每组6只)分别给药环孢菌素A(Neoral Oral溶液，Sandoz，East Hannover，NJ)橄榄油稀释液，单次剂量为2.5mg/kg；或相同的环孢菌素A，单次剂量为2.5mg/kg，然后皮下注射50mg/kg本发明非肽类CCR1受体拮抗剂在40％环糊精中的溶液，每天三次。在给药后不同时间内收集全血，其中以EDTA作抗凝剂。采用用于检测环孢菌素的Cyclo-Trac SP全血放射免疫分析器(DiaSorin Stillwater，MN)，基本上按使用说明的要求进行血浆中环孢菌素A浓度的测量。在试验前对标准样、对照样和样品进行甲醇提取。将甲醇提取物与I125标记的环孢菌素示踪剂混合。将环孢菌素A特异性的鼠单克隆抗体和驴抗鼠抗体混合物一次性加入。温育1小时后，将试管离心，倾去上清液并进行计数。沉淀中放射活性与样品中环孢菌素A成反比。以结合程度对浓度的对数作图，利用四参数的对数曲线拟合程序得出校正曲线。通过校正曲线求取环孢菌素A浓度。
通过试验证明，本发明非肽类CCR1受体拮抗剂不明显影响环孢菌素A在大鼠全血中的清除半衰期。
实施例7体外试验单核细胞的粘附和滚动非肽类CCR1受体拮抗剂的功能性体外评价采用文献所述(Grne，H.J.等人，(1999)，同上，以及Weber，K.S.等人，Eur.J.Immunol.(1999)，第29卷，700-712页)的层流试验研究单核细胞和内皮细胞的相互作用。人表皮微血管内皮细胞在培养皿中生长融合，然后用10ng/ml IL-1β刺激12小时或不作处理。试验前将细胞与10ng/ml的RANTES温育30分钟。细胞片作为流通池平行的两个内壁中的下壁被安装于其中，并将流通池置于Olympus IMT-2倒置显微镜的载物台上，显微镜采用20或40倍的相差接物镜。采用尼可登高渗透梯度离心分离人血单核细胞并在试验用缓冲液(10mM HEPES，0.5％HASpH7.4)中重新悬浮，浓度为5×106细胞/ml。在试验前一刻将Mg2+和Ca2+浓度调整为1mM。试验期间细胞混悬液于37℃下保持在加热块中并以1.5dyn/cm2的速率灌入流通池中，时间为5分钟。为进行抑制试验，单核细胞与不同浓度的本发明非肽类CCR1受体拮抗剂或DMSO对照于37℃下预温育10分钟。对于JVC 3CCD摄像机和JVC SR 9000 E摄像记录器长时间累积所得的影像记录至少进行5点分析，对紧密结合的细胞进行计数。结果表示为细胞/mm2。低剪切力下滚动单核细胞的数目是一个与细胞粘附数目成反比的参数，可以在5分钟试验期的最后30s中进行测量，结果表示成分析范围内总相互作用的百分比。
通过试验证明，本发明非肽类CCR1受体拮抗剂抑制了单核细胞对活化内皮细胞的粘附，增加了进行或维持滚动细胞的百分比。
实施例8本实施例说明了用于口服给药的本发明代表性药物组合物的制备A.成分％wt/wt.
活性成分 20.0％乳糖 79.5％硬脂酸镁 0.5％将上述成分混合并分装至硬壳明胶胶囊中，每个胶囊100mg，每个胶囊约为一天的剂量。
B.成分％wt./wt.
活性成分 20.0％硬脂酸镁 0.9％淀粉 8.6％乳糖 69.6％PVP(聚乙烯吡咯烷酮)0.9％除硬脂酸镁外，将上述成分混合并采用水作为造粒用液体进行造粒。干燥后与硬脂酸镁混合，然后在适当的压片机中压片。
C.成分活性成分 0.1g丙二醇20.0g聚乙二醇400 20.0g多乙氧基醚1.0g水加至100ml将活性成分溶于丙二醇、聚乙二醇400和多乙氧基醚中。然后在搅拌下加入足够量的水以获得100ml溶液，过滤并装瓶。
D.成分％wt./wt.
活性成分 20.0％花生油78.0％Span 60 2.0％将上述成分融化、混合并装入软质弹性胶囊中。
E.成分％wt./wt.
活性成分 20.0％甲基或羧甲基纤维素2.0％0.9％生理盐水 加至100ml将活性成分溶于纤维素/盐水溶液中，过滤，装瓶待用。
实施例9本实施例说明了用于非胃肠道给药的本发明代表性药物组合物的制备成分活性成分 0.02g丙二醇 20.0g聚乙二醇40020.0g多乙氧基醚 1.0g0.9％生理盐水 加至100ml将活性成分溶于丙二醇、聚乙二醇400和多乙氧基醚中。然后在搅拌下加入足够量的水制成100ml静脉注射溶液，0.2μm滤膜滤过并在无菌条件下包装。
实施例10本实施例说明了用于栓剂的本发明代表性药物组合物的制备成分％wt./wt.
活性成分 1.0％聚乙二醇1000 74.5％聚乙二醇4000 24.5％将上述成分在蒸汽浴中一起融化、混合并倒入模具中，每个栓剂总重为2.5g。
实施例11本实施例说明了用于吹入剂的本发明代表性药物组合物的制备成分％wt./wt.
微粉化的活性成分 1.0％微粉化的乳糖 99.0％将成分研磨，混合并装入带有定量泵的吹入器中。
实施例12本实施例说明了气雾剂型的本发明代表性药物组合物的制备成分％wt/wt活性成分 0.005％水89.995％乙醇 10.000％将活性成分溶于乙醇中，然后与水混合并装入带有定量泵的雾化器中。
实施例13本实施例说明了喷雾剂型的本发明代表性药物组合物的制备成分％wt./wt.
活性成分 0.10％驱动剂11/12 98.90％油酸 1.00％将活性成分分散于油酸和驱动剂中，所得混合物灌入带有定量阀的气雾罐中。
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虽然结合具体的实施方案对本发明已经进行了描述，但应该认识到对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神实质和范围的条件下，对于本发明可以进行多种改变或存在等价品。此外，为了使特殊的环境、材料、物质组成、处理方法、步骤适应于本发明的目的、精神和范围，本发明也可进行多种变化。所有这些变化也包含在本发明的范围之内。
权利要求
1.一种用于治疗哺乳动物心脏移植排异反应的药物组合物，其包括药学可接受的赋形剂、治疗有效剂量的非肽类CCR1受体拮抗剂和亚肾毒性剂量的环孢菌素A。
2.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述非肽类CCR1受体拮抗剂为选自式(I)所示的化合物 其中R1a为相互独立的一个或多个选自烷基或羟烷基的取代基；R2为4位的氟；R3为4位被氯取代且2位被氨羰基、脲基或甘氨酰胺基取代的苯基；R4为-O-；R5为亚甲基；R6为-C(O)-；其中化合物可为单一立体异构体或其混合物，或其一种药学可接受的盐。
3.如权利要求2所述的药物组合物，其中所述非肽类CCR1受体拮抗剂选自(2R，5S)-1-((4-氯-2-(氨羰基)苯氧基)甲基)羰基-2，5-二甲基-4-(4-氟苄基)哌嗪；(trans)-1-((4-氯-2-(甘氨酰胺基)苯氧基)甲基)羰基-2，5-二甲基-4-(4-氟苄基)哌嗪；(2R)-1-((4-氯-2-(脲基)苯氧基)甲基)羰基-2-甲基-4-(4-氟苄基)哌嗪；(trans)-1-((4-氯-2-(脲基)苯氧基)甲基)羰基-2，5-二甲基-4-(4-氟苄基)哌嗪；(2R，5S)-1-((4-氯-2-(脲基)苯氧基)甲基)羰基-2，5-二甲基-4-(4-氟苄基)哌嗪；和(2R，5S)-1-((4-氯-2-(甘氨酰胺基)苯氧基)甲基)羰基-2，5-二甲基-4-(4-氟苄基)哌嗪。
4.如权利要求2所述的药物组合物，其中所述非肽类CCR1受体拮抗剂为(2R)-1-((4-氯-2-(脲基)苯氧基)甲基)羰基-2-甲基-4-(4-氟苄基)哌嗪。
5.如权利要求4所述的药物组合物，其中所述需要治疗的哺乳动物为人。
6.一种对需要治疗的哺乳动物给药药物组合物以治疗心脏移植排异反应的方法，其中所述组合物包括药学可接受的赋形剂、治疗有效剂量的非肽类CCR1受体拮抗剂和亚肾毒性剂量的环孢菌素A。
7.如权利要求6所述的方法，其中非肽类CCR1受体拮抗剂和环孢菌素A同时地或顺序地对需要治疗的哺乳动物给药。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述非肽类CCR1受体拮抗剂为选自式(I)所示的化合物 其中R1a为相互独立的一个或多个选自烷基或羟烷基的取代基；R2为4位的氟；R3为4位被氯取代且2位被氨羰基、脲基或甘氨酰胺基取代的苯基；R4为-O-；R5为亚甲基；R6为-C(O)-；其中化合物可为单一立体异构体或其混合物，或其一种药学可接受的盐。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述非肽类CCR1受体拮抗剂选自(2R，5S)-1-((4-氯-2-(氨羰基)苯氧基)甲基)羰基-2，5-二甲基-4-(4-氟苄基)哌嗪；(trans)-1-((4-氯-2-(甘氨酰胺基)苯氧基)甲基)羰基-2，5-二甲基-4-(4-氟苄基)哌嗪；(2R)-1-((4-氯-2-(脲基)苯氧基)甲基)羰基-2-甲基-4-(4-氟苄基)哌嗪；(trans)-1-((4-氯-2-(脲基)苯氧基)甲基)羰基-2，5-二甲基-4-(4-氟苄基)哌嗪；(2R，5S)-1-((4-氯-2-(脲基)苯氧基)甲基)羰基-2，5-二甲基-4-(4-氟苄基)哌嗪；和(2R，5S)-1-((4-氯-2-(甘氨酰胺基)苯氧基)甲基)羰基-2，5-二甲基-4-(4-氟苄基)哌嗪。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述非肽类CCR1受体拮抗剂为(2R)-1-((4-氯-2-(脲基)苯氧基)甲基)羰基-2-甲基-4-(4-氟苄基)哌嗪的方法。
11.如权利要求10所述的方法，其中需要治疗的哺乳动物为人。
12.一种治疗哺乳动物中心脏移植排异反应的方法，该方法包括向需要治疗的哺乳动物给药药物组合物，其中所述组合物包含一种或多种药学可接受的赋形剂、治疗有效剂量的非肽类CCR1受体拮抗剂和亚肾毒性剂量的环孢菌素A。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述非肽类CCR1受体拮抗剂是选自式(I)所示的化合物 其中R1a为相互独立的一个或多个选自烷基或羟烷基的取代基；R2为4位的氟；R3为4位被氯取代且2位被氨羰基、脲基或甘氨酰胺基取代的苯基；R4为-O-；R5为亚甲基；R6为-C(O)-；其中化合物可为单一立体异构体或其混合物，或其一种药学可接受的盐。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述非肽类CCR1受体拮抗剂选自(2R，5S)-1-((4-氯-2-(氨羰基)苯氧基)甲基)羰基-2，5-二甲基-4-(4-氟苄基)哌嗪；(trans)-1-((4-氯-2-(甘氨酰胺基)苯氧基)甲基)羰基-2，5-二甲基-4-(4-氟苄基)哌嗪；(2R)-1-((4-氯-2-(脲基)苯氧基)甲基)羰基-2-甲基-4-(4-氟苄基)哌嗪；(trans)-1-((4-氯-2-(脲基)苯氧基)甲基)羰基-2，5-二甲基-4-(4-氟苄基)哌嗪；(2R，5S)-1-((4-氯-2-(脲基)苯氧基)甲基)羰基-2，5-二甲基-4-(4-氟苄基)哌嗪；和(2R，5S)-1-((4-氯-2-(甘氨酰胺基)苯氧基)甲基)羰基-2，5-二甲基-4-(4-氟苄基)哌嗪。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述非肽类CCR1受体拮抗剂为(2R)-1-((4-氯-2-(脲基)苯氧基)甲基)羰基-2-甲基-4-(4-氟苄基)哌嗪。
16.如权利要求15所述的方法，其中需要治疗的哺乳动物为人。
17.如权利要求15所述的方法，其中非肽类CCR1受体拮抗剂和环孢菌素A同时地或顺序地对需要治疗的哺乳动物给药。
全文摘要
本发明涉及一种用于治疗哺乳动物心脏移植排异反应的药物组合物，其包括药学可接受的赋形剂、治疗有效剂量的非肽类CCR1受体拮抗剂和亚肾毒性剂量的环孢菌素A。
文档编号A61K38/13GK1655818SQ01813800
公开日2005年8月17日 申请日期2001年7月31日 优先权日2000年7月31日
发明者理查德·霍鲁克 申请人:舍林股份公司