专利名称：人类sars冠状病毒受体抑制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及人类SARS冠状病毒(本文以下称为SARS冠状病毒)受体的抑制剂，具体涉及人类SARS冠状病毒受体CD13/APN的抑制剂。
F23是抗CD13/APN单克隆抗体(鼠源性)，已知F23作用于CD13/APN活性点。CD13/APN主要是通过其N端酶学功能来调控某些活性信号蛋白。它可以灭活或激活某种多肽或蛋白，70％的白血病细胞表达这种CD13/APN。曾有人用F23作为抗肿瘤剂，如用于治疗白血病等(参见文献Xu Y，Scheinberg DA.，Elimination of human leukemia by monoclonal antibodies in anathymic nude mouse leukemia model.Clin Cancer Res 1995 Oct；1(10)1179-87)。
已有人发现，某些小分子化合物也可作为CD13/APN抑制剂。(参见文献Xu Y，Wellner D，Scheinberg DA.Cryptic and regulatory epitopes inCD13/aminopeptidase N.Exp Hematol 1997 Jun；25(6)521-9)。这些小分子化合物包括商品名为ACTINONIN、BESTATIN和AMASTATIN等的药物(可购自SIGMA公司)。
目前已知人类冠状病毒株229E的受体也是CD13/APN。(参见文献Yeager CL et al.Human aminopeptidase N is a receptor for human coronavirus229E.Nature 1992 Jun 4；357(6377)420-2)。但未见用CD13/APN抑制剂作为对抗人类SARS冠状病毒的药物。
本发明的技术方案是选择可与CD13/APN特异性结合的药物，从而阻断人类SARS冠状病毒结合到CD13/APN，以预防人类SARS冠状病毒进入人体。
所述可与CD13/APN特异性结合的药物包括F23以及ACTlNONIN、BESTATIN和AMASTATIN等小分子化合物。以上所述这些药物可称之为人类SARS冠状病毒受体抑制剂。
上述小分子化合物的化学名称是ACTINONIN(3-[[1-[(2-(Hydroxymethyl)-1-pyrrolidinyl)carbonyl]-2-methylpropyl]carbamoyl]octanohydroxamic acid)BESTATIN(N-[(2S，3R)-3-Amino-2-hydroxy-4-phenylbutyryl]-L-leucinehydrochloride)AMASTATIN((2S，3R)-3-Amino-2-hydroxy-5-methylhexanoyl-Val-Val-Asp hydrochloride)本发明进行了如下实验先将F23单抗及本发明所述的小分子化合物分别加入HL60(CD13/APN阳性人类细胞株)细胞培养液中，然后加入人类SARS冠状病毒，发现本发明提供的这些人类SARS冠状病毒受体抑制剂能有效地保护不受病毒感染。
反之，如果先将灭活的SARS冠状病毒加入HL60细胞株中，然后再加入F23单抗，则F23与HL60的结合率减少了90～95％。本发明提示SARS冠状病毒与F23是同一结合点。
以上实验证实1.CD13/APN是人类SARS冠状病毒进入人体时所需要通过的特异性受体，当人类SARS冠状病毒受体抑制剂进入人体后，能够特异性地结合在CD13/APN的活性中心。
2.小分子化合物(CD13/APN酶抑制剂)的结合点与F23是同一位点，均可结合至CD13/APN。
3.F23和CD13/APN酶抑制剂都能阻断人类SARS冠状病毒进入人体，作为治疗和预防SARS冠状病毒感染的药物。
本发明提供的人类SARS冠状病毒受体抑制剂能有效阻断SARS冠状病毒感染人类CD13/APN阳性细胞株，并能够有效阻断SARS冠状病毒结合至CD13/APN活性点。说明本发明提供的人类SARS冠状病毒受体抑制剂可作为一类新型的预防或治疗人类SARS冠状病毒感染的药物。
RAJICD13/APN阴性人类细胞株。
F23抗CD13/APN单克隆抗体(鼠源性)。
M195抗CD33单克隆抗体(鼠源性)。
ActinoninCD13/APN活性抑制剂，与F23竞争CD13/APN活性点(附论文Xu Y，Wellner D，Scheinberg DA.Cryptic and regulatory epitopes inCD13/aminopeptidase N.Exp Hematol 1997 Jun；25(6)521-9)。
GAM-FITC羊抗鼠荧光抗体，用于检测鼠抗体的含量，常用于流式细胞检测法中。实验材料来源HL60、RAJI、购买于美国ATCC组织；M195、F23，GAM-FITC由SCHEINBERG赠送；SARS冠状病毒来源于中国SARS感染病人咽分泌物。实施例1 F23和Actinonin阻断SARS病毒感染人类CD13/APN阳性细胞株1.实验方法将F23，Actinonin及M195分别加入HL60细胞培养液(RPMI)中30-60分钟，然后加入人类SARS冠状病毒，2-3天后在显微镜下观察HL60细胞存活数。
2.实验结果表1对人类CD13/APN阳性细胞株SARS病毒感染的阻断实验
3.结论F23及Actinonin可以保护CD13/APN阳性人类细胞株HL60免于受到SARS冠状病毒感染。并可证明人类SARS冠状病毒感染人细胞是通过CD13/APN而实现的。实施例2 SARS病毒感染人类CD13/APN阴性细胞株实验1.实验方法将F23及M195分别加入CD13/APN阴性人类细胞株RAJI细胞培养液(RPMI)中30-60分钟，然后加入人类SARS冠状病毒，2-3天后在显微镜下观察RAJI细胞存活数。
2.实验结果见下表表2 人类SARS冠状病毒CD13阴性的细胞株感染实验
3.结论人类SARS冠状病毒不感染CD13阴性的细胞株RAJI。实施例3 人类SARS冠状病毒与CD13/APN活性点结合实验1.实验方法先将人类SARS冠状病毒用钴60灭活，在4～6℃状态下，将病毒或空白加入HL60细胞株中30-45分钟，然后再加入F23或M195单抗，继续作用45-50分钟，用PBS液洗2次细胞，再加入GAM-FITC，30-45分钟，再用PBS液洗2次细胞，用流式细胞仪表读取HL60荧光强度。
2.实验结果见下表表3 人类SARS冠状病毒与CD13/APN活性点结合实验
3.结论从表中数据看出，病毒可以阻断F23的结合点，即CD13/ANP活性点。另外，从实验中可以看到，病毒不结合至CD33受体，即不阻断M195结合至CD33受体。这里用CD33受体作为CD13/APN的阴性对照组。从而论证SARS冠状病毒只结合至CD13/APN而且不结合至CD33对照受体。
由此证明人类SARS冠状病毒可以直接结合至CD13/APN的活性点，也即F23的CD13/APN结合点。
权利要求
1.人类N端氨基酶CD13/APN的特异性抑制剂在制备预防和治疗人类SARS冠状病毒药物中的应用。
2.权利要求1所述的人类N端氨基酶CD13/APN的特异性抑制剂是F23。
3.权利要求1所述的人类N端氨基酶CD13/APN的特异性抑制剂是ACTINONIN、BESTATIN和AMASTATIN。
全文摘要
本发明利用人类N端氨基酶CD13/APN的特异性抑制剂对人类SARS冠状病毒的受体的阻断作用，提供了一类新型作用机理的对抗SARS冠状病毒的药物，从而预防或治疗人类SARS冠状病毒的感染。
文档编号A61K38/43GK1466996SQ0313715
公开日2004年1月14日 申请日期2003年6月6日 优先权日2003年6月6日
发明者许洋, 许 洋 申请人:许洋, 许 洋