免疫偶联物的制作方法

专利名称：免疫偶联物的制作方法
技术领域：
本发明涉及哺乳动物血管内皮生长因子(VEGF)或其片段、类似物或衍生物的免疫偶联物，以及它们在治疗和预防与肿瘤血管发生有关的疾病中的用途。
VEGF是一种强促分裂原，可诱导血管发生(初始血管发生(vasculogenesis)和再生血管发生(angiogenesis))。初始血管发生是血管通过胚胎发生期间早期内皮细胞分化的从头发育。另一方面，再生血管发生是预先存在的血管通过新组织形成新的毛细血管。因此，VEGF在损伤的组织中发现，缺氧对VEGF的诱导随后导致血管发生，这是修复机制的一部分。VEGF也与绝经前妇女子宫内膜的每月循环再生有关。
天然VEGF证明在许多种(包括人和啮齿类动物)之间具有相当高的序列同源性。一般而言，它是一种糖蛋白，通过单一基因的多种备选剪接变体的二聚作用产生。121、165、189、206个氨基酸残基的多肽链已经鉴定(Houck，K.A.等人1996；Mol.Endocrinol.51806-1814)。其中已经证明121个氨基酸残基的同种型VEGF121是血管发生中最有效的分子。
我们现在发现，能够生产VEGF的衍生物，它们是强免疫原，能够在一种免疫治疗方法中使用，以治疗与肿瘤血管发生有关的疾病。具体而言，已经研制了VEGF的衍生物，其中一个或多个VEGF肽部分与载体(如蛋白质或多肽)偶联，形成一种免疫原性偶联物。该偶联免疫原在免疫的宿主中能够诱导可以结合天然VEGF并中和其作用的抗体。
因此，根据一个方面，本发明提供了一种免疫原性偶联物在生产药物中的用途，该偶联物含有与载体偶联的至少一种血管内皮生长因子肽部分，该药物用于治疗肿瘤，特别是肿瘤转移，例如通过血管化对抗肿瘤血管生成，从而通过限制转移控制癌症扩散。载体偶联的至少一种血管内皮生长因子肽部分，例如用于治疗或预防，特别是治疗肿瘤和肿瘤转移。
VEGF偶联物可以用来免疫患者对抗天然VEGF分子，使得该生长因子的活性被特异性抗生长因子或抗多肽抗体中和。
VEGF肽部分可以是任何肽部分，在体内不一定具有天然VEGF的生物活性，能够作为天然VEGF的一种免疫模拟剂，即在免疫学上模拟VEGF，以产生可以结合并且灭活VEGF分子的抗体。
这些肽部分可以包括天然VEGF序列通过单氨基酸或多氨基酸置换、添加或缺失的修饰，也包括氨基酸残基被化学修饰，但是保留VEGF免疫原活性的序列。这些功能(即免疫学意义上)相当的变体可以是自然的生物变异，或者可以用公知的标准技术制备，例如化学合成或修饰、诱变，例如定点或随机诱变等。关于修饰的重要特征是，VEGF肽保留作为天然VEGF的免疫模拟剂的能力。因此，例如，可以将一种氨基酸替换为另外一种氨基酸，后者保留VEGF肽或其表位的物理化学性质，例如在电荷密度、亲水性或疏水性、大小和构型方面，因此保留免疫结构。“添加”变体可以包括N端或C端融合，以及单氨基酸或多氨基酸的序列内插入。缺失可以是序列内缺失，或者可以是从N端或C端截短。如此处所用的术语“VEGF肽”包括所有天然VEGF肽及其功能相当的变体。
VEGF肽部分通常包含一种氨基酸序列，该序列与天然VEGF序列的全部或一部分(例如8-100个、更优选地10-30个、特别优选地12-25个氨基酸的部分)具有高度同源性，例如至少80％的同源性，优选地至少90％的同源性。特别优选地，它与天然VEGF序列的一部分具有这种高度同源性，该部分与该天然VEGF序列的一个糖基化位点重叠、邻接或邻近(例如在5个氨基酸残基以内)，特别是这样一个部分它包含以N端方向从这个糖基化位点起前12个氨基酸残基中的至少8个，更特别地，以N端方向从这个糖基化位点起前16个氨基酸残基中的至少12个。
最优选地，VEGF肽部分包含一种寡肽，该寡肽与以下SEQ ID No.1
最优选地，VEGF肽部分包含一种寡肽，该寡肽与以下SEQ ID No.1所示VEGF121的71-100片段的至少一部分高度同源(优选地100％同源)。
SEQ ID No.1TEESNITMQI MRIKPHQGQH IGEMSFLQHNVEGF肽部分优选地含有一种寡肽(T)a(M)b(Q)c(I)dMRIKPHQGQ(H)e(I)f(G)g(E)h(M)i(S)j(F)k(L)l(Q)m，其中a-m各自为0或1，但是a-c和f-m可以不是1，除非这样产生的序列对应于SEQ ID No.1的序列。e-g优选地是1，更优选地e-j是1。
VEGF肽部分优选地通过它的N末端与载体偶联。当通过C末端偶联时，优选地是至少14-mer，特别是包含序列HIGEM的那些。
VEGF肽部分适当地通过载体结合部分与载体偶联。作为偶联物的一种前体，可以制备一种VEGF衍生物，其含有与一种肽载体结合部分偶联的至少一种VEGF肽部分。这些衍生物构成本发明的另外一个方面。
根据另外一个方面，本发明提供了一种血管内皮生长因子衍生物，其含有与一种肽载体结合部分偶联的至少一种VEGF肽部分。
该载体结合部分作为一个工具，VEGF肽部分可以通过它与免疫载体连接，该载体通常是蛋白质或多肽，因而优选地含有一种氨基酸残基，该残基含有反应性侧链，利用标准偶联技术，VEGF肽部分可以容易地通过该侧链与该载体偶联。
有利地，这个侧链可以含有游离的羟基、羧基或巯基。因此这种氨基酸通常可以是半胱氨酸、酪氨酸、天冬氨酸或谷氨酸残基，或其衍生物，如N-乙酰半胱氨酸。
已经证明本发明的VEGF衍生物改进了与免疫载体的偶联，以用于诱导能够在免疫治疗中使用的抗体，在这点上这些衍生物比天然肽有优势。
载体结合部分可以呈在VEGF肽部分的N端或C端肽延伸的形式，或者从两个或多个VEGF肽部分之间的链片段下垂或在其中排列的肽的形式。
((A)-Xn)m-Lp-Y-[Lq(Xr-(A))s]t(I)其中A代表VEGF肽部分；X代表氨基酸；Y代表氨基酸，其含有一个侧链，其中含有游离的-SH、-OH或-COOH基；L代表有机接头，它能够在一个或多个位点处结合基团(A)-Xn)-，例如能够结合可达10个(A)Xn部分；n和r各自＝0-20；m和s各自为1，例如1-10，优选地1、2、3或4；p、q和t各自为0或1；限制条件是如果m＝2，则p＝1，或者如果s＝2，则q＝1。
优选地，A是一个12-mer到25-mer VEGF肽部分，其对应于SEQID No.1的一部分。X可以连接在VEGF肽部分的N端或C端，优选地连接在N端。
基团L可以是任一有机接头结构，然而优选地它是肽链，它可以是线性或分支的或单氨基酸残基，含有天然或合成氨基酸或假氨基酸的残基。然而，它也可以是以羧基或胺基为末端的树状或级联聚合物，例如分支的多胺。
当t＝0时，将看到通式(I)的化合物包括衍生物，其中载体结合部分(即X-Y或X-L-Y)连接在VEGF肽部分的N端或C端，成为简单的N端或C端延伸，或者其中多个VEGF肽部分与一个载体结合部分连接，终止于基团Y，例如成为树状阵列，或者其中VEGF肽部分附着于载体结合部分的多个位点处。
当t＝1时，将看到这些衍生物可以呈“二聚体”类型结构的形式，其中载体结合部分的载体结合基团Y排列于该衍生物的一个链片段内，即在两个或多个VEGF肽部分之间有效排列。
如果t＝1，而且L是氨基酸残基或肽链，则L可以是或者包含一个“链倒置”氨基酸或假氨基酸(即能够连接两个肽部分的一种化合物，例如二胺或二羟酸)，它是一种能够倒置或反转肽链的N端至C端方向的化合物。这种化合物因此通常包含两个氨基或两个羧酸基团，例如谷氨酸或-亚烷基二胺或-亚烷基二羧酸。此外优选地，当t＝1时，基团((A)-Xn)-的总数不超过8。
优选的通式(I)的化合物包括如下化合物其中n和r各自为0-10，优选地1-6，以及如下化合物其中m和s各自为8，优选地1、2或4。
基团X优选地代表一个氨基酸，其不含侧链或者含有一个烃基侧链(优选地烷基、C3-7环烷基或环烯基、C3-7环烷基-或环烯基-烷基、烷芳基、芳烷基或烷芳基烷基部分，其中每个烷基部分可以是饱和或不饱和的，含有可达6个碳，且每个芳基部分优选地是苯环)，特别优选地含有一个脂肪族侧链。甘氨酸、丙氨酸、-丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸是优选的，甘氨酸是特别优选的。
基团Y优选地是半胱氨酸、酪氨酸、谷氨酸或天冬氨酸或其衍生物，如N-乙酰-半胱氨酸。
基团L优选地含有至少一个氨基酸或假氨基酸残基，其含有至少两个胺或羧基，例如赖氨酸、精氨酸、谷氨酸或天冬氨酸，特别是当t＝0时。适当地，这种优选的基团L是线性或分支肽链，例如含有2-15个氨基酸残基。分支当然可以如下发生在氨基酸残基侧链的胺或羧基处，例如在赖氨酸或精氨酸的侧链胺基处，或者在天冬氨酸或谷氨酸的侧链羧基处形成肽键。含有一个或多个，例如1-3个赖氨酸残基的基团L是特别优选的。分支可以如下发生在赖氨酸的氨基和氨基处形成肽键。
优选的通式(I)的化合物因此包括通式(II)-(IV)的化合物(A)-Xn-Y (II)(A)-Xn-L-Y (III)((A)-Xn)m-L-Y(IV)(A)-Xn-L-Y-L-Xr-(A) (V)其中A、X、L、n和r如上所述，m＝2。
当通式(IV)的化合物含有1个以上的(A)基团时，它们优选地在同一末端连接，即，优选地全部都在N端或者全部都在C端连接。在通式(II)和(III)的化合物中，当X与作为VEGF肽的基团A在C端连接时，Y优选地是半胱氨酸。当X与A的N端连接时，Y优选地是N-乙酰-半胱氨酸。在通式(II)-(V)中，Xn或Xr各自优选地是1-6个甘氨酸残基的链。在通式(IV)的化合物中，m优选地是2或4。在通式(III)-(IV)中，L优选地是赖氨酸、-lys-(X)u、-lys-lys-(X)u或-lys-lys-(X)u-lys。其中u是0-10，优选地0-6，X是如上所述的氨基酸。因此，优选的通式(IV)的化合物是通式(VI)和(VII)的化合物 其中A、X、Y、n和u均如上所述，K是赖氨酸。
在通式(V)的“二聚体型”衍生物中，VEGF肽部分可以是VEGF肽的“反转”或“倒置”序列变体，即一种VEGF肽，其中组成氨基酸的顺序反转。
根据本发明的代表性VEGF衍生物包括A-(Gly)1-6-Cys；N-乙酰-Cys-(Gly)1-6-A；
(A-(Gly)1-2-部分可以与-氨基或氨基基团键合) A1-(Gly)1-6-Cys-(Gly)1-6-A；N-乙酰-Cys-Ala-AN-乙酰-Cys-(Ala)4-AN-乙酰-Cys(Gly)6-AN-乙酰-Cys-Gly-Ala-Gly-Ala-A
(A)-Gly Cys(A)-Cys(A)-TyrN-乙酰-Cys-(A)Tyr-(A)N-乙酰-Cys-Gly-(A)Cys-(A)其中A是VEGF，A′是倒置或反转的VEGF序列。
尽管甘氨酸是优选的，但是也可以用脂肪族侧链氨基酸代替上述通式中的一个或多个Gly残基。
尽管通过计算机辅助能量最低化模建检查，通常认为本发明的肽衍生物太小，以至单独时没有最佳免疫原性，但是已经发现，当通过载体生物太小，以至单独时没有最佳免疫原性，但是已经发现，当通过载体结合部分与一种载体偶联时，这些肽衍生物引发强烈且可能具有保护性的免疫应答。它们的偶联物因此特别适合在对抗肿瘤血管发生的免疫治疗中使用。不希望被理论所束缚，可以认为肽与载体通过载体结合部分偶联产生与天然VEGF序列基本具有相同构象的衍生物。
根据本发明的新衍生物可以利用大量标准技术产生，对于肽，包括Merrifield固相法，其中向与固体基质连接的成长多肽上逐步添加氨基酸(Merrifield，R.B 1962；Fed.Proc.Amer.Soc.Biol.21412和Merrifield，R.B.1963；Jour.Amer.Chem.Soc.852149)，以及常规FMOC化学法。希望时，在链合成期间，成长链中的氨基酸的反应性侧链基团可以受到保护。分支结构可以用类似的技术制备。
当新衍生物是线性肽时，它们也可以利用本领域公知的技术，通过重组DNA表达制备，如Sambrook等人，《分子克隆实验手册》，第二版，1989所述。
因此，本发明也提供编码本发明的VEGF肽衍生物的一种核酸分子，和与之序列互补的核酸分子。
根据本发明的另外一个方面，我们提供了一种表达载体，其含有本发明的核酸分子。这种载体可能适合在以下宿主中表达微生物，可以是原核或真核生物，例如大肠杆菌或酵母，或者植物或动物，例如哺乳动物细胞。
本发明的衍生物与载体的偶联可以利用本领域公知的方法实现，例如用异双功能交联剂处理。当通过末端半胱氨酸(或N-乙酰半胱氨酸)偶联时，连接剂可以是间马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基磺基琥珀酰胺酯；在此情况下，马来酰亚胺修饰肽载体中的一个或多个赖氨酸侧链，在末端半胱氨酸残基处形成硫醚键。也可以使用本领域公知的其它偶联试剂，例如碳二亚胺偶联。
可以使用本领域公知用于这些用途的任何载体，包括结核菌素、破伤风类毒素、白喉类毒素、匙孔血蓝蛋白、谷胱甘肽S-转移酶或其衍生物的纯化的蛋白质衍生物。
物也可以利用重组DNA方法制备，其中编码该偶联分子的核酸分子在适当的宿主细胞中表达。
本发明的新VEGF偶联物可以在一种免疫治疗方法中使用，治疗与血管生成活性和/或VEGF水平正常或升高有关的疾病，这是优于当前可用的方法的一种方法。患者顺应性应当提高，因为施用频率低于使用现有治疗的情况，且可以避免不希望的副作用。
因此根据另外一方面，本发明提供一种药物组合物，其含有根据本发明的VEGF偶联物，以及一种或多种药学可接受的载体或赋形剂。
根据另一方面，本发明提供一种根据本发明的VEGF偶联物，用于治疗或预防。
根据另外一方面，本发明提供一种治疗人或非人(例如哺乳动物)患者的肿瘤的方法，包括对该患者施用有效量的根据本发明的VEGF偶联物。
因此可以利用该方法控制形成的肿瘤的血管形成，并阻止癌症通过转移扩散。
在一个实施方案中，本发明的方法是一种针对转移免疫的方法，即不需要在患者中检测到转移。在该实施方案中，当检测到肿瘤时，例如在确定为恶性肿瘤之前，或许在开始或已经结束对检测的肿瘤的治疗(例如化学治疗、手术或放射治疗)之前，可以施用该偶联物。
VEGF偶联物可以通过任何常规方法施用，包括肠胃外(例如腹膜内、皮下、肌肉内、皮内，例如以惰性颗粒的形式，如吸附了该衍生物的金丸或珠，它们可以被加速，从而足以使它们能够穿透患者的皮肤，或者静脉内)、局部(例如作为乳膏对皮肤施用)、关节内、粘膜(例如经口、经鼻、经阴道、经直肠及通过眼内途径)或者通过肺内施用，例如借助用来对肺和支气管系统直接输送药物的装置，如吸入装置和雾化器，并且按照常规药学方法任选地与一种或多种药学可接受的载体或赋形剂一起配制，如Gennaro编著的《Remingtons药学》，Mack PublishingCompany，Pennsylvania，USA(1990)所述。
这些组合物适当地配制为单位剂型，例如用于粘膜、肠胃外或经口施用。
实际治疗方案或预防方案、制剂和剂量在很大程度上取决于个体患者，可由医生根据个体情况计划。
制剂类型应当适合施用途径。例如，偶联的类似物在PBS、盐水或注射用水中的无菌水悬液，任选地与一种或多种免疫佐剂(例如氢氧化铝、皂苷、quil A、胞壁酰二肽、矿物油或植物油、基于囊泡的佐剂、非离子嵌段共聚物或DEAE葡聚糖)一起，通过皮下或肌肉内注射肠胃外施用。也可以使用其它成分，如防腐剂。
注射剂量可以是1-100μg肽相当物，施用频率可以从每3个月或6个月一次，到每年一次或每5年一次。
为了经口施用，偶联的衍生物可以配制为片剂、液体、胶囊等。剂量为1-1000μg肽相当物，根据产品的生物利用度以一定的间隔施用。
根据另外一个方面，本发明提供一种方法，用于在人或非人患者中获得最大VEGF阻断，相当于或者超过化学或放射治疗获得的，该方法包括对该患者施用有效量的一种根据本发明的VEGF偶联物。
此外，本发明的VEGF偶联物也可以对女性或雌性非人哺乳动物施用，作为一种避孕方法，或者治疗子宫内膜异位症。这些用途、方法等是本发明的另外一些方面。
现在通过下列非限制性实施例，参照实验数据，更详细地描述本发明，其中表2显示每个血清采样日的抗体滴度+/-sem(稀释度对应于OD值升高0.1)；鼠模型对照组。
A组＝接种铝胶/盐水安慰剂。
B组＝接种VEGF 6疫苗。
C组＝接种VEGF 7疫苗。
D组＝接种VEGF 8疫苗。
E组＝接种VEGF 9疫苗。
表3显示施用黑素瘤细胞后，每种VEGF疫苗对鼠模型肺重量的影响。
表4显示每种VEGF疫苗对鼠模型肺中黑素瘤集落发展的影响。
表2、3、4用由下列衍生物制备的免疫原产生N-乙酰-VEGF 6-Gly-CysN-乙酰-Cys-Gly-VEGF 7N-乙酰-VEGF 8-Gly-CysN-乙酰-Cys-Gly-VEGF 9VEGF 6、7、8、9分别含有SEQ ID Nos.2-5的序列。
SEQ ID No.2TMQIMRIKPHQGQHIGEMSSEQ ID No.3TMQIMRIKPHQGQSEQ ID No.4TMQIMRIKPHQGQSEQ ID No.5MRIKPHQGQHIGEMS实施例1肽的产生肽根据Fmoc固相肽合成策略用Protein Technologies，Symphony肽合成仪合成。使用的树脂是含有Rink酰胺接头的Tentagel S-NH2。对于Cys、His、Asn和Gln，使用的Fmoc氨基酸的侧链保护基是Trt，对于Tyr、Thr、Asp、Glu和Ser是tBu；对于Lys是Boc，对于Trp是吲哚N，对于Arg是Pmc。羧基的活化利用TBTU/HOBt/DIPEA实现，所有偶联都在DMF中进行。Fmoc基团的脱保护使用溶于DMF的20％哌啶完成。使用溶于TFA的5％茴香醚/5％苯甲硫醚/5％EDT/3％水/2％TES，经1小时，从树脂上切下肽。使用Waters Deltaprep 4000上的40mm×210mm Deltapak C18径向压力柱，通过RP-HPLC纯化这些肽，并且使用Kratos Maldi 3通过MALDI-TOF并且通过AAA表征。
对于树状聚合物Fmoc，用上述方法连接Lys(Fmoc)-OH，产生自由肽延伸的氨基。因此必须提高使用的Fmoc氨基酸的量。
Rink酰胺接头＝对-[(R，S-[1-(9H-芴-9-基)-甲氧基甲酰胺基]-2，4-二甲氧基苄基]-苯氧基乙酸Fmoc＝9-芴基甲氧羰基Trt＝三苯甲基tBu＝叔丁基Boc＝叔丁氧羰基Pmc＝2，2，5，7，8-五甲基色满-6-磺酰基TBTU＝2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸HOBt＝N-羟基苯并三唑DIPEA＝二异丙基乙胺DMF＝N，N-二甲基甲酰胺EDT＝二巯基乙烷(Ethanedithiol)TES＝三乙基硅烷TFA＝三氟乙酸RP-HPLC＝反相高效液相层析MALDI-TOF＝矩阵辅助的激光解吸电离-飞行时间AAA＝氨基酸分析Fmoc-Lys(Fmoc)-OH＝二-9-芴基甲氧羰基赖氨酸以这种方法合成下列肽(1)N-乙酰-VEGF 6-Gly-CysAc-TMQIMRIKPHQGQHIGEMSGC-NH2(2)N-乙酰-Cys-Gly-VEGF 7Ac-CGTMQIMRIKPHQGQ-NH2(3)N-乙酰-VEGF 8-Gly-CysAc-TMQIMRIKPHQGQGC-NH2(4)N-乙酰-Cys-Gly-VEGF 9Ac-CGMRIKPHQGQHIGEMS-NH2
实施例2偶联程序向匙孔戚血蓝蛋白(KLH)在磷酸缓冲液(PBS)中的溶液中加入150摩尔过量的S-MBS，间马来酰亚胺基苯甲酰-N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯，在密封瓶中在20-25℃下搅拌0.5小时。
在PBS中通过层析除去过量的S-MBS交联剂(使用G-25 Sephadexcourse matrix凝胶排阻)。收集活化KLH峰，测定游离马来酰亚胺基，如下所述使用。
向获得的KLH载体蛋白溶液中加入2倍摩尔过量的VEGF衍生肽。获得的溶液在密封容器中在2-8℃下搅拌可达2小时。
如上所述通过凝胶排阻层析从游离肽中纯化该偶联物。
将终偶联物稀释为使用浓度，如希望地配制。
按照该程序，实施例1的VEGF衍生物(1)-(4)分别与活化KLH等份偶联。
实施例3免疫研究实施例1的4种VEGF衍生物如实施例2所述分别与KLH等份偶联，配制方法是吸附于在生理盐水(0.9％(w/v))载体中的0.4％(w/v)氢氧化铝凝胶上(铝胶，Superfos s/a，丹麦)。所有偶联物均作为25μg/ml肽相当物溶液使用。在5个处理组中使用C57BL/6小鼠，每组23只小鼠。处理组接受A组铝胶/盐水安慰剂疫苗0.2ml/小鼠。
B组N-乙酰-VEGF 6-Gly-Cys，每只小鼠5μg肽相当物/衍生物免疫治疗剂，在0.2ml疫苗中。
C组N-乙酰-Cys-Gly-VEGF 7，每只小鼠5μg肽相当物/衍生物免疫治疗剂，在0.2ml疫苗中。
D组N-乙酰-VEGF 8-Gly-Cys，每只小鼠5μg肽相当物/衍生物免疫治疗剂，在0.2ml疫苗中。
E组N-乙酰-Cys-Gly-VEGF 9，每只小鼠5μg肽相当物/衍生物免疫治疗剂，在0.2ml疫苗中。
施用途径为皮下途径，在研究过程中每只小鼠接受3个独立剂量的指定的试验样品。在施用的每天和研究终止时记录每只小鼠的体重。
实验程序在第-50天，随后在第-28天和第-7天，小鼠单次皮下施用载体，或试验样品。在研究的第-1天和+14天制备血清进行分析。
通过心脏穿刺将每种血样收集到血清试管中，使之凝结，然后在采样45分钟内离心，产生血清。
血清标本尽可能快地冷冻于大约-20℃下。
表1研究程序的时间表
通过利用酶联免疫吸附测定(ELISA)滴定血清中存在的抗VEGF肽抗体，测定每个血清标本中由于处理引起的抗体应答产生。
该测定如下进行用100μl在PBS中稀释的检测底物，例如N-乙酰-VEGF6-Gly-Cys-BSA(10μg肽相当物/孔)，包被96孔Nunc Maxisorp微量滴定板，20-25℃1小时。同时向不同的孔中加入100μl PBS，作为底物空白。
用200μl磷酸缓冲液(PBS)/0.1％Tween 20洗板3次。
用PBS/0.1％Tween 20稀释血清标本至适当的稀释度。稀释度一般为i)1/100-5μl小鼠血清+495μl PBS/0.1％Tween 20ii)1/1000-20μl(i)+180μl PBS/0.1％Tween 20iii)1/2000-10μl(i)+190μl PBS/0.1％Tween 20
iv)1/5000-4μl(i)+196μl PBS/0.1％Tween 20将适当稀释的血清(100μl)加入适当的孔中，20-25℃温育1小时，使底物与抗体结合。
用200μl PBS/0.1％Tween 20洗板3次。
用PBS/0.1％Tween 20以1∶5000稀释兔抗小鼠IgG过氧化物酶偶联物，即1μl IgG过氧化物酶+5ml PBS/0.1％Tween 20。其结合小鼠血清抗体，并且使得抗体可以检测。
将100μl稀释的IgG过氧化物酶加入适当的孔中，在20-25℃下放置45分钟。
用200μl PBS洗板3次。
将250μl等份过氧化物酶底物3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)加至含有4μl 30％过氧化氢的25ml 0.1M乙酸钠缓冲液pH5.5中。
将制备的100μl TMB底物加入适当的孔中，包括空白孔。发生显色反应，其中发生抗体/底物结合。在20-25℃下放置15分钟，然后向每孔中加入50μl 10％硫酸终止反应。
读取平板在405nm下的吸光度，这是过氧化物酶在TMB底物上的反应产生的，它与第一(抗VEGF)抗体键的量成正比。用统计学软件包(SAS研究所，1997)分析获得的吸光度读数，测定滴度。
表2每个血清采样日的抗体滴度(+/-sem)
对于第-1天的数据，n＝3，对于第14天的数据，n＝20。
与抗体滴度数据平行，检测所有动物在体重、呼吸困难和全身表现方面的总体生理学改变，作为毒性或有害影响的全面评价。
所有处理组均未记录到不良反应，表明VEGF处理在产生抗VEGF抗体方面有效，而在动物中没有有害的生理学效应。
实施例4鼠抗转移研究为了评价VEGF免疫治疗疫苗的抗转移能力，如此处所述处理实施例3所述的接种小鼠。另外，平行处理既不接受疫苗也不接受安慰剂的另外一组小鼠，作为鼠模型对照组。
实验程序在研究的第0天，每只小鼠均静脉内注射0.1ml B16/F10黑素瘤细胞悬液。在研究的第14天杀死小鼠，从每只小鼠中取出肺。肺称重，之后在布安氏液中固定，以显示施用B16/F10细胞产生的所有黑素瘤集落。固定后，计数来自每只小鼠的肺表面存在的集落数量。
表3施用B16/F10黑素瘤细胞后，每种VEGF疫苗处理对鼠肺重量的影响
数据表示为平均值±sem(n＝19-20)。
*与处理组A相比。
表4施用B16/F10黑素瘤细胞后，每种VEGF疫苗对鼠模型肺集落计数的影响
数据表示为平均值±sem(n＝19-20)。
*P＜0.05，**P＜0.01，使用Kruskal-Wallis和Dunn′s检验，与处理组A相比。
表2根据报告的滴度结果证明了抗VEGF6、抗VEGF7、抗VEGF8和抗VEGF9 IgG分子的分别明确的产生。这表明研究的疫苗引起对靶肽的主动免疫，通过与对照处理组A比较证实了这一点，对照处理组A只用安慰剂免疫，产生的抗VEGF肽滴度为0。
表3证明用VEGF偶联物免疫的所有组的肺重量均增加。与鼠模型对照组相比，证实疫苗处理的B、C、D组肺重量增加可达15％。同时，与既不接受疫苗也不接受安慰剂的鼠模型对照相比，免疫的安慰剂对照组显示肺重量增加极少。
表4证明，与只用疫苗安慰剂处理的安慰剂组(A组)相比，用VEGF偶联物免疫的组的肺黑素瘤集落计数降低超过三分之一。对于用含有VEGF8和VEGF9的疫苗处理的组，集落计数降低最大，表明转移得到最佳控制，也是统计学显著的。
在研究的第14天，所有VEGF疫苗处理组都有良好的抗VEGF肽IgG滴度。但是，用制剂VEGF8和VEGF9免疫后产生的IgG证明了明显控制肿瘤扩散的不同的内在能力。这强调了针对肽VEGF8和VEGF9的IgG分子可能具有最强的控制肿瘤转移的活性。这些数据证明，在这些研究使用的鼠模型上，针对肽VEGF8和VEGF9的IgG分子与天然VEGF特异性相互作用。
权利要求
1.一种免疫原性偶联物，其含有与载体偶联的至少一种血管内皮生长因子(VEGF)肽部分。
2.根据权利要求2的偶联物，其用于治疗或预防。
3.如权利要求1或2之一所述的偶联物，其用于治疗肿瘤和肿瘤转移。
4.如上述权利要求中任何一项所述的偶联物，其中所述VEGF肽部分含有一种氨基酸序列，该序列与天然VEGF序列的全部或一部分具有至少80％同源性。
5.如权利要求4所述的偶联物，其中天然VEGF序列的该部分是8-100个氨基酸的部分。
6.如权利要求4所述的偶联物，其中天然VEGF序列的该部分是12-25个氨基酸的部分。
7.如权利要求4所述的偶联物，其中所述同源性程度是与天然VEGF序列的与糖基化位点重叠、邻接或邻近的部分。
8.如权利要求7所述的偶联物，其中该部分包含以N末端方向从所述糖基化位点起前16个氨基酸残基中的至少12个。
9.如上述权利要求中任何一项所述的偶联物，其中所述VEGF肽部分含有一种寡肽，该寡肽含有SEQ ID No.1TEESNITMQIMRIKPHQGQH IGEMSFLQHN的至少一部分。
10.如上述权利要求中任何一项所述的偶联物，其中所述VEGF肽部分含有下式的寡肽(T)a(M)b(Q)c(I)dMRIKPHQGQ(H)e(I)f(G)g(E)h(M)i(S)j(F)k(L)l(Q)m其中a-m各自为0或1，但是a-c和f-m可能不是1，除非这样产生的序列对应于SEQ ID No.1的序列e-g是1。
11.如权利要求10所述的偶联物，其中e-j是1。
12.如上述权利要求中任何一项所述的偶联物，其中所述VEGF肽部分通过其N末端与载体偶联。
13.如上述权利要求中任何一项所述的偶联物，其中所述载体选自结核菌素、破伤风类毒素、白喉类毒素、匙孔血蓝蛋白、谷胱甘肽S-转移酶及其衍生物的纯化的蛋白质衍生物。
14.如权利要求1-13中任何一项所述的免疫原性偶联物用于生产治疗肿瘤的药物的用途，其中所述免疫原性偶联物含有与载体偶联的至少一种血管内皮生长因子肽部分。
15.一种血管内皮生长因子衍生物，其含有与肽载体结合部分偶联的至少一种VEGF肽部分。
16.一种核酸分子，其编码根据权利要求15的血管内皮生长因子衍生物，该衍生物含有与肽载体结合部分偶联的至少一种VEGF肽部分，以及含有与之互补的序列的核酸分子。
17.一种表达载体，其含有根据权利要求16的核酸分子。
18.一种药物组合物，其含有根据权利要求1-13中任何一项的偶联物，以及一种或多种药学可接受的载体或赋形剂。
19.一种治疗人或非人患者的肿瘤的方法，包括对该患者施用有效量的如权利要求1-13中任何一项所述的偶联物。
20.在人或非人患者中获得最大VEGF阻断的一种方法，这种阻断相当于或者超过化学或放射治疗获得的阻断，该方法包括对该患者施用有效量的根据权利要求1-13中任何一项所述的VEGF偶联物。
全文摘要
本发明涉及一种免疫原性偶联物，其含有与载体偶联的至少一种血管内皮生长因子(VEGF)肽部分。
文档编号A61K38/18GK1675241SQ03818573
公开日2005年9月28日 申请日期2003年6月17日 优先权日2002年6月17日
发明者J·格洛弗, M·唐哈姆, A·罗舒尔, D·斯潘塞, I·哈格雷夫 申请人:普罗塞瑞克斯公开公司