专利名称:重组牛痘病毒的制作方法
本发明涉及一种重组牛痘病毒，更具体地说，涉及一种通过用减毒的利斯特(Lister)温度敏感突变牛痘病毒菌株作为载体而得到的重组牛痘病毒，这种菌株在兔肾细胞中不具有高温生长性，并在受精卵的绒毛尿囊膜上具有小的痘疱尺寸。
近年来，已经发明了一个插入异源DNA的构建重组牛痘病毒的方法，并建议了用插入，例如编码传染病病原体抗原的DNA作为异源的DNA来构建的重组牛痘病毒用作活疫苗的方法(例如USP4，603，112，WO84/02077，等)。
该方法是按照例如下面的步骤(见图1)来实现的。首先，用限制性内切酶从对牛痘病毒生长非主要的一个DNA区中切出适当的DNA，并插入到一个质粒中以制备一个第一重组质粒。然后，把异源的DNA插入到该重组质粒的牛痘病毒的DNA部分来制备一个第二重组质粒。
另一方面，制备事先用牛痘病毒感染了的动物细胞，并把第二重组质粒导入到该动物细胞中，由此在该感染动物细胞中引起了牛痘病毒和第二重组质粒之间的同源重组，并产生了一个具有该异源的DNA导入其中的重组牛痘病毒(例如，上面提到过的那些现有技术文献，Cell Technology vol.2，NO.9，P.84-87(1983)，等)。
按照该方法，根据不同的用途可插入各种各样异源的DNA，并且该方法作为生产活疫苗的新方法很有用。
然而，在常规方法中使用的牛痘病毒大多是WR株(上面提到过的现有技术文献，Journal of virology 49，857-864(1984)，等)，但由于这些牛痘病毒经常会发生像脑炎或脑病以及进行性牛痘这样一些严重的接种后的并发症，所以出于安全的观点，它们很难用于实践。
因此，本发明人为了开发一种安全的活疫苗进行了研究，结果发现利用一种减毒的利斯特温度敏感突变株(即一种在兔肾细胞中不具有高温生长性并在受精卵的绒毛尿囊膜上具有小痘疱尺寸的减毒的利斯特温度敏感的突变牛痘病毒菌株)来代替WR株作为载体是很有效的，并在以前已申请过专利(日本专利申请号18590/85)。
但是，尽管通过这种方法获得的重组体在安全方面是很满意的，但它在表达效率上是不足的，这是因为插入在该牛痘病毒基因组中的异源DNA是处在该牛痘病毒的非主要DNA区固有的启动子控制之下。上述的重组体已发现是有缺点的，特别是由于在将它接种到实验的哺乳动物上时，很难得到一种通过该异源DNA编码的蛋白质引起的免疫作用。
本发明的一个目的是要通过将彼此邻接的具有启动子功能的DNA和异源DNA插入到一个减毒的利斯特温度敏感突变体中以提供一种具有高表达效率的牛痘病毒菌株。
本发明的另一个目的是要提供一个制备上述牛痘病毒的重组方法。
本发明还有一个目的是要提供一个通过培养上述牛痘病毒株来生产疫苗的方法。
于是，按照本发明，提供了一种重组牛痘病毒，它是通过把彼此邻接的具有启动子功能的DNA和能在它控制下表达的异源DNA插入到一个减毒的利斯特温度敏感突变牛痘病毒株的非主要DNA区得到的，该突变牛痘病毒株在兔肾细胞中不具有高温生长性并在受精卵绒毛尿囊膜上具有小的痘疱尺寸;还提供了一个制备上述牛痘病毒的重组方法及生产疫苗的方法。
图1显示了一个制备重组牛痘病毒方法的示意图。图2显示了比较例2的实施方法。图3至图6显示了实例1的实施方法。
用于将异源DNA插入其中的牛痘病毒是一种减毒的利斯特株病毒的温度敏感突变体，它在受精卵的绒毛尿囊膜上痘疱的大小为3毫米或更小，最好为1毫米或更小，比原菌株(即利斯特株)的痘疱小，而且它在兔肾细胞中的停止温度为41℃或更低些，最好是40.5℃或更低些。
在这里所使用的术语“减毒的”意指所说的突变体在兔和猴的中枢神经系统中呈现出显著低于原菌株(即利斯特株)的致病力，并且基本上不会由于末梢的感染而侵袭到小鼠的中枢神经系统(见日本专利申请公开号44178/87的实例4)。一个特别优越的突变体是把该突变体按5.8log10TCID50/〔一次〕剂量接入到重量为2.0至2.5公斤的日本白兔后的6天，由10%脑匀浆中回收到病毒量是2log10TCID50/ml或更少，最好是1或更少。
这样的减毒的温度敏感突变体，例如可以通过在兔肾细胞中，于30℃，传代培养利斯特菌株，进行空斑克隆，然后选择在40℃于Vero细胞中生长很弱的菌株，再进一步使这样获得的菌株在受精卵的绒毛尿囊膜上形成痘疱，选择一个显示较小痘疱的克隆来得到(见美国专利4，567，147)。
减毒的温度敏感变种的具体例子包括用下述方法制备的LA菌株，LB菌株(CNTM-1-423)，等。1)LA菌株的制备把利斯特菌株作为原始菌株，在兔肾细胞中于30℃传代培养36代以上，然后空斑克隆三次，分离出50个克隆。由50个克隆中选出一个于40℃，在由绿猴(Coropithecus aethiopus)肾细胞形成的Vero细胞中，显示出生长最差的温度敏感突变体。与原始菌株相比，该温度敏感突变体在兔肾细胞中生长较好但在兔中枢神经系统细胞中生长较差。在猴的中枢神经系统中显示出与DIs菌株(由Dairen I菌株制备的一种减毒的微痘疱突变体)相似的致病力;但比原始菌株降低了很多。由于这些事实已被证实，所以给少量的受验者进行了接种试验。结果发现，上述的突变体导致了轻微的全身反应，有14%伴有发热症状，随后缓慢形成皮痂。为此，要试图分离出一个显示皮肤生长能力差的克隆。作为分离上述克隆的一个标誌，就是采用在受精卵的绒毛尿囊膜上痘疱的大小。这就是，将上面提到的温度敏感突变体在兔肾细胞中传代培养6代以上，然后空斑克隆两次，分离出在受精卵绒毛尿囊膜上显示出相对小(2至3毫米)而均匀的痘疱的克隆，这样获得的菌株被命名为LA菌株。该菌株的停止温度为41℃，它比原始菌株减毒了很多。
2)LB菌株的制备把LA菌株在兔肾细胞中，于30℃，再进行三代以上的传代培养，以分离出一个在受精卵的绒毛尿囊膜上显示极小痘疱(1毫米或更小)的克隆。这样获得的菌株被命名为LB菌株。该菌株的停止温度为40.5℃，它比LA菌株减毒更多。
表1显示了作为原菌株的利斯特菌株与LB菌株性能之间的比较表1利斯特菌株与LB菌株的比较利斯特菌株 LB菌株停止温度(在兔肾中 41℃或更高 40.5℃培养的细胞)空斑大小(在兔肾中 大(3.5毫米) 中等(2.0毫米)培养的细胞)痘疱大小 大(4.0毫米) 小(0.9毫米)在受精卵的绒毛尿囊 +++ +++膜中的可生长性在Vero细胞中的可 +++ +1生长性在中枢神经系统中的致病性兔2+++ +Cynomolgus猴3有(死亡) 没有(生存)通过末梢感染到中枢神经系统的侵袭力4小鼠(醋酸可的松， 有 没有皮下接种)小鼠(未治疗) 有 没有皮肤生长能力兔 +++ +人 ++ +注释1、它们彼此相差大约2log10TCID50。
2、根据大脑内接种106.7TCID50病毒后6天回收的病毒量来估价的。
3、通过丘脑内接种108.5TCID50病毒后鉴定的。
把具有启动子功能的DNA连接在其上的异源DNA插入到这些牛痘病毒的温度敏感突变体中的方法可使用常规的方法。例如这种插入可通过利用在牛痘病毒DNA区域中的一个非主要的区域来实现，这种区域的失去对生成的病毒的生长性没有重要的影响。
详细地说，先构建一个含有一部分或全部上述的非主要DNA区的第一重组载体，然后构建一个第二重组载体，在该载体中，带有具有启动子功能的DNA连接在其上的异源DNA已被插入到插入在第一重组载体的非主要的DNA区域中。然后把该第二重组载体用如磷酸钙法这样的常规方法导入到预先已用上面提及的温度敏感牛痘突变体感染的动物细胞中去，从而通过上述的DNA区域，在感染的动物细胞中导致同源重组，以得到一种包含具有启动子功能的DNA和异源DNA作为插入物的重组牛痘病毒(例如WO84/02077，Nature 302，7，April 1983，P490-495，Proc.Natl.Acad.Sci.in USA 79，7415-7419(1982)，等)。
作为本发明中使用的上述的非主要的DNA区可以使用任何一个非主要的DNA区，只要它对其生长性没有根本的影响。这种非主要DNA区的具体例子包括例如一个具有胸苷激酶(TK)编码的DNA区，一个具有血细胞凝集素(HA)编码的DNA区，WR菌株牛痘病毒DNA的HindⅢF-片段，F-片段，M-片段和N-片段(Virus 36(1)，23-33(1986))，以及在美国专利4，603，112中描述的那些DNA区。
另一方面，用于构建第一重组载体的载体不是关键的，可以使用任何的载体，只要非主要的DNA能被插入其中。载体的具体例子包括，例如，质粒如PBR322，PBR325，PBR327，PBR328，PUC7，PUC8，PUC9，PUC19等等，噬菌体如入噬菌体，M13噬菌体等等，以及如PHC79这样的cosmids(Gene 11，291(1980))。
第一质粒载体可以用常规的方法来构建。例如用适当的限制性内切酶完全地消化牛痘病毒DNA，接着分离和纯化符合于非主要区的DNA片段，然后用酶的方法将它与一个用限制性内切酶切开的载体连接起来，该限制性内切酶在DNA中能产生像前面的限制性内切酶所产生的一样的粘性末端。
是否能成功地获得所需要的载体，可以这样来看，例如通过这样一个方法，该方法包括用一个含有通过与切开的载体的酶的连结而得到的重组载体的DNA混合物来转化(或转导)一种微生物，例如大肠杆菌，并从这样得到的转化(或转导)株中选择一个具有包含了非主要区DNA插入在其中的所需载体的菌株。
在本发明中，由这样获得的第一重组载体和有具有启动子功能的DNA插入在其上的异源DNA构建了第二重组载体。
作为用于本发明的具有启动子功能的DNA可使用含有任何碱基序列的DNA，不论是合成的还是自然的DNA，只要在由一种牛痘病毒占有的转录系统中有效地起着启动子的作用，例子有例如在Journal of Virology Sept 1984，P662-669中作为例证的牛痘病毒基因组中发现的一些启动子序列，具体的有，具有7.5K多肽编码的牛痘病毒基因的启动子，具有19K多肽编码的牛痘病毒基因的启动子，具有42K多肽编码的牛痘病毒基因的启动子，具有胸苷激酶编码的牛痘病毒基因的启动子，具有28K多肽编码的牛痘病毒基因的启动子，等。
虽然所用的异源DNA是非关键的，但它最好是具有感染疾病病原体(例如病毒，细菌，寄生虫，原生动物，等)的抗原蛋白编码的DNA。异源DNA的具体例子包括，例如具有疱疹病毒，水疱性口炎病毒，肝炎B病毒，肝炎A病毒，肝炎非A非B因子，脚和口腔疾病病毒，脊髓灰质炎病毒，狂犬病病毒，日本脑炎病毒，霍乱杆菌，沙门杆菌，tetranus杆菌，疟原虫、血吸虫等的抗原蛋白编码的DNA区。除了这些具有抗原蛋白的DNA外，还可以使用具有如血凝因子Ⅷ和Ⅸ等这些有用蛋白质编码的DNA。
在本发明中，在构建第二重组载体之前，应当先把具有启动子功能的DNA连接到异源DNA上。这样的连结可按照构建第一重组载体的方法进行。例如把具有启动子功能的DNA插入到一个载体中，然后把异源DNA以正确译读方向插入到启动子部位的下游，之后，用适宜的限制性内切酶由上述的载体中切割出所须的DNA区域。
既然是这样，将具有启动子功能的DNA与异源DNA彼此邻接的连接是很重要的。通常，把启动子部位中的转录起始部位与异源DNA中的第一转译起始部位之间的距离调节到200个碱基对或更少些，最好为100个碱基对或更少些。
第二重组载体是由这样获得的有具有启动子功能的DNA直接连于其上的异源DNA与第一重组载体制备的。也可以用常规方法进行这种制备。例如，用限制性内切酶切开第一重组载体，使插入第一重组载体的牛痘病毒非主要DNA区中有裂开的部位，然后，用DNA聚合酶钝化这样获得的DNA片段的两端，再把有具有启动子功能DNA的异源DNA片段直接导入，并用酶法与上述的DNA片段连接，该异源DNA片段的两端也已相似地用DNA聚合酶处理而被纯化了。
所需要的第二重组载体可以用如第一重组载体同样的方式来采集。
在本发明中，第二重组载体再被导入到预先用一种牛痘病毒感染的动物细胞中，借以形成重组牛痘病毒。
作为所使用的动物细胞，只要该牛痘病毒能在其中生长，任何细胞都可使用。这种动物细胞的具体例子包括，例如TK-143(从人的骨肉瘤中得来的)，FL(从人的羊膜中得来的)，Hela(从人的子宫颈癌得来的)，KB(从人的鼻咽癌得到的)，CJ-1(从猴的肾得到的)，BSC-1(从猴的肾得到的)，RK13(从兔肾得到的)，L929(从小鼠结缔组织得到的)，CE(鸡胚胎)细胞，CFF(鸡胚胎纤维细胞)，等。
作为把重组载体导入到动物细胞中去的方法，可以使用常规的方法，例如磷酸钙法、脂质体法、微注射法或其它方法。
构建的重组牛痘病毒的选择也可以用常规的方法来进行。例如，当这个非主要的DNA区是一个具有胸苷激酶编码的DNA区时，该重组牛痘病毒可以通过培养在含有25μg/ml的5-溴脱氧尿苷(BUdR)的培养介质中进行了三天的同源重组的牛痘病毒感染的胸苷激酶一缺乏细胞，并选择由这种重组牛痘病毒形成的空斑来获得。
可是，当把一种停止温度为40.5℃的菌株用作利斯特温度敏感突变牛痘病毒菌株时，要得到一个重组牛痘病毒是很困难的。并且，该重组牛痘病毒的空斑只有用含有较低BUdR浓度的培养介质进行
5天或更多天的培养才能被选择。
作为生产一种疫苗的方法，可以采用常规的方法。例如把重组牛痘病毒接种到一个适宜的宿主中去，例如像白兔这样的小动物，在生长一定的期限后，从该宿主分离出如此生长的减毒病毒，并用作疫苗。
这样获得的重组牛痘病毒在体外的表达活性比本发明人在以前构建的，不含具有启动子功能的DNA插在其中的重组体高几百倍或更多(见后面要描述的实例3)。表达活性的这种改进作用比用WR菌株作为亲代菌株(见WO84/02077)的情况下获得的显著得多。与以WR菌株作为亲代菌株获得的重组体比较，本发明的重组体显示出每个感染细胞的异源蛋白质的产量要高得多，尽管它的病毒感染力效价较低。
此外，本发明的重组体的生长力基本上与不含具有启动子功能DNA插在其中的重组体相等，而且在兔中枢神经系统中关于致病力的性能特性还更优越。
因此，按照本发明，通过把含有直接连接在其上的，具有启动子功能DNA的异源DNA插入到一个在兔肾细胞中没有高温生长性并且在受卵绒毛尿囊膜上具有较小痘疱尺寸的利斯特温度敏感突变牛痘病毒菌株的非主要DNA区中，可以获得这样一种重组牛痘病毒，它既使被接种到哺乳动物中也不失去它的生长力，可确保该异源DNA的充分表达，允许产生其抗体，而且在安全方面是极好的。此外，这种重组牛痘病毒的优点还在于由于每个感染细胞的异源蛋白质的产量的增加，因此用在试验等方面的细胞量可被减少。
实例参考下列的实例可以更具体地解释本发明。
比较例1(1)含有牛痘病毒TK基因的第一载体(质粒PCZ02)的制备(见图2)用ECORI消化5μg的PBR328，然后用酚-氯仿(1∶1)提取，并用乙醇沉淀回收被切开的PBR328，然后，通过S1酶处理钝化这样获得的DNA片段的两个末端。再连接经这样处理的DNA片段以得到一个没有ECORI切开部位的质粒(PCZO1)。通过用该连接的DNA转化反应潜能大肠杆菌菌株C600细胞及选出氯霉素敏感转化株来选择PCZ01。
随后，用Hind Ⅲ处理5ug的质粒PCZ01，并用苯酚-氯仿提取，在乙醇沉淀后收集DNA。通过碱性磷酸酶的处理除去在5′-末端的磷酸基团，用苯酚-氯仿再次提取DNA，然后通过乙醇沉淀进行收集。用0.1μg的含有牛痘病毒胸苷激酶(TK)基因的纯化的牛痘病毒(WR菌株)Hind ⅢJ片段与0.5μg的切开的PCZ01 DNA连接，把这样所获得的重组质粒称为PCZ02。通过下面的方法来证实在PCZ02中存在着牛痘病毒TK基因。先用连接的DNA转化反应潜能大肠杆菌菌株HB101细胞，并选出对氨苄青霉素有抗性但对四环素敏感的细胞。然后用Birnboin和Doiy方法(Nucleic Acid Res，Ⅰ，1513～(1979))从这些细胞中提取质粒，在用Hind Ⅲ消化后，用电泳法测试是否有与原牛痘病毒Hind Ⅲ J片段同样长度的片段存在。
(2)含有HBs Ag基因的第二载体(质粒PCZ03)的制备
(见图2)使用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ消化10μg含有一个具有肝炎B表面抗原编码基因(HBsAg)的质粒PBRHBadr 72(Nucleic acid Res.vol 11，NO，13，4601-4610(1983))，然后用低融琼脂糖电泳法(40伏特，60小时)分离出大约1.27Kb的DNA片段。随后用溴化-3，8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶嗡染色(ethidium bromide dyeing)来鉴定DNA片段，并切出凝胶，用苯酚进行提取。然后通过乙醇沉淀，收集含有HBsAg基因的大约1.27Kb的DNA片段。把收集的DNA片段溶解在10μl含有10mM Tris-Hcl(pH8.0)和1mM EDTA的缓冲溶液中，用DNA聚合酶处理使它们的两个末端钝化，用苯酚-氯仿提取，再通过乙醇沉淀进行回收。
另一方面，1ug ECORI连接物的5′-末端用10单位的在Kination缓冲液中的激酶，于37℃磷酸化30分钟，然后加入预先制备好的HBsAg DNA片段并在12℃进行连接16小时。反应混合物用苯酚-氯仿处理，通过酒精沉淀收集DNA后添加20单位的EcoRI进行进一步的消化，用苯酚-氯仿处理，再用乙醇沉淀。
另一方面，以每ugDNA2单位的量，用EcoRI在缓冲液中于37℃处理PCZ02 2小时，使之线性化。通过使线性化的质粒处在含有50mM Tris-Hcl(pH9.0)，1mM Mgcl2，0.1mM Zncl2和1mM亚精胺的缓冲溶液中，用0.1单元的牛小肠碱性磷酸酶使线性质粒的5′末端脱磷酸化。然后用等量的苯酚-氯仿提取缓冲液，并通过乙醇沉淀来回收DNA。在由66mMTris-Hcl(pH7.5)，6.6mM Mgcl2，10mM DTT和0.5mM ATP组成的混合物中，于12℃将这样获得的线性质粒处理15小时，然后与0.2ug含有HBsAg基因的1.27Kb的Eco RI片段进行连接。把所得到的质粒用来转化大肠杆菌株HB101，并且在含有1.5%琼脂和50μg/ml的氨苄青霉素的LB培养介质中，将转化的大肠杆菌细胞在37℃培养15小时。这种在琼脂上生长的转化大肠杆菌细胞在含50μg/ml氨苄青霉素的LB液体介质中，于37℃培养15小时并用上述的Birnboim和Doly方法进行钝化。在一种缓冲液中把10%的每种DNA样品用5单位的EcoRI，在37℃消化1小时，并用琼脂糖电泳法进行筛选以获得质粒DNAs的1.27Kb的EcoR Ⅰ片段。
由于1.27Kb的EcoR Ⅰ肝炎B病毒的DNA片段可以以正确方位或反方向方位插入到每个质粒中，所以对插入基因的方位要进行筛选。它是通过用xho Ⅰ在一种缓冲液中消化由质粒PCZ20得到的质粒1小时，用琼脂糖电泳法来分析所得到的DNA片段以及比较它们的长度来进行的。一种HBsAg基因以与牛痘病毒TK基因启动子正确方位插入到其中的质粒被称为PCZ03，而HBsAg基因以反方向方位插入到其中的质粒被称为PCZ04。
(3)重组牛痘病毒的制备把一种减毒的牛痘病毒菌株(减毒的牛痘菌株LA，在兔肾细胞中的停止温度为41℃，在受精卵绒毛尿囊膜上的痘疱尺寸是2-3mm，由起始菌株制备的方法已在前面叙述过)以0.1pfu/细胞的量，接种到直径为6cm的北特尔平皿(Petri dish)中培养的RK-13细胞中。在2.2ml的无菌水中溶解12μg通过把HBsAg基因插入到牛痘病毒TK基因中而获得的PCZ03质粒，并用Hidaka等人的方法(Tampaku，Kakusan，Kaso(Protein，Nucleic Acid，Enzyme)27，340(1985))制备DNA一磷酸钙共沉淀物。接种后45分钟，把0.5ml的共沉淀物滴在被感染的RK-13细胞上。把该北特利平皿在一个有5%Co2的培养箱中，于37℃放置30分钟，加入4.5ml含有10%胎牛血清的EagleMEM。3小时后，用新鲜的液体培养基换掉该培养基，培养48小时后，把该培养基与培养的细胞一起反复冰冻和融化三次，随后超声处理1分钟。
为了证实重组体中的HBsAg基因插入物，把上述的空斑形成病毒接种到培养在直径为6cm的北特尔平皿的TK-阴性(TK-)(line 143)细胞中，45分钟后，培养基用含有1%琼脂，12%胎牛血清和25μg/mlBUdR的Eagle MEM覆盖。培养3天后，感染的细胞用0.01%的Neutural红染色，空斑形成的百分比约为0.05%。由北特尔平皿中取出琼脂平板，在4℃进行贮存。用一个灭菌的尼龙膜压在余留在北特尔平皿底部的细胞表面上以使病毒转移，用0.5N NaoH处理10分钟，再用1M Tris-Hcl缓冲液处理5分钟，反复进行三次，再用含1.5M NaCl的0.5M Tris-HCl缓冲液处理5分钟。然后用2×SSC(1×SSC＝0.15M NaCl和0.015MC3H4(OH)(CooNa)3)浸透此尼龙膜，在80℃烘2小时。然后用4×SET(0.6M NaCl，0.008M Tris-HCl，4mM EDTA，pH7.8)-10×Denhard-0.1%SDS在68℃处理2小时。用4×SET-10×Denhardt-0.1%SDS-0.1%Na4P2O7-50ug的变性鲑精子DNA/ml和用32p标记的肝炎BDNA于68℃，通过切口平移(nick-translation)进行14小时的杂化，洗涤尼龙膜后，把X射线胶片一张放在另一张上面进行自动射线照相。证实了有斑点存在，把该X射线胶片放在琼脂板上于4℃贮存。那些在位置上与斑点重合的空斑被鉴定为是由于含有HBsAg基因的重组体(rLA菌株)，用灭菌的巴氏吸管进行分离。
比较例2通过按比较例1进行实验得到一个含有HBsAg基因的重组体(rLB菌株)，只是将减毒的天花LB菌株(在兔肾细胞中的停止温度40.5℃，在受精卵绒毛尿囊膜上痘疱尺寸约0.9mm，CNCM-I-423)用作利斯特温度敏感突变牛痘病毒，并且选择重组牛痘病毒的方法也作了如下改变选择重组体的方法用上面提及的空斑一形成病毒接种到在直径为6cm的北特尔平皿中培养的TK-阴性(TK-)(line 143)细胞中，45分钟后，用含有1%琼脂，12%胎牛血清和15μg/mlBUdR的Eagle MEM覆盖培养基。培养三天后，用有同样组成的MEM覆盖Eagla MEM，这些细胞再培养三天。然后感染的细胞用0.01%的Neutral红染色。此后，它们用与比较例1同样的方法进行处理。
实例1(1)含有牛痘病毒TK基因的第一重组载体(质粒pUNZ 34)的制备(见图3)用Hind Ⅲ消化5ug的puc9，然后用苯酚一氯仿(1∶1)提取，通过乙醇沉淀回收切开的PUC9。通过碱性磷酸酶的处理，除去5′-末端的磷酸基因，用苯酚一氯仿再提取DNA并通过乙醇沉淀进行回收。用0.1ug的纯化的牛痘病毒(上述的LB菌株)的Hind Ⅲ K片段(大约5.0Kbp)连接0.5ug被切开的PUC9DNA，把这样得到的重组质粒称为PUNZ 34利斯特菌株的Hind Ⅲ K片段与WR菌株的Hind Ⅲ J片段相当这是已知的(J.Gen.Vircl。45，683(1979))，可以认为TK基因是存在于Hind Ⅲ K片段中。
在PUNZ34中存在Hind Ⅲ K片段可以这样证实转化反应潜能大肠杆菌株JM-103细胞，使该转化株在含5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(0.003%)，异丙基-β-D-吡喃半乳糖苷(0.03mM)和40ug/ml氨苄青霉素的LB培养基琼脂平板上形成菌落，并用与比较例1同样的方式由白菌落中提取DNA。
(2)含有具有7.5K多肽编码的早期牛痘病毒基因启动子的质粒(PUWP-1)的制备(见图4)用限制性核酸内切酶Hind Ⅲ消化Sug牛痘病毒(WR菌株)的DNA(大约180Kbp)，通过低融琼脂糖电泳法(40伏特60小时)分离大约21Kbp的Hind Ⅲ C片段。随后用溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶嗡染色，对该DNA片段进行鉴定，然后切出凝胶并用苯酚处理，通过乙醇沉淀回收该Hind Ⅲ C片段，接着用限制性核酸内切酶EcoR Ⅰ消化该Hind Ⅲ C片段，并在上述同样的条件下分离出大约9.7Kbp的EcoR Ⅰ A片段，并以上述的方式从凝胶中提取，再用乙醇沉淀回收，进一步用限制性核酸内切酶Sal Ⅰ消化EcoR Ⅰ A片段。另一方面，用Sal Ⅰ消化5ug的PUC9，然后用苯酚一氯仿(1∶1)提取，通过乙醇沉淀来回收，把事先通过用Sal Ⅰ消化制备的该片段与切开的PUC9连接，并且把所获得的含有7.5K多肽编码的牛痘病毒的启动子区的重组质粒称为PUWHES-1。
在上述的EcoR Ⅰ A片段中存在着四个Sal Ⅰ识别部位，并且当该片段用Sal Ⅰ消化时，含有启动子区的片段和不含有启动子区的片段基本上以同样的长度产生(见Mass等人，Cell 125，805-813(1921))。因此，有不含启动子区片段作为插入物的质粒(PUWHES-2)也同时产生。然而，由于在该片段中有Hinc Ⅱ识别部位存在，这两种质粒可以通过上述部位存在的优点来相互区分。
详细地说，通过用所获得的质粒转化反应潜能大肠杆菌株JM 103细胞来筛选，获得PUWHES-1，以与比较例1(1)同样的方式提取质粒，用限制性核酸内切酶Hinc Ⅱ同样消化，把消化物进行琼脂糖电泳，选择在电泳中给出大约0.9Kb片段的质粒。
其后，用限制性核酸内切酶Sal Ⅰ消化5μg质粒PUWHES-1，用低熔融琼脂糖凝胶电泳法回收1ug约0.9Kbp的含7.5K启动子区的DNA片段。用限制性核酸内切酶RSa Ⅰ消化1μg的该DNA片段，之后通过低熔融琼脂糖凝胶电泳回收0.2ug含7.5K启动子区的DNA片段(图4中的黑体部分)。
另一方面，用Sal Ⅰ和Sma Ⅰ消化0.5ug的PCU9，然后用苯酚一氯仿(1∶1)提取，通过乙醇沉淀回收。接着，将这样得到的DNA片段与含7.5K启动子区的DNA片段连接，把所得到的重组质粒称为PUWP-1。PUWP-1中存在牛痘病毒7.5K启动子基因可通过下列事实被证实用该质粒转化反应潜能大肠杆菌株JM103细胞，然后用与比较例1(1)相同的方式进行质粒的提取，用Sal Ⅰ和EcoR Ⅰ消化，该消化物进行琼脂糖电泳，由此获得大约0.3Kbp的片段。
(3)含有HBsAg基因直接连接到一个具有7.5K多肽编码的早期牛痘病毒基因的启动子上的质粒(PUWPHBS-1)的制备(见图5)用EcoR Ⅰ处理1.3ug的质粒PUMP-1，并用苯酚一氯仿提取，用乙醇沉淀后回收DNA。用碱性磷酸酶处理除去5′-末端的磷酸基因，这样处理过的DNA用苯酚一氯仿再次提取后通过乙醇沉淀回收。用一包含了具有肝炎B表面抗原(HBSAg)(与比较例1中所使用的相同)编码的基因的大约1.27Kbp的EcoR Ⅰ DNA片段与1.3ug的切开的UPWP-1 DNA连结。
因为EcoR Ⅰ肝炎B病毒DNA片段(图5中的阴影部分)可以相对于被插入的启动子以正确的方位或相反的方位插入到每个质粒中。根据插入基因的方位进行筛选可以如此进行，用在缓冲溶液中的Hinc Ⅱ消化从质粒PUWP-1得来的质粒，通过琼脂糖电泳来分析所得到的DNA片段，并比较它们的长度。HBsAg基因已经相对于牛痘病毒7.5K启动子基因以正确的方位插入的质粒称为PUWPHBS-1，而HBsAg基因以其相反方位插入的质粒称为PUWPHBS-22。启动子部位中的转录起始部位与EcoR Ⅰ HBsAg DNA片段中的转译起始部位之间的距离大约是60bp，它们都已插入质粒PUWPHBS-1中。
(4)含有已连接上具有7.5K多肽编码的早期牛痘病毒基因的HBsAg基因的第二重组载体(质粒PUNZEn)的制备(见图6)。
用EcoR Ⅰ，消化1.5μg上述(1)中所获得的质粒PUNZ 34，然后用苯酚一氯仿(1∶1)提取，并通过乙醇沉淀回收已切开的PUNZ 34。
随后，用Hpa Ⅱ消化10μg用上述(3)制备的质粒PUWPHBS-1，然后通过低融琼脂糖电泳(40伏特，60小时)分离大约1.2Kbp的DNA片段。接着用溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶嗡进行染色，鉴定，切出该凝胶，用苯酚提取。通过乙醇沉淀回收含有牛痘病毒7.5K启动子基因和HBsAg基因的约1.2Kb的DNA片段。把上述被切开的PUNZ 34加到这些DNA片段中，并将它们的两个末端用DNA聚合酶处理钝化，随后用苯酚一氯仿提取，通过乙醇沉淀进行回收。连接如此得到的DNA片段，并且把所得到的含有有HBsAg基因直接连结上的HBsAg的重组质粒称为PUNZEn。
作为所需要的质粒PUNZEn的鉴定可通过用xho Ⅰ消化所获得的质粒，用琼脂糖电泳分析所得到的DNA片段并比较它们的长度来实现。
(5)重组牛痘病毒的制备以比较例1(3)中所描述的相同方法进行实验，获得一个含7.5K启动子基因和HBsAg基因的重组件(rLA-p菌株)，只是用上述(4)所制备的质粒PUNZEn来代替质粒PCZ03。
实例2以比较例2中所描述的相同方法进行实验，获得一个含有7.5K启动子基因和HBsAg基因的重组体(rLB-p菌株)，只是用在实例1(4)中制备的质粒PUNZEn来代替质粒PCZ03。
实例3重组体在细胞中的表达用本发明的每个病毒株(rLA-p和rLB-p)和没有7.5K启动子插入其中的参照病毒株(rLA和rLB)，以28.2至32.3的m.o.i，接种到在短试管中培养的RK-13细胞(约5×105个细胞)中。于37℃吸附1小时后，取出该病毒溶液并用Eagle MEM清洗细胞，之后，加入含有2%小牛血清的Eagle MEM。
为了在HBsAg产生时测定HBsAg和牛痘病毒传染效价，在培养24小时和48小时时收集培养物上清液和细胞提取物。通过收集短试管中的培养物上清液，加入等容量的含有2%小牛血清的Eagle MEM到残余物中以及反复冰冻-融化两次来得到细胞提取物。
用酶免疫分析法(EIA法，DAINABOT有限公司;Anzyme)测定每个培养物上清液和每个细胞提取物的HBsAg，并用492nm波长的吸收值(OD492)来表示。
牛痘病毒的效价可用下列方法测定，以+进制方式，用Eagle MEM稀释每次收集的培养物上清液和细胞提取物，把0.1ml的每个稀释液接种到在4个短试管中培养的RK-13细胞中，使之在37℃对其进行吸附1小时。吸附后，取出病毒溶液，加入含有2%小牛血清的Eagle MEM0.5ml，之后，所得的混合物在37℃滚动培养7天，规定呈现CPE情况的为感染，并计算出TCID50/ml。
结果是，与未将7.5K启动子插入其中的rLA或rLB病毒相比，rLA-P或rLB-P病毒，即本发明的重组体，无论是在培养24小时或48小时时，其培养物上清液或细胞提取物都显示出高几百倍的HBsAg产量，并且显出极大地改善了体外HBsAg的表达百分比。在以上二个时间点上，在测定HBsAg时，病毒的传染性效价对所有的病毒株都是105.0-8.0TCID50/ml，而且在所有的情况下没有显著的差别。
实例4给兔接种牛痘病毒重组体把5×108TCID50的在上面实例或比较例中制备的每个牛痘病毒重组体或其原始菌株接种到日本白兔中，在耳朵上静脉注射或在背上不同的7个部位上皮下注射使兔子感染。接种后，每隔一天直至第14天从其耳上抽血，分离出血清，然后冷冻并在-20℃贮存。
这样处理的兔子没有一个在这14天的观察中显示任何异常。
把冷冻血清都放在室温中使其融化，通过酶免疫分析法(AUSABEIA.Abott Laboratories，样品量为0.2ml)测定对HBsAg的抗体的效价，所得的结果显示在表3上。
表3上的抗体效价是用稀释度来表示的，在逐次把稀释后进行试验，在这样的稀释度下，每个血清呈现阳性。
表3在用重组牛痘病毒感染的兔中抗-HBsAg抗体的效价菌株接种 参照菌株 本发明菌株LB rLB rLA-P rLA-P rLB-P rLB-P后的天数 (iv) (iv) (iv) (id) (iv) (id)2 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜14 ＜1 ＜1 10 40 10 106 ＜1 ＜1 ＞400 ＞400 100 108 ＜1 2 ＞400 ＞400 ＞400 4010 ＜1 ＜1 ＞400 ＞400 100 10012 ＜1 ＜1 ＞400 ＞400 100 10014 ＜1 ＜1 ＞400 ＞400 100 100
从这些结果中可以看出本发明的重组体与原始菌株(LB株)和比较例2中获得的重组体(rLB菌株)相比较已大大地改进了在体内诱发产生抗体的能力。
实例5给兔再接种牛痘病毒重组体以皮下注射的方式将5×108TCID50的牛痘病毒重组体rLA-P接种到日本白兔中，接种7天后，取血样测定对HBsAg的抗体的效价。该效价是600m.I.U.效价随时间的推延而减小，接种16个月后为21mI.U.
为了测定对HBsAg效价的变化，对同一兔子附加接种5×108TCID50的重组体rLA-P。接种7天后的效价是594mI.U.;也就是说，观察到出现与第一次接种几乎同样的效价。
如上所示，由于现在这种重组体具有再次产生免疫力的能力，因此可以说这种重组体是一种非常有希望作为活疫苗的材料。
对HBsAg的抗体效价(m.I.U./ml)是按照RIA平行线测定法，以HBIG(10I.U./ml)作对照测定的。
实例6牛痘病毒重组体在兔体内的生长对实例4中得到的血清进行血红细胞凝集抑制作用(HI)试验(Gakuyukai，National Institute of Health “Servey of virus Experimentation”2nd ed.P.217～，Maruzen Co.，Ltd.(June 1973))，由此研究对牛痘病毒抗体的效价。通过制备每个血清-系列的2倍稀释液(即以2n倍稀释每个血清)来进行试验，并把在血红细胞凝集中呈现抑制作用的血清的最大稀释度作为n值。得到的结果被列示在表4中。
表4
从这些结果中可以看出，本发明的重组体在兔体中的生长性基本上与其亲代菌株相等。
实例6在兔中枢神经系统中致病力的试验为了把本发明的重组体(rLA-P和rLB-P)对中枢神经系统的致病力与不含有7.5K启动子插入其中的重组体或WR菌株的致病力进行比较，对兔进行脑内接种试验。
对每个健康的，重量为2.0至2.5Kg的日本白兔，用0.25ml各种病毒菌株的106.8TCID50的病毒溶液在大脑内接种。在临床观察6天后，处死存活的兔子，从其脑内回收病毒，并进行病理学和组织学的检查，所得的结果显示在表5中。
结果是，本发明的重组体(rLA-P和rLB-P)显示出与rLA和rLB有相似的病毒回收率和中枢神经系统的致病力，但是与WR菌株比较，显示出一个较低的病毒回收率和低得多的中枢神经系统的致病力。这些结果表明，重组体rLA-P和rLB-P像它们各自的亲代菌株一样是减毒的病毒。
接种后脑病和脑炎的致病机制已由牛痘病毒侵入脑子并在那里生长而导致脑脊髓膜炎和脉络丛炎的假定来解释。上述的动物实验被认为是研究病毒的中枢神经系统致病力的一个典型系统，而对中枢神经系统只具有低致病力的本发明重组体被认为是高度安全的病毒并适合于作为活疫苗。
权利要求
1.一个通过将具有启动子功能的DNA和能在其控制之下进行表达的异源DNA，彼此邻接地插入到一个减毒的利斯特温度敏感突变牛痘病毒菌株的非主要DNA区中所得到的重组牛痘病毒，该突变牛痘病毒菌株在兔肾细胞中不具有高温生长性并在受精卵绒毛尿囊膜上具有小的痘疱尺寸
2.一个如权利要求
1所述的重组牛痘病毒，其中启动子中的转录初始部位与异源DNA中的第一转译初始部位之间的距离是200个碱基或更少。
3.一个如权利要求
1所述的重组牛痘病毒，其中该利斯特温度敏感突变牛痘病毒菌株在兔肾细胞中的停止温度是41℃或更低。
4.一个如权利要求
1所述的重组牛痘病毒，其中该利斯特温度敏感突变牛痘病毒菌株在受精卵的绒毛尿囊膜上的痘疱尺寸是3毫米或更小。
5.一个如权利要求
1所述的重组牛痘病毒，其中该利斯特温度敏感突变牛痘病毒菌株的非主要DNA区是一个具有胸苷激酶编码的DNA。
6.一个如权利要求
1所述的重组牛痘病毒，其中具有启动子功能的DNA是一个具有7.5K多肽编码的早期牛痘病毒基因的启动子。
7.一个如权利要求
1所述的重组牛痘病毒，其中异源DNA是具有传染病病原体蛋白质编码的DNA。
8.一个如权利要求
1所述的重组牛痘病毒，其中该蛋白质是肝炎B表面抗原。
专利摘要
一个通过将具有启动子功能的DNA和能在其控制之下进行表达的异源DNA，彼此邻接地插入到一个减毒的利斯特温度敏感突变牛痘病毒菌株的非主要DNA区中所得到的重组件痘病毒，该突变牛痘病毒菌株在免肾细胞中不具有高温生长性并在受精卵绒毛尿囊膜上具有小的痘疱尺寸。
文档编号C12R1/91GK87106793SQ87106793
公开日1988年7月20日 申请日期1987年9月4日
发明者小岛朝人, 小林广茂, 安田斡司, 后藤浩之, 中里早木子, 鸭川幸市, 森田迪夫, 渡边邦子 申请人:国立预防卫生研究所长, 日本泽恩株式会社千葉县导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan