专利名称：一种基因载体的制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医学领域用的材料，尤其是一种基因载体材料的制备方法及应用。
背景技术：
基因治疗为人类许多重要的疾病如遗传疾病、肿瘤、心血管疾病和神经退行性疾病提供了广阔的治疗前景。基因治疗是将外源目的基因通过载体或其它途径导入体内并在靶组织和靶细胞中显示出相应生物学效应而达到治疗疾病的一种手段，而具备有效性和安全性的治疗载体仍是努力攻克的课题。
有效性(1)所介导的目的基因能够高效地进入所期望的靶细胞；(2)不被血浆或组织细胞中各种补体以及各种酶所破坏；(3)转导基因能够透过核膜，进入细胞核，并整合到染色体DNA中，从而获得转基因的高效、稳定表达而发挥治疗作用。
安全性(1)用于基因转移的载体不会引起宿主严重的免疫反应；(2)不会导致生殖细胞的感染；(3)不会导致插入位点的基因失活与基因突变等。
为了克服病毒载体的缺陷，一系列的非病毒型载体正被人们认识和利用。如阳离子脂质体(lipofectin)、多聚赖氨酸(ploy-L-lysine)、聚乙烯亚胺(PEI)、树枝状高聚物(dendrimers)。表现出低毒、低免疫、大容量、易操作、易制备、易修饰等多种潜在的优越性，使设计和研制新的更理想的基因治疗载体成为可能。非病毒载体目前还面临着许多挑战，如脂质体虽在某些细胞水平上基因转染效率较高，但在体内即使注入肿瘤，其效率仍然不高，而且无靶向性。因此建立一种非病毒、无免疫原性、具有靶向性的高效安全的基因体内靶向转移载体，已是基因治疗的当务之急。
发明内容
本发明的目的是提供一种羟基磷灰石作为基因载体，它的结构与骨和牙齿相似，是具有良好生物相容性的生物陶瓷材料，在基因治疗中是具备有效性和安全性的治疗载体。
本发明的技术方案包括羟基磷灰石纳米颗粒的制备、羟基磷灰石纳米颗粒混悬液制备及急性毒性试验、羟基磷灰石纳米颗粒与DNA结合及纳米颗粒-DNA复合体体外转染，具体制备过程如下(1)羟基磷灰石纳米颗粒制备将分析纯Ca(NO3)2和(NH4)H2PO4分别溶于去离子水中，配成1mol/L的溶液，将Ca(NO3)2和(NH4)H2PO4溶液以体积比5∶3的比例在1500转/min的转速下混合，并用NaOH调节溶液的pH值在11～12范围，搅拌10小时后，老化24小时；再将得到的沉淀物放入高压釜中，在200℃、200mv、200转/分钟的转速下处理4小时，再经清洗、过滤、干燥得到羟基磷灰石纳米颗粒；(2)羟基磷灰石纳米颗粒混悬液制备及急性毒性试验取羟基磷灰石纳米颗粒0.5g，放入离心管，加去离子水20ml，用超声波分散制备羟基磷灰石混悬液，并加入分散剂，使混悬液充分分散和稳定。用浓度梯度分别为4.5mg/ml、1.5mg/ml、0.5mg/ml的羟基磷灰石纳米颗粒混悬液尾静脉注射小白鼠，连续两周观察动物的死亡及毒性反应；(3)羟基磷灰石纳米颗粒生物相容性实验将SGC-7901细胞接种于96孔组织培养板；加入不同浓度的纳米颗粒混悬液，继续培养48h后进行MTT测定。比色法确定有活力的细胞数，方差分析方法采用SPSS9.0统计软件进行。
(4)羟基磷灰石纳米颗粒与DNA结合实验取琼脂糖粉制凝胶羟基磷灰石纳米颗粒混悬液稀释加PEGFP-N1混均10min(VORTEX2GENIE，USA)，静置30min，离心；以PEGFP-N11μg为对照，取上清液琼脂糖凝胶电泳检测。羟基磷灰石纳米颗粒混悬液并将其调至不同的pH值，将其分别放入eppendorf管与PEGFP-N1混合，混均，室温静置30min，离心；取上清液琼脂糖凝胶电泳检测；(5)纳米颗粒-DNA复合体体外转染细胞实验将SGC-7901细胞按接种于培养皿加入配有小牛血清的DMEM培养基培养24h后，在培养皿加入纳米颗粒DNA复合体；以单纯PEGFP-N1表达质粒DNA以及与脂质体结合的PEGFP-N1表达质粒DNA作为对照。混合培养分别于24，48，72h后荧光显微镜下观察结果；羟基磷灰石纳米颗粒制备方法中，原料还可用CaCI2和H3PO4为原料，可用HNO3和NH4NO3来调节溶液pH值。
羟基磷灰石纳米颗粒除了可与PEGFP-N1基因结合作为基因载体外，还可携带抗肿瘤和抗病毒基因进行抗肿瘤和抗病毒治疗；可制成实验室常用的基因转染试制；与保湿因子等基因结合可制成护肤产品，与生长因子结合可用于治疗烧伤。
本发明制备的结构与骨和牙齿相似，具有良好生物相容性的生物陶瓷材料——羟基磷灰石基因载体，克服了其它载体材料因生物相容性差等原因引起缺陷。纳米级羟基磷灰石可根据应用的要求制备成所需要的几何形态、三维结构、密度、孔口径、机械强度和纯度，具有小尺寸效应、表面效应等特点；颗粒具有大的表面能，增强其携带DNA的能力，解决了基因载体转导率低、药物易从脂质体中渗漏和难制备等问题。通过对纳米级羟基磷灰石颗粒进行表面改性，保证了其在使用过程中的分散稳定性，满足了基因治病的有效性和安全性。
本发明工艺简单，原料来源广泛，所制备的羟基磷灰石纳米颗粒具有良好的生物相容性，无急性毒性作用，能与PEGFP-N1表达质粒DNA完全结合，对DNA有保护作用并能将DNA运送到器官或组织并表达，最大转染效率约为脂质体转染的效率的80％。
图1 本发明的工艺流程图；图2 HA纳米颗粒透射照片；图3 HA纳米颗粒与SGC-7901细胞混合培养-良好的生物相容性；图4 HA纳米颗粒与DNA结合实验电泳分析显示DNA被纳米颗粒吸收；图5 HA纳米颗粒与PEGFP-N1结合后转染SGC-7901细胞(100x视野)；图6 羟基磷灰石纳米颗粒作为基因转染载体将PEGFP-N1表达质粒DNA转染入细胞瞬时表达；图7 羟基磷灰石纳米颗粒-DNA复合体尾静脉注射小白鼠后，脑组织切片绿色荧光蛋白表达。
具体实施例方式
实例1①羟基磷灰石纳米粉制备将分析纯Ca(NO3)2和(NH4)H2PO4分别溶于去离子水中，配成1mol/L的溶液，将Ca(NO3)2和(NH4)H2PO4溶液以体积比5∶3的比例在1500转/min的转速下混合，并用NaOH调节溶液的pH值在11～12范围，搅拌10小时后，老化24小时。再将得到的沉淀物放入高压釜中，在200℃、200mv、200转/分钟的转速下处理4小时，再经清洗、过滤、干燥得到羟基磷灰石纳米颗粒。
②羟基磷灰石纳米颗粒混悬液制备取羟基磷灰石纳米颗粒0.5g，放入离心管，加去离子水20ml，浓度为25mg/ml，用超声波分散60min(UltrasonicHemogenizer-4710，USA)，静置观察2h，羟基磷灰石纳米颗粒混悬液无分层，呈乳状。将纳米颗粒混悬液置入50ml玻璃瓶，高压灭菌后保存。取1ml纳米颗粒混悬液样本行电镜分析。
③羟基磷灰石纳米颗粒与SGC-7901细胞生物相容性实验将SGC-7901细胞接种于96孔组织培养板，104细胞一孔，加10％小牛血清DMEM培养基培养24h使细胞贴壁，置换新鲜培养基，每孔100μl。加入50μl不同浓度的纳米颗粒混悬液，浓度从0、7.5、15.6、31.2、62.3、125、250、至500μg/ml，振荡混均，继续培养48h后行MTT测定。将MTT溶液过滤除菌，以正常生长细胞为对照组，每孔加8μlMTT溶液，培养4h，弃上清，加入二甲基亚砜(DimehylSulfoxide)100μl每孔，显微镜下观察有MTT结晶形成，振荡10min，每孔取100μl置于OD测定板，测OD值，波长595nm，比色法确定有活力的细胞数，方差分析方法采用SPSS9.0统计软件进行。
④羟基磷灰石纳米颗粒与DNA结合实验取琼脂糖粉1g，制凝胶，将已消毒的羟基磷灰石纳米颗粒混悬液稀释10倍，浓度2.5mg/ml，测pH值为6.5，各取混悬液20μl置入5管eppendorf管中，分别加入不同量的PEGFP-N1(1，3，5μg)，混均10min(VORTEX2GENIE，USA)，静置30min，离心(eppendorfCentrifuge5415R离心机，USA，13200rpm，10min)，以PEGFP-N11μg为对照，取上清琼脂糖凝胶电泳检测。各取50μl的羟基磷灰石纳米颗粒混悬液并将其调至不同的pH值(2，7，12)；将其分别放入eppendorf管与2μgPEGFP-N1混合，混均10min，室温静置30min，离心(eppendorfCentrifuge5415R离心机，13200r/min，10min)，取上清琼脂糖凝胶电泳检测。
⑤纳米颗粒-DNA复合体体外转染细胞实验将SGC-7901细胞按1x105接种于培养皿(CellCultureDish，35×10mn2)，加入配有小牛血清的DMEM培养基培养24h，显微镜下观察见细胞贴壁且生长良好。用1xDMEM洗脱两次，按每培养皿转染绿色荧光蛋白基因PEGFP-N1表达质粒DNA2μg加入纳米颗粒DNA复合体，以单纯PEGFP-N1表达质粒DNA2μg以及与脂质体结合的PEGFP-N1表达质粒DNA2μg作为对照，混合培养8h后更换10％的小牛血清培养，分别于24，48，72h后荧光显微镜下观察结果。
⑥羟基磷灰石纳米颗粒悬液的急性毒性试验昆明种小白鼠，健康无病，60只，雌雄各半，体重17g-21g，当天下午禁食16h(不禁水)后，随机分为对照组和实验组，每组15只，一次给予最大体积0.4ml/20g纳米颗粒悬液，浓度梯度分别为4.5mg/ml、1.5mg/ml、0.5mg/ml，尾静脉注射小白鼠，观察二周动物的死亡及毒性反应。
⑦羟基磷灰石纳米颗粒及纳米颗粒-DNA复合体昆明种小白鼠，健康无病，30只，雌雄各半，体重17g-21g，当天下午禁食16h(不禁水)后，随机分为对照组和实验组，每组10只，一组用最大体积0.4ml/20g浓度梯度为1.5mg/ml的纳米颗粒悬液尾静脉注射小白鼠，一组用纳米颗粒-DNA复合体尾静脉注射小白鼠，复合体为体积0.4ml/20g、浓度梯度1.5mg/ml的纳米颗粒悬液与PEGFP-N1表达质粒1μg结合。另一组为对照，生理盐水0.4ml尾静脉注射小白鼠。分别于24h，48h后处死动物，取小白鼠肝、肾及脑组织，分别放入冻存管和2％戊二醛溶液，分别行冰冻切片和电子显微镜检查，观察组织内是否有绿色荧光蛋白表达和纳米颗粒分布。
权利要求
1.一种基因载体的制备方法，其特征在于(1)羟基磷灰石纳米颗粒制备将分析纯Ca(NO3)2和(NH4)H2PO4分别溶于去离子水中，配成1mol/L的溶液，将Ca(NO3)2和(NH4)H2PO4溶液以体积比5∶3的比例在1500转/min的转速下混合，并用NaOH调节溶液的pH值在11～12范围，搅拌10小时后，老化24小时；再将得到的沉淀物放入高压釜中，在200℃、200mv、200转/分钟的转速下处理4小时，再经清洗、过滤、干燥得到羟基磷灰石纳米颗粒；(2)羟基磷灰石纳米颗粒混悬液制备及急性毒性试验取羟基磷灰石纳米颗粒0.5g，放入离心管，加去离子水20ml，用超声波分散制备羟基磷灰石混悬液，并加入分散剂，使混悬液充分分散和稳定。用浓度梯度分别为4.5mg/ml、1.5mg/ml、0.5mg/ml的羟基磷灰石纳米颗粒混悬液尾静脉注射小白鼠，连续两周观察动物的死亡及毒性反应；(3)羟基磷灰石纳米颗粒生物相容性实验将SGC-7901细胞接种于96孔组织培养板；加入不同浓度的纳米颗粒混悬液，继续培养48h后进行MTT测定。比色法确定有活力的细胞数，方差分析方法采用SPSS9.0统计软件进行。(4)羟基磷灰石纳米颗粒与DNA结合实验取琼脂糖粉制凝胶羟基磷灰石纳米颗粒混悬液稀释加PEGFP-N1混均10min(VORTEX2GENIE，USA)，静置30min，离心；以PEGFP-N11μg为对照，取上清液琼脂糖凝胶电泳检测。羟基磷灰石纳米颗粒混悬液并将其调至不同的pH值，将其分别放入eppendorf管与PEGFP-N1混合，混均，室温静置30min，离心；取上清液琼脂糖凝胶电泳检测；(5)纳米颗粒-DNA复合体体外转染细胞实验将SGC-7901细胞按接种于培养皿加入配有小牛血清的DMEM培养基培养24h后，在培养皿加入纳米颗粒DNA复合体；以单纯PEGFP-N1表达质粒DNA以及与脂质体结合的PEGFP-N1表达质粒DNA作为对照。混合培养分别于24，48，72h后荧光显微镜下观察结果。
2.根据权利要求1所述的基因载体的制备方法，其特征在于羟基磷灰石纳米颗粒制备，可用CaCI2和H3PO4为原料；可用HNO3和NH4NO3来调节溶液pH值。
3.一种基因载体的应用，其特征在于羟基磷灰石纳米颗粒可携带抗肿瘤和抗病毒基因进行抗肿瘤和抗病毒治疗；可制成实验室常用的基因转染试制；与保湿因子结合可制成护肤产品；与生长因子结合可用于治疗烧伤。
4.根据权利要求1所述的基因载体的制备方法，其特征在于①羟基磷灰石纳米粉制备将分析纯Ca(NO3)2和(NH4)H2PO4分别溶于去离子水中，配成1mol/L的溶液，将Ca(NO3)2和(NH4)H2PO4溶液以体积比5∶3的比例在1500转/min的转速下混合，并用NaOH调节溶液的pH值在11～12范围，搅拌10小时后，老化24小时；5再将得到的沉淀物放入高压釜中，在200℃、200mv、200转/分钟的转速下处理4小时，再经清洗、过滤、干燥得到羟基磷灰石纳米颗粒；②羟基磷灰石纳米颗粒混悬液制备取羟基磷灰石纳米颗粒0.5g，放入离心管，加去离子水20ml，浓度为25mg/ml，用超声波分散60min(UltrasonicHemogenizer-4710，USA)，静置观察2h，羟基磷灰石纳米颗粒混悬液无分层，呈乳状；将纳米颗粒混悬液置入50ml玻璃瓶，高压灭菌后保存；取1ml纳米颗粒混悬液样本行电镜分析；③羟基磷灰石纳米颗粒与SGC-7901细胞生物相容性实验将SGC-7901细胞接种于96孔组织培养板，104细胞一孔，加10％小牛血清DMEM培养基培养24h使细胞贴壁，置换新鲜培养基，每孔100μl；加入50μl不同浓度的纳米颗粒混悬液，浓度从0、7.5、15.6、31.2、62.3、125、250、至500μg/ml，振荡混均，继续培养48h后行MTT测定；将MTT溶液过滤除菌，以正常生长细胞为对照组，每孔加8μlMTT溶液，培养4h，弃上清，加入二甲基亚砜(DimehylSulfoxide)100μl每孔，显微镜下观察有MTT结晶形成，振荡10min，每孔取100μl置于OD测定板，测OD值，波长595nm，比色法确定有活力的细胞数，方差分析方法采用SPSS9.0统计软件进行；④羟基磷灰石纳米颗粒与DNA结合实验取琼脂糖粉1g，制凝胶，将己消毒的羟基磷灰石纳米颗粒混悬液稀释10倍，浓度2.5mg/ml，测pH值为6.5，各取混悬液20μl置入5管eppendorf管中，分别加入不同量的PEGFP-N1(1，3，5μg)，混均10min(VORTEX2GENIE，USA)，静置30min，离心(eppendorfCentrifuge5415R离心机，USA，13200rpm，10min)，以PEGFP-N11μg为对照，取上清琼脂糖凝胶电泳检测；各取50μl的羟基磷灰石纳米颗粒混悬液并将其调至不同的pH值(2，7，12)；将其分别放入eppendorf管与2μgPEGFP-N1混合，混均10min，室温静置30min，离心(eppendorfCentrifuge5415R离心机，13200r/min，10min)，取上清琼脂糖凝胶电泳检测；⑤纳米颗粒-DNA复合体体外转染细胞实验将SGC-7901细胞按1×105接种于培养皿(CellCultureDish，35×10mn2)，加入配有小牛血清的DMEM培养基培养24h，显微镜下观察见细胞贴壁且生长良好；用1×DMEM洗脱两次，按每培养皿转染绿色荧光蛋白基因PEGFP-N1表达质粒DNA2μg加入纳米颗粒DNA复合体，以单纯PEGFP-N1表达质粒DNA2μg以及与脂质体结合的PEGFP-N1表达质粒DNA2μg作为对照，混合培养8h后更换10％的小牛血清培养，分别于24，48，72h后荧光显微镜下观察结果；⑥羟基磷灰石纳米颗粒悬液的急性毒性试验昆明种小白鼠，健康无病，60只，雌雄各半，体重17g-21g，当天下午禁食16h(不禁水)后，随机分为对照组和实验组，每组15只，一次给予最大体积0.4ml/20g纳米颗粒悬液，浓度梯度分别为4.5mg/ml、1.5mg/ml、0.5mg/ml，尾静脉注射小白鼠，观察二周动物的死亡及毒性反应；⑦羟基磷灰石纳米颗粒及纳米颗粒-DNA复合体昆明种小白鼠，健康无病，30只，雌雄各半，体重17g-21g，当天下午禁食16h(不禁水)后，随机分为对照组和实验组，每组10只，一组用最大体积0.4ml/20g浓度梯度为1.5mg/ml的纳米颗粒悬液尾静脉注射小白鼠，一组用纳米颗粒-DNA复合体尾静脉注射小白鼠，复合体为体积0.4ml/20g、浓度梯度1.5mg/ml的纳米颗粒悬液与PEGFP-N1表达质粒1μg结合。另一组为对照，生理盐水0.4ml尾静脉注射小白鼠。分别于24h，48h后处死动物，取小白鼠肝、肾及脑组织，分别放入冻存管和2％戊二醛溶液，分别行冰冻切片和电子显微镜检查，观察组织内是否有绿色荧光蛋白表达和纳米颗粒分布。
全文摘要
本发明涉及医学领域用的材料，尤其是一种基因载体材料的制备方法，其特征在于将Ca(NO
文档编号A61K48/00GK1712070SQ20041002334
公开日2005年12月28日 申请日期2004年6月25日 优先权日2004年6月25日
发明者周科朝, 朱晒红, 黄苏萍, 李志友 申请人:中南大学