专利名称：一种苦荞麦过敏性贮藏蛋白基因的克隆及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域，是一种具有应用前景的植物新基因，即苦荞过敏性贮藏蛋白基因(Tartary buckwheat allergenic storage protein(简称TBc)，其表达的蛋白，以及部分多核苷酸片段(简称TBa)和表达产物的纯化。
背景技术：
荞麦属于蓼科植物，其栽培种分为甜荞(Fagopyrum esculentum)和苦荞(Fagopyrum)tataricum)两种。前者在亚洲、欧洲和拉美等国栽培较广，后者在国内西南和一些北方高寒地区普遍栽培。苦荞麦不仅是一种良好的膳食营养源，也是一种具有食疗、食补作用的传统药用植物。许多研究和使用证明苦荞麦能有效的降低人体血糖、血脂和尿糖，对糖尿病和高血压等心脑血管疾病有很好的预防和治疗效果。近年来国内的一些苦荞功能保健产品相继面市，受到消费者的普遍欢迎，市场前景广阔。但荞麦中所含的过敏源也可引起接触和食用荞麦食品的人群产生过敏症状。因此，国外有不少科学家开始研究甜荞(common buckwheat)中的过敏成分，在国内对荞麦中的过敏成分的研究尚属起步，而对苦荞麦(tartary buckwheat)主要过敏源基因的克隆、表达则未见报道。利用克隆、表达技术获得苦荞主要过敏性蛋白，可为下一步大规模生产苦荞过敏源，用于过敏性诊断及分子改造奠定基础。
过敏反应是人类常见的一类免疫疾病，由于它症状复杂，种类繁多，危害广泛且很难根治，所以长期以来一直是医学界的一大难题。目前，对植物来源过敏蛋白研究较多的有水稻、花生和大豆。2001年Bannon等报道了重组花生过敏原用于过敏性检测和免疫治疗的体外免疫效果，从而为花生过敏患者提供了一种安全可靠的免疫检测和治疗手段。目前，有关荞麦重组过敏源的研究国内外研究较少，日本学者2001年报道了甜荞中的主要过敏源，而有关苦荞主要过敏蛋白基因及其重组过敏蛋白的研究在国内外尚属空白。本发明获得的基因及其表达产物可为临床过敏反应的诊断与治疗增加新内容，其中苦荞过敏蛋白基因可制备低致敏DNA疫苗的用途，基因产物苦荞过敏蛋白可用于荞麦过敏病人的脱敏治疗等方面，从而填补荞麦研究领域的一项空白。
发明内容
本发明的目的是提供一种苦荞麦过敏性贮藏蛋白(tartary buckwheat allergen)全长cDNA基因(简称TBc)及其制备方法。以及它编码的苦荞麦过敏性贮藏蛋白，该蛋白具有与特异性抗体IgE结合位点，能促发由IgE介导的I型过敏反应。
本发明的另一个目的是提供一种苦荞麦过敏性贮藏蛋白C端多肽片段(简称TBa)及其它的原核表达方法和表达产物的纯化及应用。
本发明提供的苦荞麦过敏性贮藏蛋白基因TBc的cDNA核苷酸序列，含有1548核苷酸，包括启始密码子ATG和终止密码子TAA。如图1所示。
所述的cDNA全长基因编码一个515氨基酸组成的的蛋白质，它的通顺阅读框包含一段22个氨基酸的信号肽序列和一个493氨基酸的成熟蛋白。如图2所示。
所述苦荞麦过敏性贮藏蛋白基因的制备方法，其特征在于包括如下步骤(a)、提取苦荞麦总RNA并以其为模板，合成cDNA第一链；(b)、采用RT-PCR和3′RACE法扩增3′端585核苷酸及其3′端尾部序列；(c)、根据步骤(b)得到的部分基因设计特异性引物扩增5’端及全长基因序列。
所述的苦荞麦过敏性贮藏蛋白，含有C端的第321位至515位的多肽片段TBa。如图3所示。
所述的多肽片段TBa含有195个氨基酸，为它编码的基因包含585个核苷酸序列和终止密码子TAA。
一种载体，即多肽片段TBa的重组表达载体，含有编码多肽片段TBa的核苷酸序列和原核载体，它是将3′端585个核苷酸基因片段克隆至原核表达载体后获得的重组子pET28a-TBa。所述的载体，是质粒，含有T7启动子。
一种苦荞麦过敏性贮藏蛋白工程菌，它含有如前所述的载体。是将所述的多肽片段C端基因重组子转化至一种菌中，例如大肠杆菌BL21细胞中，构建成工程菌，例如pET28a-TBa/BL21。
多肽片段TBa的表达方法，是在合适表达TBa的条件下，培养工程菌，IPTG诱导表达目的蛋白，从培养物种分离、纯化目的蛋白TBa。具体包括如下步骤(a)、构建pET28a-TBa表达载体；(b)、将pET28a-TBa按照标准法转化至菌中，工程菌株接种在含卡那霉素的LB培养基中，诱导表达2-4小时；(c)、收集菌体，破碎细胞，层析纯化，冷冻干燥后获得产品。
优选将pET28a-TBa表达载体转化到大肠杆菌BL21中，构建大肠杆菌pET28a-Tba/BL21，接种在含卡那霉素的LB培养基中，37℃，200r/min振荡培养至O.D 600nm为0.6，加入IPTG使终浓度为0.1mmol/L，诱导表达2-4小时；收集菌体，破碎细胞，将上清经亲和层析纯化，合并每次柱洗脱获得的目的蛋白，冷冻干燥后获得产品。
苦荞麦过敏性贮藏蛋白全基因通过Blast分析，表明与甜荞的主要过敏性贮藏蛋白全长cDNA有91％的同源性，与甜荞豆球类蛋白及13S贮藏蛋白的全长cDNA有近90％的同源性，说明得到的苦荞过敏蛋白全长cDNA序列为苦荞中一新基因。
采用免疫印记法(Western Bloting)和酶联免疫测定法(ELISA)证明，苦荞麦过敏性贮藏蛋白具有与特异性抗体IgE结合位点，能促发由IgE介导的I型过敏反应。苦荞过敏性蛋白基因编码的蛋白质，是具有一定生物学功能的新型植物过敏源，苦荞过敏蛋白基因可用于制备低致敏DNA疫苗。过敏蛋白在制备诊断和治疗特异性苦荞过敏症药物中的用途。
附图1苦荞麦过敏性贮藏蛋白基因TBc的全长cDNA序列以及推测的氨基酸序列。
附图2苦荞麦过敏性贮藏蛋白全长氨基酸序列。
附图3苦荞麦过敏性贮藏蛋白C端多肽片段(TBa)的氨基酸序列。
附图4重组表达载体pET28a-TBa结构示意图。
附图5重组表达产物TBa的SDS-PAGE电泳图，图中Mr为分子量标准，1为表达产物，2为纯化后的表达产物。
具体实施例实施例1 苦荞麦过敏蛋白基因全长cDNA的克隆步骤一，苦荞麦总RNA提取及cDNA第一链的合成取苦荞种子适量，洗净，30℃萌发至根尖1cm左右，采用异硫氰酸胍法提取总RNA。以苦荞总RNA为模板，以Oligo(dT)为引物合成非端部扩增所用cDNA第一链，称作cDNA1。另以总RNA为模板，以3′RACE试剂盒提供的引物AP(5′-ggc cac gcg tcg act agt act ttt ttt tttttt ttt t-3′)合成扩增3′端所用cDNA第一链，称作cDNA2。合成的cDNA1和cDNA2分别在-20℃保存备用。
步骤二，苦荞麦主要过敏源基因TBa及其3′末端的克隆采用RT-PCR和3′RACE法扩增过敏源基因B亚基TBa及其3′末端序列，具体操作是根据本室先前从苦荞中纯化、测序所得的该过敏蛋白的N-末端氨基酸序列和文献报道的甜荞BT1蛋白质序列推测出相应核苷酸序列设计PCR引物I5′-gga ttg gaa caa gcg ttc tgcaac ct-3′、引物II5′-aac aat aga gaa acg ttc cct ctc ct-3′用于TBa的扩增。另采用引物I和引物AUAP5′-ggc cac gcg tcg act agt ac-3′用于3’末端序列的扩增。每50μl PCR反应体系分别加入1μl cDNA1和cDNA2作为模板，PCR扩增，电泳检测，发现分别在600bp和400bp附近出现预期的特异性扩增条带，回收此条带分别连接至T-easy载体，构建重组质粒pGEM-T-TBa，转化大肠杆菌DH5α，挑选重组克隆测序。测序结构表明，以cDNA1为模板获得的基因片段由585个碱基组成，用Blast数据库同源性分析显示585bp片段与甜荞主要过敏蛋白BT1同源性达93％，可编码一个长度为195个氨基酸组成的多肽片段，此多肽是荞麦中的主要过敏性成份之一。另外以cDNA2为模板获得的基因片段由404个碱基组成，包括终止密码子TAA和加尾信号(polyA)。若去除尾部polyA序列，可获得一个编码195个氨基酸的结构基因，由该基因推测的氨基酸序列见附图3。根据上述分析可以判断本发明获得了苦荞主要过敏性蛋白的结构基因片段。
步骤三，苦荞麦主要过敏源基因5’端及全长cDNA的克隆根据步骤二得到的结构基因内部序列设计3′特异性引物λ25′-tcc ttc gtc tcc aacaac ctg-3′，并依据甜荞BT1推测的核苷酸序列选用一段保守区设计引物λ35′-caa cgc tccagg cag agt gag-3，以苦荞cDNA1为模板，先合成一段807bp左右的基因片段，其中包括5′端基因序列543bp及结构基因TBa部分序列264bp。以AAP5′-ggc cac gcg tcg actagt acg ggi igg gii ggg iig-3′和AUAP5′-ggc cac gcg tcg act agt ac-3′为引物，并根据上述扩增得到的5′端807bp基因序列设计引物w15′-ttc tgg tgc tgg tcc ccg-3′和w25′-ctcacg gga ttg gcg gtc-3′，利用5′-RACE和巢式PCR法克隆获得5′端全长序列。经序列测定表明，克隆到的5′端部分基因片段519bp，包括807bp基因片段中的结构基因57bp，在5’端46bp处出现起始密码子ATG，其后为66bp的信号肽序列。将步骤二、三获得的四个基因片段(TBa结构基因585bp、3′端404bp及5′端807bp和519bp)进行叠加、拼接，获得苦荞麦过敏蛋白全长cDNA序列，经测序表明全长基因共计1548bp，可编码一个515个氨基酸的蛋白质，包括22个氨基酸信号肽序列和493个氨基酸的成熟肽序列(见附图1，附图2)。
实施例2 苦荞麦过敏蛋白C端多核苷酸片段在大肠杆菌中表达步骤一 表达载体pET28a-TBa的构建。
将实施例1步骤二中获得重组质粒pGEM-T-TBa和pET-28a空载体分别用BamH I和Hind III双酶切，琼脂糖凝胶电泳分离，回收585bp目的DNA片段，和5.3kb载体DNA片段，经连接后，转化大肠杆菌DH5α，筛选具有卡那霉素抗性的转化子。提取质粒，经BamH I和Hind III双酶切得到585bp和5.3kb两个片段，分别与苦荞过敏蛋白基因TBa和表达载体pET-28a大小相同，再经DNA序列分析，证明苦荞过敏蛋白基因TBa已经克隆到表达载体pET-28a中，将此重组质粒命名为pET28a-Tba(见附图4)。
步骤二 利用大肠杆菌工程菌株pET28a-Tba/BL21制备过敏蛋白TBa。
将pET28a-TBa按照标准法转化大肠杆菌BL21，构建大肠杆菌工程菌株pET28a-Tba/BL21，单克隆接种在含0.25μg/ml卡那霉素抗性的液体LB培养基中，37℃200r/min振荡培养过夜，然后以1％的接种量接种在含0.25μg/ml卡那霉素抗性的液体LB培养基上，37℃200r/min振荡培养至O.D 600nm为0.6，加入IPTG使终浓度为0.1mmol/L，诱导表达3小时，收集菌体，超声破碎，13000r/min离心分离上清和沉淀，经SDS-PAGE检测后，和空菌比较在凝胶电泳图谱上出现一条新的蛋白带，与预计蛋白分子量大小相一致，目的蛋白可溶性表达量约占菌体总蛋白的30％。
步骤三 目的蛋白的亲和纯化所选用的表达载体pET28a上带有编码6个组氨酸的核苷酸序列，因此可用亲和层析进行纯化。将步骤二获得的可溶性表达蛋白样品通过Hitrap chelating亲和柱，平衡后用0.5ml 0.1mol/L镍盐溶液洗脱，收集目的蛋白，SDS-PAGE检测后在电泳图谱上显示单一条带，表明获得了纯度较高的目的蛋白纯品(见附图5)，合并每次柱洗脱获得的目的蛋白，经冷冻干燥即为苦荞麦过敏蛋白TBa产品。
本发明是按上述方案从苦荞麦天然资源中获得苦荞麦过敏性贮藏蛋白基因，并对其序列做相关分析。将C端多核苷酸基因片段(585bp)克隆至原核表达载体，经大肠杆菌中可溶性表达，亲和纯化获得纯度较高的22kD重组苦荞麦过敏性贮藏蛋白片段，可以为深入研究荞麦食品过敏机理，荞麦过敏蛋白基因的分子改造和育种改良奠定基础。
权利要求
1.一种苦荞麦过敏性贮藏蛋白基因，其特征在于具有如下cDNA全长核苷酸序列1 ATGTCAACTA AACTCATCCT CTCCTTCTCC CTGTGCCTTA TGGTACTAAG51 CTGCTCTGCG CAGGCAGCGC AGCTATGGCC ATGGCGGAAG GGACAAGACA101 GCCGCCCCCA CCACGGCCAC CAGCAATTCC AGCAGCAATG TGATATCCAG151 AGGCTCACCG CCTCTGAGCC CTCTCGTAGA GTCCGTTCTG AGGCCGGAGT201 TACCGAGATT TGGGACTACA ACACCCCTGA GTTCCGATGC ACCGGATTTG251 TCGCCGTCCG TTACGTAATT CAGCCAGGAG GCCTCTTGCT TCCTTCCTAC301 TCCAACGCCC CTTACATCAC CTTTGTCGAG CAAGGGGAGG GAGTGCAGGG351 AGTGGTCATC CCAGGATGTC CCGAGACCTT CCAGTCGGAC TCCGAGTACC401 CTCAGTCTCA GAGAGGCCAA CGCTCCAGGC AGAGTGAGAG CGAAGAATCC451 AGCCGCGGGG ACCAGCACCA GAAGATTTTC AGAGTCAGAG AAGGTGACGT501 CATCCCATCT CCCGCCGGTG TCGTGCAGTG GACTCACAAC GACGGTGACC551 AAGATCTCAT CAGTGTCACT CTTCTCGATG CCAACAGCTT CCACAACCAG601 CTCGATGAGA ACGTTAGGAG CTTCTTCCTA GCTGGTCAGA GCCAGCAAGG651 CAGGGAGGAA CGCCGCAGCC AGCAACAGAC GAGGGAGGAA GGCGGTGACC701 GCCAATCCCG TGAGAGCGAT GACGTCGAAG CACTTATCGG CGCAAACATC751 TTGAGTGGAT TCCAGGACGA GATCCTCCAC GAACTCTTCC GAGATGTTGA801 CCGGGAGACC ATCAGCAAGC TCAGAGGCGA GAACGACCAG AGAGGATTCA851 TCGTCCAGGC TCAGGACCTC AAACTCCGGG TCCCAGAGGA TTCTGAAGAA901 GGATATGAGA GGCAAAGAGG TGACAGGAAA AGAGACGAAA GAGGAAGCGG951 AAGGAGCAAT GGATTGGAGC AAGCGTTCTG TAACCTAAAA TTCAGGCAAA1001 ATGTTAACAG GCCTTCTCAC GCCGACGTCT TCAACCCACG CGCCGGACGT1051 ATCAACACCG TCAACAGTAA CAATCTCCCA ATCCTCGAAT TCCTCCAACT1101 TAGCGCCCAA CACGTCGTCC TCTACAAGAA TGCGATCATC GGACCGAGAT1151 GGAACTTGAA CGCACACAGC GCACTGTACG TGACAAGAGG AGAAGGAAGA1201 GTCCAGGTTG TTGGAGACGA AGGAAAGAGT GTATTCGACG ACAACGTGCA1251 GCGAGGACAG ATCCTTGTGG TGCCACAGGG ATTCGCAGTG GTGGTGAAGG1301 CAGGAAGACA AGGATTGGAG TGGGTGGAGT TGAAGAACAA CGATAACGCC1351 ATAACCAGTC CGATTGCCGG TAGGACTTCG GTGTTGAGGG CGATCCCTGT1401 GGAGGTACTG GCCAACTCGT ATGATATCTC GACGGAGGAA GCATACAAAT1451 TGAAGAATGG GAGGCAGGAG GTTGAGGTCT TCCGACCATT CCAGTCCCGA1501 TATGAGAAGG AGGAGGAGAA GGAGAGGGAA CGTTTCTCCA TAGTTTAA
2.如权利要求1所述的苦荞麦过敏性贮藏蛋白基因的制备方法，其特征在于包括如下步骤(a)、提取苦荞麦总RNA并以其为模板，合成cDNA第一链；(b)、采用RT-PCR和3′RACE法扩增3′端585核苷酸及其3′端尾部序列；(c)、根据步骤(b)得到的部分基因设计特异性引物扩增5’端及全长基因序列。
3.一种苦荞麦过敏性贮藏蛋白，其氨基酸序列如下1 MSTKLILSFS LCLMVLSCSA QAAQLWPWRK GQDSRPHHGH QQFQQQCDIQ51 RLTASEPSRR VRSEAGVTEI WDYNTPEFRC TGFVAVRYVI QPGGLLLPSY101 SNAPYITFVE QGEGVQGVVI PGCPETFQSD SEYPQSQRGQ RSRQSESEES151 SRGDQHQKIF RVREGDVIPS PAGVVQWTHN DGDQDLISVT LLDANSFHNQ201 LDENVRSFFL AGQSQQGREE RRSQQQTREE GGDRQSRESD DVEALIGANI251 LSGFQDEILH ELFRDVDRET ISKLRGENDQ RGFIVQAQDL KLRVPEDSEE301 GYERQRGDRK RDERGSGRSN GLEQAFCNLK FRQNVNRPSH ADVFNPRAGR351 INTVNSNNLP ILEFLQLSAQ HVVLYKNAII GPRWNLNAHS ALYVTRGEGR401 VQVVGDEGKS VFDDNVQRGQ ILVVPQGFAV VVKAGRQGLE WVELKNNDNA451 ITSPIAGRTS VLRAIPVEVL ANSYDISTEE AYKLKNGRQE VEVFRPFQSR501 YEKEEEKERE RFSIV
4.如权利要求3所述的苦荞麦过敏性贮藏蛋白，其特征在于它含有C端的第321位至515位的多肽片段，其氨基酸序列为321 GLEQAFCNLK FRQNVNRPSH ADVFNPRAGR INTVNSNNLP ILEFLQLSAQ371 HVVLYKNAII GPRWNLNAHS ALYVTRGEGR VQVVGDEGKS VFDDNVQRGQ421 ILVVPQGFAV VVKAGRQGLE WVELKNNDNA ITSPIAGRTS VLRAIPVEVL471 ANSYDISTEE AYKLKNGRQE VEVFRPFQSR YEKEEEKERE RFSIV
5.一种载体，含有权利要求4所述的编码多肽片段的核苷酸序列和原核载体。
6.权利要求5所述的载体为质粒，含有T7启动子。
7.一种苦荞麦过敏性贮藏蛋白工程菌，其特征在于它含有权利要求5或6所述的载体和一种菌。
8.权利要求4所述多肽片段的表达方法，其特征在于，包括如下步骤(a)、构建pET28a-TBa表达载体；(b)、将pET28a-TBa按照标准法转入一种菌中，构建成工程菌株，接着接种在含卡那霉素的LB培养基中，诱导表达2-4小时；(c)、收集菌体，破碎细胞，层析纯化，冷冻干燥后获得产品。
9.权利要求8所述的方法，其中(b)步骤的条件为，37℃，200r/min振荡，培养至O.D 600nm为0.6，加入IPTG使终浓度为0.1mmol/L，诱导表达2-4小时。
10.权利要求8所述的方法，其中菌为大肠杆菌BL21，构建大肠杆菌工程菌株pET28a-Tba/BL21。
11.权利要求1所述的苦荞过敏蛋白基因可在制备低致敏DNA疫苗中的用途。
12.如权利要求3或4所述的过敏蛋白在制备诊断和治疗特异性苦荞过敏症药物中的用途。
全文摘要
本发明通过RT－PCR和RACE技术克隆和序列测定获得苦荞麦过敏性贮藏蛋白基因(TBc)，该基因全长1548核苷酸，开放阅读框可编码一个515个氨基酸组成的蛋白质，其中包含22个氨基酸的信号肽序列和493个氨基酸的成熟肽序列，分子量约58kDa。将该基因3′端的部分结构基因(TBa)构建表达载体，通过原核表达后，可获得一个分子量约22kDa的功能蛋白，该功能蛋白包含195个氨基酸。由苦荞麦过敏性贮藏蛋白基因编码的完整蛋白质和功能蛋白均是苦荞中的主要过敏源，可促发由IgE介导的I型过敏反应。本发明可用于制备诊断和治疗特异性过敏症药物。
文档编号A61P37/08GK1715410SQ200410092438
公开日2006年1月4日 申请日期2004年12月24日 优先权日2004年12月24日
发明者王转花, 张政, 李玉英, 景巍 申请人:山西大学