专利名称：用于猪呼吸病的灭活混合疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及用于猪呼吸病的疫苗。具体地说，本发明涉及用于猪呼吸病的灭活混合(联合)疫苗。
背景技术：
猪呼吸病已经成为导致农场严重经济损失的重要问题。特别地，如果疾病发展成特征在于新生小猪死亡，持续萎缩和每天体重减轻的断奶后多系统消瘦综合征(post-weaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)，或者如果疾病发展成猪呼吸病综合征(porcine respiratory disease complex，PRDC)，就产生极端严重的问题。为了避免和减轻感染所述猪呼吸病(综合征)导致的经济损失，曾采用过各种各样的疫苗。然而，因为猪呼吸病有各种各样的原因，所以对于任何一种情况的疫苗在很多情况下是没有效的。在这点上，开发出了几种混合疫苗并且在几个农场中应用。然后，混合疫苗和一价抗原疫苗相比没有足以令人满意的保护效果，因为所述疾病在不同的时间发生。
猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)引起的猪地方流行性肺炎、副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)引起的格拉塞氏病(Glasser’s disease)以及猪繁殖和呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)病毒引起的猪生殖和呼吸综合征(PRRS)公知是突出的猪呼吸病(综合征)。
猪格拉塞氏病对于2-4月龄的猪仔有高传染性，一般自5-6周龄断奶猪仔发病。所述疾病通过病原微生物感染而发生，该病一般位于上呼吸道，特别是当猪仔的免疫系统被应激反应阻抑时，例如，运输或突然的环境变化。猪肺炎支原体或PRRS病毒能引发猪的格拉塞氏病。猪地方流行性肺炎是一种常年病(year-round disease)，有非常高的感染率但是表现出低死亡率。当由母猪来源的抗体水平降低不能产生抗感染的保护作用时，所述疾病主要是4-5周龄猪仔发病。所述疾病破坏了呼吸道的粘膜绒毛和细胞削弱了第一免疫系统，从而引发了干咳和慢性肺炎。接着，肺巨噬细胞减弱的免疫应答使受猪地方流行性肺炎感染的猪容易感染其他呼吸疾病(格拉塞氏病、猪胸膜肺炎、PRRS和猪流感等)，引起猪的高死亡率。所述PRRS病毒为有被膜且属于披膜病毒科(Togaviridae)科的动脉炎病毒(Arterivirus)属的RNA病毒。所述PRRS病毒特征在于引起成年猪的多种生殖力衰竭，以及引起猪仔的低进食效率、高断奶后死亡和与间质肺炎相关的呼吸综合征。此外，与表现出典型症状的急性感染相反，慢性感染其自身的持续感染和与其他病原体同时发生的次级感染能导致更严重且持续时间更长的经济损失，即使慢性情况本身不严重。
特别地，PRRS或猪地方流行性肺炎的临床发生使得猪对其他呼吸病的次级感染非常敏感，例如，格拉塞氏病、猪地方流行性肺炎、猪流感、链球菌属(Streptococcus spp)和猪霍乱沙门氏菌(Salmonella cholerasuis)。如果猪呼吸病发展成PMWS和PRDC，则导致猪仔和成长的猪的每天体重减轻、低进食效率、高断奶后死亡率以及更多的呼吸综合征。因此，需要开发预防可能导致农场严重经济损失的所述突出的猪呼吸病的方法。还有，实践上对于防止PMWS和PRDC的需求增加了。然而，还没有合适的疫苗完全满足这些需求。
在这点上，我们发明人经研究发现用一个有效方案同时预防所述突出的猪呼吸病的方法。我们通过设计含有三类抗原的混合疫苗，并且通过测定动物模型中的安全性和抗体形成而完成了本发明。
发明内容
本发明提供了用于三种类型猪呼吸病的混合(联合)疫苗。更具体地，本发明提供了灭活混合疫苗用于预防猪格拉塞氏病、猪地方流行性肺炎和猪生殖和呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)。
本发明的另一个目的是提供灭活混合疫苗用于减少产生成年猪的三种类型的猪呼吸病、PMWS和PRDC的原因。
本发明的另一个目的是提供当制备本发明的混合疫苗时使用豚鼠检测PRRS中和抗体滴度的新的方法。
为了实现上述的目的，发明人设计了能预防或减少猪格拉塞氏病、猪地方流行性肺炎和PRRS、断奶后多系统消瘦综合征(Post-weaningMultisystemic Wasting Syndrome，PMWS)和猪呼吸病综合征(PorcineRespiratory Disease Complex，PRDC)三种类型猪呼吸病的发病和发展的病因的具有极好免疫性的有效灭活混合疫苗。在本发明中，使用福尔马林将从家养猪场患病猪仔分离的副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)S4菌株和副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)S5菌株灭活，来制备用于格拉塞氏病的疫苗。使用福尔马林将猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)J/101株灭活，来制备用于猪地方流行性肺炎的疫苗。使用MN-HS(MinnesotaUniversity，Prof.Han Soo Joo，美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection，ATCC)保藏编号VR2509)或来自猪肺巨噬细胞的CNV-1(得自Prof.Kim，Hyeon Su，Chungnam National University，Korea；Sequenceanalysis of ORF4 gene of porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV)Korean isolate CNV-1，Korean J.Vet Res(1999)39(2)294-300)、猪睾丸细胞系(swine testis cell line，STL)或A-72细胞(ATCC No.CRL-1542)来制备用于PRRS的疫苗。培养感染的细胞之后，当观察到大约80％细胞病变作用(cytopathic effect，CPE)时将其分离，用于制备疫苗。
同时，当对抗体阴性猪注射灭活PRRS疫苗时，典型血清中和(SerumNeutralization，SN)试验不能提供抗体滴度。就这一点，本发明的发明人设计了新的抗体滴度测定系统。即发明人首先测定豚鼠和猪之间关于使用灭活PRRS疫苗接种的对比关系。然后，本发明使用豚鼠测定了中和抗体滴度。因此，使用豚鼠测定PRRS中和抗体滴度的新方法解决了使用猪不能克服的问题。因为非常难以获得对于PRRS病毒保持阴性(在农场90.4％阳性且对于猪45.1％阳性)的猪，并且因为中和PRRS病毒的抗体(IgG)在随后阶段(接种后4-5周)出现，不容易检测中和抗体滴度。为了解决问题，发明人使用豚鼠代替猪，用于上面提到的检测中和抗体滴度。对豚鼠和猪仔注射本发明的混合疫苗之后测定对PRRS病毒的中和滴度。证明用补体(含有豚鼠新鲜血清1重量％-5重量％)在4℃下中和48小时是最有效的方法。
本发明的混合疫苗组合物优选含有20-30％(体积/体积)范围的疫苗组分。所述组分和它们的优选内含物如下副猪嗜血杆菌S4菌株(光密度值(optical density，O.D)0.4-0.5，410纳米)，副猪嗜血杆菌S5菌株(O.D 0.4-0.5，410纳米)，猪肺炎支原体J/101(O.D 0.05-0.15，410纳米)和PRRS MN-HS(105.0-108半数组织培养感染量(median tissue culture infective dose，TCID50)/毫升)。将疫苗成分完全混合之后，使用铜网过滤混合物，然后向过滤后的混合物加入氢氧化铝凝胶10-20％(体积/体积)以使疫苗成分吸附到凝胶上。接着，向混合物加入油佐剂(IMS 1313NPR)5-10％(体积/体积)和乙二胺四乙酸(EDTA)0.14％(重量/体积)，得到混合疫苗组合物。
在一个实施方案中，利用小鼠、豚鼠和猪仔评价本发明的混合疫苗的安全性。结果，小鼠和豚鼠在接种后存活7天，猪仔在接种后存活14天。
在另一个实施方案中，测定了本发明的混合疫苗的免疫原性。如表9所示，混合疫苗诱导抗体形成。
在另一个实施方案中，将使用豚鼠对抗PRRS病毒的中和抗体滴度测定与使用抗体阴性猪相比较。根据结果，使用豚鼠测定抗PRRS病毒的抗体滴度提供更精确的抗体滴度。
在另一个实施方案中，在冰箱中贮存21个月期间，每3个月监测一次本发明的混合疫苗的活性。结果证明本发明的疫苗确实有效并且在长期贮存期间没有问题(表15、表16、表17和表18)。
在另一个实施方案中，在农场猪仔上证明安全性和免疫原性。本发明的疫苗表现出极好的安全性和免疫原性(表19和表20)。
在另一个实施方案中，对于在三个农场中给予本发明的混合疫苗的一组猪和给予传统疫苗的一组猪，评价上市猪的完成阶段、每天体重增加和商品猪的销售率(表21、表22、表23和表24)。对于11周龄的猪，给予了本发明混合疫苗的猪的平均体重范围是3.1-4.2千克，这证明施用了本发明的混合疫苗的猪的体重增加率高于用传统疫苗处理的猪。用本发明的混合疫苗处理的猪的销售率比用传统疫苗处理的猪高10％。因此，用本发明的混合疫苗处理组的平均销售时间比用传统疫苗处理的组的平均销售时间缩短10天。
图1至图3显示肺炎评分的例子；图1是肺炎的例子，并且显示整个正常肺的各个肺叶的百分比；图2是肺炎的例子，并且显示有12％肺叶评分的肺损害；图3是肺炎的例子，并且显示有20％肺叶评分的肺损害。
在实施例的基础上进一步详细公开本发明。可以理解本发明的范围不受实施例实施例1分离和培养病毒对于猪格拉塞氏病，在含有45微克/毫升β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(β-Nicotinamide adenine dinucleotide，β-NAD)、0.5％酵母提取液和0.5％蔗糖的胰酶大豆肉汤(Tryptic Soy Broth，TSB)培养基中分别培养副猪嗜血杆菌S4菌株和副猪嗜血杆菌S5菌株(从National Veterinary Research andQuarantine Service获得)。然后将培养后的菌株分离，冻干并在-80℃下深低温保藏。在支原体培养基(表1)中释放并培养引发猪地方流行性肺炎的猪肺炎支原体J/101株(从National Veterinary Research and Quarantine Service获得)。分离之后，将培养后的该支原体株冻干，并在-80℃下深低温保藏。接着，将猪肺炎支原体J/101株转移到1/3体积的支原体培养基(表1)中，并且培养7至10天，直到培养基的颜色变为黄色。在猪肺巨噬细胞、猪睾丸细胞系(swine testis cell line，STL)或A-72细胞(ATCC No.CRL-1542)(表2，细胞培养基)中接种并培养猪生殖呼吸综合征(reproductive respiratorysyndrome)MN-HS病毒(Minnesota University，Prof.Han Soo Joo，ATCC No.VR2509)或CNV-1(得自Prof.Kim，Hyeon Su，Chungnam National University，韩国)的病原体，直到出现80％CPE，然后分离培养的病毒株。接着将分离的病毒株冻干，并在-80℃下深低温保藏，以用作疫苗组分。接着，将肺巨噬细胞、STL细胞或A-72细胞悬浮于细胞培养基(表2)。将细胞悬浮液在37℃培养1-3天，然后将悬浮液分装到培养瓶中。当培养的细胞形成层时，移除培养液。然后，将103.0TCID50/毫升(50％组织培养感染剂量)的分离的MN-HS病毒转移到病毒培养基中(表3)并且用旋转细胞培养系统在37℃下培养。
表1支原体培养基成分
表2细胞培养基成分(总体积1000毫升)
表3病毒培养基成分(总体积1000毫升)
实施例2分离和灭活对于猪格拉塞氏病，在含有45微克/毫升β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(β-NAD)、0.5％酵母提取液的TSB培养基中释放实施例1的各种子培养液并且在37℃下培养12小时。然后将培养的菌株分离并浓缩，并使用0.3％福尔马林灭活72小时。对于猪地方流行性肺炎，在支原体培养基中传送猪肺炎支原体J/101株，并且在37℃培养7-10天。然后，将培养的支原体株分离并浓缩，并使用0.2％福尔马林在室温下灭活72小时。对于PRRS病毒，对猪肺巨噬细胞、猪睾丸细胞系(STL)细胞或A-72细胞接种MN-HS或CNV-1，并且使用旋转培养系统在37℃培养3-5天。当接种病毒之后观察到大约80％CPE时，分离病毒并且使用0.1％福尔马林在室温下灭活48小时。关于格拉塞氏病和猪地方流行性肺炎，合适地稀释灭活的株。然后，使用UV分光光度计测定稀释株的光密度值(optical density，O.D)值(410纳米)。以1/10稀释灭活的PRRS病毒，将0.1毫升所述稀释溶液接种到猪肺巨噬细胞、猪睾丸细胞系(STL)细胞或A-72细胞，接着在37℃将细胞培养72小时。PRRS病毒接种后随着CPE的出现测定病毒含量。病毒含量超过106.0TCID50/毫升。
实施例3灭活混合疫苗的制备使用实施例2的三种抗体对各种感染培养液进行株分离、致病物质分离和灭活。疫苗成分的总含量是全部混合疫苗组合物的30％(体积/体积)。各疫苗成分的O.D.值如下副猪嗜血杆菌S4(410纳米，O.D 0.45)，副猪嗜血杆菌S5(410纳米，O.D 0.45)，猪肺炎支原体J/101(410纳米，O.D 0.1)和PRRS MN-HS(106.0TCID50/毫升)。混合疫苗组合物之后，通过铜网过滤。然后，使用氢氧化铝凝胶20％(体积/体积)吸附过滤后的组合物，然后另外加入油佐剂(IMS 1313NPR)5％(体积/体积)和EDTA 0.14％(重量/体积)，并且以1000转/分混合30分钟，得到混合物。接着，将一定量的混合物分装到瓶中并且在冷库(cold room)在2-7℃下贮存。获得的混合疫苗组合物形成两个分开的层，玫瑰粉色液体层和沉淀层，其中当摇动时，这两层容易混合成均匀溶液。组合物没有任何味道和气味。将每批疫苗样品分别转移到巯基乙酸培养基(Thioglycollate medium，Thio)、营养琼脂(Nutrient agar，NA)和营养肉汤(Nutrient broth，NB)，并且在22℃下培养7天。另外，将每批疫苗样品分别转移到巯基乙酸培养基(Thio)、营养琼脂(NA)和营养肉汤(NB)，并且在37℃下培养7天。培养期间，没有出现培养基的污染(表4)。各疫苗样品用于下面的实验。各批中福尔马林含量范围为0.19-0.20％(体积/体积)(表5)。
表4各种微生物的污染
*-没有污染表5福尔马林含量
实施例4在动物模型中安全性的评价(1)小鼠中安全性的试验对于这项试验，使用10只体重13克的小鼠和10只体重15克的小鼠。对体重13克的五只小鼠和体重15克的五只小鼠腹膜内给予各种实施例3的疫苗样品(0.5毫升，批号.1-3)。对体重13克的五只小鼠和体重15克的五只小鼠皮下给予各种实施例3的疫苗样品(0.5毫升，批号.1-3)。监测接种的小鼠并且与5只没有处理的对照小鼠比较。用本发明的混合疫苗注射的所有的小鼠在监测期都存活(表6)。
表6使用小鼠对混合疫苗的安全性试验
(2)豚鼠中安全性的试验在该项试验中使用体重300克和350克的豚鼠各12只。对体重300克和350克的各4只豚鼠肌内注射实施例3的各种疫苗样品(0.1毫升)。对体重300克和350克的各4只豚鼠真皮内注射实施例3的各种疫苗样品(0.1毫升)。对体重300克和350克的各4只豚鼠皮下注射实施例3的各种疫苗样品(0.1毫升)。监测接种的豚鼠并且与4只没有处理的对照豚鼠比较。所有的豚鼠在监测期都存活(表7)。
表7使用豚鼠的安全性试验
(3)猪仔中安全性的试验在该项试验中使用对副猪嗜血杆菌、猪肺炎支原体和PRRS病毒呈阴性抗体的18只一周龄猪仔。使用实施例3的混合疫苗(2.0毫升，批号.1)通过颈部肌肉对5只猪仔注射。同样，使用实施例3的混合疫苗(2.0毫升，批号.2)通过颈部肌肉对5只猪仔注射。此外，使用实施例3的混合疫苗(2.0毫升，批号.3)通过颈部肌肉对5只猪仔注射。对注射本发明的混合疫苗的猪仔和用于对照的3只未处理猪仔监测14天。结果，没有猪仔有临床症状，例如厌食、呼吸症状(例如咳嗽和呼吸困难)、腹泄、呕吐和神经病学上的症状(参见表8)。它们保持38.7-39.7℃范围的正常体温。
表8使用猪仔的安全性试验
●-正常实施例5免疫原性试验在该项试验中使用对副猪嗜血杆菌、猪肺炎支原体和PRRS病毒呈阴性抗体的18只一周龄猪仔。使用实施例3的混合疫苗(1.0毫升，批号.1)通过颈部肌肉对5只猪仔注射。同样，使用实施例3的混合疫苗(1.0毫升，批号.2)通过颈部肌肉对5只猪仔注射。此外，使用实施例3的混合疫苗(1.0毫升，批号.3)通过颈部肌肉对5只猪仔注射。第一次注射后2周，用和第一次使用的相同的疫苗(2.0毫升)对各猪仔通过耳肌肉附近注射。第二次注射4周后，为了测定抗体滴度，从接种了疫苗的猪仔和两只没有处理的猪仔采集血液。第一次注射2周后，对于副猪嗜血杆菌的酶联免疫吸附试验(ELISA)抗体滴度提高80-160倍，第二次注射4周后，ELISA抗体滴度提高320-1280倍。对于用作对照的未处理猪测得抗体滴度不超过10倍。第一次注射2周后，对于猪肺炎支原体ELISA抗体滴度提高80-320倍，第二次注射4周后，ELISA抗体滴度提高640-2560倍。对于用作对照的未处理猪测得抗体滴度不超过10倍。第一次注射2周后，对于PRRS病毒的抗体滴度不超过2倍，第二次注射4周后，范围是4-8倍。对于未处理对照猪测得不超过10倍的中和抗体滴度(表9)。
表9对猪仔的免疫原性试验
实施例6对豚鼠中和抗体滴度的测定在该项试验中使用12只豚鼠(300-350克)。其中10只肌内接种了1毫升本发明的混合疫苗，另外，在第一次注射三周后用相同量的混合疫苗注射。两只豚鼠用作对照。第二次注射后2周，为了测定中和抗体滴度，从所述豚鼠上采集血样。从一个农场获得8只三周龄猪仔，其中已经证实农场是抗体阴性的。用疫苗样品(2毫升)通过颈部肌肉对其中的6只注射，另外在第一次注射3周后注射。其中两只猪用作对照。分别在第一次注射之前、第一次注射后3周、第二次注射后2周和第二次注射后4周采集猪血样。使用采集的血液测定中和抗体滴度，并且将结果与如下所述的常规方法的结果相比较。也就是，常规方法包括，在56℃下将血清灭活30分钟，在含有50微升的实施例1的表3公开的细胞培养基(α-MEM)的96孔微量滴定板中将血清稀释1/2，向稀释的血清加入50微升PRRS病毒培养液(200 TCID50/0.1毫升)并且在37℃下中和1小时，另外加入含有3％胎牛血清(fetal bovineserum，FBS)的50微升培养基，含有250000个PRRS病毒敏感细胞(MARC-145、MA-104)，为了测定中和抗体滴度，混合物在37℃在5％CO2保温箱中温育5天，并且检测CPE。使用豚鼠和猪，在37℃下1小时完成中和抗体滴度测定，在4℃下48小时完成中和抗体滴度测定，并且彼此比较结果(表10和表11)。在4℃下中和48小时的情况下，加入有不同量的豚鼠新鲜血清(未加入、1重量％血清、5重量％血清)的培养基作为补体。此外，使用补体(1％新鲜豚鼠血清)在4℃下中和48小时证实结果的可再现性。也使用补体(1％新鲜豚鼠血清)在4℃下中和48小时的抗体阴性猪仔测定中和抗体滴度，这不同于常规方法。下面的表10至表14公开了这项试验的结果。从这些结果，看出豚鼠能被用作测定中和抗体滴度的极好的样本。
表10根据中和时间测定中和抗体滴度
*37℃，1小时；**4℃，48小时表11根据补体量测定中和作用
*未加入补体，**1％血清，***5％血清表12补体(1％血清)、4℃下48小时
*Choongang Vaccine Laboratory Co.，Ltd.的Sung-sik Yoo检验**Choongang Vaccine Laboratory Co.，Ltd.的Yeon-sil Lee检验***Choongang Vaccine Laboratory Co.，Ltd.的Hyeok-jin Kwon检验表13测定抗体阴性猪中对PRRS病毒的中和抗体滴度的常规方法
表14对抗体阴性猪在4℃下进行48小时的血清中和抗体滴度测定(1％血清)
实施例7长期贮存试验在冰箱中长期贮存时监测本发明的混合疫苗。疫苗样品贮存在2-7℃范围的冷暗处。贮存疫苗期间，从制备日始，每三个月对1周龄健康猪仔通过颈部肌肉注射1.0毫升所述疫苗，所用猪仔对于副猪嗜血杆菌、猪肺炎支原体和PRRS病毒呈阴性，持续21个月。第一次注射2周后，对猪仔注射2.0毫升疫苗样品。第二次注射4周后，采集血清并测定ELISA抗体滴度(副猪嗜血杆菌和猪肺炎支原体)和中和抗体滴度。在21月之前，免疫原性是有效的，稳定性是令人满意的(表15、表16、表17和表18)。
表15混合疫苗的稳定性试验(-3个月)
表16混合疫苗的稳定性试验(6-9个月)
表17混合疫苗的稳定性试验(12-15个月)
表18混合疫苗的稳定性试验(18-21个月)
实施例8实地试验(Field test)(1)猪仔安全性试验为了检验在猪仔中的安全性，挑选330只1周龄健康猪仔。330只猪仔中的30只用作对照。通过颈部肌肉对300只猪仔接种本发明的混合疫苗(2.0毫升)，并且与未处理的猪仔相比较监测14天。没有猪仔有临床症状，例如，厌食、呼吸症状(例如咳嗽和呼吸困难)、腹泄、呕吐和神经病学上的症状(参见表19)。测量接种的30只猪仔(3种疫苗样品各10只猪仔)和用作对照10只猪仔的体温。所有的猪仔表现出正常体温(表19)。证明本发明的混合疫苗对目标动物是安全的。
表19猪仔中安全性的试验
(2)猪仔中免疫原性的试验在该项试验中使用抗体对副猪嗜血杆菌、猪肺炎支原体和PRRS病毒呈阴性的31只1-周龄猪仔。通过颈部肌肉对28只猪仔给予3种混合疫苗样品(1.0毫升)。第一次注射后2周，又对猪仔通过颈部肌肉分别注射3种疫苗样品(2.0毫升)。第二次注射后4周，收集包括未处理猪仔的所有猪仔的血清。测定对副猪嗜血杆菌和猪肺炎支原体的ELISA抗体滴度。测定对PRRS病毒的中和抗体滴度。第一次注射后2周，对副猪嗜血杆菌的ELISA抗体滴度提高80-160倍，第二次注射后4周，提高320-1280倍。第一次注射后2周，对猪肺炎支原体的ELISA抗体滴度提高80-320倍，第二次注射后4周，提高640-2560倍。对于未处理对照猪测得抗体滴度不超过10倍。第一次注射后2周，对于PRRS病毒的抗体滴度不超过2倍，第二次注射后4周，范围是4-8倍。对于未处理对照猪测得不超过2倍的中和抗体滴度。
表20对猪仔的免疫原性试验
对比例在三个农场使用本发明的混合疫苗进行6个月的对照试验，其中用其他混合疫苗或一价抗原疫苗处理农场的猪。为此目的监测销售猪龄、销售率和平均体重。
表21农场和疫苗
表22本发明疫苗处理组和传统疫苗处理组的平均体重变化
表23猪的数目和平均销售猪龄
表24混合疫苗处理组和传统疫苗处理组的肺损伤评分
如表21所示，用本发明的混合疫苗接种的7周龄猪仔比用传统疫苗接种的那些猪体重增加的平均范围为1.5-2.0千克。用本发明的混合疫苗接种的11周龄猪仔比用传统疫苗接种的那些猪体重增加的平均范围为3.1-4.2千克。参考表22，注射本发明的混合疫苗的组表现出销售率增长92.2-94.9％，而用传统疫苗注射的组增长83.6-84.4％。因此，与用传统疫苗处理的组相比，平均销售猪龄缩短大约8-13天。根据表23，用传统疫苗处理的组的肺损伤评分在30.4-33％范围内，而用本发明的混合疫苗处理组的评分在5.5-8.2％范围内。根据已知方法(STRAW，B.E.等，Clinical assessment of pneumonia levelsin swine through measurement of the amount of coughing.InInternational PigVeterinary Society Congress，8，1986，Barcelona.Proceedings...BarcelonaIPVS，1986.p.275.)进行肺损伤评分测定(见图1)。
工业实用性因此，本发明的混合疫苗能有效预防猪格拉塞氏病、猪地方流行性肺炎和猪生殖和呼吸病综合征这些突出的猪呼吸病的感染。此外，本发明的混合疫苗提供防止由于新生猪仔死亡率、萎缩和每天体重增加减少，而由猪呼吸病向猪呼吸病综合征(Porcine Respiratory Disease Complex，PRDC)和断奶后多系统消瘦综合征(Post-weaning Multisystemic Wasting Syndrome，PMWS)发展的实用性方法。
权利要求
1.一种用于预防猪格拉塞氏病、猪地方流行性肺炎和猪生殖和呼吸病综合征，以及用于预防疾病发展成断奶后多系统消瘦综合征和猪呼吸病综合征的灭活混合疫苗，该疫苗含有使用福尔马林灭活的410纳米光密度为0.4-0.5的副猪嗜血杆菌S4和副猪嗜血杆菌S5(Korean National Veterinary Research and Quarantine Service)；使用福尔马林灭活的410纳米光密度为0.05-0.15的猪肺炎支原体J/101(Korean National Veterinary Research and Quarantine Service)；保藏编号为ATCC No.VR2509的MN-HS病毒或每毫升半数组织培养感染量为105.0-108.0的CNV-1病毒，其中，在猪肺巨噬细胞、猪睾丸细胞系或保藏编号为ATCC No.CRL-1542的A-72细胞中培养所述MN-HS病毒或CNV-1病毒，直到观察到80％细胞病变作用时，然后分离并灭活；和药用可接受赋形剂。
2.一种用于预防猪格拉塞氏病、猪地方流行性肺炎和猪生殖和呼吸病综合征，以及用于预防疾病发展成断奶后多系统消瘦综合征和猪呼吸病综合征的灭活混合疫苗的制备方法，该方法包括培养副猪嗜血杆菌S4及副猪嗜血杆菌S5和猪肺炎支原体J/101，并且使用福尔马林灭活；使用猪肺巨噬细胞、猪睾丸细胞系或A-72细胞培养MN-HS病毒或CNV-1病毒，当出现80％细胞病变作用时分离培养的病毒，并使用福尔马林灭活分离的病毒；测定对副猪嗜血杆菌S4及副猪嗜血杆菌S5和猪肺炎支原体J/101的酶联免疫吸附试验抗体滴度；使用豚鼠新鲜血清作为补体，测定对MN-HS病毒或CNV-1病毒的中和抗体滴度；和将灭活的疫苗成分与药用可接受赋形剂混合。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，用1-5重量％的豚鼠新鲜血清补体在4℃下中和抗体48小时后，使用豚鼠或猪仔进行使用豚鼠血清的抗病毒中和抗体滴度的测定。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其中，所述MN-HS病毒或CNV-1病毒在猪睾丸细胞系细胞或A-72细胞而不在猿细胞中培养。
全文摘要
本发明涉及用于预防猪呼吸病的灭活混合疫苗。含有一定量的灭活副猪嗜血杆菌S4和灭活副猪嗜血杆菌S5、猪肺炎支原体和PRRS病毒的本发明的灭活的混合疫苗能有效预防猪呼吸病，例如格拉塞氏病、猪地方流行性肺炎和PRRS。此外，本发明的混合疫苗能防止猪呼吸病发展成猪呼吸病综合征(PRDC)和断奶后多系统消瘦综合征(PMWS)。
文档编号A61K39/295GK1942204SQ200580011614
公开日2007年4月4日 申请日期2005年4月26日 优先权日2004年4月26日
发明者尹寅重, 李成珉, 俞成植 申请人:株式会社中央疫苗研究所