专利名称：核苷衍生物及其治疗用途的制作方法
技术领域：
本申请涉及核苷化合物和相关的合成方法、组合物和其通过给予核苷化合物用于治疗高增生疾病包括癌症的治疗方法。
背景技术：
需要作为治疗如癌症疾病的治疗分子的新的核苷化合物。需要使用已知的和新的两类核苷化合物治疗具体疾病的方法。
图1显示在皮下注射HCT116人结肠癌细胞的裸小鼠中，通过RX-3117抑制的肿瘤生长。
发明内容
一系列核苷化合物被合成并分析用于治疗活性，包括抗癌活性。本发明的核苷化合物被证明对治疗高增生疾病，包括肿瘤，例如乳腺肿瘤、结肠肿瘤、肺肿瘤和胃肿瘤有效。
发明详述定义所述的术语“核苷”、“核苷化合物”和“核苷衍生物”在本申请中可互换使用，指如下定义的式I或II的化合物。本申请中使用的所有科学和技术术语具有本领域通常使用的意思，除非另外说明。正如本申请中使用的，以下的词或短语含有具体指定的意思。
这里使用的“可药用的载体”指任何物质，当与本发明的化合物结合时，允许该化合物保持生物学活性，例如加强肥大细胞和巨噬细胞的抗菌活性的能力。实例包括但不限于任何标准的药用载体，例如磷酸盐缓冲盐溶液、水、乳化剂如油/水乳化剂，和不同类型的润湿剂。含有这些载体的组合物通过众所周知的常规方法配制(参见例如，Remington′s PharmaceuticalSciences，43章，第14版，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.)。
所述的术语“结合物(conjugate)”指由两个或更多分子之间组合而成的化合物。更具体地，在本发明中，所述的核苷衍生物可结合至，例如，共价结合至特异细胞的靶向部分(targeting moieties)，生成结合的化合物，以有效和特异地将药剂传送到感兴趣的细胞。
所述的短语“靶向部分”指用来将本发明的化合物传送到特异的位点以达到期望的活性的一种分子。靶向部分包括，例如，与在特定的细胞表面上的分子特异结合的分子。用于本发明的靶向部分包括抗细胞表面抗原抗体。细胞因子，包括白介素和因子如粒细胞/巨噬细胞刺激因子(GMCSF)，也是具体的靶向部分，已知其是结合到高水平表达它们受体的特定细胞。
所述的术语“前药部分”是一种促进本发明化合物应用的取代基，例如促进药物进入细胞或化合物的给药。所述的前药部分可从化合物中断裂，例如在体内酶促裂解。前药部分的实例包括能在体内水解的磷酸酯基、肽连接基和糖。
“治疗”指抑制、减少、调节、改善或阻断在受该病症威胁或遭受其痛苦的受治疗者中至少一种表现病理情况特征的症状。
“高增生疾病”是特征为细胞的不正常增生的疾病，一般包括皮肤疾病如牛皮癣和器官系统的良性及恶性肿瘤。后一类的高增生疾病包括，例如，乳腺癌(包括小叶癌和管癌)和其它实体瘤、癌(carcinomas)、肉瘤和癌症(cancers)，包括肺癌如小细胞癌、大细胞癌、鳞癌和腺癌，肺间皮瘤、结肠直肠癌、胃癌、前列腺癌、卵巢癌如严重的囊腺癌和粘液性囊腺癌、卵巢生殖细胞肿瘤、睾丸癌和生殖细胞瘤、胰腺癌、胆腺癌(biliaryadenocarcinoma)、肝细胞(heptacellular)癌、膀胱癌包括移行细胞癌、腺癌和鳞癌，肾细胞腺癌、子宫内膜癌包括腺癌和混合的Mullerian肿瘤(癌肉瘤)、宫颈内膜癌、外宫颈癌和阴道癌如腺癌和鳞癌，皮肤瘤如鳞状细胞癌、基底细胞癌、黑素瘤和皮肤附件瘤，食道癌、鼻咽癌和口咽癌包括鳞癌和腺癌、唾液腺癌、脑和中枢神经系统肿瘤包括神经胶质瘤、神经元瘤和脑膜源(meningeal origin)瘤，外周神经瘤、软组织肉瘤和骨和软骨肉瘤。
本发明包含核苷化合物及其在受治疗者(例如病人或其它动物受治疗者)中治疗高增生病症、疾病或情况中的应用。本发明的方法包含给予受治疗者有效量的核苷化合物。这种治疗可以，例如阻止、改善和/或抑制高增生情况的症状，和/或可以阻止或抑制例如肿瘤中例如恶性肿瘤中的细胞增生或生长。本发明的治疗策略将减轻肿瘤负担至少到可测量的程度，并提高患高增生疾病病人的存活率。在这些疾病中，对本发明药剂治疗敏感的病症和病症为肿瘤，且更具体地为不同起源的肿瘤(肺、结肠、胃、平滑肌、食道、非-何杰金(氏)淋巴瘤、非小细胞肺癌等)。
根据本发明方法中有用的化合物本发明方法中有用的化合物包含具有下式I的核苷 其中Y＝H或OH且X＝H、F、Br、I或CH3。
同样包含的为具有下式II的化合物 其中Y＝H或OH，且X＝H、F、Br或I。尽管由基于天然存在的糖的立体化学构形所例示，但本发明包括相关的立体异构体和混合物。相关的立体异构体包括它的对映体、非对映体和混合物，以及消旋混合物和两种或更多种非对映体的混合物。本发明也包括这些化合物的可药用盐。
本发明的化合物非常有效地对抗多种高增生疾病包括肿瘤。例如，本发明的化合物可有效对抗卵巢瘤、乳腺瘤、宫颈瘤、前列腺瘤、肝肿瘤、肺肿瘤、肾肿瘤、结肠瘤、胰腺肿瘤、脑肿瘤、胃肿瘤和黑素瘤。非常有效指化合物具有的IC50值为5.0μM或更少、2.0μM或更少、1.0μM或更少，或0.5μM或更少，对于一种具体肿瘤的至少一种细胞系。用于测定活性的示例性细胞系包括卵巢肿瘤的人OVCAR-3、乳腺瘤的MCF-7或MDA-MB-231、宫颈瘤的Hela、前列腺瘤的PC3或LNCap、肝肿瘤的HepG2、肺肿瘤的A549或NCI-H226、肾肿瘤的UMRC2、结肠瘤的HT-29或HCT116、胰腺瘤的PANC-1、脑肿瘤的U251、胃肿瘤的MKN-45及黑素瘤的SK-MEL-28。
药物组合物和给药本发明的化合物可以药物组合物的形式使用，由这里定义的有效量的本发明化合物和可药用的载体或稀释剂制备得到。
本发明的核苷化合物可以配制成药物组合物并对需要治疗的受治疗者例如哺乳动物如病人给药，以适应所选的给药途径的不同形式，例如口服或肠胃外途径，通过静脉、肌肉内、表面或皮下的途径。
因此，本发明的核苷化合物可通过全身给药，例如口服，与可药用的载体如惰性稀释剂或可吸收的可食用载体结合，或通过吸入或喷入。它们可包封在硬或软壳明胶胶囊中，可压缩成片剂，或可直接与病人饮食的食物结合。对于口服治疗给药，所述的核苷化合物可与一种或多种赋形剂结合并以下列形式使用可摄取的片剂、含片、糖锭、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、纸囊剂(wafer)等。所述的核苷化合物可与fme惰性的粉状载体结合并由受治疗者吸入或喷入。这种组合物和制剂应包含至少0.1％核苷化合物。该组合物和制剂的百分比当然可以是不同的，且可以方便地在所给单位剂量形式重量的大约2％至大约60％之间。这种治疗有用的组合物中的核苷化合物的量将得到有效的剂量水平。
所述的片剂、糖锭、药丸、胶囊等也可包含以下的粘合剂例如黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或白明胶；赋形剂例如磷酸二钙；崩解剂例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、褐藻酸等；润滑剂例如硬脂酸镁；以及甜味剂例如蔗糖、果糖、乳糖或阿司帕坦，或调味剂如薄荷、冬青油，或樱桃调味料可以加入。当所述的单位剂量形式是胶囊剂时，除了以上类型的物质，它可包含液体载体如植物油或聚乙二醇。其它不同的物质可作为包覆物存在或另外改变固体单位剂量形式的物理形式。例如，片剂、药丸，或胶囊剂可由明胶、蜡、虫胶或糖等包被。糖浆或酏剂可包含所述的活性化合物，蔗糖或果糖作为甜味剂，对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯作为防腐剂，颜料和香料例如樱桃或柑橘香料。当然，用于制备任何单位剂量形式使用的任何物质在使用的量上应该为可药用的和基本上无毒的。此外，所述的核苷化合物可以掺入到持续释放的制剂和装置中。
所述的核苷化合物也可通过输液或注射静脉内或腹膜内给药。该核苷化合物的溶液可在水中制备，任选地与无毒表面活性剂混合。分散体也可在甘油、液态聚乙二醇、甘油醋酸酯及其混合物和油中制备。在通常的储存和使用情况下，这些制剂可以包含防腐剂来预防微生物的生长。
所述的适合注射或输液的药物剂量形式可包括无菌水溶液或分散体或包含适合无菌可注射的无菌粉剂，其或可输液的溶液或分散体临时制剂的核苷化合物，任选地包封在脂质体中。在所有情况下，最终的剂量形式在制备和储存的情况下应为无菌的、流动的和稳定的。所述的液体载体或载体(vehicle)可为溶剂或液体分散介质，其包含例如，水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液态聚乙二醇等)、植物油、无毒甘油酯和其适合的混合物。可以保持适当的流动性，例如，通过形成脂质体、通过在分散的情况下保持需要的颗粒大小，或通过使用表面活性剂。预防微生物的作用可通过不同的抗细菌剂和抗真菌剂产生，例如，对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在很多情况下，包含等渗剂将会是优选的，例如，糖、缓冲剂或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中使用吸收延迟剂带来，例如单硬脂酸铝和明胶。
无菌可注射的溶液是通过将所述的核苷化合物以所需要的量与其它上面列举的不同成分在适当的溶剂中混合来制备，按需要，随后是过滤灭菌。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其产生活性成分粉剂和存在于先前滤过无菌的溶液中的任何附加所需成分。
对于外用，所述的核苷化合物可以纯的形式应用。然而，通常需要将它们以组合物或制剂给药到皮肤，与一种皮肤病学上可接受的载体相结合，该载体可以是固体或液体。
有用的固体载体包括细分固体例如滑石粉、粘土、微晶纤维素、二氧化硅、矾土等。其它固体载体包括无毒的聚合的毫微粒或微粒。有用的液体载体包括水、醇或乙二醇或水/醇/乙二醇混合物，其中该核苷化合物可为以有效水平溶解或分散，任选地借助于无毒表面活性剂。佐剂如香味和附加的抗微生物剂可以加入来优化对于所给用途的性质。生成的液体组合物可用于吸收垫，用于浸渍绷带和其它敷裹用品，或使用泵型或喷雾器喷到患部。
增稠剂如合成的聚合物，脂肪酸、脂肪酸盐和酯、脂肪醇、改性纤维素或改性矿物材料也可以与液体载体一起使用，从而形成可以涂开的糊剂、凝胶、软膏、皂类等，直接用于使用者的皮肤。
能够用来传送该核苷化合物到皮肤的有用的皮肤病学组合物的实例在本技术领域中已知；例如，参见Jacquet等人(美国专利号4,608,392)，Geria(美国专利号4,992,478)，Smith等人(美国专利号4,559,157)和Wortzman(美国专利号4,820,508)。
式I或II化合物的有用剂量可以通过比较它们的体外活性和动物模型中的体内活性来判定。从小鼠和其它动物中的有效剂量外推到人类中的方法在本领域中是已知的；例如，参见美国专利号4,938,949。
通常，液体组合物如洗剂中核苷化合物的浓度，将会从大约0.1-25重量％，或从大约0.5-10重量％。半固体或固体组合物如凝胶或粉剂中的浓度可为大约0.1-5重量％，或大约0.5-2.5重量％。
用于治疗中使用所需的核苷化合物的量将会随所选的具体的盐和给药途径、被治疗的疾病的特性和病人的年龄和情况改变，且最终由医生或临床医生决定。
本发明药剂的有效剂量和给药途径是依照惯例的。所述核苷化合物确切的量(有效剂量)将会按受治疗者不同而改变，取决于，例如，受治疗者的人种、年龄、体重和通常或临床的情况，被治疗的任何疾病的严重性和机理，使用的具体药剂或载体，给药方法和进程安排等。治疗有效的剂量可以通过本领域技术人员已知的常规程序以经验为主地判断。参见例如，ThePharmacological Basis of Therapeutics，Goodman和Gilman，编辑，MacmillanPublishing Co.，New York。例如，有效剂量最初或者可以在细胞培养试验中或者在合适的动物模型中估计。动物模型也可以用来判定合适的浓度范围和给药途径。然后这些信息可以用来判定在人身上的有用剂量和给药途径。治疗剂量也可以通过类比类似的治疗药剂的剂量来选择。
具体的给药方式和剂量方案将由主治医师选择，考虑病例具体情形(例如受治疗者、疾病、涉及的疾病状态以及治疗是否是预防性的)。治疗可以包含每日或多日剂量的一种或多种化合物，进行一段周期从几天到几个月，或者甚至几年。
通常，然而，合适的剂量将会在大约0.5至大约100mg/kg体重的范围，例如，每天从大约10至大约75mg/kg体重，例如每天每千克受试者身体重量3至大约50mg，6至90mg/kg/天，或在15至60mg/kg/天的范围。例如，合适的剂量可为每天0.5、5、10、25、50、100、250或500mg/kg体重。
所述的核苷化合物方便地以单位剂量形式给药；例如，每单位剂量形式包含5至1000mg、10至750mg，或50至500mg活性成分。
所述的核苷化合物可被给药到血浆浓度峰值从大约0.5至大约75μM，大约1至50μM，或者，大约2至大约30μM。典型的合意的血浆浓度包含至少或不超过0.25、0.5、1、5、10、25、50、75、100或200μM。这是可以达到的，例如，通过静脉内注射0.05至5％核苷化合物的溶液，任选地在盐水中，或以包含大约1-100mg核苷化合物的大丸剂口服给药。合意的血中浓度可以通过连续的输液以提供大约0.01-5.0mg/kg/小时来保持，例如至少或不超过0.005、0.01、0.1、2.5、5.0或10.0mg/kg/小时。或者，这种浓度可通过间断的包含大约0.4-15mg/kg的输液而得到，例如至少或不超过0.25、0.5、1.0、5.0、10.0、15.0或25.0mg/kg所述的核苷化合物。
所述的核苷化合物可方便的以单次剂量或以在适当间隔给药的分份剂量而存在，例如，每天以二、三、四或更多份的亚剂量。该亚剂量本身可以进一步细分，例如，细分成许多分离松散隔开的给药；例如从吹药器多次吸入或通过多次滴剂滴入眼中的应用。
核苷靶向至细胞在一个典型的实施方案中，所述的核苷化合物靶向至需要治疗的细胞，例如，至人的癌细胞。所述的化合物通过结合到特异结合所需细胞的靶向部分靶向至所需的细胞，从而引导结合分子的给药。有用的靶向部分是特异结合细胞抗原或细胞表面配体的配体，例如，抗B细胞抗原的抗体，CD19(如B43)等。
为形成本发明的结合物，靶向部分共价结合到核苷化合物上的位点。该靶向部分，其通常是多肽分子，结合到本发明的化合物的反应活性部位包括NH2、SH、CHO、COOH等。特殊的连接剂用来连接该化合物。连接剂根据靶向部分连接的反应活性部位来选择。
用来选择适当的连接剂和反应活性部位使靶向部分连接到本发明化合物的方法是已知的，且被描述例如在Hermanson，等人，BioconjugateTechniques，Academic Press，1996；Hermanson，等人，Immobilized AffinityLigand Techniques，Academic Press，1992；和Pierce Catalog and Handbook，1996，页码。T155-T201。
实施例本发明可进一步通过参考以下的实施例来阐明，其用来举例说明一些优选的实施方案，且不以任何方式限制本发明。
实施例1-2.核苷衍生物的合成所有无水溶剂例如乙腈、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、四氢呋喃、氯仿、和二氯甲烷在使用之前在CaH2或P2O5或Na/二苯甲酮上蒸馏。所有化合物是试剂级且买自Aldrich Chemical Company(Milwaukee，Wis.)或SigmaChemical Company(St.Louis，Mo.)。
物理特性质子核磁共振谱在Varian-400 MHz光谱仪上在氘化的溶剂如IDMSO-d6，CDCl3，乙腈-d3或丙酮-d6中记录。化学位移以百万分之一(ppm)报告，用四甲基硅烷(TMS)作为内标物且其化学位移为零ppm。耦合常数(J)以赫兹给出且缩写s、d、t、q、和m分别指单峰、双峰、三重峰、四重峰和多重峰。TLC在Merck预涂的60F254板上进行。柱色谱法使用硅胶60(230-400目，Merck)进行。
实施例1.取代的氟环戊烯醇的合成适当取代的氟环戊烯醇是由异亚丙基-D-核糖1制备的，如流程1概述。
合成中一种重要的中间体为叔烯丙基β-醇6。相应的α表异构物是抗氧化的，因此阻止中间体7的形成。中间体叔烯丙基β-醇6选择性地由其开环对应物中间体5制备。已经发现伯醇上大保护基团的存在有利于化合物5相对于其非对映的表异构物的形成，从而促进了中间体叔烯丙基β-醇6和最终氧化产物7的制备。在这点上，苄基保护基团给出了不适当的α-表异构物，叔丁基二甲基甲硅烷基保护基团显示出一些选择性(大约75∶8β∶α)，叔丁基二苯基甲硅烷基保护基团显示出更好的产率和更高的选择性，且三苯甲基提供了高产率和高立体选择性。
流程1 2，3-O-异亚丙基-5-三苯甲基-D-核糖(2)。
将异亚丙基-D-核糖1(10g，52.58mmol)和三苯甲基氯(21.95g，78.88mmol)在吡啶(250ml)中的溶液在室温搅拌20小时。加入水之后，该反应混合物用乙酸乙酯萃取，干燥，过滤，并真空蒸发。将得到的残留物用硅胶柱色谱法纯化，使用己烷和乙酸乙酯(4∶1)作为洗脱剂，得到无色油的三苯甲基醚2(21.53g，95％)；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ7.40-7.21(m，15H)，5.72(d，J＝4.0Hz，0.4H)，5.32(s，0.6H)，4.76(d，J＝5.6Hz，0.6H)，4.72(dd，J＝6.0，4.0Hz，0.4H)，4.63(d，J＝6.0Hz，0.6H)，4.57(dd，J＝6.4，1.2Hz，0.4H)，4.34-4.33(m，0.6H)，4.18-4.17(m，0.4H)，4.09(bs，2H)，3.40(dd，J＝10.4，2.8Hz，0.4H)，3.39(dd，J＝10.0，3.6Hz，0.6H)，3.32(dd，J＝10.0，3.6Hz，0.6H)，3.00(dd，J＝10.4，3.2Hz，0.4H)，1.53(s，1.2H)，1.46(s，1.8H)，1.35(s，1.2H)，1.32(s，1.8H)。
(1R)-1-((4R，5S)-2，2-二甲基-5-乙烯基-[1，3]二氧戊环-4-基)-2-三苯甲氧基-乙醇(3)。
将叔-丁醇钾(10.79g，88.26mmol，试剂纯度95％)于0℃加入至甲基三苯溴化鏻(32.28g，90.36mmol)在四氢呋喃(300ml)中的搅拌的悬浮液中，并在室温搅拌该混合物1小时。再次将该混合物冷却到0℃之后，加入内半缩醛2(18.18g，42.03mmol)在四氢呋喃(50ml)中的溶液。该反应混合物于0℃搅拌3小时，并在室温搅拌4小时。该反应混合物在水和乙酸乙酯之间分配，用盐水清洗，干燥，过滤，并在真空蒸发。得到的残留物用硅胶柱色谱法提纯，使用己烷和乙酸乙酯(8∶1)作为洗脱剂，得到白色固体的烯烃3(15.20g，82％)；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ7.45-7.21(m，15H)，5.96(td，J＝10.4，6.8Hz，1H)，5.37(td，J＝16.8，1.6Hz，1H)，5.23(td，J＝10.8，1.6Hz，1H)，4.67(t，J＝6.4，1H)，4.15(dd，J＝8.8，6.4Hz，1H)，3.77-3.71(m，1H)，3.36(dd，J＝9.6，3.6Hz，1H)，3.32(dd，J＝9.6，6.0Hz，1H)，2.37(d，J＝4.8Hz，1H)，1.36(s，3H)，1.34(s，3H)。
1-((4S，5S)-2，2-二甲基-5-乙烯基-[1，3]二氧戊环-4-基)-2-三苯甲氧基-乙酮(4)。
将DMSO(8.9ml，125.51mmol)在CH2Cl2(30ml)中的溶液于-78℃滴加至(COCl)2(28.69ml，57.38mmol，2M在CH2Cl2中的溶液)在CH2Cl2(200ml)中的搅拌的溶液，并在同样温度搅拌该反应混合物30分钟。加入醇3(15.44g，35.86mmol)在CH2Cl2(30ml)中的溶液，并将该反应混合物于-78℃搅拌1小时。将三乙胺(32.99ml，236.68mmol)于-78℃加入，然后允许该反应混合物加热到室温并搅拌1小时。小心地将饱和氯化铵溶液于0℃加入并将该反应混合物在CH2Cl2和水之间分配。将该有机层干燥、过滤并减压蒸发。该残留物用硅胶柱色谱法提纯，使用己烷和乙酸乙酯(6∶1)洗脱，得到酮4(13.83g，90％)，白色固体；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ7.46-7.23(m，15H)，5.56(ddd，J＝17.2，10.4，6.8Hz，1H)，5.26(td，J＝16.8，1.2Hz，1H)，5.13(td，J＝10.4，1.2Hz，1H)，4.88-4.84(m，1H)，4.76(d，J＝7.6Hz，1H)，4.06(d，J＝18.0Hz，1H)，3.72(d，J＝18.4Hz，1H)，1.41(s，3H)，1.34(s，3H)。
(2R)-2-((4S，5S)-2，2-二甲基-5-乙烯基-[1，3]二氧戊环-4-基)-1-三苯甲氧基-丁-3-烯-2-醇(5)。
将溴化乙烯基镁(68.44ml，68.44mmol，1.0M在四氢呋喃中的溶液)于-78℃滴加至4(14.66g，34.22mmol)在四氢呋喃(150ml)中的搅拌的溶液中，并在同样温度搅拌该反应混合物1小时。该反应混合物通过饱和的氯化铵溶液和盐水中止，并用乙酸乙酯萃取。该有机层在无水硫酸镁上干燥、过滤、并蒸发。得到的油用柱色谱法(己烷∶乙酸乙酯＝9∶1)提纯，得到白色半固体5(15.62g，100％)；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ7.43-7.22(m，15H)，6.16(dd，J＝17.2，10.8Hz，1H)，6.01-5.93(m，1H)，5.42(dd，J＝17.2，1.2Hz，1H)，5.27(dd，J＝10.8，1.2Hz，1H)，4.99(d，J＝16.0Hz，1H)，4.98(d，J＝11.2Hz，1H)，4.54-4.47(m，2H)，3.33(d，J＝8.8Hz，1H)，3.05(d，J＝8.4Hz，1H)，2.54(bs，1H)，1.46(s，3H)，1.40(s，3H)。
(3aS，4R，6aS)-2，2-二甲基-4-三苯甲氧基甲基-4，6a-二氢-3aH-环戊二烯并[1，3]二氧杂环戊烯-4-醇(6)。
将三环己基膦[1，3-二(2，4，6-三甲基苯基)-4，5-二氢咪唑-2-亚基]-[亚苄基]二氯化钌(VI)(270mg，0.32mmol)加入到5(14.55g，31.86mmol)在二氯甲烷(100ml)中的搅拌的溶液中，并在室温搅拌该反应混合物2天。该挥发物在减压下除去且该残留物用硅胶柱色谱法提纯(己烷∶乙酸乙酯＝5∶1)，得到白色半固体的6(12.83g，94％)；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ7.47-7.21(m，15H)，5.93(dd，J＝5.6，1.6Hz，1H)，5.73(d，J＝5.6Hz，1H)，5.31(d，J＝5.6Hz，1H)，4.56(d，J＝5.6Hz，1H)，3.59(d，J＝9.2Hz，1H)，3.15(d，J＝9.2Hz，1H)，3.02(s，1H)，1.32(s，3H)，1.21(s，3H)。
(3R，6aR)-2，2-二甲基-6-三苯甲氧基甲基-3a，6a-二氢-环戊二烯并[1，3]二氧杂环戊烯-4-酮(7)。
将6(12.17g，28.40mmol)、4分子筛(14.2g)和吡啶鎓重铬酸盐(32.05g，85.20mmol)在DMF(100ml)中的溶液于室温搅拌两天。将混合物用乙醚和乙酸乙酯稀释之后，该混合物通过硅胶和Celite混合物的短垫过滤。将该滤液蒸发且得到的残留物用硅胶柱色谱法提纯(己烷∶乙酸乙酯＝4∶1)，得到白色固体的酮7(11.14g，92％)；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ7.44-7.22(m，15H)，6.42(t，J＝2.0Hz，1H)，4.96(d，J＝5.2Hz，1H)，4.45(d，J＝5.6Hz，1H)，4.23(dd，J＝18.4，2.0Hz，1H)，3.93(dd，J＝18.0，2.0Hz，1H)，1.34(s，6H)。
(3R，6aR)-5-碘-2，2-二甲基-6-三苯甲氧基甲基-3a，6a-二氢-环戊二烯并[1，3]二氧杂环戊烯-4-酮(8)。
将吡啶(3.0ml，36.27mmol)在氮保护气氛下于0℃加至7(17.19g，40.30mmol)和碘(12.27g，48.36mmol)在二氯甲烷(80ml)中的搅拌的溶液中，并将该反应混合物于室温搅拌6小时。该混合物用二氯甲烷和水稀释并将该有机层用水、饱和的硫代硫酸钠溶液、盐水清洗，并在无水硫酸镁上干燥。溶剂蒸发之后，该残留物用快速硅胶柱色谱法提纯(己烷∶乙酸乙酯＝7∶1)，得到白色固体8(16.03g，72％)；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ7.43-7.15(m，15H)，5.35(d，J＝5.6Hz，1H)，4.45(d，J＝5.6Hz，1H)，4.19(d，J＝16.0Hz，1H)，4.08(d，J＝16.0Hz，1H)，1.36(s，3H)，1.24(s，3H)。
(3R，4R，6aR)-5-碘-2，2-二甲基-6-三苯甲氧基甲基-4，6a-二氢-3aH-环戊二烯并[1，3]二氧杂环戊烯-4-醇(9)。
将硼氢化钠(676mg，17.88mmol)于0℃加至8(8.97g，16.25mmol)和氯化铈(III)七水合物(6.66g，17.88mmol)在甲醇(80ml)中的搅拌的溶液中，并将该混合物以相同温度搅拌1小时。该混合物用盐水稀释并用乙酸乙酯萃取。该有机层用盐水清洗，在无水硫酸镁上干燥，并蒸发。该残留物用快速硅胶柱色谱法提纯(己烷∶乙酸乙酯＝6∶1)，得到白色固体9(8.56g，95％)；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ7.48-7.20(m，15H)，5.20(d，J＝5.6Hz，1H)，4.76(t，J＝5.6Hz，1H)，3.88(d，J＝12.0Hz，1H)，3.79(d，J＝12.0Hz，1H)，2.78(d，J＝10.4Hz，1H)，1.40(s，3H)，1.30(s，3H)。
(3R，4R，6aR)-叔-丁基-(5-碘-2，2-二甲基-6-三苯甲氧基甲基-4，6a-二氢-3aH-环戊二烯并[1，3]二氧杂环戊烯-4-基氧)-二苯基-甲硅烷(10)。
将TBDPSCl(4.80ml，18.47mmol)于室温在氮保护气氛下加至9(8.53g，15.39mmol)和咪唑(3.14g，46.17mmol)在无水N，N-二甲基甲酰胺(70ml)中的搅拌的溶液中，并将该反应混合物以相同温度搅拌过夜。该混合物用水终止，用乙醚萃取，在无水硫酸镁上干燥，并蒸发。该残留物用快速硅胶柱色谱法提纯(己烷∶乙酸乙酯＝30∶1)，得到无色油的10(11.66g，96％)；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ7.82-7.18(m，25H)，4.94(d，J＝5.6Hz，1H)，4.47(d，J＝5.6Hz，1H)，4.05(d，J＝5.6Hz，1H)，3.89(d，J＝12.0Hz，1H)，3.78(d，J＝12.0Hz，1H)，1.29(s，3H)，1.25(s，3H)，1.13(s，9H)。
(3R，4R，6aR)-叔-丁基-(5-氟-2，2-二甲基-6-三苯甲氧基甲基-4，6a-二氢-3aH-环戊二烯并[1，3]二氧杂环戊烯-4-基氧)-二苯基-甲硅烷(11)。
将正-丁基锂(27.6ml，44.13mmol，1.6 M在己烷中的溶液)于-78℃在氮保护气氛缓慢地加入至10(11.66g，14.71mmol)和N-氟苯磺酰亚胺(5.566g，17.65mmol)在无水四氢呋喃(100ml)中的搅拌的溶液中，并将反应混合物以相同温度搅拌1小时。该混合物用饱和的氯化铵溶液终止并用乙酸乙酯萃取。该有机层在无水硫酸镁上干燥，并蒸发。该残留物用快速硅胶柱色谱法提纯(己烷∶乙酸乙酯＝6∶1)，得到白色固体的11(7.35g，73％)；
1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ7.81-7.17(m，25H)，4.94(t，J＝7.2Hz，1H)，4.35(m，1H)，4.25(m，1H)，3.89(t，J＝12.0Hz，1H)，3.77(t，J＝12.0Hz，1H)，1.42(s，3H)，1.38(s，3H)，1.08(s，9H)。
(3R，4R，6aR)-5-氟-2，2-二甲基-6-三苯甲氧基甲基-4，6a-二氢-3aH-环戊二烯并[1，3]二氧杂环戊烯-4-醇(12)。
将四-正-丁基铵氟化物(12.88ml，12.88mmol，1.0M在四氢呋喃中)滴加至11(7.35g，10.73mmol)在四氢呋喃(50ml)中的搅拌的溶液中，并将该混合物于室温搅拌1小时。除去溶剂之后，该残留物用快速硅胶柱色谱法提纯(己烷∶乙酸乙酯＝4∶1)，得到无色油的12(4.31g，90％)；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ7.43-7.18(m，15H)，5.12(t，J＝5.6Hz，1H)，4.69(m，1H)，4.38(t，J＝5.6Hz，1H)，3.91(d，J＝13.2Hz，1H)，3.74(d，J＝13.2Hz，1H)，2.75(d，J＝10.4Hz，1H)，1.43(s，3H)，1.39(s，3H)。
实施例2.2-氟环戊烯基核苷的合成氟-环戊烯醇12结合到受保护的N3-苯甲酰基碱基上，如流程2概述。
碱基缩合的一般过程将二乙基偶氮二羧酸酯(780mg，4.48mmol)在无水四氢呋喃(30ml)中的溶液于0℃在氮保护气氛下滴加至氟-环戊烯醇12(800mg，1.79mmol)、三苯基膦(1174.8mg，4.48mmol)和选定的N3-苯甲酰基碱基(尿嘧啶衍生物，3.58mmol)在四氢呋喃(10ml)中的溶液中。该反应混合物于室温搅拌15小时，然后在减压下蒸发挥发物。该残留物用快速硅胶柱色谱法提纯(己烷∶乙酸乙酯＝4∶1)，得到缩合碱基的产物。
流程2 缩合产物13-18的产率和光谱数据如下(3R，4S，6aR)-3-苯甲酰基-1-(5-氟-2，2-二甲基-6-三苯甲氧基甲基-4，6a-二氢-3aH-环戊二烯并[1，3]二氧杂环戊烯-4-基)-1H-嘧啶-2，4-二酮(13)。865.5mg，75％；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ7.97-7.24(m，15H)，7.66(d，J＝8.0Hz，1H)，5.92(d，J＝8.0Hz，1H)，5.49(bs，1H)，4.72(t，J＝6.0Hz，1H)，4.35(d，J＝13.2Hz，1H)，4.29(t，J＝6.0Hz，1H)，4.15(dt，J＝13.2，2.4Hz，1H)，1.43(s，3H)，1.34(s，3H)。
(3R，4S，6aR)-3-苯甲酰基-1-(5-氟-2，2-二甲基-6-三苯甲氧基甲基-4，6a-二氢-3aH-环戊二烯并[1，3]二氧杂环戊烯-4-基)-5-氟-1H-嘧啶-2，4-二酮(14)。924.6mg，78％；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ7.94-7.24(m，15H)，7.13(d，J＝5.2Hz，1H)，5.33(td，J＝6.0，0.8Hz，1H)，5.27(bs，1H)，4.62(t，J＝7.2Hz，1H)，4.03(d，J＝12.8Hz，1H)，3.87(dt，J＝12.8，2.4Hz，1H)，1.44(s，3H)，1.36(s，3H)。
(3R，4S，6aR)-3-苯甲酰基-5-氯-1-(5-氟-2，2-二甲基-6-三苯甲氧基甲基-4，6a-二氢-3aH-环戊二烯并[1，3]二氧杂环戊烯-4-基)-1H-嘧啶-2，4-二酮(15)。875.3mg，72％；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ7.95-7.21(m，15H)，7.83(s，1H)，5.42(td，J＝6.0，0.8Hz，1H)，5.35(bs，1H)，4.65(t，J＝7.2Hz，1H)，3.99(d，J＝12.8Hz，1H)，3.75(dt，J＝12.8，2.4Hz，1H)，1.43(s，3H)，1.32(s，3H)。
(3R，4S，6aR)-3-苯甲酰基-5-溴-1-(5-氟-2，2-二甲基-6-三苯甲氧基甲基-4，6a-二氢-3aH-环戊二烯并[1，3]二氧杂环戊烯-4-基)-1H-嘧啶-2，4-二酮(16)。893.7mg，69％；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ8.04(s，1H)，7.97-7.28(m，15H)，5.29(td，J＝6.0，0.8Hz，1H)，5.25(bs，1H)，4.71(t，J＝7.2Hz，1H)，4.15(d，J＝12.8Hz，1H)，3.95(dt，J＝12.8，2.4Hz，1H)，1.41(s，3H)，1.37(s，3H)。
(3R，4S，6aR)-3-苯甲酰基-1-(5-氟-2，2-二甲基-6-三苯甲氧基甲基-4，6a-二氢-3aH-环戊二烯并[1，3]二氧杂环戊烯-4-基)-5-碘-1H-嘧啶-2，4-二酮(17)。855.2mg，62％；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ8.26(s，1H)，7.93-7.22(m，15H)，5.38(td，J＝6.0，0.8Hz，1H)，5.29(bs，1H)，4.73(t，J＝7.2Hz，1H)，4.14(d，J＝12.8Hz，1H)，3.97(dt，J＝12.8，2.4Hz，1H)，1.48(s，3H)，1.34(s，3H)。
(3R，4S，6aR)-3-苯甲酰基-1-(5-氟-2，2-二甲基-6-三苯甲氧基甲基-4，6a-二氢-3aH-环戊二烯并[1，3]二氧杂环戊烯-4-基)-5-甲基-1H-嘧啶-2，4-二酮(18)。990.4mg，84％；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ7.94-7.22(m，15H)，7.25(s，1H)，5.43(td，J＝6.0，0.8Hz，1H)，5.19(bs，1H)，4.52(t，J＝7.2Hz，1H)，4.13(d，J＝12.8Hz，1H)，4.01(dt，J＝12.8，2.4Hz，1H)，2.02(s，3H)，1.44(s，3H)，1.36(s，3H)。
脱保护的一般过程将受保护的化合物13-18(1.00mmol)溶解于10ml的1N HCl/甲醇(2∶1，v/v)中，且该反应混合物于室温搅拌20小时。在减压下除去溶剂，将所得到的残留物用快速硅胶柱色谱法提纯(二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)，得到N-苯甲酰基尿嘧啶衍生物。
从上面得到的N-苯甲酰基尿嘧啶衍生物用10ml氨甲醇溶液处理，并将该混合物于室温在密封管中搅拌过夜。蒸发该反应混合物且该残留物用快速硅胶柱色谱法提纯(二氯甲烷∶甲醇＝5∶1)，从乙醚/甲醇结晶，得到表1的尿嘧啶衍生物。
表1.尿嘧啶衍生物
尿嘧啶衍生物19-24的产率和光谱数据如下(1S，4R，5S)-1-(2-氟-4，5-二羟基-3-羟基甲基-环戊-2-烯基)-1H-嘧啶-2，4-二酮(19，RX-3116)。170.4mg，66％；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ7.48(d，J＝8.0Hz，1H)，5.74(d，J＝8.0Hz，1H)，5.44(bs，1H)，4.68(t，J＝5.2Hz，1H)，4.37(d，J＝12.8Hz，1H)，4.20(td，J＝5.6，0.8Hz，1H)，4.12(dt，J＝12.8，2.4Hz，1H)。
(1S，4R，5S)-5-氟-1-(2-氟-4，5-二羟基-3-羟基甲基-环戊-2-烯基)-1H-嘧啶-2，4-二酮(20，RX-3116A)。168.5mg，61％；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ7.74(dd，J＝6.4，0.8Hz，1H)，5.46(bs，1H)，4.67(td，J＝5.6，1.2Hz，1H)，4.37(d，J＝12.8Hz，1H)，4.18(td，J＝5.6，1.2Hz，1H)，4.12(dt，J＝12.8，2.4Hz，1H)。
(1S，4R，5S)-5-氯-1-(2-氟-4，5-二羟基-3-羟基甲基-环戊-2-烯基)-1H-嘧啶-2，4-二酮(21，RX-3116B)。190.2mg，65％；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ8.43(s，1H)，5.45(bs，1H)，4.69(td，J＝5.6，1.2Hz，1H)，4.35(d，J＝12.8Hz，1H)，4.20(td，J＝5.6，1.2Hz，1H)，4.15(dt，J＝12.8，2.4Hz，1H)。
(1S，4R，5S)-5-溴-1-(2-氟-4，5-二羟基-3-羟基甲基-环戊-2-烯基)-1H-嘧啶-2，4-二酮(22，RX-3116C)。192.1mg，57％；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ8.59(s，1H)，5.43(bs，1H)，4.64(td，J＝5.6，0.8Hz，1H)，4.35(d，J＝12.8Hz，1H)，4.16(td，J＝5.6，0.8Hz，1H)，4.11(dt，J＝12.8，2.4Hz，1H)。
(1S，4R，5S)-1-(2-氟-4，5-二羟基-3-羟基甲基-环戊-2-烯基)-5-碘-1H-嘧啶-2，4-二酮(23，RX-3116D)。195.9mg，51％；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ8.67(s，1H)，5.46(bs，1H)，4.66(td，J＝5.6，1.2Hz，1H)，4.36(d，J＝12.8Hz，1H)，4.15(td，J＝5.6，1.2Hz，1H)，4.08(dt，J＝12.8，2.4Hz，1H)。
(1S，4R，5S)-1-(2-氟-4，5-二羟基-3-羟基甲基-环戊-2-烯基)-5-甲基-1H-嘧啶-2，4-二酮(24，RX-3116E)。204.2mg，75％；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ7.62(s，1H)，5.49(bs，1H)，4.69(td，J＝5.6，1.2Hz，1H)，4.36(d，J＝13.2Hz，1H)，4.17(td，J＝5.6，1.2Hz，1H)，4.10(dt，J＝13.2，2.4Hz，1H)，1.82(s，3H)。
转化为胞嘧啶衍生物的一般过程将表1的尿嘧啶化合物19-24(1.00mmol)在无水吡啶(10ml)中的溶液用醋酸酐(940μl，10.0mmol)处理，并将该混合物于环境温度搅拌5小时。所有挥发物蒸发后，将得到的残留物用二氯甲烷稀释；用稀释的HCl、饱和的NaHCO3溶液和盐水清洗；用MgSO4干燥；过滤，并蒸发。包含三乙酸盐的残留物不用进一步提纯在下一步使用。
将1，2，4-三唑(760mg，11.0mmol)和三氯氧磷(915μl，10.0mmol)在乙腈(10ml)中的溶液用4ml乙腈中的三乙胺(1.25ml，9.0mmol)和甘油三乙酸酯(triacetate)(1.00mmol)处理。该反应混合物于室温搅拌15小时。另外加入三乙胺(1.5ml)和水(4.5ml)，且搅拌该混合物10分钟。用二氯甲烷稀释后，该混合物用饱和的NaHCO3溶液和盐水清洗，用MgSO4干燥，过滤，并蒸发。该残留物不用进一步提纯在下一步使用。
将氢氧化铵(28％，2ml)于0℃加入至上述残留物在1，4-二噁烷(8ml)中的溶液中，且将该反应混合物在环境温度搅拌10小时。除去所有挥发物后，该残留物溶解于氨的甲醇溶液(5ml)且在环境温度搅拌12小时。使该反应混合物蒸发，且将残留物用ODS柱色谱法提纯(水∶丙酮＝20∶1)，从乙醚/甲醇结晶，得到表2的胞嘧啶衍生物。
表2.胞嘧啶衍生物
胞嘧啶衍生物25-29的产率和光谱数据如下(1S，4R，5S)-4-氨基-1-(2-氟-4，5-二羟基-3-羟基甲基-环戊-2-烯基)-1H-嘧啶-2-酮(25，RX-3117)。133.8mg，52％；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ7.47(d，J＝7.6Hz，1H)，5.92(d，J＝7.6Hz，1H)，5.35(bs，1H)，4.69(t，J＝5.6Hz，1H)，4.36(d，J＝12.8Hz，1H)，4.26(td，J＝5.6，0.8Hz，1H)，4.11(dt，J＝12.8，2.4Hz，1H)。
(1S，4R，5S)-4-氨基-5-氟-1-(2-氟-4，5-二羟基-3-羟基甲基-环戊-2-烯基)-1H-嘧啶-2-酮(26，RX-3117A)。156.9mg，57％；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ7.79(d，J＝6.4Hz，1H)，5.41(bs，1H)，4.68(td，J＝5.6，1.2Hz，1H)，4.37(d，J＝12.8Hz，1H)，4.23(td，J＝5.6，1.2Hz，1H)，4.12(dt，J＝12.8，2.4Hz，1H)。
(1S，4R，5S)-4-氨基-5-氯-1-(2-氟-4，5-二羟基-3-羟基甲基-环戊-2-烯基)-1H-嘧啶-2-酮(27，RX-3117B)。134.2mg，46％；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ8.50(s，1H)，5.37(bs，1H)，4.70(td，J＝5.6，1.2Hz，1H)，4.41(d，J＝12.8Hz，1H)，4.25(td，J＝5.6，1.2Hz，1H)，4.17(dt，J＝12.8，2.4Hz，1H)。
(1S，4R，5S)-4-氨基-5-溴-1-(2-氟-4，5-二羟基-3-羟基甲基-环戊-2-烯基)-1H-嘧啶-2-酮(28，RX-3117C)。164.7mg，49％；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ8.62(s，1H)，5.41(bs，1H)，4.69(td，J＝5.6，1.2Hz，1H)，4.40(d，J＝12.8Hz，1H)，4.22(td，J＝5.6，1.2Hz，1H)，4.14(dt，J＝12.8，2.4Hz，1H)。
(1S，4R，5S)-4-氨基-1-(2-氟-4，5-二羟基-3-羟基甲基-环戊-2-烯基)-5-碘-1H-嘧啶-2-酮(29，RX-3117D)。160.9mg，42％；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ8.70(s，1H)，5.43(bs，1H)，4.66(td，J＝5.6，0.8Hz，1H)，4.34(d，J＝12.8Hz，1H)，4.21(td，J＝5.6，0.8Hz，1H)，4.08(dt，J＝12.8，2.4Hz，1H)。
脱氧的一般过程将DMAP(1.00mmol)和1，3-二氯-1，1，3，3-四异丙基二硅氧烷(0.75mmol)于环境温度加入至表1的尿嘧啶衍生物(0.50mmol)在吡啶(5ml)中的搅拌的溶液中。10小时之后，除去溶剂，且该残留物在二氯甲烷和水之间分配。该有机层用盐水清洗，然后在无水硫酸镁上干燥。该溶剂在减压下除去且该粗制残留物不用进一步提纯在下一步使用。
将4-二甲基氨基)吡啶(1.00mmol)和苯基氯硫代甲酸酯(0.60mmol)加入至粗制残留物在无水乙腈(5ml)中的搅拌的溶液中，然后允许该反应混合物加热在室温搅拌5小时。该混合物在二氯甲烷和盐水之间分配，且该有机层用盐水清洗，在无水硫酸镁上干燥，并过滤。除去挥发物且将该含有苯基硫代酯的残留物不用进一步提纯用于在接下来的自由基反应中。
将三乙基硼(1.00mmol，1.0M在己烷中的溶液)和氢化三丁基锡(1.00mmol)加入至含有苯基硫代酯的残留物在无水苯中的搅拌的溶液中，且该反应混合物于环境温度搅拌过夜。蒸发该混合物，且该残留物用硅胶柱色谱法(二氯甲烷∶甲醇＝20∶1)提纯，得到脱氧产物。
将四-正-丁基铵氟化物(1.20mmol，1.0M在四氢呋喃中)滴加入至该脱氧产物在四氢呋喃(5ml)中的搅拌的溶液中，且将该混合物于室温搅拌5小时。除去溶剂之后，该残留物用快速硅胶柱色谱法提纯(二氯甲烷∶甲醇＝5∶1)，从乙醚/甲醇结晶，得到表3的2’-脱氧尿嘧啶衍生物。
表3.2’-脱氧尿嘧啶衍生物
脱氧尿嘧啶衍生物30-35的产率和光谱数据如下(1S，4R)-1-(2-氟-4-羟基-3-羟基甲基-环戊-2-烯基)-1H-嘧啶-2，4-二酮(30，RX-3216)。63.0mg，52％；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ7.50(d，J＝8.0Hz，1H)，5.85(d，J＝8.0Hz，1H)，5.52(bs，1H)，4.62(d，J＝12.8Hz，1H)，4.39(d，J＝12.8Hz，1H)，4.25(m，1H)，2.05-2.18(m，2H)。
(1S，4R)-5-氟-1-(2-氟-4-羟基-3-羟基甲基-环戊-2-烯基)-1H-嘧啶-2，4-二酮(31，RX-3216A)。63.7mg，49％；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ7.75(d，J＝6.4Hz，1H)，5.55(bs，1H)，4.65(d，J＝12.8Hz，1H)，4.34(d，J＝12.8Hz)，4.15(m，1H)，2.04-2.20(m，2H)。
(1S，4R)-5-氯-1-(2-氟-4-羟基-3-羟基甲基-环戊-2-烯基)-1H-嘧啶-2，4-二酮(32，RX-3216B)。65.0mg，47％；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ8.39(s，1H)，5.35(bs，1H)，4.69(d，J＝12.8Hz，1H)，4.37(d，J＝12.8Hz，1H)，4.20(m，1H)，2.05-2.18(m，2H)。
(1S，4R)-5-溴-1-(2-氟-4-羟基-3-羟基甲基-环戊-2-烯基)-1H-嘧啶-2，4-二酮(33，RX-3216C)。72.2mg，45％；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ8.57(s，1H)，5.35(bs，1H)，4.69(d，J＝12.8Hz，1H)，4.37(d，J＝12.8Hz，1H)，4.20(m，1H)，2.08-2.22(m，2H)。
(1S，4R)-1-(2-氟-4-羟基-3-羟基甲基-环戊-2-烯基)-5-碘-1H-嘧啶-2，4-二酮(34，RX-3216D)。75.5mg，41％；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ8.69(s，1H)，5.39(bs，1H)，4.67(d，J＝12.8Hz，1H)，4.37(d，J＝12.8Hz，1H)，4.16(m，1H)，2.01-2.17(m，2H)。
(1S，4R)-1-(2-氟-4-羟基-3-羟基甲基-环戊-2-烯基)-5-甲基-1H-嘧啶-2，4-二酮(35，RX-3216E)。67.9mg，53％；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ7.72(s，1H)，5.39(bs，1H)，4.68(d，J＝12.8Hz，1H)，4.37(d，J＝12.8Hz，1H)，4.15(m，1H)，2.10-2.25(m，2H)。
转化为胞嘧啶衍生物一般过程用醋酸酐(470μl，5.0mmol)处理表3的尿嘧啶化合物(0.5mmol)在无水吡啶(5ml)中的溶液，且将该混合物于环境温度搅拌5小时。将得到的残留物在蒸发所有挥发物之后用二氯甲烷稀释；用稀释的HCl、饱和的NaHCO3溶液和盐水清洗；用MgSO4干燥；过滤，并蒸发。该包含三乙酸酯的残留物不用进一步提纯在下一步使用。
用在4ml乙腈中的三乙胺(1.25ml，9.0mmol)和甘油三乙酸酯(1.00mmol)处理1，2，4-三唑(760mg，11.0mmol)和三氯氧磷(915μl，10.0mmol)在乙腈(10ml)中的溶液。该反应混合物于室温搅拌15小时。另外加入三乙胺(1.5ml)和水(4.5ml)，且将该混合物搅拌10分钟。用二氯甲烷稀释之后，该混合物用饱和的NaHCO3溶液和盐水清洗，用MgSO4干燥，过滤，并蒸发。该残留物不用进一步提纯在下一步使用。
将氢氧化铵(28％，2ml)于0℃加入至上述残留物在1，4-二噁烷(8ml)中的溶液，且该反应混合物于环境温度搅拌10小时。除去所有挥发物后，将该残留物溶解于氨的甲醇溶液(5ml)且于环境温度搅拌12小时。蒸发该反应混合物，且该残留物用ODS柱色谱法提纯(水∶丙酮＝20∶1)，从乙醚/甲醇结晶，得到表4的2’-脱氧胞嘧啶衍生物。
表4.2’-脱氧胞嘧啶衍生物
脱氧胞嘧啶衍生物36-40的产率和光谱数据如下(1S，4R)-4-氨基-1-(2-氟-4-羟基-3-羟基甲基-环戊-2-烯基)-1H-嘧啶-2-酮(36，RX-3217)。63.9mg，53％；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ7.48(d，J＝8.0Hz，1H)，5.95(d，J＝8.0Hz，1H)，5.40(bs，1H)，4.37(d，J＝12.8Hz，1H)，4.20(m，1H)，4.08(d，J＝12.8Hz，1H)，2.04-2.19(m，1H)。
(1S，4R)-4-氨基-5-氟-1-(2-氟-4-羟基-3-羟基甲基-环戊-2-烯基)-1H-嘧啶-2-酮(37，RX-3217A)。53.1mg，41％；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ7.81(d，J＝6.4Hz，1H)，5.39(bs，1H)，4.37(d，J＝12.8Hz，1H)，4.25(m，1H)，4.11(d，J＝12.8Hz，1H)，2.08-2.21(m，1H)。
(1S，4R)-4-氨基-5-氯-1-(2-氟-4-羟基-3-羟基甲基-环戊-2-烯基)-1H-嘧啶-2-酮(38，RX-3217B)。62.0mg，45％；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ8.51(s，1H)，5.39(bs，1H)，4.45(d，J＝12.8Hz，1H)，4.23(m，1H)，4.18(d，J＝12.8Hz，1H)，2.05-2.16(m，2H)。
(1S，4R)-4-氨基-5-溴-1-(2-氟-4-羟基-3-羟基甲基-环戊-2-烯基)-1H-嘧啶-2-酮(39，RX-3217C)。76.8mg，48％；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ8.61(s，1H)，5.46(bs，1H)，4.41(d，J＝12.8Hz，1H)，4.23(m，1H)，4.16(d，J＝12.8Hz，1H)，2.08-2.17(m，2H)。
(1S，4R)-4-氨基-1-(2-氟-4-羟基-3-羟基甲基-环戊-2-烯基)-5-碘-1H-嘧啶-2-酮(40，RX-3217D)。64.2mg，35％；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ8.63(s，1H)，5.38(s，1H)，4.35(d，J＝12.8Hz，1H)，4.19(m，1H)，4.11(d，J＝12.8Hz，1H)，2.11-2.23(m，2H)。
实施例3.核苷化合物的细胞生长抑制癌细胞系的生长用于测定核苷化合物效果的癌细胞系从以下来源获得人OVCAR-3(卵巢)，MCF-7(乳腺，激素依赖的)，MDA-MB-231(乳腺)，HeLa(宫颈)，PC3(前列腺)，LNCap(前列腺)，HepG2(肝)，A549(肺)，NCI-H226(肺)，HT-29(结肠)，HCT116(结肠)，SK-MEL-28(黑素瘤)和PANC-1(胰腺)来自American Type Culture Collection(ATCC)(Manassas，VA)；U251(脑)来自Riken(日本)；MKN-45(胃)来自DSMZ(德国)；UMRC2(肾)来自美国国立癌症研究所(Bethesda，MD)。除了MDA-MB-231、HCT116、UMRC2和PANC-1，所有细胞系生长在RPMI1640培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，并补充10％胎牛血清(″FBS″)、1mM丙酮酸钠、10mM HEPES和100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素(″P/S″)。MDA-MB-231、HCT116、UMRC2和PANC-1细胞保存在Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基(″DMEM″，Invitrogen)中，并补充10％FBS，P/S，10mM HEPES和2mM L-谷氨酰胺。所有细胞于37℃在加湿的5％CO2下培养。
细胞生长抑制测定核苷衍生物对抗不同的人肿瘤细胞的生长抑制可以被评价。研究了所述化合物上的特定取代基的相对重要性。根据上述所制备的核苷衍生物，使用DMSO作为对照来测试。
使用Sulforhodamine B(″SRB″)方法(Skehan等人，J.National CancerInstitute，821107-1112(1990))来进行RX-3117对抗16种人肿瘤细胞系的生长抑制测试。简言之，指数生长的肿瘤细胞以2-3×103细胞/孔的密度接种于96-孔板，且第二天用核苷化合物处理。每一处理使用三个孔。细胞与不同的化合物于37℃在加湿的5％CO2气氛下培养培养96小时。在96小时培养之后，细胞用10％三氯乙酸(“TCA”)固定，于4℃培养1小时，用自来水清洗3遍。随后，细胞用1％乙酸中的0.4％Sulforhodamine B染色30分钟，用1％乙酸清洗4遍，并再次风干。在10mM Tris溶液中振荡5分钟之后，使用Benehmark PlusMicroplate reader(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)于530nm处测定每孔的吸光度。
为了将OD530值转化成每孔中活细胞的数量，将该OD530值与用于每个细胞系所产生的标准OD530-对-细胞数量曲线进行比较。该百分存活率使用下式计算％存活率＝活细胞数量[测试的]/活细胞数量[对照的]×100IC50值通过非线性回归分析计算。
表5概括了利用RX-3117测定的细胞生长的抑制(IC50，μM)。
表5RX-3117对抗人癌细胞系的细胞生长的抑制(IC50，μM)
如表5中所示，本发明的核苷衍生物在对抗大范围的肿瘤细胞系都有效。
实施例4.体外异种移植研究为了观察动物模型中肿瘤生长的抑制，使用RX-3117进行裸小鼠的体外异种移植研究。合适的人癌细胞系是那些已经被用于癌细胞生长抑制测试的，尤其优选的为结肠癌HCT116。通过对抗裸小鼠中皮下注射肿瘤异种移植物评价RX-3117的抗癌功效，且在RX-3117处理之后测量肿瘤体积。
HCT116细胞悬浮液(2×106细胞在0.1ml RPMI中)在第0天皮下注射到六周龄雄性无胸腺小鼠(BALB/c nu/nu)的右侧腹。用HCT116细胞悬浮液注射足够数量的小鼠，以便在治疗开始的那天被选出用于试验的肿瘤的体积范围越窄越好。带有在恰当尺寸范围中的肿瘤的动物被分配成不同的处理组。RX-3117溶解于PBS中的10％DMSO中，且溶剂单独作为对照。所有研究药物(对照，RX-31172mg/kg/天，RX-311710mg/kg/天)通过腹腔内注射给药，每周三次，从第5天开始到第37天结束。为了量化肿瘤的生长，每3-5天用测径器测量肿瘤的三项垂直的直径，并监测小鼠的体重用于评价毒性。肿瘤体积使用下式计算肿瘤体积(mm3)＝(宽)×(长)×(高)×π/6。
每组动物的肿瘤体积(平均数±SEM)呈现在图1中，其显示了肿瘤体积的测量，作为RX-3117对抗HCT116人结肠癌异种移植物功效的指标。观察到该RX-3117处理具有很好的耐受性，没有死亡和不超过1g的体重波动。第37天之后，用RX-3117以2和10mg/kg治疗的小鼠中的肿瘤体积相对对照显著地减小。因此，如图1中所示的，RX-3117引起用HCT116人结肠癌细胞皮下注射的裸小鼠中肿瘤生长的抑制。
本说明书中图解和讨论的实施方案目的仅仅是向本领域的技术人员教导发明者知道的制备和使用本发明的最好的方法。任何在本说明书中的都不该被考虑为限制本发明的范围。所有呈现的实施例是有代表性的且非限制性的。本发明上述的实施方案可在不偏离由在了解了本发明上述教导之后的本领域的技术人员所意识到的本发明的范围之内修改或改变。因此应当理解，在本发明的权利要求的范围及其等同范围内，本发明可按不同于本发明描述的方案来实践。
权利要求
1.一种治疗高增生疾病的方法，其包括对需要这种治疗的受治疗者给药组合物由此治疗高增生疾病，所述的组合物含有下式化合物 其中Y＝H或OH，且X＝H、F、Cl、Br、I，或CH3或下式化合物 其中Y＝H或OH，且X＝H、F、Cl、Br，或I，或其可药用盐。
2.权利要求1的方法，其中所述的化合物为 其中Y＝H或OH，且X＝H、F、Cl、Br、I，或CH3，或者 其中Y＝H或OH，且X＝H、F、Cl、Br，或I。
3.权利要求1的方法，其中所述化合物具有下式
4.权利要求1的方法，其中所述化合物具有下式
5.权利要求1的方法，其中所述化合物为
6.权利要求1的方法，其中所述高增生疾病包含肿瘤。
7.权利要求1的方法，所述的组合物进一步包含可药用载体或稀释剂。
8.权利要求6的方法，所述肿瘤选自卵巢肿瘤、乳腺肿瘤、宫颈肿瘤、前列腺肿瘤、肝肿瘤、肺肿瘤、肾肿瘤、结肠肿瘤、胰腺肿瘤、脑肿瘤、胃肿瘤和黑素瘤。
9.下式化合物 其中A是 或 Y＝H或OH，且X＝H、F、Cl、Br、I，或CH3；条件是，当A是 的时候，X不是CH3。
10.权利要求9的化合物，其具有下式 其中Y＝H或OH，且X＝H、F、Cl、Br、I或CH3。
11.权利要求9的化合物，其具有下式 其中Y＝H或OH，且X＝H、F、Cl、Br或I。
12.权利要求9的化合物，其是
13.药用组合物，其包含治疗有效量的根据权利要求9的化合物，或其可药用盐，和可药用载体或稀释剂。
14.根据权利要求9的化合物，对于至少一种肿瘤细胞系具有的IC50不超过10μM，所述的肿瘤选自卵巢肿瘤、乳腺肿瘤、宫颈肿瘤、前列腺肿瘤、肝肿瘤、肺肿瘤、肾肿瘤、结肠肿瘤、胰腺肿瘤、脑肿瘤、胃肿瘤和黑素瘤。
15.根据权利要求14的化合物，其中所述细胞系选自卵巢肿瘤的人OVCAR-3、乳腺肿瘤的MCF-7或MDA-MB-231、宫颈肿瘤的HeLa、前列腺肿瘤的PC3或LNCap、肝肿瘤的HepG2、肺肿瘤的A549或NCI-H226、肾肿瘤的UMRC2、结肠肿瘤的HT-29或HCT116、胰腺肿瘤的PANC-1、脑肿瘤的U251、胃肿瘤的MKN-45和黑素瘤的SK-MEL-28。
16.权利要求14的化合物，其具有的IC50不超过1.0μM。
17.权利要求14的化合物，其具有的IC50不超过0.5μM。
18.一种合成下式化合物的方法 其中Y＝H或OH，且X＝H、F、Cl、Br、I，或CH3或合成下式化合物的方法 其中Y＝H或OH，且X＝H、F、Cl、Br，或I，包括选自下列组的至少一个步骤 其中B选自叔-丁基二甲基甲硅烷基，叔-丁基二苯基甲硅烷基，苯甲基和三苯甲基。
19.权利要求18的方法，其中B为三苯甲基。
全文摘要
本发明涉及由通式I和II代表的核苷衍生物、它们的合成方法及其可药用盐、和包含这类化合物的组合物。也包括通过给予该化合物治疗高增生疾病的方法。
文档编号A61P35/00GK1980898SQ200580017825
公开日2007年6月13日 申请日期2005年4月1日 优先权日2004年4月1日
发明者安昌浩, 崔元准, 李永福, 郑乐臣, 李相国 申请人:雷克斯安公司