专利名称：Regⅲ蛋白的抑制剂作为哮喘的治疗剂的制作方法
技术领域：
本发明的一个目的是提供筛选用于治疗哮喘的试剂的方法。本发明的另一个目的是提供治疗哮喘的方法。本发明的这些和其它目的和优点从下文的描述中将会显而易见。
背景技术：
本发明一般涉及哮喘的治疗。具体地，本发明涉及筛选用于治疗哮喘的试剂的方法和治疗哮喘的方法。哮喘是一种以可逆性气道阻塞和气道高反应性(AHR)的重复发作为特征的气道慢性炎性疾病。其典型的临床表现包括，呼吸短促、喘鸣、咳嗽和胸部紧迫感，其可以变成威胁生命或致命的疾病。当现在的治疗都关注于降低症状性支气管痉挛和肺部炎症时，人们越来越注意到长期的气道改变在患哮喘的患者的加速的肺部恶化中发挥作用。气道改变涉及很多的病理特征，包括上皮平滑肌和成肌纤维细胞增生和/或组织转化，上皮下的纤维化和基质沉积。这些过程共同导致在致命性哮喘中气道高达约300％的肥厚。尽管对于阐述哮喘的病理生理学已经有了重大的进步，但在过去的20年间，该疾病的流行、发病率、和死亡率却一直在上升。2000年单是在美国，直接由哮喘就导致了近180万人到急诊室就诊，465,000人住院治疗并有4,487人死亡。每年与哮喘有关的医疗保健费用估计达140亿美元。一般公认，变应性哮喘是由对空气变应原的不当炎性反应引发的。哮喘者的肺表现出了淋巴细胞、肥大细胞，尤其是嗜酸性细胞的强烈渗透。大量的证据表明，该免疫应答是由表达TH2细胞因子分布的CD4+T-细胞驱动的。哮喘的一个鼠类模型包括，使动物对卵白蛋白(OVA)致敏，然后在气管内传输OVA激发。该方法在小鼠肺中产生了TH2免疫应答，并模拟在人哮喘中可见的4种主要的病理生理学应答，包括血清IgE(特应性)向上调节，嗜酸性粒细胞增多、粘液过度分泌、和AHR。由嗜碱粒细胞、肥大细胞表达，由T细胞和NK细胞激活的细胞因子IL-l 3在小鼠肺对OVA的免疫应答中发挥了重要的作用。鼠IL-l 3的直接肺部滴入引发了全部4种与哮喘相关的病理，相反地，可溶性IL-l 3拮抗剂(sIL-l 3Rα2-Fc)的存在会完全阻断OVA-激发诱导的杯状细胞粘液合成和AHR转变成乙酰胆碱。Wills-Karp，M.，等人，″Interleukin-13central mediator of allergic asthma，″Science282(5397)(1998)；Grunig，G.，等人，″Requirement for IL-l 3independently of IL-4 in experimental asthma，″Science 282(5397)2261-2263(1998)。因此，IL-l 3介导的信号足以引发全部4种与哮喘有关的病理生理学表型，这正是小鼠模型中粘液分泌过多和诱导AHR所需要的。生物学激活的IL-l 3特异性地与低亲和力结合链IL-l 3Rα1和高亲和力的多聚体复合物结合，其中所述多聚体复合物包含IL-l3Rα1和IL-4R，IL-4R是IL-4信号复合物的共有组分。Wills-Karp，M.，″IL-12/IL-l 3 axis in allergic asthma，″J Allergy Clin Immunol 107(1)9-18(2001)。IL-l 3途径级联的激活引起转录激活因子Stat6补充、磷酸化及最终的核转位。大量的生理学研究表明，肺的OVA-激发不会在与Stat6-/-无效等位基因同型结合的小鼠中引起主要的病理学相关表型，包括嗜酸性粒细胞渗透、粘液分泌过多和气道高反应性。Kuperman，D.，等人，″Signal transducer and activator of transcription factor 6(Stat6)-deficient mice are protected from antigen-induced airwayhyperresponsiveness and mucus production，″J Exp Med 187(6)939-48(1998)。近来的遗传学研究表明，在IL-l 3的特异性人等位基因和其哮喘和特应性信号组分之间的结合，在人疾病的此种途径中显示了关键性的作用。Shirakawa等人，″Atopy and asthmagenetic variants ofIL-4 and IL-l 3 signaling，″Immunol.Today 21(2)60-64(2000)。IL-l 3也与其它的受体链IL-l 3Rα2结合，后者在人和小鼠中表达，其生物学功能迄今尚未确定。鼠IL-l 3Rα2以相对于IL-l 3Rα1约100倍的更大亲和力(Kd为0.5到1.2nM)与IL-l 3结合，其允许构成有效的可溶性IL-l 3拮抗剂sIL-l 3Rα2-Fc。sIL-l 3Rα2-Fc作为拮抗剂已经用于多种疾病模型，以在血吸虫诱导的肝纤维化和肉芽肿形成，肿瘤免疫监督、以及OVA-激发的哮喘模型中证明IL-l 3的作用。Wills-Karp，M.，等人，″Interleukin-13central mediator of allergicasthma，″Science 282(5397)2258-2261(1998)；Grunig，G.，等人，″Requirement for IL-l 3 independently of IL-4 in experimental asthma，″Science 282(5397)2261-2263(1998)。RegIII蛋白是Reg基因家族的一个子类，该基因家族是一个多基因家族，还包括作为β细胞生长因子的RegI和RegII。Okamoto，H.，J.Hepatobiliary Pancreat.Surg.6254-262(1999)。在人中，RegIII家族包括HIP-一种在肝细胞癌、肠、和胰腺、和胰腺炎相关蛋白(PAP)中表达的基因。出处同前。
其他在人中发现的REG家族基因是RegIα、RegIβ和Reg相关序列。出处同前。小鼠REG基因包括RegI、RegII、RegIIIα、RegIIIβ、RegIIIγ、和RegIIIδ。出处同前。在大鼠、牛和仓鼠中也观测到了Reg基因。根据其他Reg家族成员细胞的促有丝分裂活性和家族成员之间的同源性，人们相信，Reg蛋白是生长因子。出处同上。由于RegIII子类成员间序列同源性的程度，本发明者相信，这些基因和蛋白在生理结构和功能上是相关的。当前治疗支气管痉挛和气道炎症的哮喘疗法包括，使用支气管扩张剂、皮质类固醇、和白细胞三烯抑制剂。在使用了一段时间后，很多这样的治疗会包括不希望的副作用并丧失有效性。此外，在治疗性介入中使用的仅有有限的药物可以有效地减少在哮喘中发生的气道改变过程。因此，仍然存在增加对哮喘的分子理解，相应地识别出对该复杂疾病的新治疗策略的需要。本发明正是满足了这种需要。
发明简述我们发现，与对照的非哮喘动物相比，在哮喘的动物模型中RegIII蛋白的信使RNA(mRNA)在统计学上显著地增加。具体地，我们发现，通过气管内的卵白蛋白激发或直接在肺部滴注IL-l 3会使编码RegIII的mRNA增加，因此发现其可以作为哮喘治疗的靶点。因此，在本发明的一个方面，提供筛选用于治疗哮喘的试剂的方法。同时也提供治疗哮喘的方法。在本发明的一个方面，一种筛选用于治疗哮喘的试剂的方法，包括(a)将RegIII蛋白与受试试剂接触；和(b)确定受试试剂是否抑制RegIII蛋白的活性，其中减除RegIII蛋白活性的受试试剂对治疗哮喘是有用的。在一些方面，如果它抑制RegIII蛋白的活性，该方法还包括将该受试试剂归类为治疗哮喘的试剂的步骤。在另一方面，本发明提供一种筛选用于治疗哮喘的试剂的方法，包括(a)将编码与RegIII蛋白启动子可操作地连接的报道基因产物的核苷酸序列与受试试剂接触；和(b)确定该试剂是否抑制报道基因产物的产生，其中抑制报道基因产物产生的受试试剂在治疗哮喘中是有用的。在一些方面，如果它抑制报道基因产物的产生，本发明还包括将该受试试剂归类为治疗哮喘的试剂的步骤。在本发明的另一个方面，提供治疗哮喘的方法。在一个实施方案中，该方法包括，给需要治疗的哺乳动物施用治疗量的降低RegIII蛋白活性的试剂。在本发明的另一个实施方案中，该方法包括，给需要治疗的哺乳动物施用治疗量的减少RegIII蛋白生成的试剂。
附图简述附
图1是人胰腺炎相关蛋白(PAP)的mRNA序列的代表，其是如Dusetti，N.J.，等人，Genomics19(1)108-114(1994)报道的RegIII家族的一个成员(SEQ ID NO1)。残基33-557代表编码序列(Genbank登录号NP_002571)。附图2是翻译的人PAP的氨基酸序列的代表(SEQ ID NO2)，如Dusetti等人，同上所报道(Genbank登录号NM_002580)。附图3是鼠(Mus musculus)RegIIIγ蛋白的mRNA序列的代表(SEQ ID NO3)，如Narushima Y.，等人，Gene185(2)159-68(Feb.7，1997)报道，其中，残基33到557代表编码序列(Genbank登录号D63361)。附图4是翻译成鼠(Mus musculus)RegIIIγ蛋白(SEQ IDNO4)的氨基酸序列，如Narushima等人同上所报道。附图5(SEQ ID NO5)是人PAP启动子的核苷酸序列的代表。附图6(SEQ ID NO6)是小鼠RegIIIγ蛋白的核苷酸序列的代表。
发明详述本文涉及的专利和科学文献确立了本领域技术人员可用的知识。本文所引用的已公开的美国专利、已批准的申请、已公开的申请(美国和外国)和参考物，包括GenBank数据库序列都以相同程度一并引入作为参考，就像它们每个都是特定地和分别地通过参考引入本文。本发明是基于下列意想不到的发现与对照的非哮喘动物相比，在哮喘的动物模型中RegIII蛋白的mRNA在统计学上显著地增加。具体地，通过气管内的卵白蛋白激发或直接在肺部滴注IL-l 3会使编码RegIIIγ的mRNA增加。此外，依次阻断IL-l 3结合到IL-l 3受体上的能力，抑制了RegIIIγ的表达。在鼠的哮喘模型中，RegIIIγ蛋白的向上调节表明，在变应性应答中涉及Reg蛋白，同时，RegIII蛋白是通过IL-l 3途径调节的。Reg蛋白包含一个多基因家族，根据序列同源性分成3个子类。最具有特征的是RegI，最初鉴定其在胰腺β-细胞再生中作为生长因子，在胰腺再生的创伤愈合和胃粘膜愈合的模型中其表达向上调节。在去除胰腺的大鼠中，RegI促进胃上皮细胞的有丝分裂，并诱导胰腺β-细胞的体内增殖。RegIII是小鼠染色体6上的Reg多基因络合物的一部分，其几乎唯一地在肠和结肠中表达。通过直接滴注或IL-l 3的转基因肺特异性表达在肺部施用IL-l 3，会发生气道上皮细胞肥大。密切相关的Reg蛋白的有丝分裂性质使得RegIII家族候选基因进入在各种动物疾病模型和人哮喘中观察到的肺上皮肥大中用于进一步研究。本发明人相信，在例如肺中RegIII蛋白刺激上皮生长和/或肥大。由于上皮细胞生长和/或肥大而在哮喘中观察到的上皮细胞肥厚是在肺中改变过程的一部分。根据在上述讨论的小鼠变应性哮喘模型中Reg蛋白的促有丝分裂性质和RegIII家族蛋白mRNA的向上调节，因此将RegIII蛋白鉴定成在人哮喘中对抗肺上皮肥大和气道改变过程的靶基因。RegIII家族蛋白包括但不限于，人HIP、人PAP、小鼠RegIIIα、小鼠IIIβ、小鼠IIIγ、小鼠IIIδ、大鼠PAP、大鼠PAPIII、牛PTP和仓鼠岛(hamster islet)再生相关蛋白(INGAP)。因此，本发明人相信，在哮喘的变应性应答中涉及RegIII家族的蛋白质，因此，Reg蛋白的抑制剂在治疗哮喘中将是有效的。此处的“哮喘”包括但不限于，特应性哮喘、非特应性哮喘、变应性哮喘、运动诱发性哮喘、药物诱发性哮喘、职业性哮喘和后期哮喘。如上所述，本发明提供筛选用于在哺乳动物中治疗哮喘的试剂的方法。在一个实施方案中，哺乳动物是人。此处的“试剂”包括但不限于，合成的小分子，化学试剂，核酸例如反义寡核苷酸，RNA，抑制剂例如siRNA，核酶，核酸配体例如适体，肽和蛋白质例如激素、细胞因子、抗体及其片段。在一个方面，该方法包括将RegIII蛋白和受试试剂与蛋白质的底物接触。在一个方面，受试试剂调节(例如，抑制或提高)RegIII蛋白的活性。在另一个方面，受试试剂调节(例如，抑制或提高)RegIII蛋白的产生或表达。“受试试剂”是假定的“试剂”，其调节能力还未经证实。一旦筛选受试试剂，如果它们表现出调节蛋白质活性或产生或表达(例如通过调节转录或翻译)，就将其归类为“试剂”。在一个特殊的实施方案中，该试剂降低或抑制RegIII蛋白的活性。在一些实施方案中，该试剂结合到RegIII蛋白上。在其它实施方案中，该试剂与RegIII蛋白活性或表达的抑制剂或激活剂相互作用(例如通过化学修饰)。通过一个非限制性的例子，该试剂可以结合并抑制RegIII蛋白的激活剂，或者该试剂可以结合并激活RegIII蛋白活性的抑制剂。此外，在另一个非限制性的例子中，该试剂可以例如通过拮抗IL-l 3、IL-l 3受体或IL-4受体，与RegIII蛋白的上游产物相互作用。该方法包括确定该受试试剂是否调节(例如，抑制)RegIII蛋白的活性，如果该受试试剂调节(例如，抑制)RegIII蛋白的活性或表达，就将其归类为治疗哮喘的试剂。如附图1和2所分别提供，RegIII蛋白家族的一个成员—人PAP的核苷酸和氨基酸序列如SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所列。如附图3和4所分别提供，鼠RegIIIγ蛋白的的核苷酸和氨基酸序列如SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所列。抑制RegIII蛋白的活性或表达的示例性试剂包括但不限于，IL-l3的拮抗剂例如sIL-l 3Rα1-Fc、sIL-l 3Rα2-Fc，IL-13受体的拮抗剂，IL-4受体的拮抗剂，抗体例如抗-RegIII蛋白抗体(例如，抗-HIP、抗-PAP、抗RegIIIγ)、IL-l 3中和抗体、IL-l 3R抗体，核酸例如siRNA、适体(即核酸配体)、反义寡核苷酸和核酶和小分子化学抑制剂。当是抗体时，该方法包括但不限于，多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、遗传工程抗体、双重特异性抗体、抗体片段(包括但不限于″Fv″、″F(ab′)2″、″F(ab)″和″Dab″)和代表抗体反应部分的单链。这样的抗体包括，属于任意免疫球蛋白类的抗体，例如IgM、IgG、IgD、IgE、IgA或其子类或混合物。本发明还包括这些抗体的衍生物，例如当改变涉及其作为药物制剂使用的一个或多个性质例如血清稳定性或产生的效力时，仍保留了它们与RegIII蛋白结合活性的衍生物。在另一个实施方案中，抑制了RegIII蛋白的产生。该方法包括但不限于，确定该受试试剂是否调节(例如抑制)RegIII蛋白的表达，如果该受试试剂调节(例如抑制)RegIII蛋白的表达，就将其归类为治疗哮喘的试剂。抑制RegIII蛋白表达的示例性试剂包括但不限于，选自可溶性IL-l 3受体(例如IL-l 3Rα1和IL-l 3Rα2的胞外域，其单独或融合到异源性部分例如Fc上，例如13RαsIL-l 3Rα1-Fc、sIL-l3Rα2-Fc)；对抗IL-l 3或IL-l 3R的中和抗体或其抗原结合片段；核酶；反义寡核苷酸；RNA抑制剂(例如，siRNA)；激素；细胞因子；和化学试剂(例如小分子)的拮抗剂。参见Wynn等人的美国专利U.S.6,664,227，在此将其整体引入本文作为参考。RegIII蛋白与诱导哮喘的症状和/或并发症有关的发现，使得我们提出RegIII蛋白的序列可以用于本发明的鉴定试剂的方法。这些方法包括，测定可能的试剂抑制RegIII蛋白活性和/或产生或表达的能力。在这些测定中有用的多核苷酸和多肽不仅包括此处所公开的基因或编码的多肽，也包括与野生型基因和多肽具有基本相同活性的变异体。此处的“变异体”包括，包含一个或多个删除、插入或取代的多核苷酸或多肽，只要该变异体保留了与野生型多核苷酸或多肽基本相同的活性。至于多肽，所关注的删除型变异体包括缺少生物活性非必需部分的多肽片段，而所关注的插入型变异体包括融合多肽，其中野生型多肽或其片段融合到另一个多肽上。因此，在一个实施方案中，在本发明中使用的RegIII蛋白可以由与如SEQ ID NO1(附图1)或SEQ ID NO3(附图3)所列的核苷酸序列具有至少约60％，至少约70％，至少约80％或至少约90％同一性的核酸序列编码。可以通过例如用来自the National Institutes ofHealth的高级BLAST计算机程序，2.0.8版比较序列信息来确定同一性的百分比。另外，在另一个实施方案中，在本发明中使用的RegIII蛋白可以由与如SEQ ID NO1(附图1)或SEQ ID NO3(附图3)所列的核苷酸序列基本相似的核苷酸序列编码。此处的“基本相似”是指，核苷酸序列与在适当严格条件下杂交的对照核苷酸序列足够地相似。确定相似性的方法是本发明所属领域公知的。严格条件的例子如下表1所示高严格条件是至少如条件A-F的严格条件；严格条件是至少如条件G-L的严格条件；低严格条件是至少如条件M-R的严格条件。
表1
1杂交长度是对杂交多核苷酸的杂交区域的预期。当将多核苷酸杂交到未知序列的靶多核苷酸上时，假设杂交长度是杂交多核苷酸的长度。当杂交已知序列的多核苷酸时，可以通过校准多核苷酸的序列和鉴定最佳序列互补性的一个或多个区域来确定杂交长度。
2在杂交和洗涤缓冲液中，可以把SSPE(1xSSPE是0.15M NaCl，10mM NaH2PO4，和1.25mM EDTA，pH 7.4)替换成SSC(1xSSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠)；在杂交完成后，进行15分钟的洗涤。
TB*-TR*杂交长度预计少于50个碱基对的杂交温度应当低于杂交的熔化温度(Tm)5-10EC，其中根据下列等式确定Tm。对于长度小于18个碱基对的杂交，Tm(EC)＝2(A的#+T碱基)+4(G的#+C碱基)。对于长度在18到49个碱基对的杂交，Tm(EC)＝81.5+16.6(log10Na+)+0.41(％G+C)-(600/N)，其中N是在杂交中碱基的数目，Na+是在杂交缓冲液(Na+的1X SSC＝0.165M)中钠离子的浓度。多核苷酸杂交的严格条件的其它例子在Sambrook等人，″Molecular CloningA Laboratory Manual″，Chs.9 & 11，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1989)，和Ausubel等人编著，Current Protocols in Molecular Biology，§§2.10，6.3-6.4，John Wiley & Sons，Inc.(1995)中提供，在此一并引入作为参考。可以通过技术人员已知的方法来制备RegIII蛋白。例如，可以将编码RegIII蛋白基因的核苷酸序列引入到需要的宿主细胞中。可以首先将该核苷酸序列插入到适当的重组表达载体中。可以根据技术人员公知的方法在载体内掺入上述的核苷酸序列来构建重组表达载体。在本发明中有用的种类广泛的载体都是已知的。适当的载体包括质粒载体和病毒载体，后者包括反转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体和疱疹病毒载体。该载体可以包括在特定宿主细胞内核酸有效表达必需或需要的其他已知的遗传要素，包括调节要素。例如，该载体可以包括启动子和任意必需的增强子序列，该增强子序列与启动子相协作完成基因的转录。该核苷酸序列可以可操作地连接到所述调节成分上。这样的核苷酸序列涉及的是“遗传构造”。遗传构造可以在其自身中或在与一个或多个其他遗传成分的组合中包含遗传要素。在一些实施方案中，这些遗传要素可操作地连接。在一些实施方案中，在遗传构造中可以不存在有争论的特定基因(例如hHIP、hPAP、RegIIIγ)，包括但不限于，RegIII蛋白的启动子与报道基因可操作地结合的情况。在此处，当将核苷酸序列置于与另一核苷酸序列的功能关系中时，该核苷酸序列就是“可操作地连接”到另一核苷酸序列上。例如，如果编码序列可操作地连接到启动子序列上，这一般意味着该启动子可以启动编码序列的转录。“可操作地连接”是指被连接的DNA序列典型地是连续的，以及在必需连接两个蛋白质编码区时是连续的并在读码框中。但是，由于当通过数千碱基对分离启动子时增强子可能有作用以及内含子序列具有不同的长度，一些核苷酸序列可以可操作地连接，但并不连续。可以用很多的方法来将编码RegIII蛋白的核苷酸序列引入宿主细胞，其中该核苷酸序列可以包括在重组表达载体中。这些方法是本领域已知的，包括机械法、化学法、亲脂法和电穿孔。显微注射和具有例如被引入的DNA的金颗粒底物的基因枪的使用，是一种代表性的、非限制的示例性机械法。磷酸钙或DEAE-葡聚糖的使用，是一种代表性的、非限制的示例性化学法。示例性的亲脂法包括使用脂质体和用于脂类介导的转染的其他阳离子试剂。这些方法都是本领域公知的。在本发明中，可以使用种类广泛的宿主细胞来产生所需的大量RegIII蛋白。这些细胞包括但不限于，真核和原核细胞，包括本领域已知的哺乳动物细胞和细菌细胞。可以通过技术人员公知的技术来分离和纯化RegIII蛋白，这些技术包括但不限于，色谱、电泳和离心技术。这些方法是本领域已知的。典型地，将样品(例如组织、细胞培养、或一定量的RegIII蛋白)与受试试剂接触一段时间，以充分抑制蛋白质的活性或产生/表达。该段时间各不相同，取决于受试试剂的性质、具体的RegIII蛋白、所选择的活性或表达检测方法和所选择的样本组织。技术人员无需过多试验就可确定该时间。示例性的受试试剂是通过结合或通过例如与RegIII蛋白结合，阻断其与信号转导途径的功能性相互作用的能力来降低蛋白质的活性。类似的测定可以筛选出阻断RegIII蛋白表达的受试试剂，包括但不限于，例如IL-l 3拮抗剂(例如sIL-l 3Rα2-Fc融合蛋白)或IL-4拮抗剂。可以用种类广泛的测定来确定受试试剂是否抑制RegIII蛋白的活性。由于RegIII蛋白具有促有丝分裂活性，这些测定包括但不限于，细胞增殖测定和粘液产生测定。在一个实施方案中，所需的细胞与有效量的RegIII蛋白和受试试剂接触或培养。该量可以有效地刺激上皮细胞生长和/或肥大，是技术人员可以确定的。然后测定细胞增殖，并与用不含受试试剂的RegIII蛋白处理的对照细胞相比较。可以用种类广泛的细胞增殖测定来确定受试试剂是否抑制RegIII蛋白的活性。这些细胞增殖测定是本领域公知的，包括，例如标记的脱氧胸苷吸收测定、5-溴-2′-去氧尿苷吸收测定、溴化3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-联苯四钠测定、三磷酸腺苷产生测定，或它们的一些组合。如本领域所知，标记的脱氧胸苷结合，例如放射性标记的脱氧胸苷结合可以用于监测或定量细胞增殖。细胞结合标记的核苷酸，典型地是氚化脱氧胸苷，其进入新合成的DNA中。通过定量结合到DNA中的放射性标记的核苷酸的量来确定细胞增殖的相对量。Cunningham，B.A.，The Scientist，15(13)26(2001)。可以通过液体闪烁计数来测定结合到DNA中的放射性标记的核苷酸的量，并作为细胞增殖的量度标准。类似地，可以把其他的核苷酸结合到新合成的DNA中，定量，并作为细胞增殖的相对量度标准。例如可以把5-溴-2′-脱氧尿苷(BrdU)结合到DNA中，并通过在酶免疫分析法，例如酶联免疫吸附法(ELISA)中使用商供的单克隆抗体对抗BrdU来定量。溴化3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-联苯四钠(MTT)测定包括MTT与称作甲月替的蓝色化合物的细胞还原减少。相对于衰老或死细胞，在增殖活跃的细胞中细胞还原增加。因此通过观测蓝色的强度(例如用分光镜)定量甲月替为细胞增殖提供了相对的量度标准。Cunningham，B.A.，The Scientist，15(13)26 (2001)；Mosmann，J.Immunol.Methods 6555-63(1983)。可以使用其他的四唑盐来代替MTT或除了MTT以外使用其它的四唑盐，包括WST-1、WST-8、XTT、和MTS。可以用包括来自American Type Culture Collection(Manassas，VA)的商供的试剂盒来进行这些测定。三磷酸腺苷产生测定是测定在所研究的细胞中存在的ATP的量。典型地，ATP与各种水解ATP的成分反应，导致光的产生。光的强度与细胞中ATP的量是成比例的。在一个测定中，在氧存在下ATP与荧光素酶和荧光素反应。对这些测定的描述在，例如The Scientist，15(13)26(2001)；Mosmann，J.Immunol.Methods 6555-63(1983)和Crouch等人，J.Immunol.Methods 16081-88(1993)中。可以使用本领域已知的定量细胞的其他方法，包括使用血细胞计数器和锥虫蓝染色，例如如Ausubel，等人，编辑，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons所述。在细胞增殖测定中可以使用种类广泛的细胞。细胞的非限制性例子是哺乳动物细胞，可以对RegIII蛋白的促有丝分裂活性产生应答。这些细胞包括，例如，原发性上皮细胞或细胞系，例如LIM1863(Whitehead等人Cancer Res.47(10)2683-9(May 15，1987))。这种细胞典型地作为细胞培养物存在。细胞的其他非限制性例子是气道上皮细胞。细胞培养方法是技术人员已知的，并在例如Ausubel等人，编辑，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons；A.J.Shaw，编辑，Epithelial Cell CultureA Practice Approach(PracticalApproach Series)，IRL press，1996；R.I.Freshney和M.G.Freshney，编辑，Culture of Epithelial Cells，第二版，John Wiley & Sons，2002；和C.Wise，编辑，Epithelial Cell Culture Protocols(Methods in MolecularBiology，v.188)，Humana Press，2002中进行了描述。可以用于确定受试试剂是否抑制RegIII蛋白活性的其他测定是定量从用H&E染色的细胞中产生的粘液，这是本领域技术人员已知的技术。在一个实施方案中，上皮细胞与有效量的RegIII蛋白和受试试剂接触或培养。该量可以有效地刺激上皮细胞分化进入杯形细胞中，并可以与用不含受试试剂的RegIII蛋白处理的对照细胞相比较。除了用于粘液产生的H&E染色外，可以用经典的逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)测定编码mRNA表达的粘液的减少，用cDNA或寡核苷酸测定来测定表达的mRNA的球型曲线、或定量粘液中粘多糖的量。可以用很多种的测定来定量粘液，包括用染料给粘膜成分染色，并用比色法定量。在一个实施方案中，可以用高碘酸Schiff技术给粘膜中存在的粘蛋白、糖蛋白或粘多糖染色。或者，可以放射性标记粘蛋白，并通过如Svitacheva，N.和Davies，J.R.，″Mucinbiosynthesis and secretion in tracheal epithelial cells in primaryculture，″Biochem.J.35323-32(2001)所述的通过疏水相互作用色谱来分析。可以用本领域已知的标准方法和例如，如Svitacheva，N.和Davies，J.R.(出处同上)所述，来分离粘液。简言之，收集培养物中的细胞，在透析样品后通过等容密度梯度离心来分离粘蛋白。来源广泛的哺乳动物上皮细胞可以在上述包括定量粘蛋白的筛选测定中使用，以及用于上述的细胞增殖测定。上皮细胞的非限制性例子是小气道上皮细胞或支气管上皮细胞，其可从Clonetics(www.cambrex.com)获得。典型地，这些细胞作为细胞培养物存在。细胞培养方法是技术人员已知的，并例如在Ausubel等人，编辑，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons；A.J.Shaw，编辑，Epithelial Cell CultureA Practice Approach(Practical ApproachSeries)，IRL press，1996；R.I.Freshney，和M.G.Freshney，编辑，Culture of Epithelial Cells，第二版，John Wiley&Sons，2002；和C.Wise，编辑，Epithelial Cell Culture Protocols(Methods in MolecularBiology，v.188)，Humana Press，2002中进行了描述。此外，上皮细胞系可以用于涉及粘蛋白定量的筛选测定。在本发明的筛选方法中可以测定种类广泛的受试试剂。例如，本领域已知的小分子化合物，合成小分子化学试剂，核酸例如反义寡核苷酸，RNA抑制剂例如siRNA、核酶、和适体，肽和蛋白质例如激素、抗体、和其片段，都可以作为受试试剂。在一个非限制性的例子中，通过结晶由酶和已知抑制剂形成的络合物来确定RegIII蛋白的活性位点的三维结构。然后用推理性药物设计，通过改变已知抑制剂的结构或设计结合到酶的活性位点的小分子来鉴定新的受试试剂。类似地，技术人员将会理解，推理性药物设计也可以用于设计IL-l 3R和/或IL-4R的拮抗剂，这两种拮抗剂也可以用于调节RegIII蛋白的产生。如本文的其他地方所讨论，受试试剂包括RegIII蛋白活性的抑制剂，以及RegIII蛋白表达或产生的抑制剂。RegIII蛋白活性抑制剂的非限制性例子包括RegIII蛋白的抗体、小分子抑制剂、和蛋白质和肽，例如激素和细胞因子。RegIII产生抑制剂包括但不限于，抑制RegIIImRNA或蛋白产生的受试试剂。这些受试试剂的非限制性例子包括IL-l3的拮抗剂、siRNA、反义核酸、核酶、适体、IL-l 3的中和抗体、IL-l3R和IL-4R。IL-l 3的拮抗剂包括但不限于，阻断IL-l 3与IL-l 3受体或IL-4受体结合能力的受试试剂。这些拮抗剂包括但不限于IL-l3Rα1-Fc，SIL-l 3Rα2-Fc，和抗IL-l 3、IL-l 3R或IL-4R的中和抗体。在一个实施方案中，本发明也提供筛选用于在哺乳动物中治疗哮喘的试剂的方法，包括，筛选调节(例如，抑制或激活)RegIII蛋白活性或产生或表达的试剂。该方法包括，将编码报道基因产物的核苷酸序列与被认为可以有效抑制RegIII蛋白产生的受试试剂接触，其中该核苷酸序列可操作地与编码RegIII蛋白的哺乳动物基因的启动子连接，其中所述基因包括但不限于hHIP、hPAP、或RegIIIγ；确定该受试试剂是否抑制报道基因产物的产生；和如果该受试试剂抑制报道基因产物的产生，就将其归类为治疗哮喘的试剂。在一个实施方案中，哺乳动物是人。在一个实施方案中，编码RegIII蛋白的基因的启动子包括如SEQ ID NO5或SEQID NO6分别所列的核苷酸序列，其中所述基因包括但不限于hHIP、hPAP、或RegIIIγ。与所述序列具有至少约50％，至少约70％，至少约80％，或至少约90％的同一性，并例如作为启动子具有直接表达如所述的编码RegIII蛋白的基因的功能的核苷酸序列，也包括在本发明中。可以用本领域公认的方法来确定RegIII蛋白的启动子的核苷酸序列。所述方法一个非限制性的例子是用SEQID NO1(附图1)或SEQ ID NO3(附图3)作为探针筛选基因组文库(例如，YAC人基因组文库)中感兴趣的启动子序列。确定适当启动子序列的方法的另一个非限制性的例子是通过用探针(例如包含SEQID NO1或其一部分)探测电泳分析的人基因组DNA，然后确定该cDNA探针(例如SEQID NO1)在哪里杂交来完成人基因组DNA的索瑟恩DNA印迹法(Southern blot)。一旦确定了探针(例如SEQID NO1)杂交的带，就分离(例如从凝胶切除)该带，并用于序列分析。这就允许删除SEQID NO1的核苷酸104-106(即ATG位点)的核苷酸片段5′。该核苷酸片段的长度为约500到100个单元。如SEQ ID NO3(附图3)所列的鼠RegIIIγ蛋白的启动子序列也可以通过这些方法来确定。与所述序列具有至少约70％，至少约80％，或至少约90％的同一性，并例如作为启动子具有直接表达如所述的编码RegIII蛋白的基因的功能的核苷酸序列，也包括在本发明中。种类广泛的报道基因可以可操作地连接到上述的RegIII蛋白启动子上。这些基因可以编码例如荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、β-葡糖苷酸酶、碱性磷酸酶、和绿色荧光蛋白、或其他本领域已知的报道基因产物。在本发明的一个实施方案中，将编码与RegIII蛋白启动子可操作地连接的报道基因的核苷酸序列引入宿主细胞中。首先将该核苷酸序列插入到如前所述的适当重组表达载体中。在本发明这个方面的载体可以包括在具体哺乳动物细胞中足够表达来自RegIII蛋白启动子的核苷酸序列所必需或需要的其他已知的遗传要素，包括调节要素。例如，该载体可以包括任意在体内与启动子协作例如完成报道基因体内转录所必需的增强子序列。将核苷酸序列引入宿主细胞的方法与前述的制备RegIII蛋白的方法是相同的。在本发明的筛选方法中可以使用种类广泛的宿主细胞。示例性的宿主细胞包括，例如中国仓鼠卵巢、大肠杆菌、COS和杆菌。或者，在所述的载体中筛选的方法可以使用编码全部或部分RegIII蛋白的核苷酸序列。在该情况下，如前所述，可以通过技术人员已知的技术分离和纯化RegIII蛋白，所述技术包括色谱、电泳和离心技术。此外，可以通过本领域已知的方法定量RegIII蛋白。在将与RegIII蛋白启动子可操作地连接的编码报道基因或RegIII蛋白基因的核苷酸序列和被认为可以有效抑制RegIII蛋白产生的受试试剂结合后，确定该受试试剂是否抑制报道基因产物的产生。可以通过定量报道基因产物的量或活性来确定该端点。定量的方法取决于所使用的报道基因，但也包括取决于所使用的报道基因产物抗体的酶联免疫吸附法测定。此外，该测定可以测定化学发光、荧光或放射性衰变、或本领域已知的其他方法。确定所述报道基因产物的活性或量的测定法是本领域已知的。如果该受试试剂抑制报道基因产物的产生，就将其归类为治疗哮喘的试剂。本发明的筛选方法可以通过体外(例如在基于细胞的测定或在酶活性测定中通过监测RegIII蛋白的活性或表达)或体内(例如在给哺乳动物施用受试试剂后，通过监测组织样本例如BAL中RegIII蛋白的活性或表达)来完成。示例性的哺乳动物包括但不限于，人、小鼠、大鼠和狗。本发明也提供治疗哮喘的方法。此处的“治疗”、“治疗的”、“被治疗”是指预防、减少或消除哮喘的至少一种症状或并发症。哮喘示例性的症状和/或并发症包括但不限于，AHR、粘液产生过度、血清IgE水平升高、气道嗜酸性粒细胞增多和气道改变。这些方法包括给需要治疗的哺乳动物例如人治疗量的降低RegIII蛋白产生或活性的试剂。其他可以用本发明的试剂治疗的哺乳动物的非限制性例子包括小鼠、大鼠和狗。“治疗量”代表能抑制或降低RegIII蛋白的活性或产生或表达并导致足够临床应答的试剂的量。临床应答包括所治疗病症的改善或该病症的预防。当然，根据本发明施用的试剂的具体剂量要通过病例周围的具体环境，包括所施用的试剂、要治疗的具体哮喘及类似的情况来确定。降低RegIII蛋白的活性或产生或表达的试剂包括在上述的筛选测定中发现的那些试剂。其他的试剂或抑制剂是本领域公知的，包括，例如蛋白质和肽例如激素、细胞因子和抗体或其部分，核苷酸例如反义寡核苷酸、siRNA、核酶、和适体，以及小分子。参见例如Houston，等人，PNAS 99(14)9127-9137(2002)。通过实例，所用的对抗RegIII蛋白的抗体可以是，但不限于，多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、遗传工程抗体、双重特异性抗体、抗体片断(包括但不限于″Fv″、″F(ab′)2″、″F(ab)″和″Dab″)和代表抗体反应部分的单链。这样的抗体包括，属于任意免疫球蛋白类的抗体，例如IgM、IgG、IgD、IgE、IgA或其子类或混合物。本发明还包括这些抗体的衍生物，例如当改变涉及其作为药物制剂使用的一个或多个性质，例如血清稳定性或产生的效力时，仍保留了它们FoxM1-结合活性的衍生物。抗体的非限制性例子包括抗-RegIII蛋白抗体、抗IL-l 3中和抗体、抗IL-l 3R和抗IL-4R抗体。产生上述每一种抗体形式的方法都是本领域公知的。在不同的实施方案中，这样的抗体结合到RegIII蛋白(例如hHIP、hPAP、RegIIIγ)、IL-l 3、IL13-R、IL-4R、或RegIII信号途径的其他成分上。在另外的实施方案中，抗体结合到RegIII活性或表达的抑制剂上。产生上述每一种抗体形式的方法都是本领域公知的。可以用于合成抗体的细胞包括转化后的动物、真菌、细菌细胞或酵母细胞。通过非限制性实例，可以用已知的方法从RegIII蛋白免疫的动物制备杂交瘤细胞，和分离它们的抗体产生的B细胞，选择这些细胞用于与抗体结合的RegIII或IL-l 3，随后将这些细胞融合到，例如人或动物的例如小鼠mylenoma细胞、人淋巴样干细胞或异杂交瘤细胞或通过用适当的病毒感染这些细胞而产生无限增殖化细胞系。通过非限制性实例，可以将人RegIII(例如，HIP、PAP)或IL-l 3单克隆抗体用于检测RegIII蛋白或治疗具有哮喘样症状的患者。术语“单克隆”是指所获得的抗体的性质，来源于基本上同种群的抗体(即，除了可能在较小量中存在的自然发生的突变外，包含该种群的抗体个体是相同的)，当需要通过具体方法制备抗体时，其不会被翻译。因此在样品中RegIII蛋白的检测或定量可以通过利用在单克隆抗体和RegIII蛋白或IL-l 3之间的特定结合反应进行免疫测定来完成。各种免疫测定法是本领域公知的，可以使用它们中任何一种。免疫测定法的例子包括使用单克隆抗体和其他的单克隆抗体分别作为初级和次级抗体的夹层法，使用单克隆抗体和多克隆抗体分别作为初级和次级抗体的夹层法，使用胶体金的染色法、凝集法、胶乳法和化学发光法。抗体片段也可以用于哮喘治疗的RegIII蛋白或IL-l 3检测。例如，可以通过用酶例如番木瓜蛋白酶或胃蛋白酶清除抗体的Fc部分的酶方法，通过化学氧化或通过抗体基因的基因操作获得抗体片段。使用基因操作的非截断型片段也是可能和有利的。这些抗体或其片段可以单独或作为混合物使用。本领域技术人员可以理解，当通过减少RegIII蛋白的活性或产生或表达来进行治疗哮喘的测定时，对抗IL-l 3受体或IL-4受体的抗体也是有用的。本发明包括治疗哮喘的方法，包括施用治疗量的IL-l 3拮抗剂，其中所述施用降低了RegIII蛋白的产生。如本文在其他地方所解释，RegIII蛋白的表达至少部分地通过IL-l 3途径来调节。在一个非限制性的实施方案中，受试试剂是IL-l 3的拮抗剂，其中断IL-l 3结合到IL-l 3受体上的能力，导致RegIII蛋白的向下调节。在一个非限制性的实施方案中，IL-l 3的拮抗剂阻断IL-l 3结合到IL-l 3受体上的能力。在一个例子中，该拮抗剂与IL-l 3受体竞争性地与IL-l 3结合。在一个例子中，拮抗剂包括但不限于，包含一个或多个IL-l 3受体结合链的融合蛋白。可溶性融合蛋白的非限制性实例包括IL-l 3Rα1-Fc和IL-l 3Rα2-Fc。示例性的受试试剂也包括但不限于化学试剂，包括合成的小分子，核酸例如反义寡核苷酸、siRNA、核酶、和适体，肽和蛋白质例如激素、细胞因子和抗体或其一部分，例如抗IL-l 3中和抗体和抗IL-l 3R和IL-4R抗体。本发明包括治疗哮喘的方法，包括施用核酸。示例性的核酸包括但不限于，脱氧核糖核酸或核糖核酸。在一个实施方案中，核糖核酸具有的核酸序列与如附图1和3的SEQ ID NO1或SEQ ID NO3所列的用于编码RegIII蛋白的核苷酸序列的一部分互补。在另一个实施方案中，小的干扰RNAs(即通过RNA干扰的方法)可以作为RegIII蛋白的抑制剂使用。RNA干扰涉及由与沉默基因靶点对应的双链RNA引起的序列特异性、转录后基因沉默/使用小的干扰RNAs抑制蛋白质产生的方法是本领域公知的，并在例如PCT国际申请号WO01/75164、WO00/63364；WO01/92513；WO00/44895；和WO99/32619中公开。RNA干扰构造或siRNA复式RNA分子可以用于干扰RegIII蛋白或IL-l 3的表达。典型地，RegIII蛋白或IL-l 3的至少19，21，22，或23个核苷酸对于siRNA分子是足够的。在一个实施方案中，siRNA分子具有2-核苷酸3′悬突。如果在细胞中siRNA从构造中例如从发夹结构分子或从所需的RegIII或IL-l3序列的反转重复中表达，那么随后内源性细胞结构将会产生悬突。SiRNA分子也可以通过化学合成、体外转录、或核糖核酸酶或dicer的长dsRNA消化作用来合成。Brummelkamp，等人，Science，296550-53(2002)；Elbashir，等人，Nature，411494-98(2001)；Elbashir，等人，Genes Dev，15188-200(2001)。在一个实施方案中，本发明包括治疗哮喘的方法，包括联用一种或多种RegIII蛋白活性或产生或表达的抑制剂和一种或多种IL-l 3的拮抗剂。示例性的RegIII抑制剂包括调节(例如，抑制)RegIII蛋白活性的抑制剂例如抗RegIII抗体，以及调节(例如，抑制)RegIIImRNA转录的抑制剂例如siRNA、核酶、适体、和反义寡核苷酸。示例性的IL-l 3拮抗剂包括阻断IL-l 3结合到IL-l 3受体上的能力的试剂。这些试剂包括作用于IL-l 3分子上的试剂例如sIL-l 3Rα1-Fc、sIL-l3Rα2-Fc和抗IL-l 3中和抗体，以及作用于IL-l 3受体的试剂例如抗IL-l3R抗体和合成的小分子。IL-l 3的拮抗剂还包括核酶、适体、siRNA、反义寡核苷酸、细胞因子、和激素。此处关注的是涉及抑制RegIII蛋白和拮抗IL-l 3的试剂的联合治疗。本发明包括在哺乳动物中降低RegIII蛋白表达的方法。该方法包括施用有效量的IL-l 3的拮抗剂。在一个实施方案中，该拮抗剂阻断IL-l 3结合到IL-l 3受体上的能力。在另一个实施方案中，该拮抗剂阻断IL-l 3结合到IL-4受体上的能力。这些拮抗剂包括在上述与治疗哮喘有关的方法中所讨论的那些。在一些实施方案中，该拮抗剂选自sIL-l 3Rα1-Fc、sIL-l 3Rα2-Fc和IL-l 3的中和抗体。在另一个方面，本发明包括检测哮喘治疗效力的方法。该方法包括施用受试试剂并检测RegIII蛋白的表达，其中RegIII蛋白表达的减少表明该受试试剂在治疗哮喘中是有效的。受试试剂包括在本文的其他地方描述的那些。在一个实施方案中，该方法包括施用IL-l 3的拮抗剂。IL-l 3的拮抗剂包括上述的那些。IL-l 3拮抗剂的非限制性的例子包括sIL-l 3Rα1-Fc、sIL-l 3Rα2-Fc和IL-l 3的中和抗体。治疗哮喘的方法包括给需要治疗的哺乳动物施用IL-l 3拮抗剂，检测RegIII蛋白的活性或表达或产生水平，并将RegIII蛋白的活性或表达或产生水平与在用IL-l 3拮抗剂治疗前的对照水平相比较。RegIII蛋白的活性或表达或产生水平相对于对照水平可以增加或减少。如果受试试剂降低或抑制了RegIII蛋白的活性或表达，就将其归类为对治疗哮喘有效的IL-l 3拮抗剂。抑制RegIII蛋白的活性或表达的示例性的试剂包括但不限于，sIL-l 3Rα1-Fc、sIL-l 3Rα2-c、IL-l 3的中和抗体和抗RegIII抗体。可以通过各种途径来施用该试剂。施用的示例性途径包括口服、胃肠外、经皮和肺部施用。例如，该试剂可以鼻内、肌内、皮下、腹膜内、叶鞘内、或其任意组合地施用。对于肺部施用的喷雾器，可以用吸入器或气雾分配器递送适当制剂形式的治疗剂(即，与气雾剂一起)。此外，该试剂可以单独或与其他试剂或已知药物组合施用。在组合中，试剂可以同时施用，或者各试剂在不同时间施用。当与一种或几种已知的哮喘药物组合时，试剂和药物可以同时施用或者可以在药物前或后施用该试剂。在一个实施方案中，该试剂可以在药学可接受的载体中施用。可以使用本领域已知的任何适当的载体。在一个实施方案中，载体有效地溶解了该试剂。载体包括但不限于，固体、液体或固体和液体的混合物。载体可以制成胶囊、片剂、丸剂、粉末剂、锭剂、混悬剂、乳剂或糖浆的形式。载体可以包括作为调味剂、润滑剂、增溶剂、助悬剂、粘合剂、稳定剂、片剂崩解剂和装胶囊材料的物质。全身性口服的片剂可以包括如本领域已知的赋形剂例如碳酸钙、碳酸钠、糖类(如乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇)、纤维素(如甲基纤维素、羧甲基纤维素钠)、胶(如阿拉伯胶、黄蓍胶)，和崩解剂例如玉米、淀粉或海藻酸，粘合剂例如明胶、胶原或阿拉伯胶和润滑剂例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。在粉末剂中，该载体是精细分离的固体，其与有效量的精细分离的试剂混合。在溶液、混悬剂或糖浆中，有效量的试剂溶解或悬浮于载体例如无菌水或有机溶剂如含水的丙二醇中。其他组合物的制备，包括将抑制剂分散到淀粉或羧甲基纤维素钠的水溶液或本领域已知的适当的油中。该试剂可以治疗量施用。所述量在治疗哮喘中是有效的。该量可以不同，取决于所使用试剂的活性、哮喘的性质和患者的健康情况。术语“治疗有效量”是指某一剂量的治疗可以有效地达到所需的治疗结果。此外，技术人员将会理解，通过细调和/或施用超过一种试剂，或通过施用该试剂和抗哮喘化合物(如，皮质类固醇)可以减少或增加试剂的治疗有效量。如下文实施例所示，治疗有效量很容易即可确定，例如以经验为主以相对较低量开始，然后逐步增加并同时评价有益效果(即暴露于抗原后哮喘症状的减少)。当该试剂与载体组合时，试剂的存在量可以是约1％重量到约99％重量，剩余部分由药学可接受的载体构成。在一些实施方案中，该试剂的存在量是约25％重量到约75％重量。在一些实施方案中，该试剂的存在量是约30％重量到约60％重量。在一些实施方案中，该试剂的存在量是约40％重量到约50％重量。现在将参照具体的实施例来说明本发明。可以理解，所提供的实施例是用来说明本发明的实施方案，而不是对本发明的范围进行限定。
实施例1在小鼠肺中与变应性反应有关的基因表达改变为鉴定由气管内OVA-激发诱导的基因表达改变，在0天通过腹膜内(i.p)注射10μg的卵白蛋白(OVA)(Sigma，St.Louis，MO)的200μl PBS液使Balb/C小鼠(Jackson Laboratories(Bar Harbor，ME))免疫。在4和25天，用氯胺酮和甲苯噻嗪(分别为45和8mg/kg)的混合物使小鼠麻醉，用50μl 1.5％的OVA溶液或等体积的PBS在气管内激发。为鉴定IL-l 3介导的信号转导对mRNA的浓度依赖性，在变应激发过程前或过程中，三次腹膜内注射可溶性IL-l 3受体融合蛋白sIL-l 3Rα2-Fc来处理两组OVA-激发的小鼠。作为受体融合蛋白的Fc-部分的对照，类似地用腹膜内施用hIgG来处理两组OVA-激发的小鼠。第二组的6只对照小鼠类似地对OVA致敏，但随后并不激发，并在同一时程中在腹膜内单独施用PBS缓冲液(n＝2)，或还在腹膜内注射hIgG(n＝2)或sIL-l 3Rα2-Fc(n＝2)。第二次肺部抗原激发(28天)78小时后，收集OVA-激发和单用缓冲液的对照小鼠的肺组织。用液氮冷冻的研钵和研磅将折断的冷冻小鼠肺组织粉末化，悬浮在6ml 4M异硫氰酸胍/0.7％2-巯基乙醇(GTC/ME)中，脉冲声处理2分钟。用酸性平衡苯酚(Promega Total RNA Kit)将该组织混悬液萃取两次，并用等量的异丙醇沉淀核酸。将片状沉淀物再悬浮于0.8mlGTC/ME中，用等量的酸性苯酚再萃取两次，用氯仿萃取一次。RNA是用乙醇沉淀的，并悬浮于DEPC处理的H20中，用OD280定量。根据Byme，等人，″Preparation of mRNA for expressionmonitoring，″Current Protocols in Molecular Biology John Wiley andSons，Inc.(New York 2000)所述的变化，用Superscript Kit(BRL)从10μg总RNA合成cDNA。第一标准合成在50℃进行以阻止核糖体核糖核酸的误写入，并使用包含聚-T引物(T7T24)的启动子用于随后的体外防腐RNA(crank)的扩增和生物素标记。根据制造商的说明书使用Biome Carboxyterminated beads(Polysciences)来纯化cDNA，并在48μl的10mM乙酸钠pH7.8中洗脱。体外T7聚合酶驱动转录反应来合成和生物素标记反义cRNA，进行Qiagen Rneasy自旋柱纯化和cRNA的断裂。根据制造商的说明书，在200μl的总体积中，GeneChip杂交混合物包含在1XMES缓冲液中的10μg断裂的cRNA、0.5mg/ml乙酰化的BSA，0.1mg/ml青鱼精液DNA。在45℃将反应混合物与Affymetrix Mu11KsubA和Mu11KsubB寡核苷酸阵列杂交18小时。除去杂交混合物，洗涤该阵列，并使用GeneChip流控站400用抗生物素蛋白链菌素R-藻红蛋白(分子探针)染色，根据制造商的说明书用Hewlett Packard基因阵列扫描器扫描。收集荧光数据并用MicroArray Suite 4.0软件转变成基因特异性差异平均数。制作十一员标准曲线的方法，包括以浓度范围为0.5pM到150pM向各个杂交混合物中掺加来自克隆细菌和噬菌体序列的基因片段。这些标准品代表，假定平均转录大小为2kb时RNA的频率为约百万分之3.3到1000(ppm)。通过T7聚合酶驱动的IVT反应从基于质粒的模版中合成生物素化的标准曲线片段。粗短刺状的生物素化RNA片段可以做为内标物评价薄片敏感度，和作为标准曲线将测定个体基因得到的荧光差异平均数转化成ppm形式的RNA频率。可以用包括基因特异性寡核苷酸的正确匹配和单错配探针组合之间的平均荧光差异来确定粗短刺状标准曲线的频率值。此外，主要根据部分个体阳性或阴性应答探针对的第二组算法可以用于评价基因产物的绝对存在或缺失。将个体微阵列的敏感度设置为最小浓度的一半，在最小浓度下存在任意2或3个邻近的标准曲线粗短刺状的模版。强制标准曲线线性回归必须通过0，最小的报道基因频率设置成个体GeneChip的敏感度。测定每个处理或对照试验情况的多次独立性复制物，表达数据用于常规统计分析以努力消除假阳性。开始比较在给定试验设置下从个体测定中确定的频率值。比较处理和对照动物的平均值以获得平均倍差(AFC)。使用含原频率值的不同协方差或含log-转换的频率值的相同协方差来计算两尾t-检验。用于鉴定变应原-激发诱导的基因表达的三个处理组的每一个的全部基因表达在mRNA的完整性、要求存在的基因数目、和通过不同对照和治疗曲线(数据未列出)计算的总mRNA频率方面都达到了良好的平衡。通过腹膜内联用人IgG或sIL-l 3Rα2-Fc并不足以改变测定PBS处理的对照小鼠的基因表达曲线，因此在计算未处理基线表达的平均值时，将6只对照小鼠的频率值组合作为一个组。类似地，在计算肺变应原激发mRNA频率德平均频率值时，将腹膜内联用缓冲液或hIgG处理的4只OVA-激发小鼠组合作为一个组。数据如下表2所示。
表2变应原刺激后RegIIIγ mRNA的频率值 该数据表明RegIIIγ蛋白mRNA是由直接在肺部气管内施用IL-l 3或卵白蛋白诱导的变应性激发所诱导的。此外，这些数据显示，用可溶性受体拮抗剂(sIL-l 3Rα2-Fc)激活的IL-l 3的抑制作用完全抑制了卵白蛋白激发的RegIIIγ蛋白的表达。先前利用sIL-l 3Rα2-Fc拮抗剂的生理学研究表明，IL-l 3活性对于哮喘病理学包括上皮粘液产生和AHR是重要的。因此，经鉴定，RegIIIγ蛋白是卵白蛋白变应性激发的IL-l 3敏感基因的下游产物，其可以鉴定治疗哮喘的治疗剂。这些数据证明，腹膜内施用可溶性IL-l 3拮抗剂能完全抑制OVA变应性肺RegIII蛋白的诱导作用。先前利用sIL-l 3Rα2-Fc拮抗剂的生理学研究表明，IL-l 3活性对于哮喘病理学包括上皮粘液产生和AHR是重要的。Wills-Karp，M，等人，Science 282(5397)2258-61(1998)。因此，这些数据表明，导致抑制RegIIIγ蛋白的治疗性介入与减少和哮喘有关的症状相关。
实施例2mIL-l 3肺滴注诱导的在小鼠肺中的基因表达改变为鉴定在肺基因表达中IL-l 3介导的改变，用肺滴入多次的5μg剂量(0，24小时和48小时)的重组mIL-l 3处理6只Balb/C系小鼠(Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME)。按相同时间表给第二组对照Balb/C系小鼠(n＝4)只滴注缓冲液。此外，同样地用多次剂量的mIL13(n＝4)或PBS缓冲液(n＝5)肺部滴注来处理Stat6-/-裸鼠，然后在78小时收集所有的肺，用于制作表达曲线。Stat6-/-是另外的对照；它在IL-l 3信号途径中是关键的中间体，对于粘液产生和AHR是关键性的；该IL-l 3信号转导物的缺失将改善哮喘症状。用于鉴定变应原-激发诱导的基因表达的三个处理组的每一个的全部基因表达在mRNA的完整性、要求存在的基因数目、和通过不同对照和治疗曲线计算的总mRNA频率方面达到了良好的平衡。数据如表3所示。
表3 这些数据表明，mRNA浓度的增加是由mIL-l 3肺滴入介导的。
实施例5RegIII蛋白活性的抑制剂的筛选测定的预示性实施例将人RegIII蛋白(例如，hHIP、hPAP)克隆到细菌表达载体中，转化成大肠杆菌或COS细胞，利用标准分子生物学和生物化学方法通过柱色谱法从细菌或哺乳动物培养基中纯化。然后用RegIII蛋白处理初级上皮细胞或上皮细胞系。在与蛋白质接触后，分析细胞或细胞系中上皮细胞或粘蛋白的增加。通过将上皮细包染色或通过显微镜观察分泌粒的增加来确定它们调节(例如，抑制)粘液产生和/或上皮细胞增殖的能力，由此筛选受试试剂。
实施例6包括RegIII蛋白启动子的RegIII蛋白产生的抑制剂的筛选测定的预示性实施例将RegIII蛋白的蛋白启动子连接到报道基因，例如荧光素酶上。通过用IL-l 3诱导证明报道基因的激活，表明其转录特异性。筛选受试试剂来鉴定其中可以阻断IL-l 3诱导的报道基因活性的那些。
实施例7用RegIII蛋白抑制剂治疗哮喘给经诊断患有哮喘的患者施用治疗有效量的已知RegIII蛋白的蛋白抑制剂。同样显示哮喘症状的对照组用安慰剂对照物来治疗。施用可以是单个治疗或在数天时间里治疗。评估患者的和哮喘有关的症状，例如AHR和粘液产生。通过与对照组比较与哮喘有关的症状的减少来确定治疗的有效性。在附图和上述的描述中已经对本发明进行了详细的解释和描述，同样应当认为只是作为解释，而不是进行适当的限制，应当理解，仅对一些实施方案进行了显示和描述，因此要求保护在本发明精神内的所有改变和变更。此外，本文引用的所有参考文献对本领域技术人员都达到了指示的水平，因此将它们整体引入作为参考。
权利要求
1.一种筛选用于在哺乳动物中治疗哮喘的试剂的方法，包括(a)将RegIII蛋白与受试试剂接触；和(b)确定受试试剂是否抑制RegIII蛋白的活性，其中减除RegIII蛋白活性的受试试剂在治疗哮喘中是有用的。
2.权利要求1的方法，其中哺乳动物是人。
3.权利要求1的方法，其中哮喘选自特应性哮喘、非特应性哮喘、变应性哮喘、运动诱发性哮喘、药物诱发性哮喘、职业性哮喘和后期哮喘。
4.权利要求1的方法，其中确定受试试剂是否抑制RegIII蛋白的活性包括进行细胞增殖测定。
5.权利要求4的方法，其中细胞增殖测定选自标记的脱氧胸苷吸收测定、5-溴-2′-去氧尿苷吸收测定、溴化3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-联苯四钠测定、三磷酸腺苷产生测定，或它们的组合。
6.权利要求4的方法，其中细胞选自初级上皮细胞或上皮细胞系。
7.权利要求1的方法，其中RegIII蛋白是哺乳动物的RegIII蛋白。
8.权利要求1的方法，其中RegIII蛋白具有选自SEQ ID NO2和SEQ ID NO4的氨基酸序列。
9.权利要求1的方法，其中RegIII蛋白的氨基酸序列与选自SEQID NO2和SEQ ID NO4的氨基酸序列具有至少约70％同一性。
10.一种筛选用于在哺乳动物中治疗哮喘的试剂的方法，包括(a)将编码与哺乳动物RegIII蛋白启动子可操作地连接的报道基因产物的核苷酸序列与受试试剂接触；和(b)确定该试剂是否抑制报道基因产物的产生，其中减除RegIII蛋白活性的受试试剂在治疗哮喘中是有用的。
11.权利要求10的方法，其中哺乳动物是人。
12.权利要求10的方法，其中哮喘选自特应性哮喘、非特应性哮喘、变应性哮喘、运动诱发性哮喘、药物诱发性哮喘、职业性哮喘和后期哮喘。
13.权利要求10的方法，其中确定受试试剂是否抑制RegIII蛋白的产生包括定量报道基因产物的量或活性。
14.权利要求10的方法，其中RegIII蛋白启动子具有SEQ ID NO5的核苷酸序列。
15.权利要求10的方法，其中RegIIIγ蛋白启动子的核苷酸序列与SEQ ID NO5的核苷酸序列具有至少约80％同一性。
16.权利要求10的方法，其中RegIII蛋白启动子具有SEQ ID NO6的核苷酸序列。
17.权利要求10的方法，其中RegIII蛋白启动子的核苷酸序列与SEQ ID NO6的核苷酸序列具有至少约80％同一性。
18.权利要求10的方法，其中报道基因产物选自荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、β-葡糖苷酸酶、碱性磷酸酶、和绿色荧光蛋白。
19.一种治疗哮喘的方法，包括给需要治疗的哺乳动物施用治疗量的降低哺乳动物RegIIIγ蛋白活性的试剂。
20.权利要求19的方法，其中哺乳动物是人。
21.权利要求19的方法，其中治疗哮喘是通过选自降低AHR、降低粘液产生过多、降低血清IgE水平、和降低气道嗜酸性粒细胞过多的方法来完成的。
22.权利要求19的方法，其中降低哺乳动物RegIII蛋白活性的试剂是sIL-l 3Ra2-Fc。
23.权利要求19的方法，其中哺乳动物的RegIII蛋白是由选自SEQ ID NO1和SEQ ID NO3的核苷酸序列编码的。
24.权利要求19的方法，其中哺乳动物的RegIII蛋白是由与选自SEQ ID NO1和SEQ ID NO3的核苷酸序列具有至少约70％同一性的核苷酸序列编码的。
25.一种治疗哮喘的方法，包括给需要的哺乳动物治疗量的减少哺乳动物RegIII蛋白产生的试剂。
26.权利要求25的方法，其中减少RegIII蛋白产生的试剂是核酸。
27.权利要求26的方法，其中核酸是核糖核酸。
28.权利要求27的方法，其中核糖核酸具有的核苷酸序列与SEQID NO或SEQ ID NO3所列的用于编码RegIII蛋白的核苷酸序列的一部分互补。
29.权利要求27的方法，其中核糖核酸是干扰RNA。
30.权利要求25的方法，其中哺乳动物是人。
31.权利要求25的方法，其中该抑制剂在药学可接受的载体中施用。
全文摘要
提供筛选用于治疗哮喘的试剂的方法。该方法包括筛选降低RegIII蛋白产生或活性的试剂，已经发现RegIII蛋白在产生与哮喘有关的症状或病理并发症中发挥作用。也提供治疗哮喘的方法，以及筛选和用RegIII蛋白的抑制剂治疗。
文档编号A61K39/385GK1964987SQ200580018284
公开日2007年5月16日 申请日期2005年6月3日 优先权日2004年6月4日
发明者M·福莱蒂, D·D·唐纳森 申请人:惠氏公司