细胞因子信号转导调节剂的调节和用于免疫治疗的应用的制作方法

专利名称：细胞因子信号转导调节剂的调节和用于免疫治疗的应用的制作方法
细胞因子信号转导调节剂的调节和用于免疫治疗的应用
背景技术：
人的免疫系统不能控制和清除许多致病的感染和恶性细胞的生长。用 于慢性感染和癌症的成功治疗疫苗和免疫疗法依赖于新方法的研发， 这种新的方法用作诱导有力免疫应答的有效方式，该免疫应答能够控 制和清除与病理学相关的攻击性抗原。
T细胞识别抗原的能力依赖于抗原与主要组织相容性复合体 (MHC) I或MHC II蛋白的结合。例如，细胞毒性T细胞应答与MHC-I 蛋白结合呈递的抗原。因此，如果细胞不同时表达合适的MHC-I蛋白， 杀灭病毒感染细胞的细胞毒性T细胞将不会杀灭该细胞。辅助T细胞 识别MHC-II蛋白。辅助T细胞活性通常依赖于抗原呈递细胞上抗原的 识别和这些细胞上"自身"MHC-II蛋白的存在。对与自身MHC蛋白结 合的抗原的识别的需要称为MHC限制。在几乎所有有核细胞的表面上 发现了 MHC-I蛋白。在特定细胞的表面上发现了 MHC-II蛋白，这些细 胞包括脾脏的巨噬细胞、B细胞和树突细胞以及皮肤的朗格汉斯细胞。 引发哺乳动物免疫应答的关键步骤是激活识别MHC-II限制性外 源抗原的CD4+辅助T细胞。在抗原呈递细胞如树突细胞(DC)中的 细胞内体途径中捕获和加工这些抗原。在内体和溶酶体中，将抗原加 工成小的抗原肽，其在Golgi区室中复合到MHC-II上来形成抗原 -MHC-II复合体。该复合体在细胞表面上表达，这种表达诱导CD4+T 细胞的激活。
诱导哺乳动物有效免疫应答中的其他关键事件涉及008+ T细胞和 B细胞的激活。当所需的蛋白通过细胞发送，使其作为与MHC-I抗原 复合的经过加工的蛋白在细胞表面上呈递时，CD8+细胞得到激活。B 细胞可以通过它们的表面免疫球蛋白(IgM和IgD)与抗原相互作用而不需要MHC蛋白。然而，CD4+T细胞的激活刺激了免疫系统的所有分 支。激活时，CD4+T细胞(辅助T细胞)产生白细胞介素。这些白细 胞介素帮助激活免疫系统的其他分支。例如，辅助T细胞产生白细胞 介素_4 ( IL-4 )和白细胞介素-5 ( IL-5 )，这些帮助B细胞产生抗体； 白细胞介素-2 (IL-2)，其激活了 CD4+和CD8+T细胞；和y干扰素， 其激活了巨噬细胞。因为识别MHC-II限制性抗原的辅助T细胞在细胞 毒性T-细胞、巨噬细胞、天然杀伤细胞和B细胞的激活和克隆扩充中 起着关键作用，响应抗原激活辅助T细胞的最初事件对于诱导针对该 抗原的有效免疫应答是关键的。已经报道了使用源自溶酶体跨膜蛋白 的序列来刺激辅助T细胞激活的尝试。然而，这些尝试没有获得对测 试哺乳动物就CD8+ T细胞和B细胞而言的有效免疫应答的诱导。
除了 T细胞在免疫应答中起的关键作用，DC同样重要。DC是在自 身抗原耐受性维持以及先天免疫和获得性免疫激活中具有关键调节作 用的专门性抗原呈递细胞(Banchereau等，1998, Nature 392:245-52; Stei麵n等，2003， A謹.Rev. Immunol. 21: 685-711 )。当DC遇 到促炎症刺激物如微生物产物时，通过上调细胞表面表达的装载抗原 肽的MHC分子和共刺激分子来启动细胞的成熟过程。成熟并归巢至局 部淋巴结后，DC建立了与T细胞的接触，通过形成免疫突触，其中T 细胞受体(TCR)和共刺激分子聚集于由粘附分子围绕的中心区域中
(Dustin等，2000， Nat. Immunol. 1:23-9)。 一旦得到激活，CD8+ T细胞可以自主地增殖几个世代并获得细胞毒性功能而不需要进一步 的抗原刺激(Kaech等，2001， Nat. Immunol. 2: 415—22; vanStipdonk 等，2001， Nat. Immunol. 2:423-9 )。因此已经提出了由DC提供的 肽-MHC复合体(信号1)和共刺激分子(信号2)的水平和持续时间 对于决定抗原特异性T细胞应答的规模和结局是必要的
(Lanzavecchia等，2001， Nat. Immunol. 2:487-92; Gett等，2003, Nat. Immunol. 4: 355-60 )。
研发肿瘤疫苗的主要工作尝试了促进DC成熟和共刺激，作为增强 抗肺瘤免疫性的方式。然而，对抗自身肿瘤相关抗原(TAA)的免疫性的诱导受到内在抑制机制的限制，其中许多机制尚须明确。 一种已知
的抑制机制是T-细胞上的细胞毒性T-淋巴细胞抗原4 (CTLA4)和相 关分子用于通过与DC或其他细胞上的B7家族分子的细胞-细胞接触来 控制效应T-细胞激活的规模。DC成熟作为从自身耐受性维持至免疫性 诱导的关键转换。然而，成熟抗原呈递DC是否具有允许它们在过了成 熟点后控制获得性免疫规模和持续时间的负向调节机制仍然是不清楚 的。
细胞因子决定性地涉及多种免疫细胞功能的调节(Curtsinger 等，2003，J. Exp. Med. 197: 1141-51; Valenzuela等，2002， J. Immunol. 169: 6842-9 ) 。 DC使用toll样受体(TLR),其识别保守的微生物结 构如脂多糖(LPS)，通过激活核因子-kB (NF-kB)信号转导途径来 促进DC成熟(Akira等，2004, Nat. Rev. Immunol. 4: 499-511 )。 然后NF-kB家族成员介导促炎症细胞因子如IL-2的表达，导致先天 免疫和获得性免疫的诱导(Akira等，2004 ， Nat. Rev. Immunol. 4: 499-511; Beutler等，2003， Nat. Rev. Immunol. 3: 169-76; Ja腳ay 等，2002， Annu. Rev. Immunol. 20:197-216 ) 。 DC成熟后，细胞因 子产生和胞内信号转导途径被认为受到紧密调节以促进对抗外源抗原 的有益免疫应答同时限制过度自身免疫激活。然而，这些途径的特异 性反馈抑制机制的重要性和所得到的对自身抗原特异性免疫应答的控 制仍然是不太明确的。
SOCS1是通过多种细胞因子包括干扰素(IFN) - y、白细胞介素 (IL)-2、 IL-6、 IL-7、 IL-12和IL-15可诱导的负向信号反馈调节 剂(Kubo等，2003， Nat. Im醒ol. 4:1169-76; Alexander等，2004， Annu. Rev. Immunol. 22:503-29 ) 。 SOCS1作为假底物抑制剂通过结 合上游Janus激酶(JAK)的活化环和/或靶向JAK进行蛋白酶降解， 抑制了多种转录的信号转导物和激活物(STAT)信号转导途径(Kubo 等，2003， Nat. I画no1. 4: 1169-76; Alexander等，2004， Annu. Rev. Immunol. 22:503-29 ) 。 S0CS1还通过其SOCS盒区域通过耙向p65蛋 白进行遍在蛋白介导的蛋白水解而阻断了 NF-KB信号转导(Ryo等，2003， Mol. Cell. 12:1413-26) 。 SOCSl-缺陷(-/-)小鼠作为患有 严重全身性炎症以及T和NKT细胞异常活化的新生儿死亡，主要是由 于不受控制的细胞因子信号转导(Marine等，1999， Cel 1 98: 609-16; Alexander等，1999， Cell 98:597-608; Naka等，2001, Immunity 14:535-45 )。尽管关于S0CS1在DC中的功能知道得很少，最近的研 究表明S0CS1在控制抗原呈递细胞(APC)中信号转导中的作用(Kubo 等，2003， Nat. Immunol. 4:1169-76; Hanada等，2003， Immunity 19: 437-50 ),通过LPS或CpG-DNA刺激诱导巨噬细胞中的S0CS1表达， 且SOCSl-/-小鼠对LPS诱导的休克比野生型的同窝出生者更敏感 (Crespo等，2000， Biochem. J. 349: 99-104; Dalpke等，2002， J. Immunol 166: 7082-9; Nakagawa等，2002, Immunity 17: 677-87; Kinjyo等，2002， Immunity 17: 583-91 )。此外，其中基于SOCSl-/-背景已经在T细胞和B细胞中恢复S0CS1表达小鼠的S0CS1-/-DC对 IFNy和LPS是高应答性的，引发了异源T细胞扩增并诱导了 B细胞的 异常扩增和自身反应性抗体产生(Hanada等，2003, Immunity 19: 437-50 )。
尽管关于SOCS1在DC中的功能知道得很少，最近的研究已经证明 了 SOCS1在调节细胞因子信号转导途径中的作用。例如，已经证明了 S0CS1-/-DC呈现更成熟的表型并观察到对脂多糖(LPS)是高应答性 的，LPS与Toll-样受体(TLR) 4相互作用来用于信号转导。还观察 到S0CS1-/-DC诱导了自身反应性抗体产生。这些观察暗示了 SOCS1 可能通过控制JAK/STAT途径和TLR/NF- k B途径在DC负调节中的可能 作用。
已经进行了许多尝试在免疫治疗中使用DC来刺激哺乳动物的免 疫应答。在这些努力中，通过装载抗原并使它们在离体的环境中成熟 来操纵DC，使得它们刺激癌症患者的抗肿瘤免疫性。对于使用免疫疗 法来对抗人免疫缺陷病毒(HIV)，还没有出现有效的人免疫缺陷病毒 (HIV)疫苗。因此，本领域中长期感受到对引发哺乳动物免疫应答以 治疗疾病的有效且定向方式的需要。本发明满足了这种需要。发明概述
本发明包括用于增强免疫细胞免疫效能的组合物。优选，组合物
包括细胞因子信号转导抑制因子(suppressor of cytokine signaling) ( S0CS )、含SH2的磷酸酶(SHP )或活化STAT的蛋白抑 制剂(PIAS)中任何一种或多种的抑制剂。更优选地，抑制剂干扰所 述细胞中的负向调节途径。
特定实施方案中，抑制剂选自小干扰RNA (siRNA)、微RNA、反 义核酸、核酶、编;马转显性(transdominant)阴性突变体的表达栽体、 胞内抗体、肽和小分子。优选，抑制剂是siRNA。
再一方面中，siRNA选自双链寡核苷酸、单链寡核苷酸和多核苷酸。
再一方面中，s iRNA是化学合成的。
本发明的另一实施方案包括含有细胞因子信号转导调节剂的抑制 剂的组合物，其中组合物进一步含有生理学上可接受的载体。优选， 生理学上可接受的载体是脂质体。
另一实施方案中，细胞因子信号转导调节剂的抑制剂是由克隆至 表达载体中的分离的多核苷酸编码的。表达载体选自质粒DNA、病毒 栽体、细菌载体和哺乳动物载体。另一方面中，表达栽体进一步包括 促进分离的多核苷酸整合至宿主细胞基因组中的整合信号序列。
本发明还包括细胞因子信号转导抑制因子(SOCS)的抑制剂，其 中SOCS选自S0CS1、 S0CS2、 S0CS3、 S0CS4、 S0CS5、 S0CS6、 S0CS7 和细胞因子可诱导的含有SH2结构域的蛋白(CIS)。
另一方面中，本发明包括含有SH2的磷酸酶(SHP)的抑制剂，其 中SHP选自SHP-l和SHP-2。
再一方面中，本发明包括活化STAT蛋白抑制剂(PIAS )的抑制剂， 其中PIAS选自PIAS1、 PIAS3、 PIASx和PIASy。
本发明还包括用于增强免疫细胞免疫效能的组合物，其中组合物 进一步包括具有至少一个表位的抗原。优选，表位能够引发哺乳动物的免疫应答。另一方面中，表位诱导哺乳动物的CD4+T细胞应答。再 一方面中，表位诱导哺乳动物的CD8+T细胞应答。再一方面中，表位 诱导哺乳动物的B细胞应答。
另一实施方案中，通过表达载体来表达抗原。进一步的方面中， 抗原是分离的多肽。
再一实施方案中，抗原与疾病相关。优选，疾病选自感染性疾病、 癌症和自身免疫性疾病。
一方面中，感染性疾病是由选自病毒、细菌、真菌和原生动物的 致病微生物引起的。
另一实施方案中，抗原是由病毒基因编码的。优选，病毒基因源 自选自乙肝病毒、丙肝病毒、人免疫缺陷病毒、乳头瘤病毒和疱渗病 毒的病毒。
一方面中，抗原是由选自乙肝病毒e抗原基因、乙肝病毒表面抗 原基因和乙肝病毒核心抗原基因的病毒基因编码的。
另一方面中，抗原是由选自人免疫缺陷病毒Envgpl60基因、Gag 基因、Pol基因、Rev基因、Tat基因、Vif基因和Nef基因的病毒基 因编码的。
再一方面中，抗原是由选自乳头瘤病毒E7基因和乳头瘤病毒E6 的病毒基因编码的。
再一方面中，抗原是由源自疱渗病毒的病毒基因编码的，疱渗病 毒选自l型单纯疱渗病毒、2型单纯疱渗病毒、EB病毒、巨细胞病毒、 人疱渗病毒6、人疱渗病毒7和人疱渗病毒8。
一实施方案中，抗原与癌症相关，其中癌症选自乳癌、宫颈癌、 黑素瘤、直肠癌和前列腺癌。
进一步的方面中，肿瘤相关抗原选自超表达的肿瘤相关抗原、睾 丸肿瘤抗原、突变的肿瘤相关抗原、分化肿瘤相关抗原酪氨酸酶、MART、 trp、 MAGE-1、 MAGE-2、 MAGE-3、 gp100、 HER-2、 Ras和PSA。
再一方面中，肿瘤相关抗原选自BCR-ABL、 CASP、 CDK、 Ras、 p53、 腿-2/扁、CEA、 MUC、 TW1、 PAP、 survivin、端粒酶、EGFR、 PSMA、PSA、 PSCA、酪氨酸酶、MART、 TRP、 gp100、 MART、 MAGE、 BAGE、 GAGE、 LAGE/NY-ESO、 RAGE、 SSX-2、 CD19和CD20。
另一实施方案中，抗原与选自类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、 多发性硬化症、牛皮瓣和节段性回肠炎的疾病相关。
本发明还包括组合物，该组合物包括细胞因子信号转导调节剂的 抑制剂和具有至少一个能够引发免疫应答的表位的抗原，并进一步包 括细胞因子和Toll-样受体(TLR)激动剂。
一方面中，通过表达载体来表达细胞因子或TLR激动剂。优选， 细胞因子或TLR激动剂是分离的多肽。
另一方面中，细胞因子选自IL-12、 TNFoc、 IFNct、 IFN P 、 IFN Y、 IL-7、 IL-2、 IL-6、 IL-15、 IL-21和IL-23。
本发明还包括含有细胞因子信号转导调节剂的抑制剂的组合物， 其中抑制剂抑制对Janus激酶(JAK)信号转导的抑制。
另 一实施方案中，组合物包括细胞因子信号转导调节剂的抑制剂， 该抑制剂抑制对Toll-样受体(TLR)信号转导的抑制。
再一实施方案中，组合物包括细胞因子信号转导调节剂的抑制剂， 该抑制剂抑制对NK-KB信号转导的抑制。
本发明包括用于增强细胞免疫效能的组合物，其中组合物包括载 体，该载体含有编码抑制剂的第 一 多核苷酸和编码具有至少 一 个表位 的抗原的第二多核苷酸，其中抑制剂抑制所述细胞中的细胞因子信号 转导的调节剂，其中至少一个表位诱导哺乳动物的免疫应答。
本发明还包括用于增强细胞免疫效能的组合物，其中组合物包括 载体，该载体含有编码抑制剂的第一多核苷酸和编码细胞因子的笫二
多核苷酸，其中抑制剂抑制所述细胞中的细胞因子信号转导的调节剂。 优选，第二多核苷酸编码的细胞因子选自IL-2、 TNFcc、 IFNot、 IFN 卩、IFNy、 IL-7、 IL-2、 IL-6、 IL-15、 IL-21和IL-23。
本发明还包括含有细胞因子信号转导调节剂的抑制剂的细胞。优 选，细胞是选自APC、树突细胞、单核细胞/巨噬细胞、T细胞和B细 胞的免疫细胞。另一方面中，细胞进一步包括具有至少一个表位的抗原，其中至 少一个表位能够引发哺乳动物的免疫应答。
再一方面中，细胞进一步包括含有编码细胞因子的多核苷^的表 达载体。
本发明还包括产生沉默细胞的方法，包括将细胞接触细胞因子信 号转导调节剂的抑制剂。
另一实施方案中，本发明包括产生经沉默并脉沖(pulsed)的细
胞的方法，包括将细胞接触细胞因子信号转导调节剂的抑制剂并进一
步将细胞接触具有至少一个表位的抗原，其中至少一个表位能够引发
哺乳动物的免疫应答。
本发明还包括引发哺乳动物免疫应答的方法，包括将含有细胞因 子信号转导调节剂抑制剂的组合物给药于有此需要的哺乳动物。
本发明的另一实施方案包括引发哺乳动物免疫应答的方法，包括 将含有沉默细胞的组合物给药于有此需要的哺乳动物，其中沉默细胞 含有细胞因子信号转导调节剂的抑制剂。优选，在将沉默细胞给药于 有此需要的哺乳动物之前将沉默细胞在体外接触抗原。另 一方面中， 还可以在将沉默细胞给药于有此需要的哺乳动物之后将沉默细胞在体 内接触抗原。
附图筒述
出于说明本发明的目的，在附图中描绘了本发明的特定实施方案， 然而，本发明不限于附图中所述实施方案的精确排列和说明。


图1,包括图1A和1B,是系列图，证明了通过SOCSl-siRM下调 了 S0CS1的表达。图1A描绘了用小鼠S0CS1 siRNA共转染的293T细 胞的蛋白质印迹测试。图1B描绘了用S0CS1 siRNA oligo转染的DC 的定量RT-PCR测试。
图2是证明了用S0CS1 siRNA转染的DC对LPS或IFN-Y比用siTNA 突变体转染的DC应答性更高的图，通过增加的促炎症细胞因子如IL-6 和TNF-ot的分泌来表示。图3是重组慢病毒栽体的图示；LV-SOCSl-siRNA和LV-GFP-siRNA。
图4,包括图4A和4B，是系列图，证明了 S0CS1负向调节了 DC 体外刺激抗原特异性CTL的能力。图4A描绘了在SOCSl-siRM-DC共 培养物中卵清蛋白特异性TCR T细胞(OT-1)比在siRNA-DC突变体共 培养物中增殖地更多的事实。和这些数据相一致，SOCSl-siRNA-DC共 培养物中分泌的促炎症细胞因子的水平更高(图4B)。
图5,包括图5A至5C，是系列图，证明了 S0CS1负向调节了 DC 体内引发抗原特异性T-细胞应答的能力。图5八表示总的门控008+ T 细胞群中H2-K7卵清蛋白-PE四聚体+T细胞的百分比。图5B描绘了干 扰素Y UFNy ) ELISPOT测试。图5C描绘了 CTL测试，证明了对抗 来自给予不成熟LV-S0CS1-s iRNA-DC小鼠的脾细胞的卵清蛋白+靶细胞 更有效的细胞毒性。
图6，包括图6A至6E，是系列图，证明了体内LPS刺激强烈地增 强了由S0CS1-沉默DC诱导的CTL应答。图6A描绘了门控CD8+T细胞 中卵清蛋白-PE四聚体-阳性T细胞的百分比。图6B描绘了小鼠中CD8+ T细胞的IFN-y ELISPOT数量，该小鼠用卵清蛋白脉沖的、转导的DC 或模拟(mock) DC免疫，没有离体的LPS诱导成熟，接着体内LPS刺 激。图6C和图6D各自描绘了小鼠中CD8+T细胞的卵清蛋白-PE四聚 体+百分比和IFN-y ELISPOT数量，该小鼠用成熟DC免疫，接着体内 LPS刺激。图6E证明了使用多种细胞因子和TLR激动剂的体内刺激增 强了由S0CS1-沉默DC引起的CTL应答(ELISPOT)。
图7，包括图7A至7E，是系列图，证明了增强的由SOCSl-沉默 DC诱导的抗肿瘤免疫性。图7A描绘了使用卵清蛋白脉沖的 LV-SOCSl-siRNA-DC的免疫阻断了预先建立的卵清蛋白+EG7肿瘤生长 的事实。图7B描绘了抗CD8抗体，而不是抗CD々抗体，消除了由卵清 蛋白脉沖的LV-SOCSl-siRNA-DC诱导的抗肿瘤活性的事实。图7C至图 7E描绘了小鼠中通过S0CS1 siRNA oligo双链体转染的DC增强的抗 肿瘤活性。
图8，包括图8A至8C，是系列图，证明了通过SOCSl-沉默的DC
16增强的对抗自身肿瘤相关抗原的CTL应答。图8A描绘了成熟 LV-SOCSl-siRNA-DC有效地阻断了预先建立的B16胂瘤的生长，而成 熟LV-GFP-siRNA-DC不具有任何可观察到的抑制效果的事实。图8B 和图8C各自描绘了 LV-SOCSl-siRM-DC小鼠中有效TRP-2特异性CTL 应答的IFN-y ELISPOT和CTL测试。
图9，包括图9A至9C，是系列图，证明了受S0CS1限制的成熟 DC信号转导控制对抗自身抗原的CTL应答和抗肿瘤免疫性。图9A描 绘了免疫后两周小鼠中脾细胞的CD8+T细胞中H2-Kb-TRP2-PE四聚体 -阳性T细胞的百分比。图9B描绘了免疫后三个月接受一次或三次体 内LPS刺激的经TRP2a-脉沖的SOCSl-siRM-DC免疫的小鼠中典型的 白癜风。图9C描绘了用TRP2a肽体外再次刺激后从经免疫小鼠组汇 集的脾细胞对抗TRP2+B16的细胞毒性(上图)和用S0CS1 siRM DC 免疫的野生型小鼠脾细胞对抗TRP2—EG. 7靶细胞的细胞毒性(下图)。
图10，包括图IOA至10D,是系列图，证明了通过SOCSl-siRNADC 免疫根除了预先建立的B16肿瘤。图IOA和IOB各自描绘了没有使用 和使用LPS体内刺激的野生型小鼠的肿瘤生长曲线。图IOC描绘了监 测六十天小鼠的百分比存活。图IOD描绘了从共注射LPS并接受TRP2a 肽刺激的经免疫小鼠汇集的脾细胞分离的CD8+ T细胞的IFN-y ELISPOT测试。
图11，包括图11A至11C,是系列图，证明了由低或高亲和性肽 脉沖的S0CS1-沉默DC诱导的有效CTL应答和抗肿瘤活性。图IIA描 绘了没有使用(图1U-1)或使用LPS (图11A-2)刺激的转导DC上 共刺激/抑制分子的流式细胞分析。图11B描绘了通过用低或高亲和性 肽脉沖的S0CS1-siRNADC根除了预先建立的Bl6肿瘤。图IIC描绘了 通过IFNy ELISPOT测试测量的用TRP2a或TRP2b肽刺激的抗原特异 性CTL应答的比较。
图12，包括图12A至12D,是系列图，证明了缺乏IL-12K0S0CS1 siMA-DC对有效抗肿瘤应答的诱导。图12A和图12B各自描绘了肿瘤 体积和存活。图12C描绘了用TRP2a肽体外刺激后的IFNy ELISPOT测试。图12D描绘了使用TRP2+ B16靶细胞用TRP2a肽体外刺激后的 CTL测试。
图13，包括图13A至13D,是系列图，证明了 S0CS1控制DC的 IL-2和IL-12诱导的细胞因子产生。图13A描绘了 SOCSl siRNA DC 响应LPS和平板包,皮的抗-CD40 mAb连续刺激而分泌的IL-2水平。图 13B描绘了最初24小时刺激后除去这些刺激物后的IL-12水平。图13C 描绘了 SOCSl siRNA DC响应LPS和平板包被的抗CD40 mAb刺激24 小时接着除去刺激物而分泌的TNFcc和IL-6的水平。图13D描绘了 p35-Z-或wt SOCSl siRNA DC响应LPS和平板包被的抗CD40 mAb连 续刺激而分泌的TNFct和IL-6的水平。
图14，包括图14A和14B，是系列图，证明了体内给予IL-12增 强了 SOCSl沉默DC免疫。图14A描绘了通过体内给予IL-12增强的抗 肿瘤活性。图14B描绘了通过IL-12增强的TRP2-特异性CTL应答。
图15,包括图15A至15D,是系列图，证明了通过沉默DC中的 S0CS1增强了 gpl20-特异性抗体和CTL应答。图15A说明了 LV-SOCSl-siRNA-DC引发了比对照LV-GFP-siRM-DC显著更强烈的 gp-120特异性IgM和IgG应答。图15B显示了与LV-GFP-siRNA-DC小 鼠的相应亚类相比较，用LV-S0CS1-siRNA-DC免疫的小鼠中所有IgG 亚类中HIV-Env特异性抗体滴度的剧烈增加。图15C显示了 LV-SOCSl-siRNA-DC小鼠体内对抗gpl20-脉沖的耙细胞的CTL活性比 LV-GFP-siRNA-DC小鼠体内的那些显著更有效。图15D显示了 LV-SOCS-siRM-DC小鼠体内IFN-y十T细胞的百分比更高。
图16，包括图16A至16D,是系列图，证明了通过S0CS1沉默DC 增强的Thl-和Th-2极化细胞因子的产生。图16A描绘了 LPS刺激后 与GFP-siRNA-DC相比较，LV-SOCSl-siRM-DC产生的IL-12、 IFN-y 和TNFcx的水平。图16B描绘了 gp-120特异性CD4+ T细胞的频率。 图16C说明了 LV-SOCSl-siRNA-DC小鼠的CD4+ T细胞响应gpl20脉 冲DC刺激的增殖比LV-GFP-siRNA-DC小鼠更活跃。图16D显示了 S0CS1 沉默DC中Thl-极化(IFN- y 、 IL-2和TNF a )和Th2-极化(IL-4和IL-IO)细胞因子提高的水平。
图17，包括图UA至17D，是系列图，证明了通过S0CS1-沉默DC 增强的gpl20特异性B细胞激活。图17A描绘了经LPS刺激APRIL和 BAFF mRNA的表达水平。图17B描绘了 LV-SOCSl-siRNA-DC和 LV-GFP-siRNA-DC小鼠中产生抗gpl20 IgG的B细胞的频率。图17C 描绘了用抗CD40和IL-4共同刺激时，LV-SOCSl-siRNA-DC小鼠的B 细胞比LV-GFP-siRNA-DC小鼠的B细胞更强有力地增殖。图17D描绘 了 LV-SOCSl-siRNA-DC小鼠的B细胞响应各种刺激物而产生更高含量 的多种细胞因子，包括IL-6、 IL-12和TNF-a。
图18，包括图18A至18B，是系列图，证明了由S0CS1沉默DC 诱导的长期gpl20特异性抗体和CTL应答。图18A描绘了 LV-GFP-siRNA-DC免疫小鼠中的 gpl20 特异性抗体，与 LV-SOCSl-siRNA-DC免疫的小鼠相比较。图 18B i兌明了 LV-SOCSl-siRNA-DC 小鼠中 gpl20特异性 CTL应答，与 LV-GFP-siRNA-DC小鼠相比较。图18C说明了免疫后六个月时 LV-SOCSl-siRNA-DC小鼠中CD44hi和IFN y + CD8+ T细胞的百分比, 与LV-GFP-siRM-DC小鼠相比较。图18D说明了免疫后六个月时在 LV-S0CS1-siRNA-DC小鼠中维持并快速诱导了 gpl2Q-特异性C4+ Th 应答。
图19,包括图19A至19E，是系列图，证明了 S0CS1沉默DC对 HIV Env介导的免疫抑制的抗性。图19A说明了在gpl20蛋白存在下 LV-SOCSl-siRNA-DC保持了应答LPS的能力。预先暴露于gpl20蛋白 对LV-S0CS1-s iRM-DC诱导OVA特异性抗体应答的能力不具有明显的 效果(图19B和19C)，也没有损害由LV-SOCSl-siRNA-DC诱导的OVA-特异性CD8+ CTL和CD4+ Th应答(图19D和19E )。
图20，包括图20A至20D,是系列图，证明了通过SOCSl siRNA 增强了 HIV DNA疫苗。图20A描绘了用pSuper-SOCSl-siRNA DNA共 免疫的小鼠中HIVEnv-特异性抗体滴度的提高。图20B和20C说明了 通过pSuper-SOCSl-siRNA DNA的共同注射显著增强了 HIV Env-特异性CTL应答，如分别通过CTL和ELISPOT测试所证明的。图20D描绘 了通过共同注射SOCSl-siRNA DNA增强了 HIV Env-特异性CD4+ Th应 答的事实。
图21，包括图21A至21C，是系列图，证明了人单核细胞来源的 DC中人S0CS1的沉默。图2U说明了人S0CS1 siRNA有效地下调了人 S0CS1表达。图21B说明了合成的siRNA双链体至源自人单核细胞的 DC中的转染效率。图21C说明了 hSOCSl siRNA双链体转染的总DC群 中hSOCSl mRNA的含量。
图22，包括图22A至22C，是表征人S0CS1沉默DC的系列图。图 22A描绘了所示人S0CS1的流式细胞分析。图22B和22C说明了 hSOCSl siRNA转染DC中促炎症细胞因子如IL-2、IL-6和TNF-a的分泌水平， 与siRNA突变体转染的人DC相比较。
图23，包括图23A至23C，是系列图，证明了增强的人S0CS1沉 默DC引发抗原特异性CTL应答的免疫刺激功效。从四个使用不同 HLA-A2+捐献者的独立实验之一显示了门控CD3+和CD8+T细胞群中的 MAGE3-PE四聚体+T细胞百分比(图23A)，胞内IFNy+ T细胞百分 比(图23B )，和IFN- y + ELISPOT数量(图23C )。
图24是描绘了人源化HLA-A2. 1转基因小鼠中增强的人MAGE3-特 异性CTL应答的图。
图25，包括图25A和25B,是系列图，证明了通过人 SOCSl-siRNA-DC激活的人CTL的肿瘤裂解活性。从四个独立实验之一 显示了在MAGE3-脉沖的hSOCSl-siRNA DC或对照DC与自身T细胞在 抗人11^-12抗体不存在或存在下两周共培养后，对抗人1^^￡3+,111^42+ 黑素瘤细胞(SK-Mel-37)(图25A)和对照人MAGE3+, HLA-A2—黑素 瘤细胞(M-6-Mel)(图25B)的细胞裂解活性。
图26，包括图26A和26B，是系列图，证明了经免疫的HLA-A2. 1 转基因小鼠激活的CTL的肿瘤裂解活性。用MAGE3肽体外再次刺激5 天后测定了对抗人SK-Mel-37细胞(图26A )和对照人HLA-A2—NA-6-Mel 细胞(图26B)的细胞毒性，并从三个实验之一来呈现。图27,包括图27A和27B,是系列图，证明了用S0CS1 s匿Aoligo 双链体的共同免疫增强了体内蛋白免疫。
图28是描绘了表达人S0CS1 siRNA的复制缺陷型腺病毒载体的 图。图28还证明了 Ad-人S0CS1 siRNA对人DC的转染。
图29是描绘了通过对T细胞的S0CS1 siRNAoligo双链体转染增 强的CTL活性的图。
图30是描绘了 siRNA候选物的核酸序列的图。
发明详述
本发明涉及通过调节免疫细胞中的细胞因子信号转导调节剂来增 强免疫细胞的免疫效能。本发明提供了用于调节免疫细胞中抗原呈递 的组合物和方法，通过调节细胞因子信号转导调节剂如细胞因子信号 转导抑制因子(SOCS)、含有SH2的磷酸酶(SHP)或活化STAT的蛋 白抑制剂(PIAS)。本发明提供了疫苗和治疗方法，其中通过调节细 胞因子信号转导调节剂增强了免疫细胞的免疫效能。此外，本发明还 提供了破坏肿瘤疫苗接种中自身耐受性的机制。因此，本发明提供了 通过增强细胞的免疫刺激能力干扰免疫细胞中负向调节信号转导途径 的治疗益处。
定义
如在此所用的，以下每个术语具有该部分中伴随其的意思。 在此所用的冠词"一种"和"一个"指的是一个或多于一个(即，
至少一个)该冠词的语法宾语。例如"一个元件"意思是一个元件或
多于一个元件。
本领域技术人员将理解术语"约"并在其使用的上下文中将有一 定程度的改变。
"同种异体"指的是源自相同物种不同动物的移植物。 "同种异体抗原，，是不同于接收者所表达抗原的抗原。 如在此所用的术语"抗体"，指的是免疫球蛋白分子，其能够特异性结合抗原上的特异性表位。抗体可以是源自天然来源或重组来源 的完整免疫球蛋白和可以是完整免疫球蛋白的免疫活性部分。抗体通 常是免疫球蛋白分子的四聚体。本发明中的抗体可以以各种形式存在，
包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、 Fab和F(abh，以及单链抗 体和人源化抗体(Harlow等，1988; Houston等；Bird等，1988 )。 如在此所用的术语"抗原"或"Ag"定义为引发免疫应答的分子。 这种免疫应答可以涉及抗体产生，或特定免疫活性细胞的激活，或两 者。本领域技术人员将理解任何大分子，包括几乎所有蛋白质或肽， 可以作为抗原。此外，抗原可以源自重组或基因组DNA。本领域技术 人员将理解任何DNA，其包括编码引发免疫应答的蛋白的核苷酸序列 或部分核苷酸序列，因此编码如在此所用的术语"抗原"。此外，本 领域技术人员将理解抗原不需要只通过基因的全长核苷酸序列来编 码。显而易见的是本发明包括但不限于使用多于一个基因的部分核苷
外，本领域技术人员将理解抗原根本不需要通过"基因"来编码。显 而易见的是抗原可以合成产生或可以源自生物学样品。这样的生物学 样品可以包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或生物学流体。
"抗原呈递细胞"(APC)是能够激活T细胞的细胞，并包括但不 限于单核细胞/巨噬细胞、B细胞和树突细胞(DC)。
术语"树突细胞，，或"DC"指的是在淋巴或非淋巴组织中发现的 多种形态上相似细胞类型的群中的任何成员。这些细胞的特征在于它 们特征性的形态，高水平的表面MHC-II类表达。可以从多种组织来源 分离DC。 DC具有敏化MHC-限制性T细胞的高能力并在原位向T细胞 呈递抗原方面非常有效。抗原可以是在T细胞发育和耐受过程中表达 的自身抗原，和在正常免疫应答过程中存在的外源抗原。
如在此所用的，"激活的DC"是已经用抗原脉沖并能够激活免疫 细胞的DC。
如在此所用的术语"成熟DC"定义为表达高水平的MHC II类、 CD80 ( B7. 1 )和CD86 ( B7. 2 )分子的树突细胞。相反，不成熟树突细
22胞表达低水平的MHC II类、CD8G (B7. 1)和CD86 (B7. 2)分子，但 具有极大的摄取抗原的能力。
"装载抗原的APC"或"抗原脉冲的APC"包括已经暴露于抗原并 通过抗原激活的APC。例如，APC可以在体外变成装载Ag的，例如在 抗原存在下的培养过程中。还可以通过暴露于抗原在体内装栽APC。
通常以两条途径之一来制备"装载抗原的APC，， ( 1)将称为抗 原肽的小肽片段直接"脉沖"至APC的外表面上；或(2)用随后通过 APC摄入的完整蛋白或蛋白颗粒来温育APC。这些蛋白通过APC消化成 小肽片段并最终转运至APC表面并在APC表面上呈递。此外，还可以 通过将编码抗原的多核苷酸引入细胞中来产生装载抗原的APC。
如在此所用的，术语"沉默的(silenced) APC"或"沉默的DC" 各自指的是已经暴露于本发明的细胞因子信号转导调节剂抑制剂的 APC或DC。抑制剂优选是siRNA形式。抑制剂能够抑制细胞因子信号 转导调节剂包括但不限于SOCS、 SHP、 PIAS等。与没有用细胞因子信 号转导调节剂抑制剂处理过的其他方面相同的APC相比较时，沉默APC 具有增强的免疫效能。
"反义"特别指的是编码多肽的双链DM分子的非编码链的核酸 序列，或指的是与非编码链基本上同源的序列。如在此所定义的，反 义序列与编码多肽的双链DNA分子的序列互补。不必定反义序列只与 DNA分子编码链的编码区域互补。反义序列可以与编码多肽的DNA分 子编码链上指定的调节序列互补，该调节序列控制编码序列的表达。
如在此所用的术语"自身免疫性疾病，，定义为由自身免疫应答引 起的病症。自身免疫性疾病是对自身抗原不当和过度应答的结果。自 身免疫性疾病的实例包括但不限于，艾迪生氏病、斑秃、强直性脊柱 炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性腮腺炎、节段性回肠炎、糖尿病(I 型)、营养不良性大疱性表皮松解症、附睾炎、肾小球肾炎、突眼性 曱状腺肿、Guillain-Barr综合征、桥本氏病、溶血性贫血、系统性 红斑狼疮、多发性硬化、重症肌无力、寻常性天疱疮、牛皮癬、风湿 热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、Sjogren's综合征、脊推关节病、甲状腺炎、脉管炎、白癜风、粘液性水肿、恶性贫血、溃疡性 结肠炎等。
如在此所用的，术语"自体的"意思是源自相同个体的任何材料， 之后将该材料再次引入该个体中。
如在此所用的术语"癌症"定义为特征在于异常细胞快速和不受 控生长的疾病。癌细胞可以局部扩散或通过血流和淋巴系统扩散至身 体的其他部分。各种癌症的实例包括但不限于乳癌、前列腺癌、卵巢 癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋 巴瘤、白血病、肺癌等。
"细胞因子信号转导调节剂"或"细胞因子信号转导的调节剂" 或"细胞因子信号转导的调节剂"指的是能够负向调节细胞中细胞因 子信号转导途径的蛋白。细胞因子信号转导调节剂包括但不限于细胞
因子信号转导抑制因子(S0CS1-S0CS7、细胞因子可诱导的含有SH2 结构域的蛋白(CIS ))、含有SH2的磷酸酶(SHP )和活化STAT的蛋 白抑制剂(PIAS)。
如在此所用的术语"DNA"定义为脱氧核糖核酸。 "供体抗原"指的是由待移植入受体的供体组织表达的抗原。 "受体抗原"指的是对供体抗原的免疫应答的靶标。
如在此所用的，"效应细胞"指的是介导对抗抗原的免疫应答的 细胞。效应细胞的实例包括但不限于T细胞和B细胞。
"编码"指的是多核苷酸如基因、cDNA或mRNA中特定核苷酸序 列作为生物过程中其他聚合物和大分子合成模板的内在性质，所述聚 合物和大分子具有限定的核苷酸序列(即，rRNA、 tRNA和niRNA)或限 定的氨基酸序列和由此引起的生物特性。因此，如果对应于基因的 mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物体系中产生蛋白，该基因就编码 该蛋白。编码链，其核苷酸序列与mRNA序列相同并通常提供于序列表 中，非编码链，用作基因或cDM转录的模板，这两者均可以称为编码 该蛋白或者该基因或cDNA的其他产物。
如在此所用的"内源"指的是来自生物体、细胞、组织或系统的任何物质或在生物体、细胞、组织或系统内产生的任何物质。
如在此所用的术语"外源"指的是从生物体、细胞、组织或系统
引入的任何物质或在生物体、细胞、组织或系统外部产生的任何物质。 如在此所用的术语"表位"定义为抗原上可以引发免疫应答包括
B和/或T细胞应答的小化学分子。抗原可以具有一个或多个表位。大 多数抗原具有多个表位；即，它们是多价的。通常，表位一般为五个 氨基酸和/或糖大小。本领域技术人员将理解通常分子的整体三维结 构，而不是特定线性序列，是抗原特异性的主要标准，因此将一个表 位与另一个区别开来。
如在此所用的术语"表达"定义为特定核苷酸序列通过其启动子 驱动的转录和/或翻译。
如在此所用的术语"表达载体"指的是含有编码能够被转录的基 因产物的至少一部分的核酸序列的载体。 一些情况中，然后将RNA分 子翻译成蛋白质、多肽或肽。其他情况中，这些序列没有得到翻译， 例如，在反义分子、siRM、核酶等的产生中。表达载体可以含有各种 控制序列，其指的是对于可操作连接的编码序列在特定宿主生物体中 转录和可能的翻译所必需的核酸序列。除了支配转录和翻译的控制序 列以外，载体和表达载体还可以含有起其他作用的核酸序列。
如在此所用的术语"辅助T细胞"定义为主要功能是促进其他B 淋巴细月包和T淋巴细胞和或巨噬细胞的激活和功能的效应T细胞。大 部分辅助T细胞是CD4 T细胞。
如在此所用的术语"异源"定义为源自不同物种的DNA或RM序 列或蛋白。
如在此所用的"同源"指的是两个聚合分子之间的亚基序列相似 性，例如两个核酸分子之间，例如两个DNA分子或两个RNA分子，或 两个多肽分子之间。当两个分子中的亚基位置都由相同单体亚基占据 时，例如，如果两个DNA分子各自中的一个位置由腺噤呤占据时，则 它们在该位置就是同源的。两个序列之间的同源性是相匹配或同源位 置数目的直接函数，例如，如果两个化合物序列中的一半(例如，十个亚基长的聚合物中的五个位置)位置是同源的，则两个序列是50% 同源，如果90%的位置例如IO个中的9个是相匹配的或同源的，两个 序列具有90°/。的同源性。例如，DM序列3， ATTGCC5，和3， TATGGC 具有50%的同源性。
如在此所用的，"同源性"与"同一性"同义使用。 如在此所用的，"免疫原"指的是能够刺激或诱导哺乳动物中体 液抗体和/或细胞介导的免疫应答的物质。
如在此所用的术语"免疫球蛋白"或"Ig"定义为功能作为抗体 的一类蛋白。这类蛋白中包括的五个成员是IgA、 IgG、 IgM、 IgD和 IgE。 IgA是身体分泌物如唾液、眼泪、乳汁、胃肠道分泌物以及呼吸 道和生殖泌尿道的粘膜分泌物中存在的主要抗体。IgG是最常见的循 环抗体。IgM是大部分哺乳动物初级免疫应答中产生的主要免疫球蛋 白。它是凝集、补体固定和其他抗体应答中最有效的免疫球蛋白，且 在对抗细菌和病毒的防御中是重要的。IgD是无已知抗体功能的免疫 球蛋白，但可以作为抗原受体。IgE是通过在暴露于过敏原时引起介 质从肥大细胞和嗜碱细胞的释放来介导速发型超敏反应的免疫球蛋 白。
"分离的核酸，，指的是已经从天然存在状态中其两側序列分离的 核酸部分或片段，即，已经从通常邻接该片段的序列移出的DNA片段，
术语还适用从天然伴随核酸的其他成分基本上纯化的核酸，所述成分 即在细胞中天然伴随的RM或DNA或蛋白质。因此该术语包括，例如， 引入载体、自主复制质粒或病毒、或原核生物或真核生物基因组DNA 中的重组DNA，或其作为独立于其他序列的分离分子存在(即，作为 通过PCR或限制酶消化产生的cDM或基因组或cDNA片段)。还包括 重组DNA，其是编码其他多肽序列的杂交基因的一部分。
在本发明的内容中，使用以下对于通常出现的核酸碱基的缩写。 "A"指的是腺苷，"C"指的是胞嘧啶，"G"指的是鸟苷，"T"指 的是胸苷，和"U"指的是尿苷。
26如在此所用的术语"主要组织相容性复合体，，或"MHC，，定义为特 定的基因簇，其中许多在进化上编码涉及抗原呈递的相关细胞表面蛋 白，它们是最重要的组织相容性决定簇。I类MHC或MHC-I，主要功能 在于对CD8T淋巴细胞的抗原呈递。II类MHC或MHC-II，主要功能在 于对CD4 T淋巴细胞的抗原呈递。
如在此所用的术语"调节(modulate)"指的是生物学状态的任 何改变，即增强、降低等。例如，术语"调节"指的是正向或负向调 节S0CS1的表达或活性的能力，包括但不限于S0CS1 mRNA的转录、 S0CS1 mRNA的稳定性、S0CS1 mRNA的翻译、S0CS1多肽的稳定性、S0CS1 翻译后的修饰，或其任意组合。此外，术语调节可以用来指活性的增 强、降低、遮掩、改变、超越或恢复，包括但不限于，与树突细胞的 免疫效能相关的S0CS1活性。术语"调节"也适用于S0CS2、 S0CS3、 S0CS4、 S0CS5、 S0CS6、 S0CS7、 CIS、 PIAS(PIAS1、 PIAS3、 PIASx和 PIASy) 、 SHP (SHP-1和SHP2)或任何其他相关活性。
除非另外指出，"编码氨基酸序列的核苷酸序列"包括为相互简 并形式并编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白质或 RNA的核苷酸序列还可包括内含子，至编码蛋白质的核苷酸序列可以 在一些形式中含有内含子的程度。
如在此所用的术语"多核苷酸"定义为核苷酸链。此外，核酸是 核苷酸的聚合物。因此，如在此所用的核酸和多核苷酸是可互换的。 本领域技术人员具有核酸是可以水解成单体"核苷酸"的多核苷酸的 一般知识。单体核苷酸可以水解成核苷。如在此所用的多核苷酸包括 但不限于通过本领域可用的任何方式获得的所有核酸序列，这些方式 包括但不限于重组方式，即使用常用的克隆技术和PCIT等从重组文库 或细胞基因组克隆核酸序列，和通过合成方式。
如在此所用的术语"多肽"定义为氨基酸残基链，通常具有限定 的序列。如在此所用的术语多肽与术语"肽"和"蛋白质"相互包含。
如在此所用的"增殖"指的是实体相似形式的复制或繁殖，例如 细胞的增殖。即，增殖包括更多数量细胞的产生，并特别地可以通过简单计数细胞的数目、测量掺入细胞的力-胸苷等来测量。
如在此所用的术语"启动子"定义为被细胞合成机制识别的或引
入合成机制的启动多核苷酸序列特定转录所需要的DNA序列。
如在此所用的，术语"启动子/调控序列"意思是可操作连接至启 动子/调控序列的基因产物的表达所需的核酸序列。在一些情况中，该 序列可以是核心启动子序列，在其他情况中，这种序列还包括增强子 序列和基因产物表达需要的其他调控元件。启动子/调控序列可以是例 如以组织特异性方式表达基因产物的序列。
"组成型"启动子是可操作地连接编码或限定基因产物的多核苷 酸时，导致在大部分或所有的细胞生理条件下在细胞中产生基因产物 的核苷酸序列。
"诱导型"启动子是可操作地连接编码或限定基因产物的多核苷 酸时，基本上只在细胞中存在对应于启动子的诱导剂时导致在细胞中 产生基因产物的核苷酸序列。
"组织特异性"启动子是可操作地连接编码或限定基因产物的多 核苷酸时，基本上只在细胞是对应于启动子的组织型细胞时导致在细 胞中产生基因产物的核苷酸序列。
如在此所用的术语"RM"定义为核糖核酸。
如在此所用的术语"重组DM"定义为通过连接不同来源的DNA 片段而产生的DM。
如在此所用的术语"重组多肽"定义为使用重组DNA方法产生的 多肽。
如在此所用的术语"自身抗原"定义为由宿主细胞或组织表达的 抗原。自身抗原可以是肿瘤抗原，但在特定实施方案中，在正常和胖 瘤细胞中都表达。本领域技术人员将容易理解自身抗原可在细胞中超 表达。
如在此所用的"基本上纯化的"细胞是基本上无其他细胞类型的 细胞。基本上纯化的细胞还指的是已经从天然存在状态中通常伴随其 的其他细胞类型分离出来的细胞。 一些情况中，基本上纯化的细胞群指的是同源的细胞群。其他情况中，该术语简单地指已经从天然存在 状态中通常伴随的细胞分离出来的细胞。 一些实施方案中，细胞是体 外培养物。其他实施方案中，细胞不在体外培养。
如在此所用的术语"T-细胞"定义为胸腺衍生的参与各种细胞介
导的免疫反应的细胞。
如在此所用的术语"B-细胞"定义为源自骨髓和/或脾脏的细胞。 B细胞可以发展成产生抗体的浆细胞。
如在此所用的，"治疗有效量"是足以对给药组合物的哺乳动物 提供有益效果的治疗组合物量。
如在此所用的术语"转染的"或"转化的"或"转导的"指的是 通过其将外源核酸转移至或引入宿主细胞中的过程。"转染的"或"转 化的"或"转导的"细胞是已经用外源核酸转染、转化或转导的细胞。 细胞包括原代主体细胞及其后代。
如在此所用的短语"在转录控制下"或"可操作地连接"意思是 启动子相对于多核苷酸处于正确的位置和方向来控制通过RNA聚合酶 的转录和多核苷酸表达的启动。
如在此所用的术语"疫苗"定义为将该物质给予哺乳动物后用于 引发免疫应答的物质。
"栽体"是包括分离的核酸并可以用于将分离的核酸传送至细胞 内部的物质组成。各种载体是本领域已知的，包括但不限于，线性多 核苷酸、与离子或两性化合物结合的多核苷酸、质粒和病毒。因此， 术语"栽体"包括自主复制的质粒或病毒。还应当将该术语解释来包 括促进核酸转移至细胞中的非质粒和非病毒化合物，如例如，聚赖氨 酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺 伴随病毒载体、逆转录病毒载体等。
如在此所用的术语"病毒"定义为由蛋白壳中包封的核酸UNA 或DNA)构成的颗粒，具有或不具有外部脂质包膜，其能够在完整细 胞内复制。
"异种"指的是源自不同物种动物的移植物。描述
哺乳动物中基于细胞因子信号转导的不受控信号转导可具有灾难 性的生物后果。因此，以不同水平紧密控制信号转导途径。存在多种 类型的细胞因子信号转导调节剂，包括但不限于，细胞因子信号转导
抑制因子(SOCS)、含有SH2的磷酸酶(SHP)和活化STAT的蛋白抑 制剂(PIAS)。
细胞因子信号转导的可诱导抑制剂是细胞因子信号转导抑制因子 (SOCS)蛋白，其中存在八个家族成员S0CS1-S0CS7和细胞因子可 诱导的含有SH2结构域的蛋白(CIS) 。 SOCS蛋白识别细胞因子受体 或相关的JAK并通过直接干扰信号转导和通过靶向受体复合体进行遍 在蛋白介导的蛋白酶体降解来削弱信号转导。
SHP蛋白，包括但不限于(SHP-1和SHP-2 ),是组成型表达的并 可以通过将信号中间产物如Janus激酶(JAK)及其受体去磷酸化来削 弱细胞因子信号转导。活化STAT的蛋白抑制剂(PIAS)的家族成员， 包括但不限于PIAS1、 PIAS3、 PIASx和PIASy，也是组成型表达的并 通过抑制STAT活性来削弱信号转导。Sumoylation的过程涉及PIAS 介导的对STAT活性的抑制。
本发明涉及对这些类型细胞因子信号转导调节剂中任何一种或多 种的抑制提供了治疗性益处的发现。因此，本发明包括用于调节免疫 细胞中的细胞因子信号转导调节剂因此增强免疫细胞免疫效能的组合 物和方法。组合物包括以下至少一种或多种的任意组合细胞因子信 号转导调节剂的抑制剂、抗原、沉默的免疫细胞、脉沖的细胞、用抗 原脉冲的沉默的免疫细胞、细胞因子等。组合物可以是用于体内免疫 和/或离体治疗的疫苗。
本发明提供了沉默的APC作为一般的工具通过使APC中的关键控 制点失去能力来增强疫苗功效。用本发明的细胞因子信号转导调节剂 抑制剂或沉默的APC接种增强了抗原特异性免疫，因为细胞因子信号 转导调节剂的沉默允许抗原呈递免疫原性APC持续地体内刺激抗原特异性T细胞。本发明的一实施方案中，沉默的APC通过增强APC成熟 和抑制调节T细胞抑制的促炎症细胞因子的产生能够关闭调节T细胞。 除了产生沉默的APC,本发明还包括沉默的细胞毒性T淋巴细胞 (CTL)。本发明的公开内容证明了使用本发明的方法沉默的CTL呈现 了增强的细胞裂解活性。具有增强的细胞裂解活性的CTL在细胞治疗 和/或接种疫苗中提供了治疗益处。
调节剂的抑制剂
基于在此的公开内容，本发明包括抑制细胞因子信号转导调节剂 的一般概念，其中调节剂与调节涉及免疫应答的信号转导途径相关。
一实施方案中，本发明包括用于增强免疫细胞免疫效能的组合物。 该组合物包括以下调节剂中任一种或多种的抑制剂S0CS、 SHP或 PIAS。本发明的另一方面中，组合物干扰细胞中的负向调节途径。
含有细胞因子信号转导调节剂抑制剂的组合物选自小干扰RNA (siRNA)、微RNA、反义核酸、核酶、编码转显性阴性突变体的表达 载体、胞内抗体、肽和小分子。
兮贝碼3夂不八贝丞T杜jto仅伏的么、^T円谷pj "t 细胞因子信号转导调节剂的mRM和/或蛋白水平的一种方法是通过降 低或抑制编码调节剂的核酸的表达。因此，还可以使用抑制或降低基 因表达的分子或化合物如反义分子或核酶来降低细胞中细胞因子信号 转导调节剂的蛋白水平。
优选实施方案中，调节序列是通过质粒载体表达的反义核酸序列。 将反义表达载体用于转染哺乳动物细胞或哺乳动物自身，因此引起细 胞中所需细胞因子信号转导调节剂抑制剂降低的内源表达。然而，不
号转导调节剂的表达。相反，本发明包括本领域已知的用于抑制细胞 中蛋白表达或活性的其他方法，包括但不限于，使用核酶，表达非功 能性的细胞因子信号转导调节剂(即，转显性阴性突变体)和使用胞 内抗体。反义分子及其用于抑制基因表达的用途是本领域公知的(参见，
例如，Cohen， 1989, 在Oligodeoxyribonucleotides， Antisense Inhibitors of Gene Expression (寡脱氧核糖核苷酸，基因表达的 反义抑制剂)，CRC Press)。和该术语在别处所定义的一样，反义核 酸是与特定mRNA分子的至少一部分互补的DNA或RNA分子 (Weintraub, 1990， Scientific American 262:40 )。在细胞中， 反义核酸与相应的fflRNA杂交，形成双链分子，因此抑制基因的翻译。
使用反义方法来抑制基因翻译是本领域已知的，例如描述于 Marcus-Sakura ( 1988， Anal. Biochem. 172: 289 )。可4吏用编石马反义 分子的DNA通过基因表达将这样的反义分子提供给细胞，如Inoue， 1993， U. S.专利No. 5， 190， 931所教导的。
或者，可以合成制得本发明的反义分子并提供给细胞。优选约IO 至约30个核苷酸的反义寡聚物，更优选约15个核苷酸，因为它们容 易合成和引入靶细胞中。本发明设想的合成反义分子包括本领域已知 的与未修饰的寡核苷酸相比较具有改进的生物活性的寡核苷酸衍生物 (参见U. S.专利No. 5， 023， 243 )。
核酶及其用于抑制基因表达的用途是本领域公知的(参见，例如， Cech等,1992， J. Biol. Chem. 267: 17479-17482; Hampel等，1989， Biochemistry 28: 4929-4933; Eckstein等,国际公开No.謂2/07065; Altman等，U. S.专利No. 5， 168， 05 3 )。核酶是具有以类似于DM限制 性内切酶的方式特异性切割其他单链RNA能力的RM分子。通过编码 这些RNA的核苷酸序列的修饰，可以将分子工程化来识别RM分子中 的特定核苷酸序列并将其切割(Cech， 1988， J. Amer. Med. Assn. 260: 3030 )。这种方法的主要优势在于核酶是序列特异性的事实。
存在两种基本类型的核酶，即，四膜虫型(Haddelhoff， 1988， Nature 334: 585 )和锤头型。四膜虫型核酶识别四个碱基长的序列， 而锤头型核酶识别11-18个碱基长的碱基序列。序列越长，目标mRNA 种类中序列唯一出现的可能性越大。因此，对于灭活特定mRM种类， 锤头型核酶优于四膜虫型核酶，且18-碱基识别序列优于各种无关mRNA分子内可随机出现的较短识别序列。
通过将目标序列引入基础核酶结构中来设计用于抑制细胞因子信 号转导调节剂表达的核酶，目标序列与本发明所需细胞因子信号转导 调节剂的mRNA序列互补，细胞因子信号转导调节剂包括但不限于SOCS (S0CS1-S0CS7， CIS) 、 SHP(SHP-1和SHP2 )和PIAS ( PIAS1 、 PIAS3、 PIASx和PIASy)。可以寸吏用可购^寻的试剂(Applied Biosystems， Inc., Foster City, CA )来合成靶向所需细胞因子调节剂的核酶，或 从编码它们的DNA遗传表达来获得。
本发明的另 一个方面中，通过灭活和/或隔绝细胞因子信号转导调
节剂来抑制细胞因子信号转导调节剂。因此，通过使用转显性阴性突 变体可以实现抑制细胞因子信号转导调节剂的效果。或者，可以使用
对所需细胞因子信号转导调节剂特异性的胞内抗体，另外也称为细胞 因子信号转导调节剂的拮抗剂。 一实施方案中，拮抗剂是具有与细胞 因子信号转导调节剂结合伴侣相互作用的理想特性的蛋白质和/或化 合物，因此与相应的野生型细胞因子信号转导调节剂竟争。另一实施 方案中，拮抗剂是具有与细胞因子信号转导调节剂相互作用的理想特 性的蛋白质和/或化合物，并因此隔绝细胞因子信号转导调节剂。
小干扰RNA ( siRNA)
小干扰RNA (siRNA)是RNA分子，包括一组靶向目标基因或多核 苷酸的核苷酸。如在此所用的，术语"siRM"包括所有形式的siRNA， 包括但不限于，(i)双链RNA多核苷酸，(ii)单链多核香酸，和(iii) (i)或(ii)的多核苷酸，其中这样的多核普酸具有一个、两个、三 个、四个或多个核苷酸改变或置换。
双链多核苷酸形式的siRNA包括约18个碱基对、约19个碱基对、 约20个碱基对、约21个碱基对、约22个碱基对、约23个碱基对、 约24个碱基对、约25个碱基对、约26个碱基对、约27个碱基对、 约28个碱基对、约29个碱基对或约30个碱基对长。双链siRNA能够 干扰细胞因子信号转导调节剂的表达和/或活性。单链siRNA包括靼向目标基因或多核苷酸的RM多核苷酸序列的 一部分。单链siRNA包括约18个核苷酸、约19个核苷酸、约20个核 苷酸、约21个核苷酸、约22个核苷酸、约23个核苷酸、约24个核 苷酸、约25个核苷酸、约26个核苷酸、约27个核苷酸、约28个核 苷酸、约29个核苷酸或约30个核苷酸长的多核苷酸。单链siRNA能 够干扰目标多核普酸如SOCS (S0CS1-S0CS7， CIS) ， SHP， PIAS或其 变体的表达和/或活性。单链siRNA还能够与互补序列退火来形成能够 干扰细胞因子信号转导调节剂表达和/或活性的dsRNA。
再一方面中，siRNA包括含有双链或单链多核普酸的多核苷酸， 其中siRNA具有一个、两个、三个、四个或多个核普酸改变或置换。
siRNA多核苷酸是干扰RNA活性的RNA核酸分子，通常认为是通 过转录后基因沉默机制产生效应的。s iRNA多核苷酸优选包括双链RNA (dsRNA)，但不认为受限于此，可以包括单链MA (参见，例如， Martinez等，2002 Cel 1 110: 563-74 )。本发明中包括的siRNA多核 苷酸包括其他天然产生的、重组或合成的单链或双链核苷酸(核糖核 苷酸或脱氧核糖核苷酸或两者的组合)聚合物和/或在此提供的核苷酸 类似物(例如，寡核苷酸或多核苷酸等，通常是5，至3，磷酸二酯键)。 因此，将认识到在此作为能够指导siRNA多核苷酸转录的DNA序列公 开的特定示范性序列还旨在描述相应的RNA序列及其互补物(已知充 分建立的互补核苷酸碱基配对的原理)。
使用含有用于RNA聚合酶启动子的启动子的DNA(基因组的、cDNA 或合成的)作为模板可以转录siRNA。例如，启动子可以是U6启动子 或HI RNA聚合酶III启动子。或者，siRNA可以是合成产生的RNA分 子。特定实施方案中，siRNA多核苷酸具有平端。其他特定实施方案 中，siRNA多核苷酸的至少一条链在siRNA多核苷酸任一条链的3，端 具有至少一个，优选两个多核苷酸"突出端"(即，在相对链中没有 与互补碱基形成碱基对)。本发明的优选实施方案中，siRM多核苷 酸双链体的每条链在3，端具有两个核苷酸的突出端。两个核苷酸的 突出端优选是胸苷二核苷酸(TT)，但也可以包括其他碱基，例如TC
34二核苷酸或TG二核苷酸，或任何其他二核苷酸。突出端二核苷酸还可 以与靶向进行干扰的多核苷酸序列5，端的两个核苷酸互补。对于 siRNA多核苷酸3，端的讨论，参见例如WO01/75164。
优选siRNA多核普酸包括约18-30个核苷酸碱基对的双链多核苷 酸，优选约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、 约26或约27个碱基对，其他优选实施方案中，约19、约20、约21、 约22或约23个碱基对，或约27个碱基对，其中"约"的使用表示在 特定实施方案中和在特定条件下，形成能够干扰选定多肽表达的功能 性siRNA多核苷酸的持续裂解步骤可能不是绝对有效的。因此，作为 siRNA加工过程、生物合成或人工合成中可变性的结果，siRNA多核苷 酸可以包括一个或多个长度相差(例如，通过核苷酸插入或删除)一 个、两个、三个、四个或多个碱基对的siRNA多核苷酸分子。本发明 的siRNA多核苷酸还可以包括通过在一个、两个、三个或四个核普酸 不同于特定序列(例如，通过核苷酸置换，包括转移或转换)呈现可 变性的多核苷酸序列。这些差异可以发生在特定siRNA多核苷酸序列 的任何核苷酸位置，取决于分子的长度，不管是位于双链多核苷酸的 有义或反义链中。可以在双链多核苷酸的一条链上发现核苷酸差异， 其中替代核苷酸与之通常形成氢键碱基配对的互补核苷酸不必定相应 地替代。优选实施方案中，对于特定核苷酸序列，siRNA多核苷酸是 同源的。
特定实施方案中，包括本发明siRM多核苷酸的多核苷酸可以源 自包括单链寡核苷酸片段(例如，约18-30个核苷酸)及其反向互补 物的单链多核苷酸，其间通常通过间隔序列来隔开。根据某些这样的 实施方案，间隔物的分裂提供了单链寡核苷酸片段及其反向互补物， 使得它们退火形成本发明的双链sLRM多核苷酸，任选地使用导致从 任一条或两条链的3，端和/或5，端添加或去除一个、两个、三个或 多个核苷酸的其他加工步骤。特定实施方案中，间隔物是在间隔物分 离和任选地导致从任一条或两条链的3，端和/或5，端添加或去除一 个、两个、三个、四个或多个核苷酸的随后加工步骤之前，允许片段及其反向互补物退火并形成双链结构(例如，如发夹多核苷酸)的长 度。因此，间隔物序列是如在此所提供的位于两个互补多核苷酸序列 区域之间的任何多核苷酸序列，当两个序列退火成双链核酸时，形成
siRNA多核苷酸。优选，间隔物序列包括至少4个核苷酸。特定实施 方案中，间隔物包括5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21-25、 26-30、 31-40、 41-50、 51-70、 71-90、 91-110、 111-150、 151-200或更多个多核苷酸。已经描述了源自单核苷酸链的 siRM多核苷酸实例，该单核苷酸链包括两个通过间隔物隔开的互补 核脊酸序歹'J (侈寸^口， Brummelkamp等，2002 Science 296: 550; Paddison 等，2002 Genes Develop. 16: 948，' Paul等，2002 Nat. Biotechnol. 20:505-508; Grabarek等,2003 Bio Techniques 34:734-44 )。
多核苷酸变体可以含有一个或多个置换、添加、删除和/或插入， 使得siRM多核苷酸的活性没有显著减小。通常如本文别处所述的评 价核苷酸内容中任何这样的改变对siRM多核苷酸活性的影响。变体 优选呈现与编码天然SOCS( S0CS1-S0CS7、 CIS )， SHP( SHP-l和SHP-2 ) 或PIAS (PIAS1、 PIAS3、 PIASx和PIASy)的多核苷酸序列的一部分 至少约75%、 78°/。、 80%、 85%、 87%、 88%或89°/。的同一性，更优选至少 约90%、 "％、 "％、 96%或97%的同一性。通过比较多核苷酸与目标多 核苷酸相应部分的序列可以容易地测定百分比同一性，使用任何方法， 包括使用本领域普通技术人员公知的计算机算法。这些包括Al ign或 BLAST算法(AUschul, 1991 J. Mol. Biol. 219:555-565; Henikoff 和Henikoff， 1992， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919 )。
特定siRNA多核苷酸变体可与编码目标多肽的多核苷酸的一部分 基本上同源。源自这些多核苷酸变体的单链多核苷酸在中等严谨条件 下能够与编码目标多肽的天然产生的DM或RNA序列杂交。在中等严 谨条件下与编码目标多肽的多核苷酸序列可检测杂交的siRM多核苷 酸可具有包括至少10个与特定目标多核苷酸互补的连续核普酸的核 苷酸序列，更优选ll、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29或30个连续的核苷酸。特定的优选实施方案中，这样的siRNA序列(或其互补物)对于编码想要干扰 其表达的目标多肽的单个特定多核苷酸是独特的。特定的其他实施方 案中，该序列(或其互补物)可以为编码想要干扰多肽表达的目标多 肽的两个或多个相关多核苷酸所共有。
合适的中等严谨条件包括，例如，在5XSSC， 0. 5%SDS， 1. OmM EDTA (pH8， 0)溶液中预先洗涤多核苷酸；在50-70。C、 5XSSC将多核苷酸 杂交1-16小时(例如，过夜)；接着在22-65。C将多核苷酸洗涤一次 或两次20-40分钟，使用一次或多次含有0. 05-0. 1%SDS的2X、 0. 5X 和0. 2X SSC中的每一种。对于附加的严谨性，杂交条件可以包括在 0. 1XSSC和0. 1%SDS中50-60'C另外洗涤15-40分钟。本领域普通技 术人员将理解通过改变用于预杂交、杂交以及洗涤步骤的时间、温度 和/或溶液浓度可以获得杂交条件严谨性的改变。合适的条件部分也可 取决于所用探针和印迹过的先证核酸样品的特定核苷酸序列。因此， 将认识到当基于与一个或多个特定的先证序列杂交同时不与特定的其 他先证序列杂交的能力鉴定出所需的多核苷酸选择性时，可以容易地 选择合适的严谨条件，而不需要不适当的实验。
可以使用若干标准中的 一 个或多个来设计本发明的序列特异性 siRNA多核苷酸。例如，为了设计具有与编码目标多肽的序列相同的 约21个连续核苷酸的siRNA多核苷酸，可以扫描多核苷酸序列开放阅 读框中具有一个或多个以下特征的约21个碱基序列长度(1 )A+T / G+C 比例约为1: 1,但不高于2: l或l: 2; (2)5，端为AA双核苷酸或 CA双核苷酸；(3)内部发夹环的解链温度低于55X:; (4)同型二聚 体的解链温度低于37。C (可以使用本领域技术人员已知的计算机软件 来确定(3)和(4)中所述的解链温度计算)；(5)至少16个未鉴 定为存在于任何其他已知多核普酸序列中的连续核苷酸的序列。或者， 可以使用从各种厂商例如OligoEngine. TM. (Seattle, Wash.); Dharmacon, Inc. ( Lafayette, Colo. ); Ambion Inc. ( Austin, Tex.); 和QIAGEN， Inc. (Valencia, Calif.))可购得的计算机软件来设计 和选择siRNA多核苷酸序列。还可以参见Elbashir等，2000 Genes &Development 15: 188-200; Elbashir等，2001 Nature 411: 494-98。 然后可以才艮据本领域已知的和本文别处所述的方法来测试siRNA多核 苷酸千扰目标多肽表达的能力。siRNA多核苷酸有效性的测定不仅包 括干扰目标多肽表达能力的考虑，而且包括siRNA多核苷酸对于宿主 细胞是否是毒性的。例如，理想的siRNA将呈现RNA干扰活性，并且 还不呈现不利的生物后果。不利生物后果的实例是细胞凋亡，对于所 述细胞而言，作为将siRNA引入宿主细胞的结果，细胞死亡不是所期 望的。
基于本发明的公开内容，将认识到本发明的siRNA可以实现目标 多肽表达不同程度的沉默。因此首先必须测试siRNA的有效性。基于 给定siRNA干扰或调节目标多肽表达的能力，进行siRNA的选择。因 此，能够千扰所需目标多肽表达的特异性siRNA多核苷酸序列的鉴定 需要各个siRNA的产生和测试。测试每个siRNA的方法和用于本发明 中合适siRNA的选择在此充分列于实施例中。因为不是所有干扰蛋白 表达的siRNA都具有生理学上重要的效果，本发明的公开内容还列举 了多种生理学上相关的测试，用于测定使用本发明的siRNA干扰目标 蛋白表达的水平是否具有临床上相关的显著性。
本领域技术人员将容易地认识到作为遗传密码简并性的结果，许 多不同的核苷酸序列编码相同的多肽。即，氨基酸可以由几种不同密 码子中的一种来编码，本领域技术人员可以容易地确定，尽管一个特 定的核苷酸序列不同于另一个，但多核苷酸实际上编码具有相同氨基 酸序列的多肽。因此，本发明特别地考虑由于密码子使用差异而不同 的多核苷酸。
可以使用用于制备特定需要的siRNA多核苷酸的多种技术中的任 何一种来制备siRNA的多核苷酸。例如，可以由从合适细胞或组织类 型制得的cDNA扩增多核苷酸。可以通过聚合酶链式反应(PCR)来扩 增这样的多核苷酸。使用这种方法，基于在此提供的序列来设计序列 特异性引物，并可以购买或直接合成。引物的扩增部分可以用于使用 公知技术从合适的DNA文库分离全长基因，或其所需部分。使用一个优选，文库是大小选择的来包括较大的多核苷酸序列。为了鉴定基因
的5，和其他上游区域，随机引物文库也是优选的。基因组文库对于 获得内含子和延伸5，序列是优选的。本发明考虑的siRNA多核苷酸 还可以选自siRNA多核苷酸序列文库。
对于杂交技术，可以使用公知技术将部分多核苷酸序列标记(例 如，通过切口平移或用"P末端标记)。然后通过使用标记的探针与含 有变性细菌菌落的滤器(或含有噬菌斑的菌苔)杂交来篩选细菌或噬 菌体文库(参见，例如Sambrook等，Molecular Cloning: A Laboratory Manual (分子克隆实验室手册)，Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, N. Y. ， 2001 )。选择杂交菌落或噬斑并扩充， 分离DNA用于进一步的分析。
或者，众多扩增技术是本领域已知的，用于从部分cDNA序列获得 全长编码序列。这样的技术内，通常通过PCR来进行扩增。 一种这样 的技术称为"cDNA末端的快速扩增"或RACE(参见，例如，Sambrook 等，Molecular Cloning: A Laboratory Manual， Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, N.Y. ， 2001)。
在此包括的实施例、附图和序列表中呈现了许多用于干扰目标多 肽表达的特异性siRNA多核苷酸序列。通常可以通过本领域已知的任 何方法来制备siRNA多核苷酸，包括例如固相化学合成。还可以使用 标准诱变技术如寡核苷酸指导的位点特异性诱变将修饰引入多核苷酸 序列中。此外，siRNA可以化学上修饰或缀合其他分子来增强它们的 稳定性和/或传送特性。作为本发明的一方面包括的是在此所述的 siRNA，其中已经从其除去了一个或多个核糖。
或者，通过体外或体内转录合适的DNA序列(例如，编码目标多 肽的多核苷酸序列，或其所需部分)来产生siRNA多核苷酸分子，只 要将DM引入具有合适RM聚合酶启动子(如例如，T7、 U6、 HI或SP6, 尽管其他启动子同样可用)的载体中。此外，可以将siRNA多核苷酸 给药于哺乳动物，如同支持转录(和任选地合适的加工步骤)的DM序列(例如，在此提供的重组核酸构建体)，使得在体内产生所需的
siRM。
一实施方案中，siRNA多核苷酸，其中siRM多核苷酸能够干扰 目标多肽的表达，可以用于产生沉默细胞。本发明包括与生物来源接 触一定时间段时导致目标肽表达显著降低的任何siRNA多核苷酸。优 选，相对于siRNA不存在时检测到的目标蛋白表达水平，降低高于约 10%、更优选高于约20%、更优选高于约30%、更优选高于约40%、约 50%、约60%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%或约 98%。优选，细胞中siRNA多核苷酸的存在不导致或引起任何不利的毒 性影响，例如，细胞的凋亡或死亡，其中凋亡不是RNA干扰的期望效 果。
另一实施方案中，与生物来源接触一定时间段时，siRNA多核苷 酸引起目标多肽表达的显著降低。相对于siRM不存在时检测到的目 标多肽表达水平，优选降低是约10%-20%，更优选约20%-30%，更优选 约30%-40%，更优选约40%-50%，更优选约50%-60%，更优选约60%-70%， 更优选约70%-80%,更优选约80%-90%，更优选约90%-95%,更优选约 95%-98%。优选，细胞中siRNA多核苷酸的存在不导致或引起任何不利 的毒性影响。
再一实施方案中，与生物来源接触一定时间段时，siRNA导致目 标多肽表达的显著降低。相对于siRNA不存在时检测到的目标多肽表 达水平，优选降低约10%或更多，更优选约20%或更多，更优选约30% 或更多，更优选约40%或更多，更优选约50%或更多，更优选约60%或 更多，更优选约70%或更多，更优选约80%或更多，更优选约90%或更 多，更优选约95%或更多，更优选约98%或更多。优选，细胞中siRM 多核苷酸的存在不导致或引起任何不利的毒性影响。
因此，本发明包括siRNA多核苷酸，如siRM,如SEQ ID NO: l-3、 21-23和27-56中所示例的。SEQ 1-3和21-23各自是对于S0CS1的 鼠和人siRNA候选序列的序列。SEQ ID NO: 27-32、 33-38、 39-44、 45-50和51-56各自是对于PIAS1、 PIAS3、 PIASx、 PIASy和SHP-1的
40人siRM候选序列的序列。siRNA的序列描绘于图30中。在本领域普
通技术人员已知的计算机化数据库中可以找到对于各种细胞因子信号 转导调节剂的多核苷酸和多肽序列。 一个这样的数据库是National
Center for Biotechnology Information' s Genbank和GenPept数 据库(国家生物技术信息中心GenBank和GenPept数据库)。可以扩 增这些已知基因的核酸序列，结合(例如，连接)在此公开的序列， 和/或表达，使用在此公开的技术或通过本领域普通技术人员已知的任 何技术(例如，Sambrook等，2001 )。尽管可以在体外表达系统中表 达核酸，优选实施方案中，核酸包括用于体内复制和/或表达的载体。
siRNA的修饰
本发明的siRM多核苷酸产生后，本领域技术人员将理解siRM 多核苷酸具有可被修饰来改进siRNA作为治疗化合物的特定特征。因 此，可以进一步设计siRNA多核苷酸来抵抗降解，通过修饰来包括硫 代磷酸酯或其他键、膦酸甲酯、砜、硫酸酯、羰游离基、二硫代磷酸 酯、氨基磷酸酯、磷酸酯等(参见，例如，Agrwal等，1987 Tetrahedron Lett.28:3539-3542 ;Stec 等，1985 Tetrahedron Lett. 26:2191-2194; Moody等，1989 Nucleic Acids Res. 12:4769-4782; Eckstein, 1989 Trends Biol. Sci. 14:97-100 ; Stein ， 在 01igodeoxynucleotides. Antisense Inhibitors of Gene Expression (寡脱氧核糖核苷酸。基因表达的反义抑制剂)，Cohen编辑， Macmillan Press, London, pp.97-117 (1989))。
可以将本发明的任何多核苷酸进一步修饰来增强体内稳定性。可 能的修饰包括但不限于在5，和/或3，端添加侧翼序列；在主链中使 用硫代磷酸酯或2' 0-甲基而不是磷酸二酯键；和/或包括非传统碱基 如肌苷、queosine和wybutosine等，以及乙酰基-曱基、硫代-和其 他修饰形式的腺噤呤、胞苷、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿苷。
载体其它相关方面中，本发明包括编码抑制剂的分离核酸，其中抑制
剂优选siRNA抑制细胞因子信号转导调节剂，可操作地连接至包括启 动子/调节序列的核酸，使得核酸优选能够指导由核酸编码的蛋白的表 达。因此，本发明包括表达载体和用于将外源DM引入细胞中的方法， 伴随外源DNA在细胞中的表达，如Sambrook等(2001， Molecular Cloning: A Laboratory Ma纖l(分子克隆实验室手册)，Cold Spring Harbor Laboratory, New York)和 Ausuble 等(1997, Current Protocols in Molecular Biology (分子生物学中的通用实验方案)， John Wiley & Sons, New York)所述的那些。
另一方面中，本发明包括含有siRNA多核苷酸的载体。优选，siRNA 多核苷酸能够抑制目标多肽的表达，其中目标多肽选自S0CS (S0CSl-7、 CIS) 、 SHP或PIAS。将所需多核苷酸引入载体中和载体 的选择是本领域公知的，如描述于Sambrook等，上文和Ausubel等， 上文。
可以将siRNA多核苷酸克隆至多种类型的载体中。然而，本发明 不应当解释为限于任何特定的载体。实际上，本发明应当解释包括多
种容易获得和/或本领域公知的载体。例如，可以将本发明的siRNA 多核苷酸克隆至载体中，载体包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍 生物、动物病毒和粘粒。特定目标载体包括表达载体、复制载体、探 针产生载体和测序载体。
特定实施方案中，表达载体选自病毒载体、细菌载体和哺乳动物 细胞载体。存在多种包括至少部分或全部上述组合物的表达载体系统。 基于原核生物和/或真核生物载体的系统可以用于本发明中来产生多 核苷酸或其同源的多肽。许多这样的系统是可购得的和广泛获得的。
此外，可以以病毒载体形式将表达载体提供给细胞。病毒载体技 术是本领域公知的并描述于例如Sambrook等(2001 )和Ausubel等 (1997 )，以及其他病毒学和分子生物学手册中。用作载体的病毒， 包括但不限于，逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病 毒。通常，合适的载体含有在至少一种生物体中有功能的复制起点、启动子序列、方便的限制性内切酶位点和一个或多个选择标记(参见，
例如，WO01/96584; WO01/29058;和U. S.专利No. 6， 326， 193 )。
为了 siRNA的表达，每个启动子中的至少一个模块起作用来定位 用于RM合成的起始位点。了解最多的实例是TATA盒，但在一些缺乏 TATA盒的启动子中，如用于哺乳动物末端脱氧核苷酸转移酶基因的启 动子和用于SV40基因的启动子中，覆盖起始位点自身的分立元件有助 于固定启动位置。
另外的启动子元件，即增强子，调节转录启动的频率。通常，这 些位于起始位点上游30-110bp的区域中，尽管最近已经表明许多启动 子在起始位点下游也含有功能性元件。启动子元件之间的间隔通常是 灵活的，使得元件相对于彼此倒置和移动时，启动子功能得以保存。 在胸苷激酶(tk)启动子中，在活性开始下降之前启动子元件之间的 间隔可以增加至50bp间隔。根据启动子，似乎单个元件可以合作地或 独立地起作用来激活转录。
启动子可以是与基因或多核苷酸序列天然相连的，如可以通过分 离位于编码片段和/或外显子上游的5，非编码序列获得。这样的启动
子可以称为"内源的"。相似地，增强子可以是与多核苷酸序列天然 相连的，位于该序列的下游或上游。或者，通过将编码多核苷酸片段 置于重组或异源启动子控制下来获得特定的优势，这指的是通常不与 天然环境中的多核苷酸序列相连的启动子。重组或异源增强子也指的 是通常不与天然环境中的多核苷酸序列相连的增强子。这样的启动子 或增强子可以包括其他基因的启动子或增强子，以及从任何其他原核、 病毒或真核细胞分离的启动子或增强子，和不是"天然存在"的启动 子或增强子，即，含有不同转录调节区域的不同元件，和/或改变表达 的突变。除了合成产生启动子和增强子的核酸序列，可以使用重组克 隆和/或核酸扩增技术来产生序列，包括PGR ,结合在此公开的组合 物(U.S.专利4， 683， 202， U. S.专利5， 928， 906 )。此外，考虑到还可 以使用指导无核细胞器如线粒体、叶绿体等内序列转录和/或表达的控 制序列。自然地，使用有效指导DM片段在选择用于表达的细胞类型、细 胞器和生物体中表达的启动子和/或增强子是重要的。分子生物学领域 的那些技术人员通常知道怎样使用启动子、增强子和细胞类型组合用 于蛋白表达，例如，参见Sambrook等(2001 )。所用的启动子可以是 组成型的，组织特异性的，诱导型的，和/或在合适条件下可用于指导 引入的DNA片段的高水平表达，如在大规模生产重组蛋白和/或肽中是 有利的。启动子可以是异源或内源的。
在此呈现的实验实施例中示例的启动子序列是立即早期巨细胞病 毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是能够驱动与其可操作连接的任 何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。然而，也可以使 用其他组成型启动子序列，包括但不限于，猿猴病毒40 (SV40)早期 启动子、鼠乳房肿瘤病毒(腦TV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重 复序列(LTR)启动子、莫洛尼氏病毒启动子、鸟类白血病病毒启动子、 EB病毒立即早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子以及人基因启动子，如 但不限于，肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌 肉肌酸启动子。此外，本发明应当不限于使用组成型启动子。诱导型 启动子也考虑为本发明的一部分。本发明中诱导型启动子的使用提供 了需要这样的表达时能够打开可操作连接的多核苷酸序列的表达或不 需要表达时关闭表达的分子开关。诱导型启动子的实例包括但不限于 金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、黄体酮启动子和四环素启动 子。此外，本发明包括使用组织特异性启动子，该启动子只在所需的 组织中是活性的。组织特异性启动子是本领域公知的，包括但不限于， HER-2启动子和PSA相关启动子序列。
为了评估siRNA的表达，引入细胞中的表达载体还可以含有选择 标记基因或报告基因或两者，来帮助从寻求通过病毒载体转染或感染 的细胞群中识别和选择表达细胞。其他实施方案中，可以在分开的DNA 碎片上携带选择标记并用于共转染程序中。选择标记和报告基因可以 两侧具有合适的调节序列，使得能够在宿主细胞中表达。有用的选择 标记是本领域已知的并可以包括例如抗生素抗性基因，如neo等。报告基因用于鉴定可能转染的细胞和用于评价调节序列的功能 性。编码易于测定的蛋白的报告基因是本领域已知的。通常，报告基 因是不存在于受体生物体或组织中或不由受体生物体或组织表达并编 码其表达通过一些容易检测的特性例如酶促活性来呈现的蛋白质的基
因。在DNA已经引入受体细胞后的合适时间测试报告基因的表达。
合适的报告基因可以包括编码荧光素酶、P-半乳糖苷酶、氯霉素 乙酰转移酶、分泌的碱性磷酸酶或绿色荧光蛋白基因的基因(参见， 例如，Ui-Tei等，2000 FEBS Lett. 479: 79-82 )。合适的表达系统是 公知的并可以使用公知技术制得或商业获得。可以使用独特的内部限 制位点或通过对非独特限制位点的部分消化来产生内部删除构建体。 然后可以将构建体转染至呈现高水平siRNA多核苷酸和/或多肽表达 的细胞中。通常，将具有最小5，侧翼区域的显示报告基因最高水平 表达的构建体鉴定为启动子。这样的启动子区域可以连接报告基因并 用于评价试剂调节启动子驱动转录的能力。
沉默免疫细胞的产生
一实施方案中，本发明提供了基于细胞的系统，用于向细胞中表 达细胞因子信号转导调节剂的抑制剂。基于细胞的系统，指"沉默细 胞"，包括细胞和用于表达抑制剂的表达载体。然而，本发明应当不 受限于包括表达载体的细胞，而是本发明的沉默细胞应当解释为包括 已经用本发明任何类型的抑制剂即化学合成的siRNA修饰的细胞。任 何情况中，与没有用抑制剂沉默的其他方面相同的细胞相比较，包括 抑制剂的沉默细胞具有升高的免疫效能。沉默细胞适于单独或结合其 他治疗给予哺乳动物受体。
本发明包括含有细胞因子信号转导调节剂抑制剂的细胞。抑制剂 能够抑制包括但不限于S0CS、SHP或PIAS的细胞因子信号转导调节剂。 一方面中，可以用含有编码抑制剂的多核苷酸的载体转染细胞。不需 要将多核苷酸整合至细胞中。另一方面中，根本不需用载体转染细胞，
45而是将细胞暴露于不是从载体表达的抑制剂。这样抑制剂的实例是化
学合成的siRNA。
在表达载体的范围内，可以通过本领域的任何方法将栽体容易地 引入宿主细胞中，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如， 可以通过物理、化学或生物方法将表达载体转移至宿主细胞中。容易 理解含有本发明多核苷酸的表达载体的引入就细胞因子信号转导调节
剂而言产生了沉默细胞。
用于将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质 转染、微粒轰击、微注射、电穿孔等。产生含有栽体和/或外源核酸的 细胞的方法是本领域公知的。参见，例如，Sambrook等(2001， Molecular Clong: A Laboratory Manual (分子克隆实验室手册)， Cold Spring Harbor Laboratory, NewYork)， 和Ausuble等(1997， Current Protocols in Molecular Biology (分子生物学中的通用实 验方案)，John Wiley & Sons, New York)。
用于将目标多核苷酸引入宿主细胞中的生物方法包括使用DM和 RNA载体。病毒载体，尤其是逆转录病毒载体，已经成为将基因插入 哺乳动物例如人细胞中最广泛使用的方法。其他病毒载体可以源自慢 病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等。参见，例 如，U. S.专利No. 5， 350， 674和5， 585， 362。
用于将多核苷酸引入宿主细胞的化学方法包括胶体分散系统，如 大分子复合物、纳米胶嚢、微球体、珠子和基于脂质的系统包括水包 油型乳浊液、胶粒、混合胶粒和脂质体。优选的用作体外和体内传送 载体的胶体系统是脂质体(即，人造膜嚢泡)。这样系统的制备和使 用是本领域公知的。
与用于将外源核酸引入宿主细胞或以其它方式将细胞暴露于本发 明抑制剂的方法无关，为了证实宿主细胞中重组DM序列的存在，可 以进行各种测试。这样的测试包括，例如，本领域技术人员公知的"分 子生物，，测试，如DNA和RNA印迹、RT-PCR和PCR;"生化"测试， 如检测特定的肽的存在或不存在，例如，通过免疫学方法(ELISA和蛋白质印迹)或通过在此所述鉴定落入本发明范围内的试剂的测试。
为了产生沉默细胞，可以使用任何DM载体或传送载体来将所需 的siRNA多核苷酸在体外或体内转移至免疫细胞中。在使用非病毒传 送系统的情况中，优选的传送载体是脂质体。因此上述传送系统和实 验方案可以见Gene Targeting Protocols (基因輩巴向实验方案)，第 2版，ppl-35 (2002)和Gene Transfer and Expression Protocls (基因转移和表达实验方案)，Vol. 7, Murray编辑，pp81-89 ( 1991 )。
打算使用脂质体制剂来将本发明的细胞因子信号转导调节剂的抑 制剂引入宿主细胞中(体外、离体或体内)。本发明的特定实施方案 中，抑制剂可以结合脂质。与脂质结合的抑制剂可以包裹于脂质体的 含水内部中，散布于脂质体脂质双层内，通过与脂质体和寡核苷酸结
合的连接分子连接脂质体，包入脂质体中，与脂质体复合，分散在含 脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质组合，作为脂质中的悬浮液包含， 包含在胶粒中或与胶粒复合，或以其它方式与脂质结合。本发明的脂 质、脂质/siRNA或脂质/表达载体结合组合物不限于溶液中的任何特 定结构。例如，它们可以以双层结构存在，作为胶粒，或具有"崩解 的"结构。它们还可以简单地散布于溶液中，可能形成大小或形状不 均一的凝聚物。
脂质是天然存在的脂肪物质或合成的脂质。例如，脂质包括细胞 质中天然存在的脂肪小滴以及本领域技术人员公知的化合物类别，其 含有长链脂族烃及其衍生物，如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛。
磷脂可以用于制备根据本发明的脂质体并可以带有净的正、负或 中性电荷。双乙酰磷酸盐可以用来将负电荷赋予脂质体，和硬脂酰胺 可以用来将正电荷赋予脂质体。脂质体可以由一种或多种磷脂制得。
带中性电荷的脂质可以包括没有电荷的脂质、基本上不带电的脂
质或具有相同数量的正和负电荷的脂质混合物。合适的磷脂包括磷脂 酰胆碱和其他本领域技术人员公知的磷脂。
可以从商业来源获得根据本发明适用的脂质。例如，可以从
Sigma, St. Louis, M0 Chemical Co.获得二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱("DMPC"),从K&K Laboratories (Plainview， NY)获得双十六 烷基磷酸酯("DCP，，);从Calbiochem-Behring获得胆甾醇("Choi"); 从Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, AL)获得二肉豆蔻酖 基磷脂酰甘油("DMPG")和其他脂质。可以将氯仿或氯仿/曱醇中的 脂质储液储存于约-20'C。优选，氯仿用作唯一的溶剂，因为它比甲醇 更容易蒸发。
因为所得到脂质体的不稳定性和易漏性，来自天然来源的磷脂， 如蛋或大豆磷脂酰胆碱、脑磷脂酸、脑或植物磷脂酰肌醇、心脏心磷 脂和植物或细菌磷脂酰乙醇胺优选不用作主要的磷脂，即，构成总磷 脂组成的50%或更多。
"脂质体"是一般术语，包括多种通过封闭的脂质双层或凝聚物 的产生而形成的单和多层脂质载体。脂质体可以表征为具有磷脂双层 膜和内部含水介质的嚢泡状结构。多层脂质体具有多层通过含水介质 隔开的脂质层。当磷脂悬浮于过量水溶液中时它们自发形成。在形成 封闭的结构并将水和溶解的溶质圏闭在脂质双层之间前脂质成分经历 自我重排(Grosh和Bachhawat， 1991)。然而，本发明还包括在溶液
中具有不同于通常嚢泡状结构的结构的组合物。例如，脂质可以呈现 胶粒结构或仅仅作为脂质分子的非均一聚集物存在。还涉及的是 1 ipofectamine-核酸复合物。
当分散于水中时根据脂质与水的摩尔比，磷脂可以形成除了脂质 体以外的各种结构。在低的比例，脂质体是优选的结构。脂质体的物 理特征取决于pH、离子强度和/或二价阳离子的存在。脂质体可显示 出对离子性和/或极性物质的低渗透性，但是在升高的温度经历相变， 这显著改变了它们的渗透性。相变涉及从称为凝胶状态的紧密填充的 有序结构转变成称为流态的松散填充的有序度较低的结构。这发生在 特征性相变温度和/或导致对离子、糖和/或药物的渗透性增强。
脂质体通过四种不同的机制与细胞相互作用通过网状内皮系统 的吞噬细胞如巨噬细胞和/或嗜中性粒细胞的胞吞作用；通过非特异性 的弱疏水或静电力和/或通过与细胞表面成分的特异性相互作用吸附至细胞表面；通过将脂质体的脂质双层插入质膜中与质膜融合，同时 将脂质体的内含物释放至细胞质中；和/或通过将脂质体的脂质转移至 细胞和/或亚细胞膜，和/或相反，没有与脂质体内含物的任何相关。 改变脂质体制剂可以改变运作机制，尽管同时可以运作多于一种。
脂质体介导的寡核苷酸传送和外源DNA体外表达已经非常成功。 Wong等(1980 )证明了在培养的鸡胚胎、HeLa细胞和肝细胞瘤细胞中 脂质体介导的外源DNA传送和表达的可行性。Nicolau等(1987 )实 现了在大鼠中静脉注射后成功的脂质体介导的基因转移。
本发明的特定实施方案中，脂质可以结合血凝病毒(HVJ)。已经 表明这有助于与细胞膜的融合和促进了脂质体包裹的DM的细胞进入 (Kaneda等，1989 )。其他实施方案中，脂质可以与核的非组蛋白染 色体蛋白(HMG-1)复合或结合核的非组蛋白染色体蛋白(HMG-1)使 用(Kato等，1991)。再一实施方案中，脂质可以与HVJ和HMG-1两 者复合或结合HVJ和HMG-1两者使用。因为这样的表达载体已经成功 地用于寡核苷酸的体外和体内转移和表达中，则它们可用于本发明中。 在DNA构建体中使用细菌启动子的情况中，在脂质体内包括合适的细 菌聚合酶也是理想的。
可以通过不同方法形成根据本发明所用的脂质体。脂质体的大小 根据合成的方法而不同。悬浮于水溶液中的脂质体通常是球嚢的形状， 具有一个或多个脂质双层分子的同心层。每层由通式XY表示的分子的 平行阵列构成，其中X是亲水部分和Y是疏水部分。含水悬浮液中， 同心层排列使得亲水部分倾向于保持与水相的接触而疏水部分趋向自 我结合。例如，当脂质体内和外都存在水相时，脂质分子形成双层， 称为排列XY-YX的薄层。当多于一个脂质分子的亲水和疏水部分变得 相互连接时形成脂质的凝聚物。这些凝聚物的大小和形状取决于许多 不同变量，如溶剂的性质和溶液中其他化合物的存在。
可以根据已知的实验室技术来制备本发明范围内的脂质体。 一优 选实施方案中，通过混合容器例如玻璃梨形烧瓶中溶剂中的脂质体脂 质来制备脂质体。容器应当具有超过预期脂质体悬浮液体积十倍的体积。使用旋转蒸发器，在负压下大约4ox:除去溶剂。通常在约5分钟
至2小时内除去溶剂，取决于所需脂质体的体积。可以将组合物在真
空下的干燥器中进一步干燥。由于易于随时间而变质，通常在约l周 后丢弃干燥的脂质。
干燥的脂质可以在无菌无热原水中以25-50mM磷脂水合，通过震 荡直至所有脂质膜重新悬浮。然后将含水的脂质体分成等份，每份置 于小瓶中，在真空下冻干并密封。
在可替换的方案中，根据其它已知的实验室方法来制备脂质体 Bangham等(1965 )的方法，其内容在此引入作为参考；Gregoriadis 的方法，如"生物学和医学中的药物载体，，中所述的，G. Gregoriadis 编辑(1979 )pp. 287-341，其内容在此引入作为参考；Deamer和Uster 的方法，1983，其内容在此引入作为参考；和Szoka和 Papahadjopoulos, 1978所述的反相蒸发方法。上述方法各自捕获含 水物质的能力和各自含水空间对脂质的比例不同。
如上所述制得的干燥脂质或冻干脂质体可以脱水并在抑制肽的溶 液中重构并用合适的溶剂如DPBS稀释至合适的浓度。然后在涡旋混合 器中将混合物剧烈震荡。通过在29， OOOx g离心来除去未包裹的核酸 并洗涤脂质体沉淀物。以合适的总磷脂浓度如约50-200mM将洗过的脂 质体重悬。可以根据标准方法来测定包裹的核酸量。测定脂质体制剂 中包裹的核酸量后，可以将脂质体稀释至合适的浓度并存储于4。C直 至使用。
激活(脉沖)的免疫细胞的产生
本发明包括已经暴露于抗原或以其它方式用抗原"脉冲"并通过 抗原激活的细胞。例如，APC可以变成体外装载Ag的，例如通过抗原 存在下的离体的培养，或通过体内暴露于抗原。
本领域技术人员还容易理解可以以将APC暴露于抗原足以促进抗 原在APC表面上呈递的时间的方式来"脉沖，，APC。例如，可以将APC 暴露于称为抗原肽的小肽片段形式的抗原，直接"脉沖"至APC外表面上(Mehta-Damani等，I994);或可以用完整蛋白或蛋白微粒来温 育APC，这些蛋白或蛋白微粒随后被APC摄入。这些完整蛋白通过APC 消化成小肽片段，最后运载至APC表面并在APC表面上呈递(Cohen 等，19")。通过在此所迷的标准"脉沖"技术可以将肽形式的抗原 暴露于细胞。
不希望受到任何特定理论的束缚，为了保持抗原的免疫原性形式， 通过本发明的APC来加工外源形式的抗原或自身抗原。抗原的免疫原 性形式意思是抗原通过断裂加工产生可由免疫细胞例如T细胞识别并 刺激免疫细胞的抗原形式。优选，这样的外源或自身抗原是通过APC 加工成肽的蛋白质。可以提取并纯化通过APC产生的相关肽，用作免 疫原性组合物。通过APC加工的肽还可以用于诱导对APC加工的蛋白 质的耐受性。
认为自身免疫性疾病是由对抗"自身蛋白"(另外称为自身抗原， 即个体中存在的或内源的自身抗原)的免疫应答引起的。自身免疫应
答中，这些"自身蛋白"对T细胞呈递，这导致T细胞变成"自身反 应性的"。根据本发明的方法，用抗原脉沖APC来产生相关的"自身 肽"。相关的自身肽对于每个个体是不同的，因为MHC产物是高度多 态性的且每个单独的MHC分子可能结合不同的肽片段。然后"自身肽"
需要治疗的二体中对自身蛋白的耐受:: ^
通过将APC在体外或体内暴露于抗原来产生本发明的抗原激活的 APC，也称为"脉沖的APC"。在体外脉冲APC的情况中，将APC涂布 于培养皿上并暴露于足量的抗原和足够的时间段来使抗原结合APC。
可以使用本领域已知的或在此另外公开的方法来测定获得抗原与APC 结合所需的量和时间。本领域技术人员已知的其他方法，例如免疫测 试或结合测试，可以用来检测暴露于抗原后APC上抗原的存在。
本发明进一步的实施方案中，用允许APC表达特定蛋白质的载体 转染APC。APC表达的蛋白质然后被加工并呈递在细胞表面上MHC受体 上。然后将转染的APC用作免疫原性组合物来产生对载体编码的蛋白质的免疫应答。
如本文別处所讨论的，可以制得载体来包括编码和表达蛋白质的 特定多核苷酸，对该蛋白的免疫原性应答是所需的。优选，将逆转录 病毒载体用来感染细胞。更优选，将腺病毒载体用来感染细胞。
本发明的另一个实施方案中，通过修饰病毒载体来编码由APC上 的受体识别的蛋白质或其部分，将栽体乾向APC，借此通过载体占据 APC受体将启动对载体的胞吞作用，使得加工和呈递由病毒载体的核 酸编码的抗原。通过病毒传送的核酸对病毒可以是天然的，其在APC 上表达时编码病毒蛋白，然后该蛋白被加工和呈递在APC的MHC受体 上。
如本文别处所讨论的，各种方法可用于将多核苷酸转染至宿主细 胞中。方法包括但不限于磷酸钙沉淀、脂质转染、微粒轰击、微注射、 电穿孔、胶体分散系统(即，大分子复合物、纳米胶嚢、微球体、珠
子和基于脂质的系统包括水包油型乳浊液、胶粒、混合胶粒和脂质体)。 另一方面中，可以将编码抗原的多核苷酸克隆至表达载体中，并 将栽体引入APC中来另外产生激活的APC。本文别处讨论了将核酸引 入细胞中的各种载体和方法。例如，可以通过本领域的任何方法将编 码抗原的载体引入宿主细胞中。例如，可以通过物理、化学或生物方 法将表达载体转移至宿主细胞中。参见，例如，Sambrook等，(2001， Molecular Cloning: A Laboratory Manual (分子克隆实验室手册)， Cold Spring Harbor Laboratory, New York)和Ausubel等(1997, Current Protocols in Molecular Biology (分子生物学中的通用实 验方案)，John Wiley & Sons, New York )。容易理解引入含有编码 抗原的多核苷酸的表达载体产生了脉冲的细胞。
本发明包括用于脉沖APC的各种方法，包括但不限于，用蛋白质、 cDNA或mRM形式的完整抗原装载APC。然而，不应当将本发明解释为 限于用于脉沖APC的特定形式的抗原。相反，本发明包括本领域已知 的用于产生装载抗原的APC的其它方法。优选，用编码限定抗原的niRNA 转染APC。使用合适的引物和逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)结合
52转录反应可以在体外快速产生对应于序列已知基因产物的mRNA。用 mRNA转染APC提供了超越其他用于产生脉冲APC的装载抗原技术的优 势。例如，从微小量的组织即肿瘤组织扩增RNA的能力扩展了 APC用 于接种大量患者的用途。
抗原可以源自病毒、真菌或细菌。抗原可以是自身抗原或与选自 感染性疾病、癌症、自身免疫性疾病的疾病相关的抗原。
对于用作疫苗的抗原组合物，抗原组合物必须在细胞、组织或哺 乳动物(例如，人)中诱导对抗原的免疫应答。如在此所使用的，"免 疫学组合物"可以包括抗原(例如，肽或多肽)、编码抗原的核酸(例 如，抗原表达载体)、表达或呈递抗原的细胞或细胞组成成分。特定 实施方案中，抗原组合物包括或编码在此所述任何抗原的全部或部分， 或其免疫学功能等同物。其他实施方案中，抗原组合物在混合物中， 该混合物包括其他免疫刺激剂或编码这样试剂的核酸。免疫刺激剂包 括但不限于其他抗原、免疫调节剂、抗原呈递细胞或佐剂。其他实施 方案中， 一种或多种其他的试剂共价结合抗原或免疫调节剂，以任意 组合。特定实施方案中，抗原组合物缀合或包括HLA锚基序氨基酸。
本发明疫苗的核酸和/或细胞组成成分的组成可以不同。非限制性 实例中，编码抗原的核酸也可以和佐剂一起配制。当然，可以理解在 此所述的各种组合物可以进一步包括其他成分。例如， 一种或多种疫 苗组成部分可以包括于脂质或脂质体中。另一非限制性实施例中，疫 苗可以包括一种或多种佐剂。根据本发明的公开内容，通过在此公开 的或本领域技术人员已知的任何方法来制得和/或给药本发明的疫苗 及其各种成分。
包括但不限于，化学合成，通过固相合成和通过HPLC从化学反应的其 他产物纯化分离，或通过编码包括本发明抗原的肽或多肽的核酸序列 (例如，DNA序列)在体外翻译系统或活细胞中的表达来产生。此外， 抗原组合物可以包括从生物学样品分离的细胞成分。优选，分离并充 分透析抗原组合物来除去一种或多种不需要的小分子量分子和/或冻干以更易配制到所需的载体中。进一步理解在疫苗成分中形成其他的 氨基酸、突变、化学修饰等，如果有的话，将优选基本上不干扰表位 序列的抗体识别。
对应于一个或多个本发明抗原决定簇的肽或多肽通常至少是五或
六个氨基酸残基长，并可以含有高达约IO、约15、约20、约25、约 30、约35、约40、约45或约50个残基。可以通过本领域那些普通技 术人员已知的方法来合成肽序列，如，例如，使用自动化肽合成仪的 肽合成,如从Applied Biosystems， Inc. ， Foster City， CA( Foster City, CA)可获得的那些。
例如通过重组方法也可以制得较长的肽或多肽。特定实施方案中，
产生抗原组合物，用于本发明的各种组合物和方法。例如，特定实施 方案中，编码抗原的核酸包括于例如重组细胞的载体中。可以表达核 酸来产生含有抗原序列的肽或多肽。可以从细胞分泌肽或多肽，或作 为细胞的一部分包括或包括于细胞内。
特定实施方案中，通过用编码抗原的核酸转染或接种哺乳动物来 促进免疫应答。将核酸给药于哺乳动物后，然后目标哺乳动物内包括 的一个或多个细胞表达核酸编码的序列。疫苗还可以是例如编码抗原 全部或部分肽或多肽序列的核酸(例如，cDNA或RNA形式)的形式。 通过核酸的体内表达可以是例如通过质粒型载体、病毒载体或病毒/ 质粒构建载体。
优选方面中，核酸包括编码区域，编码全部或部分编码合适抗原 或其免疫学功能等价物的序列。当然，核酸可以包括和/或编码另外的 序列，包括但不限于含有一种或多种免疫调节剂或佐剂的那些。
肿瘤相关抗原
在本发明的范围内，"肿瘤抗原"或"过度增殖性障碍抗原"或 "过度增殖性障碍相关抗原"指的是特定过度增殖性障碍常见的抗 原。特定方面中，本发明的过度增殖性障碍抗原源自癌症，包括但不限于原发性或转移性黑素瘤、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、 非何杰金氏淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤、白血病、子宫癌、宫颈癌、膀 胱癌、肾癌和腺癌如乳癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌等。
一实施方案中，本发明的胂瘤抗原包括一种或多种由源自哺乳动
物癌肿瘤的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)免疫上识别的抗原性癌症表位。 恶性肺瘤表达可以作为免疫攻击的目标抗原的多种蛋白。这些分 子包括但不限于组织特异性抗原如黑素瘤中的MART-1、酪氨酸酶和 GP100和前列腺癌中的前列腺酸磷酸酶(PAP)和前列腺特异性抗原
(PSA )。其他目标分子属于转化相关分子组如癌基因 HER-2/Neu/ErbB-2。再一组目标抗原是肿瘤胚胎性抗原如癌胚抗原
(CEA)。在B细胞淋巴瘤中，肺瘤特异性独特型免疫球蛋白构成个体 肿瘤独特的真正肿瘤特异性免疫球蛋白抗原。B细胞分化抗原如CD19、 CD20和CD37是B细胞淋巴瘤中目标抗原的其他候选者。这些抗原中 的一些(CEA、 HER-2、 CD19、 CD20、独特型)已经用作使用单克隆抗 体的被动免疫治疗的目标，获得有限的成功。
可以从天然来源如原代临床分离物、细胞系等纯化和分离肿瘤抗 原及其抗原性癌症表位。也可以通过化学合成或通过本领域已知的重 组DNA技术来获得癌症肽及其抗原性表位。化学合成的技术描述于 Steward等(1969) ; Bodansky等(1976) ; Meienhofer (1983)和 Schrder等(1965 )。此外，如Renkvist等(2001 )中所述的，本领 域中存在多种已知抗原。下表描述了由肿瘤抗原编码的T细胞限定的 表位，且只列出了那些由T细胞(细胞毒性CD8+或辅助CD")识别的 肿瘤抗原。尽管没有列出类似物或人工改造的表位，本领域技术人员 将认识到怎样通过本领域的标准方法来获得或产生它们。在Ludwig Institute for Cancer Research (路德维希癌症研究学会)的数据 库中鉴定了通过抗体鉴定和通过Serex技术检测的其他抗原(参见， Sahin等(1997 )和Chen等(2000 ))。
微生物抗原微生物抗原可以是病毒、细菌或真菌来源的。感染性病毒的实例
包括逆转录病毒科(例如，人免疫缺陷病毒，如HIV-1 (也称为 HTLV-III、 LAV或HTLV-III/LAV，或HIV-III;和其他分离抹，如 HIV-IP;细小病毒科(例如，脊髓灰质炎病毒、甲肝病毒；肠道病毒、 人库克萨基病毒、鼻病毒、艾柯病毒)；Calciviridae (例如，引起 肠胃炎的抹)；披膜病毒科(例如，马脑炎病毒、风瘆病毒)；黄病 毒科(例如，登革热病毒、脑炎病毒、黄热病毒)；冠状病毒科(例 如，冠状病毒)；纟奉状病毒科(例如，水泡性口炎病毒、狂犬病病毒)； 线状病毒科(例如，埃博拉病毒)；副粘病毒科(例如，副流感病毒、 腮腺炎病毒、麻療病毒、呼吸道合胞病毒)；正粘病毒科(例如，流 感病毒)；布尼亚病毒科(例如，汉坦病毒、布尼亚病毒、白蛉病毒 和纳伊罗病毒)；沙粒病毒科(出血热病毒)；呼吸弧病毒科(例如， 呼吸弧病毒、环状病毒和轮状病毒)；双RNA病毒科；嗜肝DNA病毒 科(乙肝病毒)；细小病毒科(细小病毒)；乳多空病毒科(乳头瘤 病毒，多瘤病毒)；腺病毒科(大多数腺病毒)；疱疹病毒科(单纯 疱渗病毒(HSV) 1和2、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒(CMV)、疱 渗病毒)；痘病毒科(天花病毒、牛痘病毒、痘病毒)；和虹彩病毒 科(例如，非洲猪热病毒)和未分类的病毒(例如，海绵状脑病的病 原体，5肝炎的病原体(认为是乙肝病毒的缺陷型卫星)，非曱非乙 肝炎病毒的病原体(1类=内部传播的；2类=肠道外传播的(即，丙肝)； 诺沃克和相关病毒，以及星状病毒)。
感染性细菌的实例包括幽门螺杆菌(Helicobacter pyloris)、 布氏疏螺旋体(Borrelia burdorferi )、侵肺军团菌(Legionella pne画philia )、分枝杆菌(例如，结核分枝杆菌(M. tuberculosis )、 鸟分枝杆菌(M. avium)、胞内分枝杆菌(M. intracellulare )、堪萨 斯分枝杆菌(M. kansasii)、戈登分枝杆菌(M. gordonae)、金黄色 葡萄球菌(Streptococcus aureus)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、 单核细月包增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、酉良腺链J求菌(Streptococcus pyogenes ) (A 组链球菌)、无乳链球菌 (Streptococcus agalactiae ) ( B组链球菌)、草绿色链球菌(组)、 粪链球菌(Streptococcus faecalis)、 牛链球菌(Streptococcus bovis )、链球菌(厌氧)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae )、 致病性弯曲杆菌(Campylobacter)、肠球菌(Entercoccus)、流感 嗜血菌 (Haemophilus influenzae)、 炭疽芽孢杆菌 (Bacillus anthracis)、 白喉棒杆菌(Cornebacterium dipheriae)、棒杆菌、 猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae )、产气荚膜梭菌
产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes )、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、 多杀巴斯德氏菌(Pasteulla multocida)、拟杆菌
(Bacteroides)、 具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、念珠 状链杆菌 (Streptobacillus moniliformis)、 极细密螺旋体
(Treponema pertenue)、钩端螺旋体(Leptospira)和衣氏放线菌
(Actinomyces israelii)。
感染性真菌的实例包括新型隐球菌(Crytococcus neoformans )、 荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum )、 厌酷球孢子菌
(Coccidiodes immitis )、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis )、 沙目艮衣原体(Chlamydia trachomatis)、白色假丝酵母(Candida albicans)。其他感染性生物体(即，原生生物)包括恶性疟原虫
(Plasmodium falciparum)和弓形虫(Toxoplasma gondii)。
经沉默和脉冲的免疫细胞
另一实施方案中，可以从培养物、组织、器官或生物体分离细胞 并作为细胞疫苗给药于哺乳动物。因此，本发明涉及"细胞疫苗"。 当然，细胞还可以表达一种或多种其他疫苗成分，如免疫调节剂或佐 剂。疫苗可以包括细胞的全部或部分。优选实施方案中，本发明的细 胞疫苗包括人APC，更优选的实施方案中，APC是DC。
细胞疫苗可以包括已经根据本发明沉默来增强其免疫效能的
ingens )、破伤风梭菌(Clostridiumtetani)、APC。然后用编码抗原的核酸来转染沉默的APC来产生装栽抗原的细 胞。另一方面中，用含有抗原的免疫刺激蛋白来脉沖沉默的APC来产 生装载抗原的细胞。基于本发明的公开内容，可以通过任何方法使用 任何类型的抗原来脉冲沉默的APC来装载抗原。此外，可以在用本发 明的抑制剂沉默APC之前、同时或之后通过任何方法来脉沖APC。
如本文别处所公开的，可以使用各种方法用抗原来脉冲细胞。本 发明的抗原含有至少一个表位，其中所述表位能够引发哺乳动物的免 疫应答。 一实施方案中，通过表达载体来表达抗原。另一实施方案中， 抗原是分离的多肽。优选，抗原与选自感染性疾病、癌症和自身免疫 性疾病的疾病相关。本文别处公开了用于脉沖本发明细胞的多种优选 抗原。抗原可以是至少一种或多种以下的形式肿瘤裂解物、蛋白质、 肽、mRNA、 DNA，从载体表达的，脂质体等。
已经用细胞因子信号转导调节剂抑制剂沉默的APC具有升高的免 疫效能，因此引发增强的免疫应答，即，增强的呈递抗原和激活对其 的免疫应答的能力。与没有沉默的其他方面相同的APC相比较，根据 本发明沉默和脉沖的APC能够刺激效应T细胞并引发对抗原增强的免 疫应答。
治疗应用
本发明包括用于增强免疫细胞如APC免疫效能的组合物。可以通 过使用本领域公知的方法监测细胞毒性T细胞应答、辅助T细胞应答 和/或对抗原的抗体应答的诱导来测量对APC呈递的抗原的应答。
本发明包括增强哺乳动物免疫应答的方法，包括将一种或多种淋 巴细胞接触抗原组合物的步骤，其中抗原是通过免疫细胞如APC来呈 递的。基于本发明的公开内容，可以通过暴露于细胞因子信号转导调 节剂抑制剂来沉默APC，借此对抑制剂的暴露增强了 APC的免疫效能。 可以在将APC暴露于抗原组合物以脉沖APC之前、同时或之后使用在 此公开的方法来沉默APC。
增强的免疫应答可以是主动或被动免疫应答。应答可以是继承性
58免疫治疗方法的一部分，其中从哺乳动物(例如，患者)获得APC如 树突细胞、B细胞或单核细胞/巨噬细胞，然后用含有抗原组合物的组 合物脉冲(在将细胞暴露于细胞因子信号转导调节剂抑制剂来另外沉 默免疫细胞之前、同时或之后)，然后将APC给药于有此需要的哺乳 动物。
组合物包括至少一种或多种以下物质的任何组合细胞因子信号 转导调节剂的抑制剂、抗原、沉默的免疫细胞、脉沖的细胞和还用抗 原脉沖的沉默免疫细胞。组合物可以是用于哺乳动物离体免疫和/或体 内治疗的疫苗。优选，哺乳动物是人。
对于离体的免疫，将细胞给药于哺乳动物之前在体外发生至少一 种以下情况i)细胞的沉默，ii )细胞的脉冲或iii )细胞的沉默和 脉沖。应当^人识到可以^吏用本文别处>^开的方法在用抗原处理APC以 脉冲免疫细胞之前、同时或之后来沉默本发明的免疫细胞(即，APC)。
另一实施方案中，可以将沉默的APC给药于有此需要的患者，而 之前没有在体外暴露于抗原。即，本发明包括将沉默的APC给药于患 者，其中细胞的脉冲发生在患者体内。
再一实施方案中，可以将脉冲的APC给药于有此需要的患者，之 前没有在体外将细胞暴露于细胞因子信号转导调节剂的抑制剂。即， 本发明包括将脉冲的APC给药于患者，其中细胞的沉默发生在患者体内。
离体(ex vivo)的方法是本领域公知的并在以下更全面地讨论。 简而言之，从哺乳动物(优选人)分离细胞并用表达细胞因子信号转 导调节剂抑制剂的载体或用在此公开的任何其他形式的细胞因子信号 转导调节剂抑制剂(即，化学合成的siRNA)来沉默(即，体外转导 或转染)。可以将沉默的细胞给药于哺乳动物受体来提供治疗益处。 哺乳动物受体可以是人，由此沉默的细胞对于受体可以是自体的。或 者，细胞对于受体可以是同种异体的、同基因的或异种的。
U.S.专利No. 5， 199， 942'中描述了用于离体扩增造血干细胞和祖 细胞的方法，在此引入作为参考，可以应用于本发明的细胞。其他合适的方法是本领域已知的，因此本发明不限于任何特定离体扩增细胞
的方法。简而言之，DC的离体培养和扩充包括(l)从哺乳动物的 外周血收集物或骨髓外植体收集CD34+造血干细胞和祖细胞；和(2) 离体扩充这样的细胞。除了 U.S.专利No. 5, 199, 942中所述的细胞生 长因子，其他因子如fU3-L、 IL-1、 IL-3和c-kit配体，可以用于培 养和扩充细胞。
用于从细胞群中鉴定和分离CD34+造血干细胞或祖细胞的各种细 胞选择技术是已知的。例如，单克隆抗体(或其他特异性细胞结合蛋 白)可以用于结合干细胞或祖细胞上发现的标记蛋白或表面抗原蛋白。 用于造血干细胞的几种这样的标记或细胞表面抗原(即flt-3、 CD34、 My-lO和Thy-l)是本领域已知的。
用合适的细胞因子培养收集的CD34+细胞。然后使0034+细胞分
化并定向成树突世系的细胞。然后使用树突细胞的特征性标记，如 CDla、 HLA DR、 CD8Q和/或CD86,通过流式细胞术或相似的方法将这 些细胞进一步纯化。DC培养分离后，根据本发明的方法来修饰细胞。 或者在分化成DC样细胞之前修饰祖细胞。
除了在离体免疫中使用基于细胞的疫苗外，本发明还提供了用于 体内免疫的组合物和方法，来引发患者对抗抗原的免疫应答。
对于体内免疫，本发明提供了细胞因子信号转导调节剂抑制剂作 为 一般方法通过使APC中的关键控制点失去能力来增强疫苗功效的应 用。因此，用于体内免疫的疫苗包括至少一种抑制剂成分，其中抑制 剂成分能够抑制细胞因子信号转导调节剂。另一方面中，疫苗包括抑 制剂成分和抗原成分，其中抗原成分能够引发哺乳动物的免疫应答。
关于体内免疫，将从患者获得的细胞在体内转染或转导来另外产 生沉默的细胞。用表达细胞因子调节剂抑制剂的载体来体内沉默细胞。 或者，使用在此公开的不是通过载体表达的任何其它形式的细胞因子 信号转导调节剂抑制剂(即，化学合成的siRNA)来沉默细胞。本文
别处讨论了体内产生沉默细胞的方法。
疫苗的另一方面包括用于体内脉沖细胞的抗原成分。任何抗原可以结合本发明的细胞因子信号转导调节剂抑制剂来给药。在用含有抑 制剂的疫苗沉默细胞之前、同时或之后使用本文别处公开的任何方法 来脉冲细胞。容易认识到在同时脉沖和沉默细胞的情况中，用含有抑 制剂和抗原两者的单个疫苗来免疫哺乳动物。或者，用两种分开的疫 苗来免疫哺乳动物， 一种含有抑制剂而第二种疫苗含有抗原。
本发明包括用于癌症和感染性疾病的体内免疫。 一实施方案中，
通过体内单独给药siRNA或结合产生对抗患者抗原的免疫应答的抗原 给药来治疗失调或疾病。基于本发明的公开内容，细胞因子信号转导 调节剂的抑制剂(即，S0CS1 siRNA)结合抗原制剂的给药增强了没有 使用细胞因子信号转导调节剂抑制剂而其它方面相同的疫苗接种方案 的功效。不希望受到任何特定理论的束縛，认为对患者抗原的免疫应 答取决于(1)给药的siRNA组合物，(2)给药的持续时间、剂量和 频率，(3)患者的一般状况，和如果合适(4)给药的抗原组合物。
一实施方案中，哺乳动物具有表达肿瘤特异性抗原的癌症类型。 根据本发明，可以制得免疫刺激蛋白，其包括肿瘤特异性抗原序列成 分。这种情况中，将细胞因子信号转导调节剂的抑制剂结合免疫刺激 蛋白给药于有此需要的患者，对于患者获得改进的治疗结果，例如通 过表达肿瘤特异性抗原的癌细胞或实体肿瘤的生长减緩或消除，或癌 细胞总数或总的肿瘤负荷的降低所证明的。
相关实施方案中，患者已经诊断为患有病毒性、细菌性、真菌性 或其他类型的感染，其与特定抗原如病毒抗原的表达相关。根据本发 明，可以制得免疫刺激蛋白，其包括由抗原例如HIV特异性抗原构成 的序列成分。在这样的情况中，将细胞因子信号转导调节剂的抑制剂 结合免疫蛋白给药于有此需要的患者，对于患者获得改进的治疗结果，
可检测症状的减轻或消除所证明的。
在另 一种情况中，可以通过将细胞因子信号转导调节剂的抑制剂 结合抗原给药于有此需要的患者来治疗失调或疾病。本发明提供了产 生保护性的DC诱导的对患者抗原的免疫应答的方法。基于本发明的公开内容，本领域技术人员将认识到促炎症细胞因子(即，IL-2、 TNF a、 IFNa、 IFN P 、 IFN y等)可以加入在此^^开的治疗方案中来增强 细胞因子信号转导调节剂抑制剂疫苗的功效。
剂量和制剂(药物组合物)
本发明预想了通过给药治疗剂例如s iRNA来治疗哺乳动物疾病例 如HIV感染、癌症等。根据本发明的治疗剂给药可以是连续的或间隔 的，取决于例如受体的生理状况、给药目的是治疗性的或是预防性的 和有经验从业者已知的其他因素。本发明药剂的给药可以在预选的时 间段内基本上是连续的或是一连串间隔的剂量。涉及局部和全身给药。 给药量将根据各种因素而改变，这些因素包括但不限于选定的组合物、 特定的疾病、哺乳动物的体重、身体状况和年龄以及有待获得预防或 治疗。临床医师使用动物模型或本领域公知的其他测试系统可以容易 地确定这样的因素。
可以通过给药编码siRNA的核酸分子来实现siRM的给药(参见， 例如，Feigner等，U. S.专利No. 5， 580， 859, Pardoll等，1995; Stevenson等，1995; Moiling 1997; Donnelly等，1995; Yang等， II; Abdallah等，1995 )。对于核酸的药物制剂、剂量和给药途径总 地公开于例如Feigner等，上文。
含有本发明治疗剂的 一种或多种合适的单位剂型，如以下所讨论 的，可以任选地配制成用于持续释放(例如使用微嚢化，参见 WO94/07529,和U. S.专利No. 4， 962， 091,其公开内容在此引入作为参 考)，可以通过各种途径给药，包括非肠道，包括通过静脉内和肌内 途径，以及通过直接注射至患病组织中。例如，治疗剂可以直接注射 至肿瘤中。在合适的情况下，制剂可以方便地存在于分开的单位剂型 中并可以通过制药学公知的任何方法来制备。这样的方法包括使治疗 剂和液体载体、固体基质、半固体栽体、细粉固体载体或其组合结合 的步骤，然后如果需要，将产物引入或成形入所需的传送系统。
当制备本发明的治疗剂用于给药时，优选将它们结合药物学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂来形成药物制剂或单位剂型。这样制剂
中的全部活性成分占制剂的0. 1至99. 9%重量。"药物学上可接受的，， 是与制剂中的其它成分相容的且对受体无害的栽体、稀释剂、赋形剂 和/或盐。用于给药的活性成分可以作为粉末或颗粒存在；作为溶液、 悬浮液或乳浊液。
可以通过本领域已知的方法使用公知的且易于荻得的成分来制备 含有本发明治疗剂的药物制剂。本发明的治疗剂还可以配制成适于非 肠道给药的溶液，例如通过肌内、皮下或静脉内途径。
本发明治疗剂的药物制剂还可以采用含水或无水溶液或分散体的 形式，或可替换的乳浊液或悬浮液的形式。
因此，可以配制治疗剂来用于非肠道给药(例如，通过注射，例 如，推注或连续输注)和可以以单位剂型存在于安瓿、预填充的注射 器、小体积输液容器或含有加入的防腐剂的多剂量容器中。活性成分 可以采用这样的形式，如油性或含水载体中的悬浮液、溶液或乳浊液， 并可以含有配制剂如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性成分可 以是粉末形式，通过无菌固体的无菌分离或通过溶液的冻干来获得， 在使用前用合适的载体例如无菌无热原的水来重配。
将认识到每个剂型的单个气溶胶剂量中所含的活性成分的单位含 量不需要自身构成用于治疗特定适应症或疾病的有效量，因为可以通 过给药多个剂量单位来获得需要的有效量。此外，使用低于剂型中的 剂量，单个或连续给药，可以获得有效量。
本发明的药物制剂可以包括，作为任选成分，药物学上可接受的 载体、稀释剂、稳定剂或乳化剂和本领域公知类型的盐。用于本发明
上可接受的緩冲盐水溶液，如pH 7. 0-8. 0的磷酸盐缓冲盐水溶液。
可以配制本发明的表达载体、转导细胞、多核苷酸和多肽(活性 成分)并给药来治疗各种病况，通过产生活性成分与生物体内药剂作 用位点接触的任何方法。通过可获得的用于药物的任何常规方式来给 药，作为单独的治疗活性成分或在治疗活性成分组合中。可以单独给药，但通常结合基于选定的给药途径和标准药物实践选择的药物学载 体来给药。
通常，水、合适的油、盐水、含水右旋糖(葡萄糖)和相关的糖 溶液和二醇类如丙二醇或聚乙二醇是用于非肠道溶液的合适载体。用
于非肠道给药的溶液含有活性成分、合适的稳定剂和如果需要緩沖物 质。抗氧化剂如硫酸氢钠、亚硫酸钠或抗坏血酸，单独或结合，是合
适的稳定剂。还可以使用柠檬酸及其盐和乙二胺四乙酸钠(EDTA)。 此外，非肠道溶液可以含有防腐剂如苯扎氯铵、曱基或丙基对羟基苯 甲酸酯和氯丁醇。合适的药物载体描述于Remington' s Pharmaceutical Sciences (雷明顿药物科学)中，这是本领域的标准 参考教科书。
本发明的活性成分可以配制成悬浮于适用于哺乳动物特别是人的 药物学上可接受的组合物中。这样的制剂包括使用佐剂，如U. S.专利 No. 4， 082， 735; 4,082,736; 4, 101, 536; 4, 185,089; 4,235, 771和 4, 406, 890中所述的胞壁酰二肽衍生物(MDP)或类似物。其它有用的 佐剂包括明巩(Pierce Chemical Co.)、脂质A、海藻糖二霉菌酸酯 和溴化二曱基双十八烷基铵(DDA)、弗氏佐剂和IL-12。其它成分包 括聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物(Pluronic )、非离子表面活性剂 和可代谢的油如角鲨烯(U. S.专利No. 4, 606, 918 )。
此外，可以使用标准药物方法来控制作用的持续时间。这些是本 领域公知的并包括控释制剂，可以包括合适的大分子，例如聚合物、 聚酯、聚氨基酸、聚乙烯吡咯烷酮、乙烯-醋酸乙烯酯、甲基纤维素、 羧甲基纤维素或硫酸鱼精蛋白。为了控制释放可以调节大分子的浓度 以及掺入的方法。此外，可以将药剂掺入聚合材料的颗粒中，聚合材 料如聚酯、聚氨基酸、水凝胶、聚(乳酸)或乙烯-醋酸乙烯酯共聚物。 除了掺入，这些物质还可以用于将化合物捕获于微胶嚢中。
因此，可以通过各种途径传送本发明的药物组合物并传送至哺乳 动物体内的各个部位来获得特定的效果(参见，例如，Rosenfeld等， 1991a; Jaffe等，上文；Berkner，上文)。本领域技术人员将认识到尽管可以使用多于一种途径来给药，特定的途径可以提供比另 一种 途径更即时且更有效的反应。可以通过给药来实现局部或全身传送， 包括将制剂应用或灌输至体腔、气溶胶的吸入或吹入或通过非肠道引 入，包括肌内、静脉内、腹膜、皮下、皮内以及局部给药。
可以以单位剂型提供本发明的活性成分，其中每个剂量单位例如 一茶匙、片剂、溶液或栓剂，含有预定量的组合物，单独或适当结合 其它的活性剂。如在此所用的术语"单位剂型，，指的是物理上分开的 单位，适于用作人和哺乳动物患者用的单位剂量，每个单位含有预定 量的本发明组合物，单独或结合其它活性剂，计算的量足以产生所需 效果，在合适的情况下，结合药物学上可接受的稀释剂、载体或介质。 本发明单位剂型的规格取决于待获得的特定效果以及在特定宿主中与 药物组合物相关的特定药物动力学。
在此所述的这些方法决不是包括全部的，更多适于特定应用的方 法是本领域技术人员清楚的。此外，通过对已知发挥所需效果的化合 物的类似性可以进一步估计组合物的有效量。
基因治疗给药
本领域技术人员将认识到不同的传送方法可以用来将载体给予细
胞中。实例包括(1)使用物理手段的方法，如电穿孔(电)、基因 枪(物理力)或使用大体积的液体(压力)；和(2)其中将所述载体 与另一种实体如脂质体、聚集的蛋白质和转运分子复合的方法。
此外，实际的剂量和给药时间表可以根据组合物是否结合其他药 物组合物给药而改变，或根据个体间药物动力学、药物分布和代谢差 异而改变。相似地，体外应用的含量可以根据所用的特定细胞系而改 变(例如，基于细胞表面上存在的栽体受体的数量，或基因转移所用 特定载体在该细胞系中复制的能力)。此外，每个细胞待加入的载体 含量可能根据插入载体中的治疗基因的长度和稳定性而改变，以及还 有序列的性质，这是特别需要根据经验确定的参数，并可以由于非本 发明方法固有的因素(例如，与合成相关的成本)而改变。本领域技术人员可以根据特定情况的紧急需要而容易地进行任何必需的调整。
含有治疗剂的细胞还可以含有自杀基因，即，编码可以用于破坏 细胞的产物的基因。许多基因治疗情况中，理想的是能够在宿主细胞 中表达用于治疗目的的基因，而且还能随意破坏宿主细胞。治疗剂可 以连接自杀基因，在激活剂化合物不存在下其表达不被激活。当需要 其中已经引入药剂和自杀基因的细胞死亡时，将激活剂化合物给药于 细胞，因此激活自杀基因的表达并杀灭细胞。可以使用的自杀基因/
药物前体组合的实例是单纯疱渗病毒-胸苷激酶(HSV-tk )和更昔洛韦 (ganciclovir)、阿昔洛韦(acyclovir);氧化还原酶和放线菌酮；
胞嘧啶脱氨基酶和5-氟胞嘧啶；胸苷激酶thymidilate激酶 (Tdk:: Tmk )和AZT;和脱氧胞苷激酶和阿糖胞苷。
在此所述的这些方法决不是包含全部的，且适于特定应用的更多
方法对本领域技术人员是显而易见的。此外，可以通过已知发挥所需
效果的化合物的类推来进一步估计组合物的有效量。
实施例
现在参照以下实施例来描述本发明。只是为了说明的目的来提供 这些实施例，且本发明不限于这些实施例，而是包括作为在此提供的
教导的结果而显而易见的所有变化。
为了将DC用于开发对抗各种癌症和感染因子的有效疫苗，进行在 此公开的实验来研究对DC抗原呈递的调节。在此公开的结果证明了干 扰免疫细胞中的负向调节途径，另外称为抑制抑制剂，增强了其免疫 刺激能力。抑制抑制剂以增强细胞的免疫效能的概念作为研发更有效 疫苗的新方法。
现在描述在此公开的实验中所用的材料和方法。
siRNA oligo的DC转染
还用21个碱基对的siRNA 寡核苷酸 (5 ， -CTACCTGAGTTCCTTCCCCTT-3， ; SEQ ID NO: 3 )转染骨髓DC，使用GenePorter，根据制造商的实验方案(Genlantis， SanDiego， CA)。 简而言之，将3jul 20jaM的寡核苷酸溶液加入3|il的GenePorter 试剂和94|111无血清RPMI 1640中。将混合物在25。C温育30分钟， 此后将100 ju 1GenePorter/寡核苷酸混合物加入每个孔中的骨髓DC中 并在37。C温育4h。温育后，将补充20%FBS的500 nl/孔RPMI 1640 加入骨髓DC中。
用慢病毒载体转导骨髓来源的DC
使用本领域已知的方法制备小鼠骨髓来源的DC。简而言之，从肢 体中沖洗出小鼠骨髓，通过尼龙网，并用氯化铵耗尽红细胞。用 RPMI-1640充分洗涤后，用2. 5ml补充磨BS、 mGM-CSF/ml( 20ng/ml ) 和重组小鼠IL-4 ( 20ng/ml; PeproTech， Inc. ， Rocky Hill， NJ )的 RPMI-164Q培养细胞。在培养的第2和4天，除去上清液并用含有 20ng/ml rmGM-CSF和20ng/ml rmIL-4的新鲜培养基替代。将所有培 养物在51潮湿的C02中37。C温育。培养48小时后除去未贴壁的粒细 胞并加入新鲜培养基。培养7天后，〉80°/。的细胞表达特征性DC特异性 标记，如通过FACS所测定的。在24-孔平板中进行小鼠骨髓来源DC 的转导，加入5pg/ml聚凝胺(Sigma, St. Louis， M0 )。将DC洗涤 并以2 x 105细胞/孔的浓度接种于24孔板中400 ju 1无血清RPMI 1640 中。以5 x 105细胞/1111的细胞密度将细胞暴露于不同感染复数(MOI ) 的慢病毒载体。转导8小时后，用PBS洗涤细胞并在新鲜组织培养基 中进一步温育。
细胞因子和蛋白质印迹
4吏用ELISA分才斤(BD Biosciences, Uncoln Park, NJ )才艮据制 造商的说明，使用细胞培养物上清液来定量各种细胞因子的含量。对 于蛋白质印迹分析，以10:1比例用表达小鼠S0CSl-siRNA或无关 GFP-siRNA的pSUPER载体和FLAG-标记的S0CS1载体共转染293T细胞。48小时后收集细胞并接受SDS-PAGE。转移至Hybond-P膜 (Amersham, Arlington Heights, IL)后,通过蛋白质印迹分析样 品，使用抗-Flag (Sigma， St. Louis， MO)或肌动蛋白(Santa Cruz Biotechnology, Inc. Santa Cruz, CA)抗体，接着用ECL-Plus试 剂(Amersham， Arlington Heights, IL)检测。用光密度计SI扫描 膜并用 ImageQuant软件(Molecular Dynamics, Piscataway， NJ) 定量SOCS-1/肌动蛋白条带。将S0CS1条带的强度相对于p -肌动蛋白 条带的强度标准化。
S0CS1的定量RT-PCR分析
通过定量实时PCR来评价转染小鼠BM-DC中S0CS1的相对表达。 使用Trizol试剂(Invitrogen， Carlsbad, CA )从3. 5-5 x 105个BM-DC 中提取总RM。用随机六聚体引物和Superscript第一链合成试剂盒 (Invitrogen, Carlsbad, CA)逆转录每个样品l.Opg总RNA。在 ABI 7900HT序歹寸检测系统(Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA)上在20jlz 1重复四份的反应中进行实时5，-核酸酶荧光PCR分析， 使用每个反应等量的5ng起始RM材料作为模板。从Applied Biosystems， Inc., Foster City, CA购买用于小鼠S0CS1 (6FAM) 和18S核糖体对照(VIC)的预先开发的引物/探针组(用于S0CS1的 引物，5， -ACCTTCTTGGTGCGCGAC-3 ， ； SEQ ID NO: 12和5， -AAGCCATCTTCACGCTGAGC-3 ， ； SEQ ID NO: 13和杂交探针， 6FAM-TCGCCAACGGAACTGCTTCTTCG-TAMRA; SEQ ID NO: 14 ) 。 PCR参数 为TaqMan通用PCR Master Mix试剂盒(Applied Biosystems, Inc.， FosterCity， CA)所推荐的，在分开的试管中进行S0CS1和18S反应。 将S0CS1含量相对于18S rRNA标准化。使用比较Ct方法(Livak等， 2001， Methods 25: 402-408 )来计算相对于模拟转染并刺激的BM-DC 的对照值的S0CS1表达。
OT-I细^ 的体外测试从OT-I小鼠收集脾脏，汇集，并破坏来获得单个细胞悬浮液。使 用MACS CD8+ T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec Inc. ， Auburn, CA)通过阴性选择来收集CD8+0T-IT细胞。简而言之，用生物素标记 的CD4 (L3T4) 、 CD45R (B220) 、 DX5、 CDllb (Mac-1)和Ter-119 特异性的抗体包被细胞。将抗生物素磁性微珠(Miltenyi Biotec Inc.， Auburn, CA)加入细胞中，将其通过连接MACS磁铁的分离柱。收集没 有结合柱子的细胞，通过FACS测定为>95°/。 CD8+。将总共5xl(T个纯 化的CD8+ OT-I T细胞和5 x 103个未成熟DC置于圓底96孔孩i量滴定 板每个孔的200 |i 1补充10% FCS、 4raM L-谷氨酰胺，lmM丙酮酸钠、 100U/ml青霉素和链霉素、10mM HEPES和5 y M 2-ME的RPMI 1640培 养基中。通过在培养最后8小时每个孔加入1 nCipH]TdR在2天后测 量增殖。进行了重复三次的测定并表示重复三次的实验。使用所示细 胞因子(BD Biosciences, San Jose, CA )的ELISA分析来测定OT-I/DC
共培养物中的细胞因子分泌。 流式细力包分析
在预先阻断FCy受体后，用含有0. 1，aN3和2%FCS的PBS中的 FITC、 PE、别藻蓝素(APC)或PerCP缀合的mAb将细胞染色。从BD Biosciences, San Jose， CA购买对小鼠CD4 ( RM4-5 ) 、 CD8( 53-6. 7 )、 CDllc ( HL30 ) 、 CD40 ( 3/23 ) 、 CD80 ( 16-10A1 ) 、 CD86 ( GL1 )特 异性的大鼠mAb和相配的同种型对照。在FACSCalibor ( Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ )流式细胞计和CRLIQuest软件上分 析染色的细胞。
四聚体染色
使用H2-K7卵清蛋白四聚体测试来检测卵清蛋白特异性CD8+T细 胞。DC免疫后不同天数，用抗CD8 a -FITC和H2-KV卵清蛋白(SIIFEKL ) -PE四聚体将免疫小鼠的脾细胞或T细胞双重染色；SEQ ID NO: 11 (Beckman Coulter Immunomics， San Diego, CA)。将四聚体染色在4t:进行1小时，每106个细胞用1 p g抗CD8a和10ju 1卵清蛋白 四聚体，根据制造商的说明。
酶联免疫斑点(ELISPOT)
将CTL肽用于CD8+T细胞刺激。还将人CD20分子的无关肽用作阴 性对照。使用MACSCD4 (L3T4)或MACS CD8 ( Ly-2 )微珠(Miltenyi Biotec Inc., Aub證，CA)从脾细胞分离CD8+T细胞。
CTL和NK测试
用标准铬释放测试评估CD8+CTL应答，这测量了体外再次刺激的 脾细胞裂解靶细胞的能力。在含有肽的RPMI 1640中将从免疫小鼠收 集的脾细胞再次体外刺激4-6天。用"Cr铬酸钠溶液标记靶细胞和对 照细胞90分钟。在96孔V底平板(200jal/孔)中用恒定数量的乾细 胞(lxl0V孑L) 37r温育不同数量的效应细胞3小时。收集重复三份 培养物的上清液(100p 1)。按照(实验释放-自发释放)/ (最大释 放-自发释放)x IOO来计算裂解百分比。通过500U/ml的重组鼠IL-2 培养1 x 106个细胞/1111来从小鼠脾细胞产生NK细胞。用51Cr将对NK 细胞裂解高度易感的YAC-1细胞在37X:温育1小时，洗涤，并以105 细胞/ml重悬浮。将NK细胞重复三份加入靶细胞中来获得不同的E:T 细胞比例。温育后，将平板离心并用y计数器(Beckman Coulter, Inc.， Fullerton， CA)计数上清液流体中的放射性。
DC免疫和肿瘤模型
用MOI为5的LV-SOCSl-siRNA或LV-CFP-s iRNA转导骨髓来源的 DC(骨髓培养第5天)。然后用卵清蛋白或TRP2肽将DC脉沖8小时， 用PBS洗涤三次，并在另外培养36小时后用于免疫。对于一些实验， 用LPS (100ng/ml， Sigma, St. Louis, MO)刺激抗原脉沖的DC 24 小时，用PBS洗涤，然后通过脚垫注射至C57BL/6小鼠中(Jackson治疗模型中，将EG7或B16肿瘤细胞(2. 5至5 x 10" 皮下注射(s.c.)至同系C57BL/6小鼠的右胁侧。在肿瘤接种后的不 同天数，将小鼠随机分组并注射5Qp 1抗原脉冲的、转导的DC或PBS 对照。在一些小鼠中，在接种疫苗后的所示天数腹膜内给药(i.p.) LPS。用卡尺测量肿瘤体积一周2或3次。
统计学分析
对于统计学分析，使用了 Student' s t检验，并取95%置信限是 显著的，限定为P〈0. 05。通常将结果表示为平均值土标准误差。 现在描述该实施例中呈现的实验结果。
实施例1:鼠S0CS-1 siRNA的鉴定和分析
使用计算机程序来选择靶向小鼠S0CS1的siRNA序 列SOCSl-siRNAl ( CCTTCCGCTCCCACTCCGA ; SEQ ID NO: 1 )， S0CSl-s iRNA2 ( CAGTCGCCAACGGAACTGC; SEQ ID NO: 2 )和S0CSl-s iRNA3 (CTACCTGAGTTCCTTCCCCTT; SEQ ID NO: 3 )。将所有靼序列接受NCBI Blast查询来证实缺乏与其他已知基因的同源性。设计正向和反向 oligo来编码通过9nt间隔物隔开的有义和反义19nt靶序列。该核心 siRM序列两侧为Hl RNA转录启动序列和5T终止子序列，和在退火 时引入的5， BglII和3， HindIII相容突出端。基于DNA的siRNA表 达载体pSUPER (Brummelkamp等，2002， Science 296:550-553 )使 用指导siRNA从头合成的HI-RNA启动子。将合成并退火的寡核苷酸对 克隆至Bglll/Hindlll消化的pSUPER栽体中。通过限制性消化来鉴定 阳性克隆并通过DM测序来证实。
用于小鼠SOCSl-siRM的慢病毒载体的产生和制备 该研究中所用的HIV转移载体是pTRIP AU3 CMV eGFP，其包括 内部巨细胞病毒(CMV)启动子并是自我灭活的(SIN载体)，在3， 长末端重复序列(LTR) U3区域中具有400bp删除，其除去了转录上活性的序列。慢病毒转移载体，pTRIPAU3CMVGFP，含有178bp片段， 该片段在原始pHR主链的独特CI a I位点中包括中心多嘌呤区段(cPPT ) 和中心终止序列(CTS)。将pTRIPAU3 CMV GFP进行改进来用于从 HI RNA启动子表达siRNA和共表达双顺反子杀稻瘟菌素抗性/eYFP选 择标记。为了适应克隆并除去天然CMV启动子，使用引物(5， -GATCGAATTCACAAATGGC-3， ； SEQ ID NO: 4和5， -CTAGGGATCCATCG CCCCAAAGTGG-3， ； SEQ ID NO: 5 )来PCR扩增pTRIP栽体的中心多嘌 呤区段/中心终止序列(cPPT/CTS)来插入用于克隆的5， -EcoRI和3， -BamHI位点。然后用EcoRI/BamHI消化cPPT-CTS PCR产物并再次插 入EcoR/BamHI消化的pTRIPAU3 CMV GFP栽体中。 <吏用引物(5， -GATCCTCGAGGTCGACAATCAACCTCTGGA-3 ' ; SEQ ID NO: 6和 5 ， -GATCGGTACCCAGGCGGGGAGG-3' ; SEQ ID NO: 7 )从pBS-SK-WPRE PCR 扩增旱獭转录后调节元件(wPRE)序列来添加5， Xhol/Sall和3， Kpnl 位点。然后用Xhol/Kpnl消化WPRE片段，并插入经修饰的pTRIP △ U3 CMV GFP主链中来产生pTRIP-W。首先将siRM和双顺反子选择标 记盒装配在pSUPER主链中用于转移至pTRIP-W中。使用引物(5， -CAGTATCGATTTAATTAATCAATATTGGCCATTAG-3， ; SEQ ID NO:8和5， -CAGTGTCGACTTAATTAAGTGGCCGCTTTACTTG-3， ； SEQ ID NO: 9 )从质粒 PYAP6 PCR扩增双顺反子选择标记CMV-Blast iR-IRES-eYFP (BY)来引 入5， -Clal和3， -SalI位点。用Clal和Sail消化PCR产物，然后 连接到Clal/Sall消化的pSUPER载体中以在Hl-RNA启动子和pSUPER MCS的3，-端添加BY标记，产生pSUPER-BY。然后BamHI/Sall消化 pSUPER-BY并连接到pTRIP-W主链来产生pTRIP-Hl-BY-W。
用BstBI和Clal消化含有hrGFP或S0CS1 ( 3 ) siRNA发夹序列的 随后的pSUPER载体，用于插入pTRIP-Hl-BY-W中来产生 pTRIP-hrGFP-siRNA-BY-W (GFP-siRNA)和pTRIP-SOCSl-siRNA-BY-W (SOCSl-siRNA)。在最终载体的Clal位点插入最后的390bp间隔物 片段以从CMV启动子开始隔开siRNA的终止序列。通过DM测序来证 实所有的载体(Lone Star Labs， Houston, TX， USA)。通过将三个质粒共转染至293T细胞中来产生重组假型慢病毒载 体。HIV衍生的包装构建体pCMVAR8.9编码HIV-l gag和pol前体， 以及调节蛋白tat和rev。从质粒pMD. G表达水泡性口炎病毒的糖蛋 白G (VSV-G)。用pCMVAR8.9、 pMD， G和慢病毒pTRIP s iRNA转移载 体通过瞬时磷酸钙共转染293T细胞来产生假型慢病毒。转染后60至 72小时，通过在4匸50， OOOxg超离心2小时来浓缩上清液。将病毒 沉淀物重悬浮于RPMI中并在-8(TC冷冻用于将来的研究。通过用连续 稀释的浓缩病毒和8 iu g/ml聚凝胺温育293T细胞6小时来测定病毒滴 度，接着在72-96小时后荧光激活细胞分选(FACS)分析来测定eYFP-阳性细胞。如下计算载体滴度滴度-Fx2xC。/VxD (其中D是病毒 稀释倍数，V是接种体积，F是eYFP-阳性293T细胞的频率，C。是接 种时的耙细胞数量)。
实施例2:用GenePorter用S0CS1 s iRNA对小鼠BM-DC进4亍转染 和S0CS1 mRNA下调
为了研究对DC的抗原呈递的S0CS1调节，如下首先鉴定特异性下 调S0CS1的小干扰RNA ( siRNA)。
在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和IL-4存在下，通 过GenePorter将合成的s iRNA ol igo双链体有效地转染至离体的小鼠 骨髓细胞来源的DC中，具有83%的转染效率。简而言之，使用 GenePorter 用 21 个碱基对 siRNA 寡核苷酸 (5 ， -CTACCTGAGTTCCTTCCCCTT-3， ； SEQ ID NO: 3)转染骨髓DC，按照制 造商的实验方案。将3)al的20liM寡核苷酸加入3pl GenePorter 试剂和94jli 1无血清RPMI 1640中并在25。C温育30分钟，此后将100 jLi 1 GenePorter/寡核苷酸混合物加入每个孔的骨髓-DC中并在37。C温 育4小时。温育后，将500 ji 1/孔补充20%FBS的RPMI 1640加入骨髓 DC中。基于本发明的公开内容，在生理学上可接受载体环境中，可以 将合成的siRNA oligo传送至细胞。可接受载体的实例是脂质体。
图1A证明了用表达S0CS1-siRNA的载体转导的细胞中S0CS1得到了下调。简而言之，j吏用GenePorter以10:1的比例用表达小鼠 SOCSl-siRNA或无关GFP-siRNA的pSUPER ( pSUP )载体和FLAG-标记 的mS0CSl表达载体共转染293T细胞，48小时后，接受蛋白质印迹。 将S0CS1条带的强度相对于p -肌动蛋白条带标准化，显示了相对强度 (比例)。将S0CSl-siRNA3 ( -CTACCTGAGTTCCTTCCCCTT-; SEQ ID NO: 3)，称为SOCSl-siRNA，用于随后的研究中。
如通过定量RT-PCR测试证实的，与不能下调S0CS1的SOCSl siRNA 突变体转染的DC中的水平相比较，用SOCSl siRM转染的总DC群中 的SOCSl mRNA水平特异性地降低约60% (图IB)。此外，观察到在骨 髓DC体外培养过程中和成熟后SOCSl表达较高。
还观察到用SOCSl siRNA转染的DC对LPS或IFN-y的应答比使 用siRNA突变体的DC强，如通过刺激时促炎症细胞因子如IL-6和TNF-oc增加的分泌(图2)，和通过STAT1、 I-kB和JNK增加的磷酸化所 示的。图IB描述了三个独立实验之一中siRNA oligo或模拟转染的 DC应答LPS (lOOng/ml)或IFN-y (10ng/ml) 24小时而分泌的细胞 因子水平。siRNA突变体(5' -ACTATCTAAGTTACTACCCCTT-3' ; SEQ ID NO: 10 )在SOCSl siRNA3序列中含有四个突变。
这些数据与报道的SOCSl参与调节JAK/STAT途径和TLR/NF-kB 途径(Hanada等，2003， Immunity 19:437-450; Chong等，2003， Immunity 18:475-487 )相一致。在IFN-y和LPS刺激之前或之后， 用SOCSl siRNA转染的DC显示出比siRM-DC突变体略微更成熟的表 型。两种转染的DC都比模拟转染的DC更成熟，这反映出siRNA非特 异性激活IFN基因的效果。
实施例3:用病毒载体转染鼠BM-DC
为了评估SOCSl是否负向调节体内的DC抗原呈递，将SOCSl siRNA 或对照绿色荧光蛋白(GFP) siRM克隆至慢病毒载体(LV)中，其能 够稳定转导DC(Rubinson等，2003，Nat. Genet. 33: 401-406; Schroers 等，2004， Methods Mol. Biol. 246:451-459 )，使得可以更可靠地评估S0CS1沉默的效果。根据本文别处所迷的方法产生了两个构建体， LV-SOCSl-siRNA和LV-GFP-siRNA，两者都含有黄色荧光蛋白(YFP ) 标记(图3)。用LV-SOCSl-siRNA或LV-GFP-siRM载体转导骨髓来 源的DC (>80%CDllc+)通常产生58-63% YFP阳性的培养细胞。与之前 对siRNA oligo转导的DC的观察相一致，观察到与LV-GFP-s匿A-DC 相比较，LV-SOCSl-siRNA-DC在刺激时总转导DC群中SOCSl mRNA水 平较低且促炎症细胞因子的分泌增强。为了测定转导DC中SOCSlmRNA 的含量，使用荧光激活细胞分选(FACS)来分离YFP+转导DC，然后通 过实时定量PCR来测定SOCSl mRNA的相对表达。观察到与模拟转导 DC中的含量相比较，YFP+ LV-SOCSl-siRNA-DC群中的SOCSl mRNA含 量低约90%。用LV-SOCSl-siRNA和LV-GFP-siRNA转导的DC,用或不 用LPS刺激，显示出CD86和CD40表达的水平相当。不希望受到任何 特定理论的束缚，认为观察到的LV-GFP-siRM-DC形成比模拟DC含 量高的CD86和CD40很可能是由于s iRNA的非特异性激活和慢病毒转 导的效应而引起的。
实施例4:通过鼠SOCSl siRNADC诱导的OVA-特异性CTL和抗肿 瘤活性
进行下一系列的实验来测试对抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞 (CTL )的DC刺激是否受到SOCSl的调节。用卵清蛋白-I肽(SI藩EKL; SEQ ID NO: 11)脉沖并用卵清蛋白-特异性TCR T细胞(OT-I)共培 养没有进一步刺激至成熟的未成熟SOCSl-siRM-DC或siRNA突变DC 时，SOCSl-siRM-DC共培养物中的OT-I细胞增殖地比siRNA-DC突变 体共培养物中的多(图4A)。与这些数据相一致，SOCSl-siRNA-DC 共培养物中分泌的促炎症细胞因子的水平较高(图4B)。此外，用 SOCSl-siRM-DC共培养后这些细胞所示的CTL测试显示出更高活性的 对抗卵清蛋白+同源EG7细胞的细胞毒性，证明了 SOCSl促成对抗原特 异性T细胞的DC刺激的调节。
接着通过用卵清蛋白脉冲的、转导的DC在缺乏离体成熟情况下直接免疫小鼠来测试SOCSl-沉默的DC体内引发抗原特异性应答的能力。 四聚体染色表明与LV-GFP-siRNA-DC或模拟DC免疫的小鼠中各自只 有0. 64%和0. 43°/。相比较，用LV-SOCSl-siRNA-DC免疫的小鼠中总CD8+T 细胞的2.3%对于卵清蛋白-四聚体是阳性的(图5A)。因为 LV-SOCSl-siRNA-DC或LV-GFP siRNA-DC之间表面成熟标记只存在较 小差异，这些数据表明增强的DC成熟不是引起LV-SOCSl-siRM-DC 功能性功效的唯一因素。使用干扰素-y (IFNy ) ELISPOT测试进一 步评价免疫小鼠中CD8+T细胞的功能状态。与分别给予未成熟模拟DC 或LV-GFP-siRNA-DC中1和18个斑点相比较，用不成熟 LV-SOCSl-siRNA-DC免疫的小鼠具有每2 x 105个CD8+T细胞68个IFN y+斑点(图5B)。这些结果与CTL测试相一致，CTL测试显示出来自 给予未成熟LV-SOCSl-siRNA-DC小鼠的脾细胞对抗卵清蛋白+靶细胞更 有效的细胞毒性(图5C)。用未成熟LV-S0CS1-siRNA-DC的免疫还诱 导了可观察到的有效抗原特异性CD4+T-辅助细胞应答。因此，S0CS1 沉默使得未成熟抗原呈递DC获得能够引发体内抗原特异性CD8+CTL应 答的免疫原性状态。不希望受到任何特定理论的束缚，认为由于S0CS1 沉默的DC不需要之前的成熟就引发了获得性免疫，因此S0CS1在维持 DC的致耐受性状态中起调节作用。
S0CS1介导的对体内成熟DC的调节
进行以下实验来研究之前没有成熟的SOCSl沉默DC对CTL应答的 引发是否是由DC应答内源环境刺激物而增强的成熟引起的。首先将卵 清蛋白脉沖的LV-SOCSl-siRNA-DC与LPS离体"小时成熟，然后在将 它们给予小鼠之前洗涤三次。LPS-成熟的LV-SOCSl-siRNA-DC显示出 比得上成熟LV-GFP-siRNA-DC的成熟表型，两种DC引发的CTL比不存 在体外成熟的DC更有效。然而，成熟的LV-S0CS1-siRM-DC在诱导抗 原特异性CTL中仍然明显优于成熟的LV-GFP-siRNA-DC,如通过卵清 蛋白四聚体染色所证明的(图5A) 。 IFN-y ELISPOT测试也显示出 LV-SOCSl-siRNA-DC小鼠中增强的卯清蛋白特异性CD8+T细胞应答(图5B)，表明S0CS1沉默允许成熟DC对内源环境刺激更高的应答性，导 致增强的CTL应答。
在进一步的体内测试中，将前一天已经用未成熟 LV-SOCSl-siRNA-DC免疫的小鼠注射LPS—次。该刺激显著(P<0. 01) 增强了未成熟LV-SOCSl-siRNA-DC小鼠中的CTL应答(CD8+T细胞中 7. 87%卵清蛋白-四聚体+)，但是在未成熟DC-GFP-siRNA小鼠中的有 效性较低(CD8+T细胞中0. 64%卵清蛋白-四聚体+)(图6A)。通过IFN-Y ELISPOT测试证实了未成熟LV-SOCSl-siRNA-DC小鼠中体内LPS刺 激后增强的卵清蛋白特异性CTL应答(图6B)。
为了测试成熟DC应答环境刺激物的信号转导是否在T细胞致敏中 起作用，将前一天已经用离体成熟LV-S0CS1-s iRM-DC免疫的小鼠注 射LPS —次或重复注射。LPS注射显著(P<0. 01)增强了成熟 LV-SOCSl-siRM-DC小鼠中的CTL应答，表明成熟DC的信号转导对于 引发T细胞应答的重要性(图6C和6D)。此外，LPS注射在增强用成 熟LV-SOCSl-s iRNA-DC免疫小鼠中的卵清蛋白特异性CTL应答中更有 效。
为了直接检测DC-S0CS1-siRNA对重复LPS刺激的反应性，测试了 SOCSl-siRM-DC和GFP-siRNA-DC在体外产生内毒素耐受性的能力。 SOCSl-siRM-DC,但不是GFP-siRM-DC，通过产生高水平的促炎症细 胞因子仍然强烈应答重复的LPS刺激，表明SOCSl-沉默的DC持续应 答刺激物。此外，通过S0CS1沉默降低了 DC对内源刺激物如作为天然 危险分子的热激蛋白(HSP)的应答性阈值。
合起来看，这些数据表明了 DC中S0CS1的沉默很可能降低了 DC 应答性的阈值，并允许未成熟和成熟的抗原呈递DC持续应答内源刺激 物，导致增强的抗原特异性CTL应答。这种机制强调了 S0CS1控制成 熟DC抗原呈递程度且因此控制获得性免疫的大小的关键作用。
通过体内刺激增强SOCSl-沉默DC免疫
为了研究使用细胞因子或Toll样受体(TLR)激动剂的体内刺激
77是否可以进一步地增强S0CS1-沉默DC的功效，给已经用OVA-脉沖的 DC-LV-SOCSl-siRM免疫的小鼠i. p.注射LPS (30yg/小鼠)、CpG (60pg/小鼠)、poly I: C (50pg/小鼠)、抗CD40 ( 100 pg/小鼠)
或IFN-g (ljig/小鼠)， 一天一次，连续三天。观察到这些刺激物优 先增强了由DC-LV-S0CS1-siRNA小鼠诱导的CTL应答(图6E )。这些 结果表明除了 LPS以外的许多刺激物可以进一步增强S0CS1沉默DC 免疫的功效。
通过DC中的S0CS1沉默增强了抗肿瘤免疫
，见察至lj的S0CS1在DC抗/^、呈递中的调节作月 的DC是否可能诱导更有效的抗原特异性抗肿瘤免疫从而导致对预先 建立的肿瘤生长的控制的研究。用缺乏离体成熟的卵清蛋白脉沖的 LV-SOCSl-siRNA-DC的免疫完全阻断了所有测试小鼠中预先建立的卵 清蛋白+EG7肿瘤的生长，与给予缺乏离体成熟的卵清蛋白脉沖的 LV-GFP-siRNA-DC或才莫拟DC的小鼠中胂瘤生长的中度降低形成对比 (图7A)。体内抗体阻断实验证明了抗CD8抗体阻断(而不是抗CD4 ) 消除了由卵清蛋白脉沖的LV-SOCSl-siRNA-DC诱导的抗肿瘤活性(图 7B)，表明CD8+CTL在抗胂瘤应答中的关键作用。
为了测试S0CS1 siRNAoligo双链体转染的DC是否具有增强的抗 肿瘤活性。用SOCSl siRNAoligo双链体或对照oligo双链体转染DC。 然后用已经用OVA或TC-1肿瘤裂解物脉冲的转染DC免疫小鼠组。用 脉沖的DC免疫小鼠后，用LPS ( 30jLig/小鼠)体内刺激小鼠三次。DC 免疫后两周，用0VA+EG7肿瘤或TC-1肿瘤攻击经免疫的小鼠。在EG7 和TC-1两个肿瘤模型中都观察到增强的抗肿瘤活性(图7C和7D)。 此外，IFNy ELISPOT测试显示出用TC-1肿瘤裂解物脉沖的S0CS1 siRNA oligo-DC免疫的小鼠中增强的肿瘤特异性CTL应答(图7E)。
进一步测试了 S0CS1沉默的DC是否可增强对抗自身肿瘤相关抗原 的免疫应答。为了这些实验，使用了在弱免疫原性B16黑素瘤细胞中 天然表达的鼠黑素细胞分化抗原酪氨酸酶相关蛋白(TRP) 2。将C57BL/6小鼠接种B16肿瘤细胞并在三天后用TRP2肽脉沖的用LPS体 外刺激的成熟LV-S0CS1-siRNA-DC或LV-GFP-siRNA-DC处理一次。成 熟LV-SOCSl-siRNA-DC有效地阻断了预先建立的B16肿瘤的生长，而 成熟LV-GFP-si MA-DC不具有任何抑制效果(图8A )。增强的抗肿瘤 活性与LV-SOCSl-siRM-DC小鼠中有效的TRP2-特异性CTL应答相关， 如通过ifn y elispot和ctl测试所检测的(图8B和8C)。只在给 予成熟LV-SOCSl-siRNA-DC小鼠中检测到有活性的NK活性。与使用卵 清蛋白+EG7肺瘤的结果相比，用未成熟的TRP2脉沖的 LV-SOCSl-siRNA-DC的免疫对B16肺瘤未能产生显著的(P>0. 05)抑 制效果，表明产生有效的抗肿瘤活性需要DC的完全成熟和成熟后的连 续信号转导。始终观察到GFP siRNA转导对对抗外源抗原(卵清蛋白) 的CTL应答的非特异性刺激效果。然而，非特异性刺激效果不足以增 强对抗自身抗原(TRP2)的CTL应答。
检测了用LV-S0CS1-siRNA-DC免疫诱导的可能的不利自身免疫病 理。观察到用TRP2脉沖的SOCSl沉默DC免疫的小鼠的脱色素(白癜 风)。然而，在200多只用卵清蛋白或TRP2脉沖的LV-SOCSl-siRNA-DC 免疫的小鼠中在免疫后长达三个月没有观察到其他明显毒性。免疫小 鼠所有主要器官和组织的组织学分析表明没有病理性炎症，且免疫组 织化学染色没有显示出肾脏中的IgG或IgM沉积。LV-SOCSl-siRNA-DC 和模拟DC小鼠中的IgG ( IgGl、 IgG2a)和抗-dsDNA的水平相当。这 些数据表明LV-SOCSl-siRNA-DC免疫不在小鼠中引起病理性炎症。不 希望受到任何特定理论的束缚，认为SOCSl-沉默的DC具有强烈增强 的诱导能够阻断预先建立的弱免疫原性肿瘤生长的有效的抗原特异性 抗肿瘤免疫的能力。
SOCSl的沉默增强了 DC的抗原呈递和抗原特异性抗肿瘤免疫 在此呈现的结果证明了 DC的刺激能力和获得性免疫的大小受到 DC中SOCSl的关键性调节。沉默抗原呈递DC中的SOCSl强烈增强了 抗原特异性抗肿瘤免疫。SOCSl代表用于定性和定量控制DC的抗原呈递和获得性免疫大小的抑制机制。
本发明的公开内容证明了 S0CS1在调节成熟DC的抗原呈递程度中 的关键作用，因此证明了允许DC控制获得性免疫的大小和持续时间的 调节机制。在此具体说明了 SOCS1在维持DC致耐受性状态中的重要性， 因为与野生型DC相比，S0CS1沉默的DC被赋予了刺激性抗原呈递能 力来引发体内T细胞应答而不需要体外成熟。不希望受到任何特定理 论的束縛，认为DC中的S0CS1控制获得性免疫大小的确切机制涉及成 熟DC在以下方面的信号转导和输出的调节抗原肽呈递、共刺激/共 抑制和应答细胞因子、微生物产物以及还有可能的细胞-细胞接触的刺 激的细胞因子产生。
基于有限数量的研究，通常认为成熟DC生命短。然而，最近使用 可靠遗传学方法的研究证明了成熟抗原呈递DC的生命周期比之前估 算的长得多，在体内持续2周，支持调节成熟DC抗原呈递程度的必要 性和重要性。
本发明涉及沉默DC中的S0CS1作为一般方法通过使DC中的关键 制动失效来增强肿瘤疫苗功效的新原理。用S0CS1沉默的DC接种疫苗 强烈地增强了抗原特异性抗肿瘤免疫，因为S0CS1沉默允许抗原呈递 免疫原性DC在体内持久地刺激抗原特异性T细胞。SOCSl-沉默的DC 通过增强DC成熟和产生抑制调节T-细胞抑制的促炎症细胞因子如 IL-6而能够关闭调节T细胞。
对T细胞上CTLA-4的阻断有效地破坏了耐受性并增强了肿瘤疫苗 功效，但是引起了患者严重的非特异性自身免疫炎症。通过在抗原呈 递水平耙向DC中的S0CS1，可以获得更为抗原特异性的抗肿瘤应答。 首先，用大量装载肿瘤相关抗原的S0CS1沉默DC进行免疫将诱导抗原 特异性免疫，与靶向效应CTL上的CTLA-4形成对比，后者是一种不可 避免地激活对抗重要正常组织的自身反应性T细胞的方法。其次，使 用具有残余S0CS1水平的部分SOCSl-沉默的DC可能不会引起严重的 自身免疫炎症，因为杂合SOCSl+小鼠没有显示出或只有轻微的自身免 疫炎症迹象。此外，在S0CS1+小鼠中看到的严重自身免疫炎症需要S0CS1的完全缺失，不仅在DC中而且在其他免疫细胞世系如T和NK 细胞中。在此呈现的结果提供了一种见识，这种见识不仅用于理解定 性和定量调节抗原呈递和获得性免疫，而且用于研发通过增强DC的刺 激潜能对抗癌症和感染性疾病的有效疫苗。
实施例5:通过小鼠S0CS1 siRNA D(H秀导的TRP2-特异性CTL和 抗胂瘤活性
本发明的7>开内容证明了成熟DC中表达由S0CS1 siRNA降低的 S0CS1表达的慢病毒载体可以增强自身抗原特异性CTL应答的大小。 将小鼠黑素细胞分化抗原-酪氨酸酶相关蛋白2 (TRP2)用作模型自身 抗原用于该研究中。使用TRP2是因为它在正常黑素细胞和弱免疫原性 B16黑素瘤细胞中都天然表达，且在TRP2中已经鉴定出多个MHC I类 表位(van Elsas等，2001， J. Exp. Med, 194: 481-9 )。
现在描述该实施例中所示实验中所用的材料和方法。
小鼠/动物模型
从Jackson实验室(Ben Harbor, Maine, USA)购买四至六周龄 的雌性C57BL/6、 CD4 K0、 CD8 K0或p35 (IL-12) K0小鼠，并根据 建立的指导饲养于Baylor College of Medicine (贝勒医学院) (Houston, TX， USA)的无病原体小鼠设施中。
丛
通过Genemed Synthesis Inc. ( South San Francisco， CA， USA) 合成H2-Kb限制性TRP2a (VYDFFVWL; SEQ ID NO: 15 )和TRP2b (SVYDFFWk SEQ ID NO: 16) (vanElsas等，2001， J. Exp. Med. 194: 481-9 ),和对照H2-Kb-限制性0VA-I ( SII翻KL; SEQ ID NO: 11 )， 并通过HPLC纯化至>95%的纯度。在最终稀释于无内毒素PBS (Sigma, St. Louis, M0)之前将所有肽溶解于DMS0中。
81用慢病毒载体转导BM来源的DC
如本文别处所述的产生重组慢病毒载体(LV-SOCSl-siRNA和 LV-GFP-siRNA)，滴定并用于转导DC。
细胞因子ELISA和酶联免疫斑点(ELISPOT)测试 在所示的时间点并使用所示的刺激物根据制造商的说明使用DC 培养物的上清液进行ELISA分析(BD Biosciences, Lincoln Pari, NJ)来定量各种促炎症细胞因子的含量。如Huang等，2003， Cancer Res. 63: 7321-9中所述的进行分离的CD4+或CD8+T细胞的ELISPOT测试。 H2-K7TRP2 I类肽用于小鼠CD8+T细胞刺激。还将来自OVA的无关肽 用作阴性对照。使用MACS CDS (Ly-2)微珠(Miltenyi Biotec Inc., Auburn CA )从脾细胞分离CD8+ T细胞。
流式细胞分析
用含有0. 1% NaNs和2°/。FCS的PBS中的FITC或PE mAb将细胞染 色。从BD Pharmingen( Franklin Lakes，NJ )或eBioscince( San Diego， CA)购买小鼠CD8 (53—6.7) 、 CDllc (HL3) 、 CD40 ( 3/23 ) 、 CD80 (16-10A1) 、 CD86 (GL1) 、 OX40L (RM13札)或PDL1 (MIH5)特异 性抗体和相配的同种型对照。在FACSCalibur (Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ， Franklin Lakes, NJ)流式细月包计上分4斤染色的 细胞。
四聚体染色
使用H2-KVTRP2-PE四聚体测试来检测TRP2-特异性小鼠CD8+ T 细胞。在Baylor College of Medicine Tetramer Core Facility (贝 勒医学院四聚体核心机构)(Houston, TX, USA)合成TRP2-四聚体。 用抗CD8oc-FITC/抗CD3-PerCP和H2-Kb/TRP2-PE将来自免疫小鼠的 脾细胞共染色。使用每106个细胞ly g抗CD8cc-Fitc和1:100稀释度的TRP2-PE四聚体在4C将四聚体染色进行lh，根据制造商的说明。 DC免疫和肿瘤小鼠研究
如本文别处所述的用MOI为5的SOCSl-siRNA或GFP-siRNA转导 BM来源的DC (脂培养的第4-5天)。简而言之，用肽将DC脉冲20 小时，用PBS洗涤三次，用LPS (100ng/ml， Sigma, St. Louis, MO) 或TNFa ( 500ng/ml， R&D Systems, Minneapolis, MN)刺激24小时， 用PBS洗涤三次，然后通过后脚垫注射至C57BL/6、 CD8 KO、 CD4 KO 或p35KO小鼠中。在治疗模型中，将B16肿瘤细胞(2.5xl05)皮下 注射(s.c.)至同系小鼠的右胁侧来建立肿瘤模型。在肿瘤接种后的 第三天，将小鼠随机分组并注射30p 1肽脉冲的(50ng/ml)、转导 的DC ( 1. 5 x 106)或PBS对照。 一些小鼠中，在DC接种后的所示天数 将LPS ( 30pg/小鼠)或重组鼠IL-12蛋白(1 jug/小鼠，Peprotech， Rocky Hill, NJ )腹膜内给药(i. p.)。用卡尺每两天测量肿瘤体积 直至实验完成。
CTL测试
用标准铬释放测试来测定CD8+ CTL应答，这测量了体外再次刺激 的脾细胞裂解靶细胞的能力(Huang等，2003 ， Cancer Res. 63:7321-9 )。从2-3只免疫小鼠汇集的脾细胞在含有H2-Kb/TRP2肽 的RPMI 1640中体外再次刺激4-6天。用51Cr铬酸钠溶液标记TRP2+ 耙B16细胞(H2-Kb)和对照EG. 7细胞(ATCC， Manassas, VA )，在 37'C震荡90分钟。将不同数量的效应细胞与恒定数量的靶细胞(5x 107孑L)在96孔U-底平板中(200|u 1/孔)在37。C温育四小时。收集 并分析重复三份培养物的上清液。按照(实验释放-自发释放)/ (最 大释放-自发释放)x ioo来计算裂解百分比。
统计学分析
为了统计学分析，使用了 Sudent， s t检验，并取95%置信限是显著的，定义为p<0. 05。通常以平均值土标准误差(SE)来呈现结果。 现在描述该实施例中所示实验的结果。
成熟DC中通过S0CS1限制的信号转导控制了自身抗原特异性CTL 应答的大小和耐受性
用LPS体外成熟的TRP2肽脉冲的、转导的DC免疫C57BL/6小鼠。 然后在LPS存在或不存在下体内刺激免疫小鼠一次或三次，并使用四 聚体分析来测量TRP2-特异性CTL应答。选择LPS来用于体内刺激是 因为它诱导许多促炎症细胞因子，其中许多受到S0CS1的调节，以及 证明的S0CS1在直接调节NF-kB (p65)信号转导中的作用(Ryo等， 2003， Mol. Cell. 12:1413-26)。在体内LPS刺激不存在下，与 GFP-siRNA DC免疫小鼠中仅3， 1%相比较，SOCSl-siRNA DC免疫的小 鼠中总CD8+ T细胞的5. 1%对于TRP2-四聚体是阳性(图9A )。体内 LPS刺激1次或3次，显著提高了 S0CS1-s iRNA DC免疫小鼠中的TRP2-四聚体阳性CD8+ T细胞的百分比(各自为9. 7°/。和19.4%)，但在 GFP-siRNA DC免疫小鼠中基本上是未改变的(各自为3. 0%和4.0%) (图9A)。相一致地，CTL测试(图9C)和干扰素-y ( IFN-y )ELISPOT 显示出相似的结果。此外，在免疫后3个月时共注射LPS的TRP2肽脉 冲的SCSl-siRNA DC免疫的大部分小鼠中白癜风(皮毛变浅、脱色素 和/或掉毛)是明显的(图9B)，表明对通常在宿主黑素细胞中表达 的TRP2的自身耐受性的破坏。相反，在任何一只GFP-siRNA DC免疫 的小鼠中都没有观察到白癜风，即使重复体内LPS给药，表明了 DC 中S0CS1用于维持对自身抗原的耐受性的关键作用。这些结果证明了 成熟抗原呈递DC中的信号转导控制了 CTL应答的大小和自身耐受性， 且成熟DC的信号转导受到S0CS1的严格限制。
S0CS1限制的信号转导控制了 DC破坏自身耐受性和诱导有效抗肿 瘤免疫的能力
肿瘤疫苗接种的主要目的是通过诱导强烈的对抗优先在肿瘤细胞上表达的自身抗原的获得性免疫应答来破坏自身耐受性。观察到的
S0CS1在调节自身抗原特异性CTL应答的大小和自身耐受性中的作用 促使了对成熟DC诱导有效抗胂瘤免疫的能力是否受到S0CS1表达控制 的研究。为了测试这一点，用B16肿瘤细胞皮下接种C57BL/6小鼠并 在三天后用LPS体外成熟的TRP2-脉冲的、转导的DC免疫一次。图10A 显示了与GFP-siRNA DC免疫相比较，单独S0CS1-siRNA-DC免疫能够 显著抑制B16肿瘤的生长(P<0. 01)。然而，50% SOCSl-siRNA DC免 疫的小鼠最终在肿瘤接种后30天死于〉l， 500mn^的肿瘤负荷。为了测 定在SOCSl-siRNA DC免疫小鼠中通过增强促炎症信号是否可以提高小 鼠存活，在DC免疫后一天用LPS体内刺激小鼠一次。将LPS刺激添加 至免疫实验方案中显著阻断了 SOCSl-siRMDC免疫小鼠中的B16肿瘤 生长(图10B)。这与GFP-siRNADC和模拟转导的DC对照形成对比， 后两者与非LPS刺激的小鼠相比较显示出肿瘤负荷没有降低(比较图 IOA和IOB) 。 SOCSl-siRNA DC免疫和LPS攻击的结合还将小鼠存活 显著提高至100%>60天(图10C) 。 SOCSl-siRNA DC免疫的小鼠中增 强的抗肿瘤活性与有效的TRP2-特异性CTL活性相关(图10D)。通过 用SOCSl-siRNA DC免疫CD4和CD8敲除(K0 )小鼠，进一步证明了抗 胂瘤活性需要CD8+和CD4+细胞，尽管在免疫的CD4 KO小鼠中观察到 弱的抗胂瘤活性(图10B-10D)。总的说来，这些结果表明成熟DC中 SOCSl限制的信号转导控制了它们破坏耐受性和诱导有效抗肿瘤免疫 的能力，且通常受到S0CS1调节的其它促炎症信号，可以进一步增强 诱导的抗肿瘤免疫应答控制预先建立的肿瘤负荷的能力。
S0CS1限制的信号3在控制自身耐受性和抗肿瘤免疫中的关键作
S0CS1很可能通过调节抗原肽/MHC呈递、共刺激和/或细胞因子信 号转导和分泌影响了成熟DC的信号转导和输出。进行以下实验来研究 对于自身抗原特异性CTL应答和抗肿瘤免疫的控制，这三种信号中的 哪一种主要受到了 S0CS1的调节。首先测试了 S0CS1沉默是否影响了共刺激分子的表达(信号2)。 通过流式细胞测试，持续地观察到在LPS诱导的成熟之前和之后，与 GFP-siRM DC上的那些相比较，SOCSl-siRNA DC上存在检测不到的或 只是略微增强的共刺激/抑制分子(B7. 1、 B7. 2、 OX40L、 CD40或PDL1 ) 的表面水平(图11A)。还检测到SOCSl-siRNA DC和GFP-siRNA DC 上相当的MHC-I和II分子水平。
鉴于CD8+T细胞在诱导抗肺瘤免疫力中的重要性，进一步研究了 MHC-I限制性肽免疫原性(TCR亲和性)是否在S0CS1限制的体内抗原 呈递中起着重要作用。因为之前鉴定了 TRP2 CTL肽的高亲和性形式
(TRP2b)和低亲和性形式(TRP2a) (vanElsas等，2001， J. Exp. Med. 194:481-9 )，将两种TRP2肽都用来测试信号1的强度是否可以 影响转导的DC诱导抗肿瘤免疫应答的能力。图11B显示了装载低
(TRP2a)或高亲和性(TRP2b)肽的成熟GFP-s iRNA DC使用体内LPS 刺激不能诱导B16肿瘤消退，尽管装载TRP2b肽的GFP-siRNA DC显示 出微弱的抗肺瘤活性(统计学不显著)。相反，装载低或高亲和性TRP2 肽的SOCSl-siRMDC组有效阻断了肿瘤生长。还使用IFNY ELISPOT 测试研究了免疫小鼠中的TRP2-特异性CTL活性。图IIC显示了装载 高亲和性肽的GFP-s iRM DC诱导了比装载低亲和性肽的GFP-s iRNA DC 更强的IFNy应答。然而，装栽低或高亲和性肽的两组SOCSl-siRNA DC 都诱导了比装载高亲和性肽的GFP-siRNA DC强得多的IFNy应答
(P<0. 01)，这与观察到的抗肿瘤活性一致(图11B)。此外，装载 低或高亲和性肽的SOCSl-siRNA DC诱导了相似的IFN Y应答(图 11C)。
这些实验的结果证明了在成熟存在或不存在下，S0CS1沉默对DC 上的共刺激/抑制分子(信号2)以及MHC-I和II分子的表达不具有 显著影响；装载高或低亲和性TRP2肽(信号l)的成熟DC在诱导有 效IFNy应答和抗肿瘤免疫中是无效的，除非S0CS1是被沉默的。
实施例6:通过小鼠S0CS1 siRM DC诱导的CTL体内IL-12提高和抗肿瘤活性
尽管已经充分研究了通过树突细胞(DC)启动的细胞毒性T细胞 (CTL)应答，但对于调节自身耐受性的维持或破坏的机制仍然不太明 确。在这个实施例中，证明了其中细胞因子信号转导抑制因子(SOCS) 1已经沉默的成熟DC,而不是成熟的野生型DC,有效地破坏了自身耐 受性，尤其是用微生物产物或IL-12体内刺激时。在此公开的实验证 明了通过抗原呈递DC提供的SOCSl-限制的信号3 (IL-12),而不是 抗原亲和性(信号1)和共刺激分子的水平(信号2 )，关键性地控制 了自身耐受性。此外，本发明的公开内容证明了 SOCSl沉默的DC诱导 了有效的对抗自身抗原的免疫应答，阻断了预先建立的B16肿瘤的生 长。此外，人SOCSl沉默的DC具有全面激活具有裂解效应功能的自身 抗原特异性人CTL的优异能力，意味着这种SOCSl沉默方法的翻译潜 能。
SOCSl限制的信号3在控制自身抗原特异性CTL激活和耐受性中 的可能重要性促使了鉴定受成熟DC中SOCSl调节的关键细胞因子。最 初测试了几种已知影响CTL激活的候选促炎症细胞因子的重要性，使 用源自不同遗传学纯合KO小鼠的DC,用于结合SOCSl沉默的DC接种。 将来自IL-12 (p35—7—) KO小鼠的DC用于免疫时，观察到装载TRP2肽 的p35—〃SOCSl-siRNA DC不再抑制B16肿瘤的生长(图12A-12B), 表明SOCSl限制的和DC产生的IL-12对肿瘤消退的关键作用。为了进 一步测定IL-12在SOCSl-限制的DC功能中的作用，评估了通过 p35—/_S0CS1-siRNA DC诱导的CTL应答。使用IFNy ELISPOT和CTL 测试，观察到与野生型SOCSl-siRNADC相比较，p35+SOCSl-si醒DC 具有显著降低的诱导TRP2特异性CTL应答的能力(图12C和12D)。 此外，LPS的体内刺激未能增强由p35+SOCSl-siRNA DC诱导的CTL 应答，如通过TRP2-四聚体分析所测量的(图9A)。令人感兴趣地， 与抗原呈递DC产生的IL-12的基本作用相比，观察到用野生型 SOCSl-siRNA DC免疫的IL-12 (p35+) KO小鼠也诱导了活性的抗肿 瘤免疫和CTL应答，表明自身抗原特异性CTL应答的诱导不需要由常居的宿主细胞产生的IL-12 (图12A-12D)。总的来看，这些结果显示 出由抗原呈递DC产生的S0CS1限制的IL-12对于诱导有效的TRP2-特 异性CTL应答和B16肿瘤根除是重要的。
S0CS1沉默的DC引起的持久和增强的IL-12和IL-12诱导的细胞 因子的产生vs.wtDC引起的短暂的和低的产生
DC应答微生物产物如LPS和CD40连接而产生相当大量的IL-12 (Schulz等，2000， Immunity 13: 453-62 ) 。 DC的IL-12产生紧紧 地限于诱导成熟后的短的时间段(8-16小时)(Langenkamp等，2000， Nat. Immunol. 1: 311-6 )并受到SOCS1的调节(Eyles等,2002， J. Biol. Chem. 277: 43735-40 )。鉴于已识别的S0CS1限制的IL-12在 调节获得性免疫中的重要作用，检测了 S0CS1沉默对DC的IL-12产 生强度和持续时间的效果，其可能与S0CS1-siRNADC破坏免疫耐受性 和诱导对TRP2的有效抗肿瘤免疫应答的能力密切相关。
图13A显示了与GFP-siRNA DC和才莫拟转导的DC相比较， SOCSl-siRM DC在72小时的时间段内应答LPS和抗CD40 mAb的连续 刺激产生了显著增加水平的IL-12 (p70)。然后通过用LPS/抗CD40 刺激24小时，然后将不含有LPS的新鲜培养基中的DC转移至新的培 养平板中，测定了尽管除去了最初刺激物，S0CS1-siRM DC维持IL-l2 水平的能力。图13B显示了 GFP-siRM DC和模拟转导的DC只在刺激 时短暂地产生了 IL-12，而S0CS1-siRMDC长久地产生显著较高水平 的IL-12,尽管除去了刺激物。不希望受到任何特定理论的束绰，除 去LPS/抗CD40后SOCSl-siRNA DC的延长和增强的IL-12产生可能是 由于原始刺激物诱导的信号转导途径延长的激活和/或可能IL-12或 其他DC分泌的促炎症细胞因子引起的自分泌/旁分泌刺激。这些结果 表明S0CS1沉默使得DC应答刺激而产生持续且增加水平的IL-12,这 可能引起了 S0CS1沉默的DC破坏耐受性并根除预先建立的肿瘤的能 力。
由于S0CS1是介导IL-12和其他细胞因子信号转导的Jak/Stat途径的关键调节剂(Kubo等，2003， Nat. Immunol. 4:1169-76; Alexander等，2004， A謹.Rev. Immunol. 22: 503-29 )，进行下一 系列的实验来测试DC中的S0CS1沉默是否通过在它们自身和可能其他 邻近DC之间产生细胞因子反馈回路而增强了细胞因子产生。为了测定 这一点，测量了 SOCSl-siRNA DC的肺瘤坏死因子(TNF) cc和IL-16 产生。测试了 (TNF) oc和IL-6，因为已知IL-12刺激诱导这些细胞 因子(Trichieri等，2003， Nat. Rev. Immunol. 3:133—46 )。
图13C显示了 SOCSl-siRNA DC在除去最初的刺激物后长久地产生 较高水平的TNFoc和IL-16,与GFP-siRNA DC和模拟转导的DC相反， 后两者只是短暂地产生低水平的TNFot和IL-6。为了进一步测定IL-12 对于产生反馈回路的重要性，比较了 p35+S0CS1-siRNA DC和wt SOCSl-siRNA DC引起的TNF oc和IL-6产生。图13D显示了 p35+SOCS1-siRNA-DC不再能够产生提高和延长量的TNFoc和IL-6， 表明IL-12反馈是SOCSl-siRNA DC引起的TNFct和IL-16产生的关键 诱导因子。这些数据表明S0CS1沉默使DC中的关键信号转导制动失效， 因此使它们通过增强的反馈回路不仅连续应答且产生IL-12,还有 IL-12诱导的促炎症细胞因子。在此公开的结果提供了可能的机制来 解释装载TRP2的SOCSl-siRNA DC诱导白癜风和对B16肿瘤细胞的有 效抗胂瘤免疫的能力。
S0CS1限制的IL-12信号转导对于控制DC破坏自身耐受性的能力 的重要性
SOCSl-s iRM DC诱导对抗自身肿瘤相关抗原的有效CTL应答的能 力暗示了 S0CS1沉默策略的治疗应用。由于临床使用LPS作为患者体 内刺激物的毒性太强，评估其信号转导受S0CS1调节的IL-12在增强 SOCSl-siRNA DC的功效中是否也是有效的。
将C57BL/6小鼠接种B16肿瘤细胞，三天后，用重组小鼠TNFot 体外成熟的TRP-2脉沖的、转导的DC免疫小鼠一次。DC免疫后，用 低剂量重组小鼠IL-12 ( 1 pg/小鼠)体内刺激受体小鼠三次。图14A
89显示了有效地阻断了 SOCSl-siRNA DC免疫小鼠中B16肿瘤的生长。相 比之下，与PBS对照相比较，体内给予IL-12的GFP-siRNADC免疫对 肿瘤生长具有很小的效果。SOCSl-siRNA DC免疫小鼠中抗肺瘤活性与 增强的TRP2-特异性CTL活性相关，如通过IFNy ELISPOT测试所示 的(图14B)。与早先的观察(图10A)相一致，与GFP-siRNA DC对 照相比较，用TRP2脉沖的、TNFoc成熟的SOCSl-siRNA DC免疫在体内 IL-12刺激不存在下也显示出增强的抗肿瘤活性。
这些结果表明体内给予IL-12显著增强了 SOCSl沉默DC的免疫刺 激能力，但没有增强野生型DC的免疫刺激能力，很可能是由于IL-12 和IL-12诱导的细胞因子增强的信号转导。这些结果进一步暗示了抗 原呈递DC中的SOCSl限制的细胞因子信号转导，而不是细胞因子如 IL-12的全身浓度，对于诱导有效的抗自身肿瘤相关抗原的抗肿瘤免 疫是重要的。
免疫后长达6个月没有观察到共注射LPS或IL-12的TRP2-脉冲 的SOCSl-siRNA-DC小鼠中除了白瘕风以外的明显毒性。免疫小鼠的所 有主要器官和组织的组织学分析揭示没有病理性炎症。 SOCSl-siRNA-DC和模拟DC小鼠中的IgG和抗-dsDNA水平相当。这些 数据表明TRP2-脉沖的SOCSl-siRNA DC免疫没有引起小鼠的病理性炎 症。
SOCSl限制的信号3的强度控制了 CTL激活、耐受性和抗肿瘤免
逸
在此公开的结果提供了对成熟DC调节CTL应答的新见识，这对于 研发肿瘤疫苗应当具有深远的意义。已知成熟对于DC从未成熟致耐受 性状态转换至成熟免疫原性状态是关键点(Banchereau等，1998， Nature 392:245-52 ; Stei画n等，2003， A廳.Rev. Immunol. 21:685-711 )。认为抗原呈递DC和T细胞之间最初接触(信号l和2) 的强度决定了 CTL应答的大小和命运，因为基于有限数量的研究认为 成熟DC的生命是短的(Porgador等，1998， Journal of ExperimentalMedicine 188: 1075-82; Ingulli等，1997， J. Exp. Med. 185: 2133-41; Ruedl等，2000, J. Immunol. 165:4910-6 )。然而，使用可靠遗传 学方法的更近的研究证明了成熟抗原呈递DC的生命周期比之前估计 的要长得多，在体内持续两周(Garg等，2003， Nat. Immunol. 4:907-12 )，表明成熟DC与T细胞最初接合后可能的调节作用。
本发明的结果证明了成熟DC中受到SOCS1密切限制的促炎症信号 转导关键性地控制了自身抗原特异性CTL应答的大小。这表明了 CTL 应答至少在两个水平上受到DC的控制CTL应答的启动需要DC成熟 和成熟DC与自身和CTL的进行中的细胞因子信号转导，其大小受到 SOCS1表达的调节。本发明的结果进一步意味着DC和它们周围环境的
互作用，这总地决定了自身耐受性的维持或破坏，因此决定了自身抗 原特异性CTL应答的命运。
在此公开的结果揭示了用于调节自身耐受性的维持或破坏的新机 制。发现由DC提供的SOCS1限制的信号3 (IL-12)，而不是肽亲和 性和共刺激分子水平，关键性地控制了自身耐受性。细胞因子对于DC 介导的激活或过度激活T细胞的重要性在众多自身免疫性疾病 (Banchereau等，2004， Immunity 20: 539-50 )和其他模型(Curtsinger 等，2003， J. Exp. Med. 197: 1141-51; Valenzuela等，2002， J. Immunl. 169:642-9 )的研究中暗示。
wt DC引起的细胞因子如IL-12产生是短暂的并在刺激时受到 SOCSl抑制，如在此和其他人的研究所证明的(Langenkamp等，2000, Nat. Immunol. 1:311-6)。观察到与wt DC相反，SOCS1沉默的DC 应答最初的刺激物可以持续产生显著提高的IL-12和IL-12诱导的细 胞因子水平，通过使该途径的可诱导反馈抑制剂失能后在DC中形成复 杂的通过Jak/Stat信号转导途径的自分泌(以及可能的旁分泌)信号 回路。相一致地，发现体内给予低剂量IL-12有效地增强了 SOCS1沉 默的DC而不是wt DC的破坏自身耐受性的能力。
总而言之，这些结果表明了通过SOCSl沉默的DC产生了持续而提高的IL-12和IL-12诱导的细胞因子产生和信号转导很可能在自身耐 受性破坏和增强的抗肿瘤CTL应答中起着关键作用。本发明的结果进 一步表明DC中S0CS1引起的对刺激信号转导的胞内抑制促成自身耐受 性的维持。尽管发现S0CS1通过其SOCS盒区域靶向p65蛋白进行遍在 蛋白介导的蛋白水解而直接阻断了 NF-KB信号转导(Ryo等，2003， Mol. Cell. 12:1413-26) ， Gingras等报道了 S0CS1通过抑制I型 IFN的信号转导间接调节了巨噬细胞中用于LPS介导毒性的TLR信号 转导(Gingras等，2004， J. Biol. Chem. 279:54702-7 )。不同于 通过I型IFN信号转导的LPS诱导毒性，在此的结果证明了 SOCSl-沉 默DC诱导的CTL应答主要是由IL-12介导的。在此的结果还证明了 SOCSl-沉默的DC应答LPS引起的多种细胞因子如TNF-ct、 IL-6和 IL-12的产生增加。
该研究证明了沉默DC中的SOCSl对于诱导有效的对抗自身肿瘤相 关抗原的抗肿瘤免疫的必要性。已经将DC疫苗看作用于肿瘤疫苗接种 的最有前景策略之一，如近年中涉及1000多名患者的98项公开DC 疫苗临床测试所证明的(Rosenberg等，2004, Nat. Med. 10: 909-15 )。 主要目的在于通过各种方法促进抗原呈递和DC成熟的这些尝试大部 分是令人失望的,具有非常低的目标临床应答率(Rosenberg等，2004， Nat. Med. 10:909-15 )。在此的数据证明了即使在用LPS或IL-12 体内刺激后，装载高亲和性肽的wt DC仍然不能破坏自身耐受性。因 此，在此的结果可以解释目前所述肿瘤疫苗的总体无效性(Rosenberg 等，2004, Nat. Med. 10:909-15 )，并通过沉默关键信号转导抑制剂 如SOCSl结合现有促进DC抗原呈递和成熟的策略，提供了研发更有效 肺瘤疫苗的新途径(Gilboa， 2004， Nat.Rev. Cancer 4:401-11; You等，2000, J. Immunol. 165: 4581-4592; Soiffer等，2003， J. Clin. Oncol. 21:3343-50; Pardoll， 2002, Nat. Rev. Immunol. 2: 227-38 )。
本发明的SOCSl沉默方法，具有特异性增强由装载抗原的DC诱导 的抗原特异性免疫应答的能力，比系统性阻断效应T细胞上CTLA4的方法也更有吸引力，后种方法不加区别地过度激活自身反应性T细胞， 包括对抗重要组织和器官的那些(Hodi等，2003， Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 100: 4712-7; Phan等,2003， Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 100: 8372-7 )。总而言之，鉴于改进肿瘤疫苗的集中努力聚焦于 抗原亲和性/剂量和共刺激的改进，本研究发现的调节自身耐受性的新 机制和SOCS I沉默的DC的增强的免疫刺激能力提供了可广泛应用的破 坏对抗肿瘤的自身耐受性限制的新疫苗接种策略。
实施例7:通过小鼠S0CS1 siRNA DC诱导的HIV特异性抗体和CTL
应答
这个实施例证明了通过抑制宿主的天然免疫抑制剂诱导抗HIV免 疫应答的可选策略。该研究证明了 S0CS1， DC中JAK/STAT途径的负向 调节剂，不仅控制了 HIV特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，而且控 制了抗体应答。S0CS1沉默的DC对于HIV包膜介导的抑制是抗性的并 有效地诱导了小鼠中平衡的记忆HIV包膜特异性抗体和CTL应答。本 发明的公开内容代表了通过抑制宿主的免疫抑制剂来引发HIV特异性 抗体和CTL应答的第一次尝试。
现在描述该实施例中所示实验中所用的材料和方法。
用慢病毒载体转导BM来源的DC
如本文别处所述的产生重组慢病毒栽体，LV-SOCSl-siRNA和 LV-GFP-siRNA,滴定并用于转导DC。
细胞因子和抗体ELISA测试
根据制造商的说明通过ELISA分析(BD Biosciences, Lincoln Park, NJ)来定量细胞培养物上清液中的细胞因子含量。为了测定 gpl20特异性抗体和亚类的滴度，将gpl20蛋白(碳酸盐緩沖液[pH9. 6] 中5 m g/ml )在4X:包被过夜，将PBS-5%FBS中的l2倍连续稀释的血 清在室温加入孔中1小时。八次洗涤后，将生物素化的抗小鼠抗体(抗
93小鼠IgM、 IgG、 IgGl、 IgG2a、 IgG2b或IgG3)在室温加入孔中1小 时。将抗生蛋白链菌素-HRP用作过氧化物酶底物。通过加入50jLil2M H2S(h来停止反应。在Bio Assay Reader上450nm处阅读光密度。将 结果表示为终点滴度的倒数，从y轴上的光密度(OD)值和x轴上的 稀释度-1的散点图来确定，为此x-轴的标尺是对数的。将数据作图后， 将对数曲线拟合运用至每个单个的稀释系列，确定曲线拟合与阳性-阴性截断值交叉的点。将每个抗体同种型的截断值计算为从对照小鼠 血清的所有稀释度的平均值(+3SD)。在相同时间测试每个实验中测 试的所有样 品。
T-细胞酶联免疫斑点(EUSPOT)测试
如本文别处所述的进行分离的CD4+或CD8+ T细胞的ELISPOT测试。
B细胞分离和产生gpl20抗体的B细胞ELISPOT测试 将完全RPMI 1640培养基中的脾脏制得的单细胞悬浮液在37°C 5°化02涂布于塑料培养皿中lhr来除去粘附的巨噬细胞。用抗Thyl.2 和兔子补体在37。C处理非粘附细胞45分钟来裂解T细胞。剩余B细 胞的纯度通常超过90%。通过此前所述的改进方法来进行B细胞 ELISPOT测试(Le Bon等，2001， Immunity 14:461-7023 )。简而言 之，用PBS中的gpl20将96孔硝基纤维素基平板(Millipore Multiscreen PI)包被过夜。用PBS将平板洗涤六次并用含有10%FBS 的RPMI 1640在37'C封闭2小时。将分离的B细胞接种于孔中(5 x 105细胞/孔)并在37 t: 5% C02温育20小时。然后用PBS 0. 5%吐温 20(Sigma， St.Louis， MO )洗涤六次来除去细胞。加入在含有0. 5%FBS 的PBS中稀释至lyg/ml的生物素化抗小鼠IgG (BDPharmgen)，并 将混合物在37。C温育2小时。将抗生物素蛋白生物素化的酶复合物 (ABC, Vector Laboratories, Inc. Burlingame， CA)力口入另夕卜1 小时。在与AEC ( 3-氨基-9-乙基咔唑；Sigma， St. Louis, M0)反应4分钟后检测抗gpl20 IgG。通过ZellNet Cousulting Inc. (New York, NY)使用自动化ELISPOT阅读系统(Carl Zeiss, Inc. Thornwood NY ) 来评价结果，使用KS ELISPOT 4. 3软件。
BAFF和APRIL的定量RT-PCR分析
通过定量实时PCR来评价转染小鼠BM-DC中的S0CS1的相对表达。 从DC提取总RNA,使用Trizol试剂(Invitrogen, Carlsbad, CA)， 用随机六聚体引物和SuperScipt第一链合成试剂盒(Invitrogen, Carlsbad, CA)来逆转录每个样品1. Ojug的总RNA。在ABI 7900HT序 歹寸检领'J系纟克上(Applied Biosystems, Inc. ， Foster City， CA)在 20p 1重复四份的反应中进行实时5，-核酸酶荧光PCR分析，每个反 应用等量5ng起始RNA材料作为模版。以下引物用于BAFF和APRIL: BAFF,有义5， -TGCTATGGGTCATGTCATCCA-3， ( SEQ ID NO: 17)和反 义5， -GGCAGTGTTTTGGGCATATTC-3， (SEQ ID NO: 18) ; APIRL，有 义-TCACAATGGGTCAGGTGGTATC-3' ( SEQ ID NO: 19 )和反义5， -TGTA AATGAAAGACACCTGCACTGT-3， ( SEQ ID NO: 20 )。从Tapman Rodent 18S 对照试剂(Applied Biosystems, Inc. ， Foster City, CA)获得用 于18S的TaqMan探针、正向和反向引物。PCR参数是对于TaqMan通 用PCR Master Mix试齐'J盒(Applied Biosystems, Inc. ， Foster City, CA)推荐的那些，在分开的试管中进行BAFF、 APRIL和18S反应。将 BAFF和APRIL含量相对于18S rRNA标准化，同时通过比较Ct方法 (Livak等，2001, Methods 25: 402-8 )来计算BAFF或APRIL表达(相 对于模拟转染的、刺激的DC的对照值)。
CTL测试
如本文别处所述的使用标准铬释放测试来测定CD8+ CTL应答，这 测量了体外再次刺激的脾细胞裂解靶细胞的能力。在含有gpU0蛋白 (20|ig/ml)的RPMI-1640中体外再次刺激从免疫小鼠汇集的脾细胞 4-6天。用"Cr铬酸钠溶液将20jig/ml gpl20蛋白脉沖过夜的靶细胞标记90分钟。用恒定数量的靶细胞(1 x IOV孑L )在96孔V-底平板(200 ja 1/孔)中在37X:温育不同数量的效应细胞3小时。收集重复三份培 养物的上清液(100jal)。按照(实验释放-自发释放)/ (最大释放-自发释放)x IOO来计算细胞裂解百分比。
T和B细力包增殖测试
将如本文别处所述分离的CD4+或CD8+T细胞(1 x 106每孔)和B 细胞(1 x 105每孔)在重复三份的96孔平板孔中在完全培养基中培养， 存在或不存在各种刺激物。在培养的第四天，用ljuCi[3H]-胸苷脉沖 细胞16小时。然后收集平板并使用MicroBeta闪烁计数器(TopCount NXT， Packard)测量掺入的[3H]-胸苷。
DC免疫
如本文别处所述的用MOI为5的LV-SOCSl-s iRNA或LV-GFP-s iRNA 转导骨髓来源的DC (BM培养第5天)。 现在描述本实施例所示试验的结果。
DC中S0CS1的沉默增强了 HIV Env特异性抗体应答 首先研究了 SOCSl沉默对DC诱导抗HIV抗体应答能力的作用。将 HIV Env用于该研究，因为其可以诱导细胞应答和中和抗体应答。如 本文别处所述的产生表达SOCSl s iRNA的重组慢病毒栽体 (LV-SOCSl-si謹)和对照栽体(LV-GFP-siRNA) ， SOCSl siRNA具 有下调转染细胞中约90% SOCSl mRNA的能力。用装载重组HIV gpl20 蛋白的LV-S0CS1 -siRNA或LV-GFP-siRNA转导小鼠骨髓(BM)来源 的DC，并用LPS体外成熟。然后用转导的DC以一周的间隔将小鼠组 免疫两次，每次DC免疫后接着体内LPS刺激。基于如本文别处所公开 的可以进一步增强通过SOCSl沉默DC诱导的对抗肿瘤相关抗原的CTL 应答的观察，使用体内刺激。图15A显示了 LV-SOCSl-siRNA-DC引发 了比对照LV-GFP-siRNA-DC显著强烈的gpl20特异性IgM和IgG应答。其特征剖析表示截然不同免疫状态的不同抗体亚类的产生取决于
CD4+T辅助(Th) 1-和Th2-极化细胞因子和Th细胞功能(Allen等， 1997， Immunol. Today 18: 387-92 )。图15B显示了与LV-GFP s iRM-DC 小鼠中相应的亚类相比较，用LV-SOCSl-siRNA-DC免疫的小鼠中所有 IgG亚类中HIV Env特异性抗体滴度的显著增加。Env-特异性抗体亚 类特征剖析显示出IgGl和IgG2a的混合应答，IgGl是Th2应答的产 物，IgG2a是与Thl应答相关的亚类，表明通过LV-SOCSl-siRNA-DC 诱导了 Thl-和Th2-依赖性免疫应答。在重复的实验中获得了相似结 果。没有进行中和测试，因为对于可靠测试HIV中和活性，小鼠不是 合适的物种(Burton等，2004， Nat. Immunol. 5:233-6 )。进一步 观察到S0CS1沉默增强了对其他HIV Env蛋白抹和抗原如卵清蛋白 (OVA)的抗体应答。这些结果证明了通过DC中S0CS1的沉默显著地 增强了包括所有IgG亚类的HIVEnv特异性抗体应答，意味着DC中的 S0CS1在控制抗原特异性抗体应答中的关键作用。
DC中S0CS1的沉默增强了 HIV gpl20特异性CTL应答 进行以下实验来评估S0CS1沉默是否能够增强HIVEnv特异性CTL 应答。将IFNy ELISPOT、胞内细胞因子染色和CTL测试用来测试免 疫小鼠中CD8+ T细胞的功能状态。LV-SOCSl-siRNA-DC小鼠中对抗 gpl20脉沖的靶细胞的CTL活性比LV-GFP-siRNA-DC小鼠中的那些显 著更有效(P^. 01)(图15C)。这些测试中检测的CTL活性是gp120 特异性的，因为来自LV-SOCSl-siRNA-DC小鼠的脾细胞缺乏任何明显 的对抗非gpl20脉沖的靶细胞的CTL活性。相一致地，在 LV-SOCSl-siRNA-DC免疫的小鼠中，检测到每5乂105个CD8+ T细胞 363个IFN y+斑点，与LV-GFP-siRNA-DC小鼠中的191个斑点相比较 (图15D)。用IFN-Y对脾细胞胞内染色也显示出LV-SOCSl-siRNA-DC 小鼠中较高百分比的IFN-Y+ T细胞。合起来看，这些结果证明了 S0CS1沉默的DC免疫的小鼠中对抗HIV Env的平衡且增强的抗体和CTL 应答，表明DC中的S0CS1关键性地调节体液和细胞免疫。S0CS1沉默的DC诱导的混合的、增强的Thl和Th2应答 不希望受到任何特定理论的束缚，鉴于细胞因子在编程Thl对Th2 应答中的作用(MacDonald等，2002， J. Immunol. 168: 3127-30; Gor 等，2003， Nat. Immunol. 4:503-5 ),认为S0CS1沉默可能通过调 节DC引起的细胞因子产生而影响CTL和抗体应答。图16A证明了 LPS 刺激后与GFP-siRNA-DC相比较，LV-SOCSl-siRNA-DC产生的IL-12、 IFN-y和TNF-cc水平的显著增加，这些细胞因子促进了 Thl-极化的应 答。令人感兴趣地，在SOCSl沉默DC中也看到了 IL-4、 IL-6和IL-IO 的显著增加，其促进了 Th2-极化的应答(P<0. 01) 。 SOCSl沉默DC 产生的促Thl-和Th2-细胞因子的较高水平可以解释SOCSl沉默DC诱 导HIV Env特异性CTL和抗体应答的能力的增强。
基于本发明的结果，DC中SOCSl沉默明显促进了抗体和CTL应答。 以下的实验了解通过SOCSl沉默是否也增强了 HIV Env特异性CD4+ Th 应答，其密切参与抗体和CTL应答的诱导。使用CD4+微珠从免疫小 鼠分离CD4+ T细胞并使用各种测试来分析。如图16B中所示的， LV-SOCS1-siRNA-DC小鼠中gpl20特异性CD4+T细胞的频率显著高于 LV-GFP-siRNA-DC小鼠。力-胸苷掺入测试显示出LV-SOCSl-siRNA-DC 小鼠的CD4+T细胞应答gpl20脉冲DC的刺激的增殖比LV-GFP-siRNA DC小鼠的更活跃(图16C)。用gpl20脉沖的DC刺激后从 LV-SOCSl-s iRNA-DC小鼠分离的CD4+T细胞产生的细胞因子谱分析显 示出Thl-极化(IFN-y 、 IL-2和TNFa )和Th2-极化(IL-4和IL-IO) 细胞因子的水平提高(图16D)。这些结果表明SOCSl-沉默的DC诱导 了对抗HIV Env的增强的、混合的Thl和Th2应答，这与图15B中混 合的gpl20特异性IgG亚类谱相一致。
SOCSl沉默的DC增强了 gpl20特异性B细胞激活 已经显示出DC通过产生APRIL (诱导增殖配体)和BAFF (B淋巴 细胞刺激因子，也称为BLyS),直接引发了 B细胞增殖、成熟和类别转换重组，APRIL和BAFF是TNF超家族的成员(Balazs等，2002， Immunity 17: 341-52; Litinskiy等，2002， Nat. Immunol. 3: 822-9; MacLennan等，2002， Immunity 17:235-8 )。因此使用实时RT-PCR 评价了 SOCSl沉默对DC引起的APRIL和BAFF产生的作用。LPS刺激 时LV-SOCSl-siRNA-DC表达比LV-GFP-siRNA-DC水平高的APRIL和 BAFF (图17A)，与S0CS1+DC中BAFF和APRIL增加的表达相一致
(Hanada等，2003， Immunity, 19:437-50 )。
为了测试SOCSl沉默的DC增强gpl20特异性B细胞激活的能力， 使用抗gpl20 IgG特异性B细胞Eli spot测试来直接检测免疫小鼠中 产生抗gpl20 IgG的B细胞的频率。LV-SOCSl-siRNA DC小鼠中产生 抗gpl20 IgG的B细胞的频率显著高于LV-GFP-siRNA DC小鼠中
(P<0. 01)(图17B)。较高百分比的B细胞呈现出激活的表型，该 表型的特征在于与LV-GFP-siRNA-DC小鼠的B细胞相比较， LV-SOCSl-siRNA-DC小鼠中高水平的CD69、 CD40和CD86。此外，纯 化来自免疫小鼠脾脏的B细胞并用各种刺激物刺激。图17C显示出用 抗CD40和IL-4共刺激时，LV-SOCSl-siRNA-DC小鼠的B细胞的增殖 比LV-GFP -siRNA -DC小鼠的B细胞更有活力。令人感兴趣地， LV-S0CS1-siRNA-DC小鼠的B细胞，而不是LV-GFP-siRNA-DC小鼠的 B细胞，仅强烈应答IL-4或抗CD40,表明通过LV-SOCSl-siRNA-DC 的免疫已经体内激活了增加数量的B细胞。还观察到 LV-SOCSl-siRNA-DC小鼠的B细胞应答各种刺激物产生了更高水平的 多种细胞因子，包括IL-6、 IL-12和TNF-oc (图17D)。总而言之， 这些结果表明了 SOCS1沉默的DC产生了增加水平的B淋巴细胞刺激因 子(BAFF和APRIL)和Th2极化细胞因子，导致对HIV Env特异性B 细胞和Th细胞更有效的激活。
SOCSl-沉默的DC诱导了长期HIV Env特异性CTL和抗体应答 已经表明了 DC中的SOCSl沉默增强了初级HIV Env特异性CTL 和抗体应答，进一步评价SOCSl沉默的DC是否可以诱导记忆HIV特异性CTL和抗体应答。图18A显示了用LV-GFP-siRNA-DC免疫的小鼠在 免疫后六个月具有非常低水平的gpl20特异性抗体，而 LV-SOCSl-s iRNA-DC小鼠在它们的血清中仍然保持相当高滴度的 gpl20特异性IgGl和IgG2抗体。加强免疫后一周，LV-S0CSl-siRNA-DC 小鼠显示出强烈的回忆抗体应答，具有抗gpl20 IgGl 2xl()S和抗 gpl20 IgG2 1 x 105的平均滴度，而LV-GFP-siRNA-DC小鼠显示出差的 回忆抗体应答，具有IgGl 3xl(^和igG2 4xl()2的平均滴度。这些数
据表明与GFP-siRNA-DC相比较，S0CS1沉默的DC在IgGl和IgG2a 抗体的滴度方面分别呈现出约64和255倍的增加。
使用ifn-y elispot测试检测gpl20特异性CD8+和CD4+ t细胞 应答来评估记忆HIV特异性CTL和Th的维持。图18B显示了免疫后六 个月时在LV-SOCSl-siRNA DC小鼠中检测到强烈的gpl20特异性CTL 应答，但在LV-GFP-siRM DC小鼠中没有(LV-SOCSl-s iRNA-DC小鼠 中每5 x 105 CD8+T细胞249个IFN y斑点对LV-GFP-s iRNA-DC小鼠中 3个IFN y斑点)。通过加强免疫快速诱导了 LV-SOCSl-s iRNA-DC小鼠 中有力的gpl20特异性CTL应答，但在LV-GFP-siRM DC小鼠中没有
(加强后第7天LV-SOCSl-siRNA-DC小鼠中每5 x 105 CD8+ T细胞446 个IFN y斑点对LV-GFP-s iRNA-DC小鼠中16个IFNy斑点)。CD8+ T 细胞的胞内IFN-y和表面CD44记忆标记的共染色也显示出在免疫后 六个月时与LV-GFP-siRM-DC小鼠相比较，LV-SOCSl-siRNA-DC小鼠 中较高百分比的CD44hi和IFN y + CD8+ T细胞(图18C )。相似地， 免疫后六个月时在LV-SOCSl-s iRNA-DC小鼠中维持并快速诱导gpl20 特异性CD4+Th应答(加强后第7天时LV-SOCSl-siRNA-DC小鼠中每5
x 105个CD4+ T细胞391个IFNy斑点对LV-GFP-siRNA-DC小鼠中37 个IFNy斑点)(图18D)。因此，用S0CS1沉默的DC免疫有效地诱 导了长期HIV Env特异性CTL、 Th和抗体应答。
免疫后长达7个月没有观察到用 gpl20脉沖的 LV-SOCSl-siRNA-DC免疫的小鼠中有明显毒性。免疫小鼠所有主要器 官和组织的组织学分析表明没有病理性炎症。DC-LV-SOCSl-siRNA和模拟DC小鼠中的IgG和抗dsDNA水平相当。这些数据表明gpl20脉冲 的LV-S0CS1-siRNA-DC免疫没有引起小鼠的病理性炎症。
SOCSl沉默的DC对HIV Env介导的免疫抑制的抗性 包括gpl20蛋白的HIV病毒可以抑制DC产生促炎症细胞因子和刺 激T细胞的能力(Fantuzzi等，2004， J. Virol. 78:9763-72 ; Granelli-Piperno 等，2G04 ， Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101: 7669-74; Barron等，2003， J. Infect. Dis. 187:26-37; Pacanowski等，2001 ， Blood 98:3016-21 )。进行以下实验来评价 SOCSl沉默增强的DC激活是否可以克服gpl20蛋白对DC的细胞因子 产生和免疫刺激能力的抑制效果。选择IL-12作为这些实验的代表性 细胞因子，因为发现DC产生的IL-12起着双重作用驱动Thl发展以 及直接发信号给B细胞用于产生体液应答(Dubois等，1998 ， J. Immunol. 161:2223-31; Dubois等，1997， J. Exp. Med. 185:941-51; Skok等,1999， J. Immunol. 163:4284-91 )。
如图19A中所示的，在gpl20蛋白存在下LV-S0CS1-siRNA-DC保 持应答LPS的能力。相反，gpl20蛋白的存在严重损害了 LV-GFP-siRM-DC对LPS刺激的应答。在体内进一步研究SOCSl沉默 的DC对gpl20介导的抑制的易感性。用0VA脉沖的转导的DC免疫小 鼠，用或没用gpl20蛋白体外预处理。预先暴露于gpl20蛋白对 LV-S0CS1-siRNA-DC诱导OVA特异性抗体应答的能力不具有明显效果 (图19B和19C),也没有损害由LV-SOCSl-siRM-DC诱导的OVA特 异性CD8+ CTL和CD4+Th应答(P〉0. 05)(图19D和19E)。然而， 这样的预处理显著降低了 LV-GFP-siRNA-DC诱导OVA特异性抗体和 CTL应答的能力(P<0.05)(图19B至19E)。这些结果表明SOCSl 沉默使得DC对HIV gpl20介导的抑制具有抗性，很可能是由于SOCSl-沉默DC增强的细胞因子产生和过度活化状态(Hannada等，2003， Immunity 19: 437—50 )。
101实施例8:体内DNA接种增强了 HIV特异性抗体和CTL应答 这个实施例证明了用SOCSlsiRNA表达子DNA共免疫显著增强了 HIV DNA接种的功效。该研究代表第一次尝试通过抑制宿主的免疫抑 制剂来引发HIV特异性抗体和CTL应答，这提出了研发更有效HIV疫 苗的新途径。
现在描述该实施例中所示实验中所用的材料和方法。 DNA疫苗接种
如之前本文别处所述的，产生pSuper-SOCSl-siRNA表达载体。为 了产生HIVEnv retrogen表达栽体，首先构建gpl40CF质粒，通过删 除gpl20/gp41切割位点和HIV gpl60的gp41的融合结构域(密码子 使用优化的 JRFL )来促进HIV Env的分泌。所得到的 pCMV/R-gpl40CF-Fc retrogen载体包含与CMV启动子控制下的IgGFc 片段融合的gpl40CF基因。从CHO细胞产生和由NIH AIDS Research and Reference Program提供重组gpl20 (JFRL)蛋白。用Qiagen试剂盒 制备无内毒素DNA,以1 jug/jal的终浓度重悬浮于无内毒素的PBS中
(Sigma, St. Louis, MO-Adrich Corp., St. Louis, MO)，并存储 于-20。C直至用于注射。在预定的接种那天，将50pggpl40CF-FcDNA 或200 " g gpl40CF-Fc DNA (50 jug)和pSuper-SOCSl-s iRNA表达DNA
(150|ig)的混合物i.m.注射至每只小鼠的四头肌中(Hauser等， 2004， Gene Ther. 11: 924—32 ; You等，2001 ， Cancer Resarch 61: 3704-11 )。然后在每次DNA免疫后1 、 3和5天用LPS(30jug/小 鼠)(IP)处理免疫小鼠三次。
现在描述该实施例中所示实验的结果。
通过用SOCS1 siRNA DNA的共免疫增强了 HIV DNA疫苗的功效 SOCS1沉默的DC增强HIVEnv特异性CTL和抗体应答的能力表明 本发明的SOCS1沉默方法在增强HIV DM疫苗接种的功效中可能是有 用的。根据Hauser等，2004， Gene Ther. 11: 924-32和You等，2001，Cancer Research 61:3704-11使用"retrogen"免疫策略，该策略 使用受体介导的胞吞作用来增强DC耙向和抗原的固C呈递。简而言之， 通过框内融合IgG Fc片段和gpl40CF基因来产生gpl40CF retrogen, 其中删除了 gpl20/gp41切割位点和gp41的融合结构域。从 gpl40CF-Fc载体转染的细胞表达和分泌所得到的gpl40CF-Fc融合蛋
—f 。
为了测试S0CS1 siRNA对DNA疫苗接种的作用，将小鼠每周只注 射gpl40CF-Fc DNA或gpl4-CF-Fc DNA和pSuper-SOCSl-siRNA表达 DNA的混合物，持续三周，然后在一周后监测小鼠的HIV Env特异性 免疫应答。用pSuper-SOCSl-siRNA DNA共免疫小鼠中的HIV Env特 异性抗体滴度的升高是明显的(图20A )。通过共注射 pSuper-SOCSl-siRM DNA显著增强了 HIV Env特异性CTL应答，如通 过CTL和ELISPOT测试所证明的(图20B和20C)。此外，通过共注 射SOCSl-siRNA DNA增强了 HIV Env特异性CD4+ Th应答(图20D)。 用细胞因子的胞内染色还显示出pSuper-SOCSl-siRNA DNA共免疫小鼠 中增强的gpl20-特异性CD4+ T细胞应答。这些结果表明由于免疫小 鼠中共转染抗原呈递细胞增强的免疫刺激能力，pSuper-SOCSl-siRM DNA共免疫增强了 HIVDM疫苗接种的功效。因此，在此呈现的S0CS1 沉默策略适用于体外基于DC的和体内的疫苗接种情况。
种方法
技术领域：
本发明的公开内容证明了 DC中负向信号转导调节剂SOCSl的沉默 导致小鼠中HIVEnv特异性抗体和CTL应答的显著增强。观察到S0CS1-沉默的DC诱导的HIV Env特异性抗体和CTL应答都是长效的。此外， 结果证明了用S0CS1 siRNA DM的共免疫显著增强了 HIV DNA疫苗接 种的功效。因此，用S0CS1沉默的DC可以诱导平衡的对抗HIV的记忆 性体液和细胞应答，且这种S0CS1沉默策略适用于治疗性和预防性的 HIV疫苗接种情况。传统上将DC在体液应答诱导中的作用看作是CD4+ Th引发T细胞 和B细胞之间同源相互作用的结果。然而，已经在体外和体内证明了 DC在体液应答刺激中的直接作用(Dubois等，1997， J. Exp. Med. 185: 941-5138; Inaba等，1983， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:6041-5 )。值得注意的，发现DC强烈地增强了 CD40激活的B细胞 的增殖和抗体产生(Dubois等，1997, J. Exp. Med. 185: 941-51 )。 用装载抗原的DC免疫可以诱导保护性体液应答(Flamand等，1994， Eur. J. Immunol. 24:605-10 )。在此的结果证明了 SOCSl沉默的DC 增加了 Th2极化细胞因子以及B淋巴细胞刺激细胞因子(BAFF和 APRIL)的产生，这很可能引起了 SOCSl沉默DC免疫的小鼠中看到的 增强的Th和B细胞激活。这个发现受到之前报道的支持S0CS1+DC 诱导B细胞的异常扩增和自身反应性抗体产生(Hanada等，2003, Immunity, 19:437-50 )。因此，该研究证明了 DC中的SOCSl在控制 HIV特异性抗体应答中的关键作用并意味着SOCSl的沉默可以普遍地 用于加强对抗除HIV Env以外抗原的抗体应答。
该研究的重要发现是S0CS1沉默的DC诱导了平衡的记忆性 HIV-Env特异性抗体和CTL应答，这对于预防或控制HIV感染是理想 的(Burton等，2004， Nat. Immunol. 5:233-6; McMichael等，2003， Nat. Med. 9:874-80; Nabel， 2001， Nature 410: 1002-7; Letvin 等，2002, A謂，Rev. Immunl. 20:73-99; Zolla-Pazner， 2004， Nat Rev. Immunol. 4: 199-210; Imami等，2002， J. Virol. 76:9011-23; Letvin等，2003， Nat. Med. 9:861-6)。不希望受到任何特定理论 的束縛，SOCSl沉默诱导平衡的记忆性体液和细胞应答的机制可能涉 及由SOCSl沉默的DC和gpl20-特异性CD4+ T细胞产生的Thl-和Th2-极化细胞因子混合模式。这些结果与天然产生的对抗许多病原体如病 毒的混合抗体和CTL应答相一致(Allen等，1997, Immunol. Today 18:387-92 )，表明Thl和Th2极化不是相互排斥的(Gor等，2003， Nat. Immunol. 4:503-5; Colonna， 2001， Nat. Immunol. 2:899-900 )。
SOCSl作为多种细胞因子使用的JAK/STAT信号转导途径的反馈抑
104制剂且涉及TLR信号转导途径的直接或间接调节(Baetz等，2004， J. Biol. Chem. 279:54708-15; Gingras等，2004， J. Biol. Chem. 279: 54702-7 )。在此的结果一致地显示出S0CS1沉默的DC应答LPS 引起的多种细胞因子如TNF-ot、 IL-6和IL-12的产生增加。LPS-TLR 信号转导激活了多种NF-KB应答性基因，包括许多炎症细胞因子，其 可以以自分泌和旁分泌方式来起作用(Baetz等，2004， J. Biol. Chem. 279:54708-15; Grohmann等，1998， Immunity 9:315-23; Pan等， 2004, Immunol. Lett. 94:141—51)。鉴于SOCS1涉及间接削弱TLR 信号转导，JAK/STAT途径中关键制动的失能应当允许细胞因子建立自 分泌和/或旁分泌刺激回路，导致细胞因子产生的增强，而不是降低。 在此公开的结果涉及使用细胞因子和细胞因子受体敲除小鼠，表明自 分泌细胞因子刺激回路引起SOCSl沉默DC的细胞因子过度产生。
DC的功能缺陷和耗尽在HIV-感染个体中是常见的，很可能引起渐 进性免疫缺陷。HIV gpl20蛋白可以抑制DC产生促炎症细胞因子和刺 激T细胞的能力(Fantuzzi等，2004， J. Virol. 78:9763-72; Carbonneil等，2004， J. Immunol. 172:7832-40 )。证明了由于增 强的促炎症细胞因子产生和S0CS1沉默DC的过度活化状态，S0CS1沉 默的DC抵抗HIV gpl20介导的抑制(Hanada等，2003, Immunity 19:437-50 )。该发现与治疗性HIV疫苗的研发特别相关，这将用于免 疫抑制的HIV感染个体中(Lu等，2004, Nat. Med. 10:1359-1365 )。
在此所述的疫苗接种策略，代表第一次通过抑制宿主DC中免疫抑 制剂增强抗HIV免疫应答的努力。因为天然免疫在控制HIV-l感染中 是无效的，使宿主的免疫抑制剂失能对产生有效的抗HIV免疫应答可 能是关键的。然而，仅仅HIV特异性免疫应答的增强可能不能引起保 护性HIV抗体和CTL应答的诱导。在这点上，这个策略给予了与目前 可获得疫苗组合免疫的机会，如通过DNA疫苗和SOCS1 siRNA DM的 共同免疫所证明的。使用改进的HIV免疫原和传送系统时(Burton等， 2004, Nat. Immunol. 5: 233-6; Yang等，2002， J. Virol. 76:4634-42 )， 这种疫苗接种方法可以提供新的途径来增强弱的保护性免疫应答或产生更宽和更强烈的应答，不仅对抗显性表位，而且对抗弱免疫原性或 隐藏的但仍然是保护性的表位。总而言之，本发明的公开内容证明了
抑制宿主DC中的信号抑制剂来增强HIV特异性抗体和CTL应答的原 理，要求进一步的研究来确定通过这种策略是否可以在猴子和最终在 人中诱导保护性抗HIV应答。此外，这种S0CS1沉默策略可以用于增 强对抗其他病原体的免疫应答。
实施例9:人S0CS1 siRNA的鉴定和分析
使用计算机程序来选择靶向人S0CS1的siRNA序列 hSOCSl-siRNAl ( CACGCACUUCCGCACAUUC. dT. dT; SEQ ID NO:21 )， hS0CSl-siRNA2 ( UUCCGUUCGCACGCCGAUU. dT. dT; SEQ ID NO:22 )和 hSOCSl-siRNA3 ( GAGCUUCGACUGCCUCUUC.dT.dT; SEQ ID NO: 23)。将 所有目标序列接受NCBI Blast查询来证实缺乏与其他已知基因的同源 性。".dT.dT"的名称指的是就在siRNA目标序列下游的多dT序列。
实施例10:用GenePorter转染人单核细胞-DC
为了研究人SOCSl在人DC调节中的作用，首先鉴定了具有特异性 下调人SOCSl能力的小干扰RNA (siRNA)。使用计算机程序来选择靶 向人SOCSl和293T细胞的s iRNA序列。然后每个合成的人SOCSl-s iRNA 寡核苷酸双链体与flag标记的人SOCSl表达载体以10: 1比例共转染 至293T细胞中，使用GenePorter转染试剂。转染48小时后，如本文 别处所述的收集细胞，并通过蛋白质印迹来分析。
图21A显示了人S0CS1 siRNA有效地下调了人SOCSl表达。通过 乱序的siRNAl寡核苷酸双链体不能下调SOCSl mRNA证实siRNA对人 SOCSl mRNA下调的特异性。因此选择人SOCSl siRMl用于进一步的 研究。通过GenePorter将合成的siRNA双链体转染至源自人单核细胞 的DC中，具有85. 5%的转染效率(图21B )。如通过定量RT-PCR测试 所证实的，与模拟转染DC中的水平相比较，用hSOCSl siRNAl双链体 转染的总DC群中hSOCSl mRNA水平特异性降低约60%(图21C，p<0. 01 )。siRM效率和SOCSl RNA降低与使用合成siRNA双链体耙向总体小鼠 骨髓来源的DC群中小鼠SOCSl的实验中观察到的那些相似。
如本文别处所述的通过定量实时RT-PCR来评价人DC中人SOCSl 的相对表达。使用从Applied Biosystems， Inc., Foster City, CA 预先开发的用于人SOCSl的引物/探针系列(引物，5 ， -TTTTTCGCCCTTAGCGGGAA-3 ' ; SEQIDNO: 24和5 ， -CTGCCATCCAGGTGAAAGC-3， ； SEQIDNO:25;和探针，6FAM-ATGGCCTC GGGACCCACGAG-TAMRA; SEQ ID NO:26 )。
人SOCSl沉默DC的表征
进行下一系列的实验来通过流式细胞分析评估人SOCSl是否调节 DC上共刺激分子的表达。如本文别处所述的评估鼠SOCSl中所用的那 些进行用于人SOCSl的流式细胞分析。观察到hSOCSl-siRNA转染的 DC和对照hSOCSl-s iRNA突变体转染的DC显示出在LPS-诱导的成熟之 前和之后在代表性共刺激分子的表达中只有轻微差异(图22A)，这 与鼠DC中的观察相一致。还检测到hSOCSl-siRNA DC和突变-siRNA DC 上相当水平的MHC-I和II分子。相比之下，观察到hSOCSl-siRNA转 染的DC对LPS刺激比siRNA突变体转染的人DC反应性更高，如通过 显著增加的促炎症细胞因子如IL-12、 IL-6和TNF- oc的分泌所示的(图 22B和22C)。
表达人SOCSl siRNA的重组腺病毒载体的产生
使用 AdEasy 系统(El和E3缺失的 Ad (5); Quantum Biotechnologies Inc., Palo Alto， CA)来构建和产生复制缺陷型 腺病毒。通过将Hl-人-SOCSl-s iRM DNA片段插入AdEasy载体中来构 建穿梭载体Ad-hSOCSl-siRNA (图28 )。通过DNA测序来证实人 SOCSl-siRM的插入。随后才艮据制造商的说明(Quantum Biotechnologies Inc., Palo Alto, CA )产生重组腺病毒Ad-hSOCSl-siRNA。根据制造商的说明(Quantum Biotechnologies Inc.,Palo Alto， CA)在293细胞中产生并滴定重组腺病毒。观察到重组 Ad(5)病毒能够转染人单核细胞来源的DC。
实施例11:通过人S0CS1 siRNA DC引发的MAGE3-特异性CTL应
筌
进行以下实验来研究人S0CS1在调节人DC免疫刺激能力中的作 用。该实施例呈现的结果证明了人SOCSl-沉默的DC对微生物产物的 刺激是超反应性的并具有增强的刺激能力来致敏自身抗原特异性人细 胞毒性T淋巴细胞(CTL)。重要地，人S0CS1沉默的DC，而不是野 生型DC,能够充分激活CTL，该CTL对天然表达抗原的人肿瘤细胞具 有活性的裂解活性。此外，认为人SOCSl沉默的DC致敏CTL的能力很 可能受到IL-12产生和信号转导的S0CS1限制的控制。这些结果表明 人S0CS1在负向调节人DC中的关键作用并意味着这种S0CS1沉默方法
开发用于人患者的更有效肿瘤疫苗的翻译潜能。
现在描述在此公开的实验中所用的材料和方法。
通过Genemed Synthesis Inc. ( South San Francisco， CA， USA) 合成HLA-A2-限制性MAGE3 CTL肽(FLWGPRALV; SEQ ID NO: 27 ) ( van der Bruggen等，1994， European Journal of Immunology 24: 3038-43 ) 和对照H-2Kb-限制性OVA-1 (SII訓KL; SEQ ID NO: 11 )并通过HPLC 纯化至〉95%的纯度。在最终稀释于无内毒素PBS ( Sigma， St. Louis, MO)中之前，将肽溶解于DMSO中。
人S0CS1表达的蛋白质印迹分析
如本文别处所述的用合成的人SOCSl-siRNA寡核苷酸双链体 (21bp)或无关寡聚物双链体和flag标记的人S0CS1表达栽体 (pCMV-hSOCSl)以10: 1的比例来共转染293T细胞，使用GenePorter 试剂。转染后48小时，收集细胞，并接受SDS-PAGE。转移至Hybond-P膜(Amersham, Arlington Heights, IL)后，通过蛋白质印迹分析 样品，使用抗-Flag ( Sigma, St. Louis, MO)或肌动蛋白(Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA)抗体，接着用ECL-Plus试 剂(Amersham, Arlington Heights, IL)检领寸。用Densitometer SI 扫描膜并用 ImageQuant软件(Molecular Dynamics, Piscataway， NJ )来定量SOCSl-1/肌动蛋白条带。将SOCSl条带的强度相对于e肌 动蛋白条带的强度标准化。
人SOCSl表达的定量RT-PCR分析
如本文别处所述的通过定量实时RT-PCR来评价人DC中人SOCSl 的相对表达。
人单核细胞来源的DC的转染和人T细胞的体外致敏 如Schroer等，2003， Clinical Can. Res. 9:4743-4755;和 Schroers等，2004， Methods Mol. Biol. 246:451-9中所述的来产 生并培养源自PBMC的人DC。从HLA-A2+健康捐献者采集肝素化血液。 通过基于PCR-SSP-DNA的程序(The Methodist Hospital, Houston, Texas)进行HLA分型。将PBMC重悬浮于无血清DC培养基中 (CellGenix， Antioch， II)并在湿润的5%C02中37。C温育。在含有 1000IU/ml重组人GM-CSF ( rhGM-CSF; R&D System Inc， Minneapolis, MN)和1000IU/ml rhIL-4 (R&D System Inc, Minneapolis, MN)的 无血清DC培养基中培养粘附于塑料的细胞部分。在第5或第6天，用 120nMsiRNA寡核苷酸转染单核细胞来源的DC，根据制造商的说明使 用GenePorter。然后用MAGE3肽(20 ji g/ml )将转染的DC脉沖过夜。 在0. 5ml补充5°/ AB人血清、rhIL-2 ( 50U/ml )和TNF a (10ng/ml， R&D System Inc， Miineapolis, MN)的RPMI-1640中与5 x 104个MAGE3 脉冲的、转染的DC ( 20: 1)共培养24孔平板每孔中总共1 x 106个人 T细胞。在共培养的第7天用自体MAGE3脉沖的、转染的DC将共培养 的T细胞再次刺激一次。对于一些实验，每三天将抗人IL-12 (P70)抗体(20jig/ml， R&D System Inc, Minneapolis, MN )加入DC和T 细胞的共培养物中。在共培养两周后，将T细胞用于免疫测试。
细胞因子ELISA和酶联免疫斑点(ELISPOT)测试 根据制造商的说明在所示的时间点和使用所示的刺激物使用DC 培养物上清液进行ELISA分析(BD Biosciences, Uncoln Park, NJ ) 来定量各种促炎症细胞因子的水平。如本文别处所述的进行人外周淋 巴细胞的ELISPOT测试。
流式细胞分析
用含有0. 1。/。NaN3和2%FCS的PBS中的FITC或PE mAb将细胞染色。 从BD Biosciences, San Jose， CA购买人CD40、 C廳和CD86特异 性抗体和相配的同种型对照。在FACSCalibur (Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ )流式细月包计上分析染色的细胞。
四聚体染色
在Baylor College of Medicine Tetramer Core Facility (贝 勒医学院四聚体核心机构)(Houston, TX, USA )合成人MAGE3/HLA-A2 四聚体。用抗-hCD8ct-FITC/抗hCD3-PerCP和MAGE3-PE四聚体共同
染色人外周血淋巴细胞或共培养物中的淋巴细胞。根据制造商的说明， 在4。C下进行四聚体染色lh，每106个细胞用1 jag抗CD8ot和1:100 稀释度的MAGE3-PE四聚体。
HLA-A2转基因小鼠的DC免疫
从Jackson实验室(Maine, USA )购买四至六周龄的雌性HLA-A2. 1 转基因小鼠并根据建立的指导飼养于Baylor Col lege of Medicine(贝 勒医学院)(Houston, TX， USA)的无病原体小鼠装置中。如本文别 处所述的，从HLA-A2. 1转基因小鼠制备小鼠BM来源的DC并用M0I 为5的重组慢病毒载体LV-SOCSl-siRNA或LV-GFP-siRNA转导。然后
110用MAGE3肽将DC脉沖20hr，用PBS洗涤三次，用TNFcx ( 500ng/ml， R&D System Inc, Miineapolis, MN)刺激24hr。然后通过后脚垫将 DC注射至HLA-A2转基因小鼠中。在一些小鼠中，在DC接种后的所示 天数腹膜内(i.p.)给予LPS (30jag/小鼠)或重组鼠IL-12 (1 n g/ 小鼠，PeproTech， Inc., Rocky Hill, NJ)。
CTL领'j试
如本文别处所公开的，用标准的铬释放测试来评估CD8+ CTL应答， 这测量了体外再次刺激的脾细胞裂解靶细胞的能力(Huang等，2003， Cancer Res. 63: 73121-9 )。在含有MAGE3肽的RPMI-1640中将从2-3 只免疫小鼠收集的脾细胞体外再次刺激4-6天。用"Cr铬酸钠溶液将 人MAGE3+， HLA-A2+黑素瘤细胞(SK-Mel-37)和对照人MAGE3+， HLA-A2-黑素瘤细胞(NA-6-Mel)在37X:标记90分钟。用恒定数量的靶细胞 (5 x IOV孔)在96孔U底平板中(200|li 1/孔)在37。C温育不同数量 的效应细胞4h。收集重复三份培养物的上清液并分析。按照(实验释 放-自发释放)/ (最大释放-自发释放)xlOO来计算裂解百分比。
现在描述该实施例中所示实验的结果。
人S0CS1沉默的DC引发抗原特异性CTL应答的免疫刺激功效增强 进行下一系列的实验来评估沉默的人S0CS1是否能够增强人DC 引发自身抗原特异性CTL的刺激功效。将源自人MAGE3的HLA-A2限制 性肽(MAGE3是一种已知在成人睾丸和黑素瘤细胞中表达的胚胎肿瘤 抗原(van der Bruggen等，1994， European Journal of Immunology 24:3038-43 ))用作模型人自身抗原。用hS0CSl siRNA寡核苷酸转染 从HLA-A2+健康志愿者的人单核细胞产生的DC，然后用MAGE3肽(20 lig/ml )脉冲过夜。在TNFa (成熟刺激)存在下(lOng/ml, R&D System Inc， Miineapolis, MN )，用5 x 1(T个MAGE3脉冲的、转染的DC( 20: 1 ) 共培养每孔总共1 x 106个自体人T细胞。在共培养的第7天用自体 MAGE3脉冲的、转染的DC将共培养的T细胞再次刺激一次。共培养两周后，将T细胞用于免疫测试。与MAGE3-脉沖的突变-siRNA DC或模 拟DC各自共培养物中仅有的5.4%和4. 3°/ 相比较，用MAGE3肽脉沖的 hS0CSl siRNA转染的DC的共培养物中，13. 9%的CD8+ T细胞对于 MAGE3-四聚体是阳性的(图23A)。来自相同捐献者的未致敏(naive ) (未刺激的)原代人淋巴细胞的四聚体染色显示出低水平的阳性 MAGE3四聚体染色(0. 5°/。的CD8+ T细胞)。相一致地，胞内IFN Y染 色(图23B)显示出与MAGE3肽脉沖的、突变siRNA DC ( 6. 9% IFNY + CD8+ T细胞)或模拟DC ( 5. 7% IFNy + CD8+ T细胞)相比较，hS0CSl siRNA DC显著增强了 MAGE3-特异性CTL应答(11. 18% IFNy+ CD8+ T 细胞)。此外，IFNy ELISPOT测试(图23C )显示出通过hS0CSl siRNA DC激活了增加数量的MAGE3特异性CTL。从HLA-A2+供体的重复实验 显示出相似的结果。与没有用抗原脉冲的DC共培养两周后，大部分的 原代人T细胞死亡。总而言之，这些结果表明了人S0CSl-沉默的DC 具有增强的免疫刺激能力来引发自身抗原特异性CTL。
SCS01限制的IL-12在CTL致敏中的关键作用
由于S0CS1沉默的DC应答微生物产物的刺激产生增加量的 IL-12，这是CTL应答激活中的关键细胞因子(Trinchieri， 2003， Nat. Rev. Immunol. 3:133-46)，且由于IL-12信号转导受到S0CS1的限 制(Eyles等，2002， J. Biol. Chem. 277: 43735-40 )，因此检测了 IL-12在人S0CS1沉默的DC致敏CTL中的作用。因此，每3天将抗人 IL-12抗体加入T细胞和MAGE3脉沖的、转染DC的共培养物中。图23A 至23C显示了使用抗IL-12 (p70)抗体的IL-12抑制消除了 hSOCSl-siRM DC刺激MAGE3特异性CTL的增强能力，如通过四聚体 染色、胞内IFN-Y染色和ELISPOT测试所证明的。
将人源化HLA-A2. 1转基因小鼠用于进一步测试IL-12在S0CS1 沉默DC诱导的增强的CTL应答中的作用。用表达鼠S0CS1 siRNA的重 组慢病毒载体(LV-mSOCSl siRNA)或对照栽体LV-GFP siRNA转导 HLA-A2. 1转基因小鼠BM来源的DC并用A2限制的MAGE3肽脉沖。用TNFoc成熟后，以每周的间隔通过脚垫将转导的DC给予HLA-A2. 1转基 因小鼠两次。每次DC免疫后，用LPS或低剂量重组IL-12细胞因子体 内刺激小鼠三次。由于诱导大量促炎症细胞因子，其中许多受到S0CS1 的调节，并由于S0CS1在调节NF-kB (p65)信号转导中可能的直接 作用(Ryo等，2003， Mol. Cell 12:1413-26)，因此使用LPS。使 用体内IL-12刺激，与MAGE3脉沖的GFP-siRNADC免疫的小鼠中每2
xl(^个T细胞仅有的10个IFNy+斑点相比较，检测到MAGE3脉冲的 S0CS1 siRNA DC免疫的小鼠中每2 x 105个T细胞239个IFNy+斑点
(图24)。体内LPS刺激还优先地增强了由S0CS1-siRNA DC诱导的 CTL应答(SOCSl-siRNA DC小鼠中每2 x 105个T细胞63个IFNy+斑 点对GFP-siRNA-DC小鼠中每2 x 105个T细胞24个IFNy+斑点)(图 24)。然而，对于增强SOCSl-siRNA-DC免疫小鼠中的MAGE3-特异性 CTL应答，IL-12刺激比LPS刺激更有效(P<0. 01) 。 IL-12这种较好 的刺激能力很可能是由于S0CS1通过Jak/Stat途径直接调节IL-12 刺激的能力，以及IL-12对S0CS1-siRNA DC免疫小鼠中已经激活的 CTL的直接作用(Trinchieri， 2003， Nat, Rev. Immunol. 3:133-46 )。 总的来看，这些结果提供了 S0CS1限制抗原呈递细胞中IL-12信号转 导的进一步证据。这些结果还强调了细胞因子信号转导决定基于细胞 因子的肿瘤治疗效力的重要性。
通过人S0CS1沉默的DC而不是通过野生型DC激活的人CTL具有 肿瘤裂解效应功能
为了测定激活的自身胂瘤相关抗原MAGE3特异性的T细胞是否具 有肿瘤裂解效应功能，将天然MAGE3+人肿瘤细胞用作CTL测试的靶细 胞。通过MAGE3脉沖的SOCSl-siRNA DC或突变-siRNA DC激活的人T 细胞容易地杀灭了 MAGE3肽脉冲的、MAGE3+HAL-A2+黑素瘤细胞 (SK-Me卜37)。然而，通过MAGE3脉冲的突变-s iRNA DC激活的人T 细胞对没有用MAGE3脉沖的天然SK-Me卜37细胞只显示出微弱的细胞 裂解活性(图25)。相反，通过MAGE3脉沖的SOCSl-siRNA DC激活的那些T细胞仍然具有强烈的对抗没有用MAGE3脉冲的天然 SK-Me卜37细胞的细胞裂解活性(图25 )。通过抗hIL-12抗体处理显 著损害了与hSOCSl-siRNA DC共培养中的T细胞的肿瘤裂解活性。由 于通过MAGE3脉冲的SOCSl-siRNA DC激活的人T细胞只具有对抗 HLA-A2阴性的、MAGE3+黑素瘤细胞(M-6-Mel)的背景细胞裂解活性， 肿瘤细胞裂解活性由CTL特异性介导。不同供体的重复实验显示出相 似的结果。
为了证实上述的观察，测试了用MAGE3脉沖的S0CS1-siRNA DC 或GFP-siRNA DC免疫的HLA-A2. 1转基因小鼠的T细胞的肿瘤裂解活 性。图26显示了 MAGE3脉沖的、mSOCSl siRNA DC免疫的转基因小鼠 的T细胞具有活性的对抗天然MAGE3+HLA-A2阳性黑素瘤细胞 SK-Mel-37的细胞裂解活性。相反，用MAGE3脉沖的、GFP siRNA DC 免疫的转基因小鼠的T细胞只具有微弱的对抗天然黑素瘤细胞的细胞 裂解活性，与图25中所示的结果相一致。此外，观察到低剂量重组 IL-12的体内刺激显著增强了由S0CS1 siRNA DC但不是GFP-siRNA DC 诱导的CTL应答(图26)。总的来看，在此的结果表明了人S0CS1沉 默的DC具有完全激活CTL的独特能力，该CTL具有对抗天然肿瘤细胞 的活性裂解效应功能，很可能是由于抗原呈递细胞增强的IL-12产生 和信号转导。
通过人S0CS1沉默的DC完全激活了自身抗原特异性人CTL
选的策略通过沉默JAK/STAT信号转导途径的抑制剂来增强人DC的 免疫刺激功效。在此公开的结果证明了人S0CS1在负向调节人DC引发 抗原特异性CTL的免疫刺激能力中的关键作用。人S0CS1沉默的DC 具有完全激活人CTL的独特能力，该CTL具有强烈的对抗天然的、表 达抗原的肿瘤细胞的裂解功能。人S0CS1沉默的DC引发CTL的能力很 可能受到对IL-12产生和信号转导的S0CS1限制的控制。因此，本发 明的公开内容证明了这种普遍适用的S0CS1沉默方法用来研发更有效的肿瘤疫苗的翻译潜能。
本发明的S0CS1沉默方法具有增强由装载肿瘤相关抗原的DC诱导 的抗原特异性免疫应答的能力。在最近十年间，肿瘤免疫学中的主要 进展是鉴定和证实大量的人肿瘤特异性或相关抗原(Van den Eynd等， 1997， Current Opinion in Immunology 9:684-93 )。因此，接种装 载肿瘤相关抗原的S0CS1沉默的DC比阻断CTL上的CTLA4更有吸引力 来诱导抗原特异性抗肿瘤应答。S0CS1沉默DC免疫的使用提供了附加 的治疗益处，在于S0CS1沉默的DC不会引起严重的自身免疫炎症，因 为杂合S0CS1+/—小鼠显示出没有或仅有轻微的自身免疫炎症征象。此 外，S0CS1+小鼠中看到的严重自身免疫炎症不仅需要DC中而且需要 其他免疫细胞世系如T细胞和NKT细胞中S0CS1完全缺乏(Kubo等， 2003， Nat. Immunol. 4: 1169-76; Alexander等，2004, A讓.Rev. Immunol. 22: 503-29; Metcalf等，2003， Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 100:8436-41; Chong等，2003， Immunity 18:475-87; Hanada 等，2003， Immunity 19:437-50; Kinjyo等，2002， Immunity 17: 583-91)。
大量增强肿瘤疫苗功效的努力聚焦于改进肿瘤相关抗原的亲和性 /剂量(信号l)和提高共刺激分子介导的信号2水平(Gilboa， 2004， Nat. Rev. Cancer 4:楊-11; Rosenberg等，2004 ， Nat. Med. 10: 909-15 )。本发明的公开内容显示出人S0CS1沉默的DC引发抗原 特异性CTL的优异能力很可能是由于IL-12增加的产生和信号转导(信 号3)。这个论断基于以下的观察1 )人S0CS1沉默的DC应答微生 物产物的刺激产生增加水平的IL-12; 2) IL-12的抗体阻断损害了人 S0CS1沉默DC的免疫刺激能力；和3)体内给予低剂量的IL-12显著 地增强了由SOCS1沉默的DC而不是由野生型DC诱导的抗原特异性CTL 应答。这些结果得到Eyles， J. L.等对IL-12信号转导的鼠S0CS1调 节的发现(Eyles等，2002， J. Biol. Chem. 277:43735-40 )和本文 别处公开结果的支持。
已经提出细胞因子作为DC提供的激活CTL的第三种信号(Curstinger等，2003， J. Exp. Med. 197:1141-51)。为了激活对 抗外源抗原的免疫应答，同时限制过量的自身免疫激活，细胞因子产 生和信号转导受到密切调节(Darnell等，1994， Science 264: 1415-21 )。细胞因子通常激活JAK,然后其将细胞因子受体的细 胞质结构域磷酸化，形成供转录的信号转导物和激活物(STAT)成员 的停泊位点(Alexander等，2004, A廳.Rev. Immunol. 22:503-29 )。 细^^因子还作为反馈抑制剂上调SOCSl的表达，然后其关闭DC的促炎 症细胞因子产生和信号转导，因此削弱进行中的免疫应答并维持自身 耐受性(Alexander等，2004， A腿.Rev. Immunol. 22:503-29 )。 SOCSl通过其SH2结构域作为假底物抑制剂特异性地结合JAK活化环 并靶向JAK2进行遍在蛋白依赖性的蛋白降解而抑制了 STAT(Kubo等， 2003， Nat. Immunol. 4: 1169-76; Alexander等，2004， A謹.Rev. Immunol. 22:503-29 )。总的来看，在此公开的结果显示了抗原呈递 细胞中受到SOCSl限制的IL-12产生和信号转导在决定CTL应答大小 中的关键重要性。
该研究的重大发现是人SOCSl沉默的DC具有完全激活具有活性裂 解效应功能的自身反应性T细胞的独特能力。在临床和实验室研究中 经常观察到通过DC接种或体外敏化可以激活自身抗原特异性T细胞， 如通过各种免疫测试如四聚体染色和ELISPOT测试所测定的。然而， 尽管这样激活的T细胞可以有效地杀灭人工抗原脉冲的肿瘤细胞或经 遗传修饰表达自身抗原的肿瘤细胞，但它们通常显示出微弱的对抗天 然肿瘤细胞的细胞裂解活性，认为这是目前肿瘤疫苗功效差的主要原 因(Zaks等,1998， Cancer Research 58:4902-8; Yu等，2002， J. Clin. Invest. 110:289-94 )。在此公开的结果表明了完全激活自身 反应性、低亲和性的T细胞并赋予它们对抗天然肺瘤细胞的活性裂解 效应功能可能需要由SOCSl沉默的DC提供的持久而增强的抗原呈递/ 刺激。
实施例12: SOCSl siRNA oligo双链体增强了蛋白免疫为了测试使用S0CS1 siRNA oligo双链体的体内免疫是否可以增 强蛋白免疫，将1) OVA蛋白与BCG免疫诱导的CTL应答与2) S0CS1 siRNA oligo双链体-脂质体和OVA蛋白与BCG共同免疫诱导的CTL应 答相比较。用OVA蛋白和BCG混合物，S0CS1 siRNA oligo双链体-脂 质体与OVA蛋白和BCG的混合物免疫小鼠组，或通过脚垫共注射OVA 蛋白与BCG的混合物和S0CS1 siRNA oligo双链体脂质体，以一周的 时间间隔进行两次。观察到第二次免疫后两周，胞内细胞因子染色和 ELISPOT测试(IFNy )显示出S0CS1 siRNA oligo双链体共免疫的小 鼠中诱导了更有效的OVA特异性CTL应答(图27A和27B)。
实施例13: S0CS1沉默的CTL具有增强的细胞裂解活性 为了研究T细胞中的S0CS1是否在调节CTL活性中起作用，用 S0CS1或突变siRNA ol igo转染从OT-I转基因小鼠(Jackson实验室， Bar Harbor, Maine)分离的具有OVA表位特异性转基因TCR的CD8+ OT-I细胞，4吏用GenePortor。将转染的OT-I细胞用于CTL测试而没 有进一步刺激。观察到与突变siRNA-oligo转染的OT-I细胞相比较， SOCSl-siRNA oligo转染的OT-I对同基因的OVA阳性EG7细胞具有增 强的细胞裂解活性(图29)。该结果表明了 T细胞中的S0CS1沉默增 强了它们的细胞裂解活性。
在此所引用的每项专利、专利申请和出版物的公开内容在此以其 整体通过参考引入本文。
尽管已经参照特定的实施方式公开了本发明，清楚的是本领域的 其他技术人员可以设计出本发明的其他实施方案和改变而不脱离本发 明真实的精神和范围。旨在将所附的权利要求解释为包括所有这样的 实施方案和等同变化。
11权利要求
1. 用于增强免疫细胞的免疫效能的组合物，所述组合物包括细胞因子信号转导抑制因子(SOCS)、含有SH2的磷酸酶(SHP)或活化STAT的蛋白抑制剂(PIAS)中任一种或多种的抑制剂，其中所述抑制剂干扰所述细胞中的负向调节途径。
2. 权利要求1的组合物，其中所述抑制剂选自小千扰RNA( s iRNA )、 微RNA、反义核酸、核酶、编码转显性阴性突变体的表达载体、胞内 抗体、肽和小分子。
3. 权利要求l的组合物，其中所述抑制剂是siRNA。
4. 权利要求3的组合物，其中所述siRNA选自双链寡核苷酸、单 链寡核苷酸和多核苷酸。
5. 权利要求3的组合物，其中所述siRM是化学合成的。
6. 权利要求l的組合物，进一步包括生理学上可接受的载体。
7. 权利要求6的组合物，其中所述生理学上可接受的载体是脂质体。
8. 权利要求1的组合物，其中所述抑制剂是由克隆至表达栽体中 的分离的多核苷酸所编码的。
9. 权利要求8的组合物，其中所述表达载体选自质粒DNA、病毒载体、细菌载体和哺乳动物栽体。
10. 权利要求8的组合物，其中所述表达栽体进一步包括促进所 述分离多核苷酸整合至宿主细胞基因组中的整合信号序列。
11. 权利要求1的组合物，其中所述SOCS选自S0CS1、 S0CS2、 S0CS3、 S0CS4、 S0CS5、 S0CS6、 S0CS7和细胞因子可诱导的含有SH2 结构域的蛋白(CIS)。
12. 权利要求l的组合物，其中所述SHP选自SHP-1和SHP-2。
13. 权利要求l的组合物，其中所述PIAS选自PIAS1、 PIAS3、 PIASx和PIASy。
14. 权利要求1的组合物，进一步包括具有至少一个表位的抗原，其中所述表位能够引发哺乳动物的免疫应答。
15. 权利要求14的组合物，其中所述抗原是由表达载体表达的。
16. 权利要求n的组合物，其中所述抗原是分离的多肽。
17. 权利要求14的组合物，其中所述至少一个表位诱导哺乳动物 的CD4+ T细胞应答。
18. 权利要求14的组合物，其中所述至少一个表位诱导哺乳动物 的CD8+ T细胞应答。
19. 权利要求14的组合物，其中所述至少一个表位诱导哺乳动物 的B细胞应答。
20. 权利要求14的组合物，其中所述抗原与疾病相关。
21. 权利要求20的组合物，其中所述疾病选自感染性疾病、癌症 和自身免疫性疾病。
22. 权利要求20的组合物，其中所述抗原与感染性疾病相关。
23. 权利要求22的组合物，其中所述感染性疾病是由选自病毒、 细菌、真菌和原生动物的致病微生物引起的。
24. 权利要求14的组合物，其中所述抗原是由病毒基因编码的。
25. 权利要求24的组合物，其中所述病毒基因源自选自乙肝病毒、 丙肝病毒、人免疫缺陷病毒、乳头瘤病毒和疱渗病毒的病毒。
26. 权利要求24的组合物，其中所述抗原是由选自乙肝病毒e 抗原基因、乙肝病毒表面抗原基因和乙肝病毒核心抗原基因的病毒基 因所编码的。
27. 权利要求24的组合物，其中所述抗原是由选自人免疫缺陷病 毒Env gpl60基因、Gag基因、Pol基因、Rev基因、Tat基因、Vif 基因和Nef基因的病毒基因所编码的。
28. 权利要求24的組合物，其中所述抗原是由选自乳头瘤病毒 E7基因和乳头瘤病毒E6的病毒基因所编码的。
29. 权利要求25的组合物，其中所述抗原是由源自选自l型单纯 疱渗病毒、2型单纯疱渗病毒、EB病毒、巨细胞病毒、人疱渗病毒6、 人疱渗病毒7和人疱渗病毒8的疱渗病毒的病毒基因所编码的。
30. 权利要求21的组合物，其中所述癌症选自乳癌、宫颈癌、黑 素瘤、肾癌和前列腺癌。
31. 权利要求14的组合物，其中所述抗原是选自超表达的肿瘤相 关抗原、睾丸胂瘤抗原、突变的肿瘤相关抗原、分化肿瘤相关抗原酪 氨酸酶、MART、 trp、 MAGE-1、 MAGE-2、 MAGE-3、 gp100、 HER-2、 Ras 和PSA的肿瘤相关抗原。
32. 权利要求31的组合物，其中所述胂瘤相关抗原选自BCR-ABL、 CASP、 CDK、 Ras、 p53、 HER-2/neu、 CEA、 MUC、 TW1、 PAP、 survivin、 端粒酶、EGFR、 PSMA、 PSA、 PSCA、酪氨酸酶、MART、 TRP、 gp100、 MART、 MAGE、 BAGE、 GAGE、 LAGE/NY-ES0、 RAGE、 SSX-2、 CD19和CD20。
33. 权利要求20的组合物，其中所述疾病选自类风湿性关节炎、 系统性红斑狼疮、多发性硬化、牛皮癣和节段性回肠炎。
34. 权利要求14的组合物，其中进一步包括细胞因子或Toll样 受体(TLR)激动剂。
35. 权利要求34的组合物，其中所述细胞因子或TLR激动剂是由 表达载体表达的。
36. 权利要求34的组合物，其中所述TLR激动剂是分离的多肽。
37. 权利要求34的组合物，其中所述细胞因子是分离的多肽。
38. 权利要求34的组合物，其中所述细胞因子选自IL-12、 TNF a、 IFNoc、 IFNP 、 IFNy 、 IL-7、 IL-2、 IL-6、 IL-15、 IL-21和IL-23。
39. 权利要求1的组合物，进一步其中所述抑制剂抑制对Janus 激酶(JAK)信号转导的抑制。
40. 权利要求1的组合物，进一步其中所述抑制剂抑制对Toll 样受体(TLR)信号转导的抑制。
41. 权利要求l的组合物，进一步其中所述抑制剂抑制对NF-kB信号转导的抑制。
42. 权利要求l的组合物，进一步其中所述抑制剂抑制对抗原受体信号转导的抑制。
43. 用于增强细胞的免疫效能的组合物，所述组合物包括载体，该载体包括编码抑制剂的第一多核苷酸和编码具有至少一个表位的抗 原的第二多核苷酸，其中所述抑制剂抑制所述细胞中细胞因子信号转导的调节剂，其中所述至少一个表位诱导哺乳动物的免疫应答。
44. 权利要求43的组合物，其中所述细胞因子信号转导调节剂选 自S0CS ( S0CSl-7， CIS ) 、 SHP ( SHP-1和SHP-2 )和PIAS ( PIAS1、 PIAS3、 PIASx和PIASy)。
45. 权利要求43的组合物，其中所述抑制剂选自小干扰RNA (siRNA)、微RNA、反义核酸、核酶、编码转显性阴性突变体的表达载体、胞内抗体、肽和小分子。
46. 权利要求43的组合物，其中所述载体选自质粒DNA、病毒载 体、细菌载体和哺乳动物载体。
47. 用于增强细胞的免疫效能的组合物，所述组合物包括载体， 该载体包括编码抑制剂的第 一 多核苷酸和编码细胞因子或TLR激动剂的第二多核苷酸，其中所述抑制剂抑制所述细胞中细胞因子信号转导 的调节剂。
48. 权利要求47的组合物，其中所述第二多核苷酸编码选自以下 的细胞因子IL-12、 TNFoc、 IFNa、 IFN P 、 IFNy 、 IL-7、 IL-2、 IL-6、 IL-15、 IL-21和IL-23。
49. 含有细胞因子信号转导调节剂的抑制剂的细胞。
50. 权利要求49的细胞，其中所述细胞因子信号转导调节剂选自 S0CS(S0CSl-7， CIS)、 SHP(SHP-1和SHP-2)和PIAS(PIAS1、 PIAS3、 PIASx和PIASy)。
51. 权利要求49的细胞，其中所述抑制剂选自小干扰RNA( siRNA)、微RNA、反义核酸、核酶、编码转显性阴性突变体的表达载体、胞内 抗体、肽和小分子。
52. 权利要求49的细胞，其中所述细胞是选自APC、树突细胞、 单核细胞/巨噬细胞、T细胞和B细胞的免疫细胞。
53. 权利要求52的细胞，其中T细胞是细胞毒性T细胞、辅助T 细胞和调节T细胞。
54. 权利要求49的细胞，进一步包括具有至少一个表位的抗原， 其中所述表位能够引发哺乳动物的免疫应答。
55. 权利要求49的细胞，进一步包括表达载体，该表达载体包括 编码细胞因子的多核苷酸。
56. 产生沉默细胞的方法，该方法包括将细胞接触细胞因子信号 转导调节剂的抑制剂。
57. 权利要求56的方法，其中所述细胞因子信号转导调节剂选自 S0CS(S0CSl-7， CIS)、 SHP(SHP-1和SHP-2 )和PIAS ( PIAS1 、 PIAS3、 PIASx和PIASy)。
58. 权利要求56的方法，其中所述抑制剂选自小干扰RNA( s iRM )、 微RNA、反义核酸、核酶、编码转显性阴性突变体的表达载体、胞内 抗体、肽和小分子。
59. 产生经沉默和脉冲的细胞的方法，该方法包括将细胞接触细 胞因子信号转导调节剂的抑制剂并进一步将所述细胞接触具有至少一 个表位的抗原，其中所述表位能够引发哺乳动物的免疫应答。
60，权利要求59的方法，其中所述细胞因子信号转导调节剂选自 S0CS(S0CS1-7， CIS)、 SHP(SHP-l和SHP-2)和PIAS(PIAS1、 PIAS3、 PIASx和PIASy)。
61. 权利要求59的方法，其中所述抑制剂选自小干扰RNA( s iRNA )、 微RM、反义核酸、核酶、编码转显性阴性突变体的表达载体、胞内 抗体、肽和小分子。
62. 引发哺乳动物免疫应答的方法，该方法包括将含有细胞因子信号转导调节剂的抑制剂的组合物给药于有此需要的哺乳动物。
63. 权利要求62的方法，其中所述细胞因子信号转导调节剂选自 S0CS(S0CS1-7， CIS)、 SHP(SHP-1和SHP-2)和PIAS(PIAS1、 PIAS3、 PIASx和PIASy)。
64. 权利要求62的方法，其中所述抑制剂选自小干扰RNA( s iRM )、 微RNA、反义核酸、核酶、编码转显性阴性突变体的表达载体、胞内 抗体、肽和小分子。
65. 引发哺乳动物免疫应答的方法，该方法包括将含有沉默细胞 的组合物给药于有此需要的哺乳动物，其中所述沉默细胞包括细胞因 子信号转导调节剂的抑制剂。
66. 权利要求65的方法，其中所述细胞因子信号转导调节剂选自 S0CS( S0CS1-7, CIS)、 SHP(SHP-l和SHP-2)和PIAS(PIAS1、 PIAS3、 PIASx和PIASy )。
67. 权利要求65的方法，其中所述抑制剂选自小千扰RNA( siRNA)、 微RNA、反义核酸、核酶、编码转显性阴性突变体的表达载体、胞内 抗体、肽和小分子。
68. 权利要求65的方法，其中在将所述沉默细胞给药于有此需要 的哺乳动物之前将所述沉默细胞在体外接触抗原。
69. 权利要求65的方法，其中在将所述沉默细胞给药于有此需要 的哺乳动物之后将所述沉默细胞在体内接触抗原。
全文摘要
本发明涉及在抗原呈递细胞如树突细胞中通过细胞因子信号转导调节剂来调节抗原呈递。本发明提供了通过调节细胞因子信号转导调节剂如SOCS(SOCS1-7，CIS)、SHP(SHP-1和SHP-2)和PIAS(PIAS1、PIAS3、PIASx和PIASy)来调节抗原呈递的方法。本发明提供了疫苗和疗法，其中通过调节细胞因子信号转导调节剂来增强抗原呈递。本发明还提供了在依赖于自身肿瘤抗原呈递的肿瘤疫苗接种方法中破坏自身耐受性的机制。
文档编号A61K48/00GK101437834SQ200580030987
公开日2009年5月20日 申请日期2005年6月23日 优先权日2004年7月19日
发明者K·C·艾沃-卡布勒, 蕾 沈, 陈思毅, 黄雪芬 申请人:贝勒医学院