专利名称：Na的制作方法
技术领域：
本发明是有关于一种丹参酚酸B镁的异构物、前体、衍生物、其医药上可接受的盐类或其组合物及其用途，特别是有关于其作为抑制负责细胞Na+/K+主动运输的Na+/K+-ATP酶的用途。
背景技术：
传统上，各种充血性心衰竭、心因性休克及心律不整的治疗主要是利用乌本苷(ouabain)、地高辛(digoxin)等强心配醣体制剂来治疗。这类强心剂的作用机转为抑制心肌细胞Na+/K+-ATP酶的活性，进而抑制细胞的Na+/K+主动运输需伴随的磷酸根水解，减少钠、钾离子通过心肌细胞，使细胞内的Na+浓度增高，导致升高钠钙交换效率并使内流的钙离子增多。因此，可加强心肌收缩，达到强心的作用，并且可降低传导速率及延长房室结(AV node)的有效不反应期。
然而，由于强心配醣体具有抑制Na+/K+-ATP酶的功能，直接影响细胞的Na+/K+主动运输，因此在急性过量投药后会导致低血钾症，引发心率不齐、心搏过速及心室纤维颤动等症状。而毛地黄的药物治疗最主要的问题，在于其具非常狭小的治疗剂量指数(therapeutic index)，因此药物治疗浓度与中毒时的药物血中浓度并没有明显的界线，其治疗剂量通常因人而异。其中，老年人、心脏病或肾功能不佳者，是中毒的高危险群。因此，使用强心配醣体药物时必须找出最适当的剂量，否则一不小心就会造成严重的中毒发生，甚至可能致命。
丹参为中国传统的活血化瘀药物，神农本草经中将丹参列为“上品”，其意为适合长期服用且无毒性作用。近年来的研究发现丹参中主要的有效成分的一为丹参酚酸B(Salvianolic acid B或magnesium lithospermate B、magnesium tanshinoate B)，为一种抗氧化剂，可促进新血管内膜细胞的凋亡，防止内膜增厚。此外，丹参亦具有增加血红细胞膜表面电荷，防止血红细胞聚集，降低血液粘滞度等保护心血管统的作用。因此，丹参目前被广泛使用于一般保健及疾病治疗上。
发明内容
本发明公开一种丹参酚酸B镁(MLB)作为细胞Na+/K+-ATP酶抑制剂的新用途，解决传统强心配醣体药物的治疗剂量指数狭小，容易造成中毒症状的问题。
依照本发明的较佳实施例，分别公开了利用大脑皮质及心肌细胞膜粗萃物来测试MLB抑制Na+/K+-ATP酶活性的结果。随着丹参酚酸B镁的剂量愈高，测量到的磷酸根浓度愈低，显示其抑制ATP水解的能力与丹参酚酸B镁的剂量成正比。根据此成比例的结果可推定丹参酚酸B镁具有抑制细胞Na+/K+-ATP酶活性的作用，可作为Na+/K+-ATP酶抑制剂。
依照本发明的另一较佳实施例，公开了各浓度下乌本苷(ouabain)或丹参酚酸B镁对Na+/K+-ATP酶的抑制效率的差异。结果显示，丹参酚酸B镁与强心配醣体乌本苷对于细胞Na+/K+-ATP酶具有一致的抑制效应。即随着Na+/K+-ATP酶抑制剂(丹参酚酸B镁或乌本苷)剂量愈高，其抑制ATP水解的能力愈强。
由上述本发明较佳实施例可知，由丹参酚酸B镁制成的保健食品或医药组合物可具有与强心配醣体等效的功能，在医药上可取代强心配醣体的强心、利尿的用途，却不具有强心配醣体使用上的容易发生中毒的危险性。
为了使本发明的目的及优点更加容易了解，在下文中配合附图及文字叙述，说明本发明的实施例。
为让本发明的上述和其它目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，所附图式的详细说明如下图1显示不同浓度的丹参酚酸B镁对大鼠大脑皮质细胞的Na+/K+-ATP酶活性抑制效果；图2为比较各浓度下乌本苷(ouabain)或丹参酚酸B镁对Na+/K+-ATP酶的抑制效率的差异；图3是丹参酚酸B镁与强心配醣体类的分子结构的比较；
图4是利用大脑皮质细胞膜粗萃物来测试丹参酚酸B镁抑制Na+/K+-ATP酶活性的结果；图5是利用心肌细胞膜粗萃物来测试丹参酚酸B镁抑制Na+/K+-ATP酶活性的结果。
具体实施例方式
本发明公开了丹参酚酸B镁可作为细胞的Na+/K+-ATP酶抑制剂的新用途。图1显示不同浓度的丹参酚酸B镁对大鼠心肌细胞的Na+/K+-ATP酶活性抑制效果，其实验操作步骤如下以三个月龄的公大鼠(Spraque-Dawley；NarllSD)为实验动物，并饲养于不含病原体的环境下。饲养期间除提供实验动物专用的饲料(RodentLaboratory Chow 5001，Purina，MO)及自来水饮用外，并给予人道的对待。最后，牺牲实验动物，并于完全除血后直接取得其大脑皮质(brain cortex)及心肌组织。
接下来，于4℃下分离大鼠的脑及心肌细胞膜样本。再将大鼠脑细胞或心肌细胞悬浮于10到20倍体积的0.32M蔗糖溶液中(含有5mM4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid(HEPES)及1.0mMEDTA，pH7.5)进行均质化。然后，此大脑皮质细胞均质物或心肌细胞均质物在离心力17000×g下离心30分钟，以得到细胞膜粗萃物。
接着，清洗细胞膜粗萃物二次，并再悬浮于0.32M蔗糖溶液中，用以进行由0.3、0.8及1.0mM所组成的连续蔗糖浓度梯度离心，并在离心力63000×g下离心1小时。最后收集介于浓度梯度0.8与1.0mM的区间的细胞膜，并于2小时内进行Na+/K+-ATP酶的酵素活性分析。
细胞的Na+/K+-ATP酶活性量测借助量测ATP水解产生的无机磷酸根(Pi)的数量来测量细胞的Na+/K+-ATP酶活性。
首先，将商品化的Na+/K+-ATP酶(购自Sigma公司；来源为猪大脑皮质)或自行纯化的Na+/K+-ATP酶(来源为大鼠大脑皮质或心肌细胞膜)分别混入反应混合物(3mM ATP，5mM MgCl2，80mM NaCl，20mM KCl，40mM Tris-HCl，pH7.4)中。经过15分钟后，以200微升(μl)的30％(W/V)三氯醋酸(trichloroacetic acid)终止反应。
接着，依照Goldberg等人所述的方法，于6000转数(rpm)下离心约15分钟后，取500μl的上清液，以分光光度计来量测磷酸根(Pi)数量。Na+/K+-ATP酶的活性以每小时中每毫克Na+/K+-ATP酶作用下所产生的磷酸根的微摩尔(μmol)来表示。
蛋白质含量以一购自Sigma公司的Bradford protein assay kit来定量。不同浓度下乌本苷(ouabain)或丹参酚酸MLB对Na+/K+-ATP酶的抑制效率，在商品化的Na+/K+-ATP酶或自行纯化的大鼠细胞Na+/K+-ATP酶混入反应混合物前10分钟，于37℃条件下观察。
请参照图1，横轴为加入反应混合物的丹参酚酸B镁的浓度，纵轴为磷酸根(Pi)的浓度。如图1所示，随着加入的丹参酚酸B镁剂量增加(由0mg到10mg)，所量测到的磷酸根(Pi)浓度持续减少，显示丹参酚酸B镁剂量愈高，其抑制ATP水解的能力愈强。由该成比例的结果可推定丹参酚酸B镁具有抑制Na+/K+-ATP酶活性的作用，可作为Na+/K+-ATP酶抑制剂。
由图1的结果发现，丹参酚酸B镁具有与强心配醣体类似的作用机制，即抑制Na+/K+-ATP酶活性。因此，图2为比较各浓度下乌本苷(ouabain)或丹参酚酸MLB对Na+/K+-ATP酶的抑制效率的差异。结果显示，丹参酚酸B镁具有与强心配醣体乌本苷一致的抑制效应，即随着Na+/K+-ATP酶抑制剂(丹参酚酸B镁或乌本苷)剂量愈高，其抑制ATP水解的能力愈强。
请参照图3，绘示丹参酚酸B镁与强心配醣体类的分子结构。强心配醣体310的结构以固醇类的环戊氢菲环化合物及至少一个糖基所构成。丹参酚酸B镁320的结构为以金属离子(M)为中心的结构。根据图2的结果，显示丹参酚酸B镁对于Na+/K+-ATP酶活性具有与强心配醣体乌本苷一致的抑制效应，鉴于酵素的活化借助钥匙/锁模式(key and lock)，推定丹参酚酸的结构在Na+/K+-ATP酶水解ATP的机制中扮演与强心配醣体结构相同的角色，即利用形成相似的构形或借助分子间的引力使Na+/K+-ATP酶不活化。
依照本发明的较佳实施例，丹参酚酸B镁320的中心离子M可为金属离子，其中以二价金属离子为较佳，例如镁、铁、锰、钙、锌、铜或钴离子。此外丹参酚酸B镁320的官能基支链R可以为-H、-OH、烷基或上述的任意组合。
请参照图4及图5，利用不同器官的细胞膜粗萃物来测试丹参酚酸B镁抑制Na+/K+-ATP酶活性的效果。图4利用大脑皮质细胞膜粗萃物来测试丹参酚酸B镁抑制Na+/K+-ATP酶活性的结果，其中横轴为加入反应混合物的丹参酚酸B镁的浓度，纵轴为磷酸根(Pi)的浓度。结果如图4所示，随着Na+/K+-ATP酶抑制剂(丹参酚酸B镁)剂量愈高，磷酸根的浓度愈低，显示其抑制ATP水解的能力与丹参酚酸B镁的剂量成正比。因此，丹参酚酸B镁具有抑制大脑皮质细胞膜的Na+/K+-ATP酶的能力。
图5利用心肌细胞膜粗萃物来测试丹参酚酸B镁抑制Na+/K+-ATP酶活性的结果，其中横轴为加入反应混合物的丹参酚酸B镁的浓度，纵轴为磷酸根(Pi)的浓度。结果呈现与图4一致的结果，随着Na+/K+-ATP酶抑制剂(丹参酚酸B镁)剂量愈高，磷酸根的浓度愈低，显示其抑制ATP水解的能力与丹参酚酸B镁的剂量成正比。因此，丹参酚酸B镁具有抑制心肌细胞膜的Na+/K+-ATP酶的能力。
根据上述实验结果，证明丹参酚酸B镁具有抑制心肌细胞膜Na+/K+-ATP酶活性的作用，因而会产生减少钠、钾离子通过心肌细胞，并使内流的钙离子增多的生理效应。因此，丹参酚酸B镁具有与强心配醣体相同的作用机转及效果，即加强心肌收缩，达到强心、利尿的用途。
依照本发明的较佳实施例，丹参酚酸B镁可用于治疗下列的疾病，例如充血性心脏衰弱、心率不齐、心房纤维颤动心房扑动、阵发性上心室搏动过速高血压、水肿以及与上述疾病进展有关的病症。
此外，本发明公开丹参酚酸B镁具有与强心配醣体等效的用途，可于有效剂量下达到强心、利尿的用途，因此可提供取代强心配醣体的另一选择，发展为保健食品或药物。
依照本发明的较佳实施例，丹参酚酸B镁及其衍生物的结构可取代强心配醣体或其它固醇类药物的环戊氢菲环化合物结构，达到等效的作用。其中，丹参酚酸B镁及其衍生物包含其前体或其衍生物、前体的异构物，及其医药上可接受的盐类。
依照本发明的较佳实施例，组合物可以丹参酚酸B镁为其有效成分，用于抑制Na+/K+-ATP酶活性的用途。丹参酚酸B镁于此组合物中的形式可包含其医药可接受的盐类、溶剂化物、其盐类的溶剂化物、多晶形或前药。此外，以丹参酚酸B镁为有效成分制成的组合物可搭配食品或医药上容许的载体，例如医药可接受性辅剂、稀释剂、赋形剂或上述的任意组合。
由上述本发明较佳实施例可知，由丹参酚酸B镁制成的保健食品或医药组合物可具有与强心配醣体等效的功能，可于有效剂量下达到抑制细胞Na+/K+ATP酶活性的作用，在医药上可取代强心配醣体的强心、利尿的用途，却不具有强心配醣体使用上的容易发生中毒的危险性。
虽然本发明已以一较佳实施例公开如上，然其并非用以限定本发明，任何本领域的技术人员，在不脱离本发明的构思和范围内，当可作各种的改变与润饰，因此本发明的保护范围当以权利要求所界定者为准。
权利要求
1.一种丹参酚酸B镁的异构物、前体、衍生物或其医药上可接受的盐类作为Na+/K+-ATP酶抑制剂的用途，其特征在于可抑制磷酸根水解，以抑制细胞内外的Na+/K+交换，并使细胞内的钙离子增加。
2.一种细胞膜的Na+/K+-ATP酶抑制剂，以及其衍生物、前体和衍生物、前体的异构物，其具有如下的基本结构 其中该R为-H、-OH、烷基或上述的任意组合；该M为金属离子。
3.一种抑制Na+/K+-ATP酶活性的组合物，以具有权利要求2所述的结构的化合物或其前体、衍生物或上述的衍生物、前体的异构物的其中之一为有效成分。
4.如权利要求3所述的抑制Na+/K+-ATP酶活性的组合物，其中该有效成分包含其医药可接受的盐类、溶剂化物、该盐类的溶剂化物、多晶形或前药。
5.如权利要求3所述的抑制Na+/K+-ATP酶活性的组合物，进一步包含食品或医药上容许的载体，该载体至少包含医药可接受的辅剂、稀释剂、赋形剂或上述的任意组合。
6.如权利要求3所述抑制Na+/K+-ATP酶活性的组合物，其中该组合物为医药组合物或保健食品。
7.如权利要求3所述抑制Na+/K+-ATP酶活性的组合物，其用于制备强心药。
8.如权利要求3所述抑制Na+/K+-ATP酶活性的组合物，其用于制备利尿药。
9.如权利要求3所述抑制Na+/K+-ATP酶活性的组合物，其用于制备治疗下列疾病的药物a)充血性心脏衰弱；b)心率不齐，包含心房纤维颤动、心房扑动、阵发性心室搏动过速；c)高血压；d)水肿；e)冠心病，包含心绞痛、心肌梗塞；以及与上述疾病进展有关的病症。
10.一种利用环戊氢菲环化合物性质的药物的衍生结构，其特征在于用如权利要求2所示的化合物来取代具有环戊氢菲环化合物性质的药物的环戊氢菲环结构。
全文摘要
一种丹参酚酸B镁(magnesium lithospermate B；MLB)的异构物、前体、衍生物、其医药上可接受的盐类或其组合物作为Na
文档编号A61P9/04GK101084887SQ20061009157
公开日2007年12月12日 申请日期2006年6月8日 优先权日2006年6月8日
发明者靳子蓉, 陈怡菁, 曾志正 申请人:杰升国际科技股份有限公司