专利名称：具有抗流感病毒的含CpG单链脱氧寡核苷酸的制作方法
技术领域：
本发明涉及系列的人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸，特别是涉及对流感病毒引起的人流感等呼吸道感染性疾病有治疗和预防作用的人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸，以及用人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸治疗和预防由流感病毒引起的人流感等呼吸道感染技术方法和技术设想。
背景技术：
流感病毒是引起人流感的病原体。在1918-1919年，全世界有两千万人死于流感病毒的流行(Patterson，K.D.&Pyle，G.F.(1991)Bull.Hist.Med.65，4-213)。流感病毒如此猛烈和难于控制与其本身下述特点密切相关(1)在空气传播；(2)不断变化抗原性(antigenic drift)逃逸已形成的保护性免疫(Parvin，J.D.，Moscona，A.，(1986)J.Virol.59，377-383；Webster，R.G.，(1982)Nature296，115-121)(3)通过不同株流感病毒RNA可在同一感染细胞内交互重组周期性产生新的突变体(Webster，R.G.，(1992)Microbiol.Rev.56，152-179)。
接种疫苗和应用抗病毒药物是防治流感病毒的两类主要方法(Bridges，C.B.，Fukuda，K.，Cox，N..J.&Singleton，J.A.(2001)Morbid.Mortal.Wkly.Rep.50，1-44)，但事实证明，这两类方法均不能有效地控制流感的流行(Webby，R.J.&Webster，R.G.(2001)Philos.Trans.R.Soc.London 356，1817-1828)。在易感人群，接种疫苗的短期(半年)保护率约为39％(Fukuda，K.，N.J.(1999)Morbid.Mortal.Wkly.Rep.48，1-28，Castle，S.C.(2000)Clin.Infect.Dis.31，578-585)。由于流感病毒抗原[血细胞凝集素(HA)和神经酰胺酶(NA)]性不断变化，现行的疫苗几乎每年都要重新改构。由于副作用较大和新的抗药流感病毒株不断出现，一些获准抗流感病毒药物的效果也不理想(Luscher-Mattli，M.(2000)Arch.Virol.145，2233-2248)。
近年来的研究表明，多种具有CpG结构的细菌和病毒DNA对人的免疫系统均为危险的信号，可激活多种免疫细胞启动机体的抗病毒机制。CpG是由胞嘧啶和鸟嘌呤通过磷酸连接成的二核苷酸，C代表胞嘧啶，G代表鸟嘌呤，p代表磷酸。进一步的研究表明，含CpG的人工合成的脱氧核糖核酸寡核苷酸(CpG ODN)也可激活多种免疫细胞启动机体的抗病毒机制。
在小鼠和豚鼠阴道应用CpG ODN可提高小鼠抵御致死量HSV-2病毒攻击的能力(Richard B.Pyles et al.Journal of Virology，November 2002，Vol.76，No.22 p.11387-11396)。给小鼠应用CpG ODN可减少其呼吸道合胞病毒(RSV)的荷量(Cho JY，et al.J Allergy ClinImmunol 2001 Nov；108(5)697-702)。给感染弗兰德病毒(一种鼠类白血病病毒)的小鼠应用CpG ODN可明显减低小鼠血中的病毒载量(Anke R.M.Olbrich，et al.Journalof Virology，November 2002，Vol.76，No.22 p.11397-11404)。给正常C57BL/6小鼠于病毒攻击前2天静脉注射CpG ODN，然后用正常致死量的单纯疱疹病毒2型(HSV-2)静脉攻击，结果发现CpG ODN可使小鼠阴道分泌物中病毒滴度明显降低并刺激生殖道粘膜快速产生的IFN-γ、IL-12和IL-18等保护性细胞因子(Harandi AM，et al.J Virol 2003；77(2)953)。
发明内容
发明概述本发明的目的之一是提供系列人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸特别是对可刺激人外周血细胞产生抗流感病毒的人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸。它们由含一个或多个CpG的寡核苷酸单链DNA分子构成，其磷酸二酯键可以是部分硫化的，全部硫化的，也可以是未硫化的。优选地，本发明的人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸具有SEQ ID NO1-5所示的序列。
本发明的目的之二是提供本发明的人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸的抗流感病毒作用。
本发明的目的之三是提供本发明的人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸对流感病毒毒感染引起的流感等人呼吸道的传染性疾病的治疗和预防的作用。
本发明的目的之四是提供用人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸治疗和预防由流感病毒感染引起的流感等人呼吸道的传染性疾病的技术方法和设想。
另外，需要指出的是，在本申请的上下文的公开内容的基础上，本发明的其它具有实质性特点的方面和创造性的有益效果对本领域的普通技术人员来说是可以直接推知的。
图-1、96孔板加样表注释DVAX-1对照人工合成的含GpC单链脱氧寡核苷酸，其序列为5’-TgCTTgggTggCAgCTgCCAgggggg-3’培养液对照未加人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸的培养上清正常Vero细胞未加流感病毒流感病毒未加细胞培养上清，加流感病毒DVAX-1，3，4，5，6分别代表代号为DVAX1，3，4，5，6的人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸IFN干扰素α，长春生物制品研究所C，D，E1-10；F，G，H3-4为一献血员的外周血单个核细胞诱导上清。
C，D，E 11-12；F，G，H5-12为另一献血员的外周血单个核细胞诱导上清。
图-2、人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸刺激人外周血单个核细胞培养上清对流感病毒攻击Vero细胞的保护作用结果表明，人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸DVAX-1，DVAX-3，DVAX-4，DVAX-5和DVAX-6(SEQID NO1，3-6)具有刺激人外周血单个核细胞产生抗流感病毒物质的作用，这些物质对流感病毒攻击Vero细胞具有明确的的保护作用；人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸DVAX-1，DVAX-3，DVAX-4，DVAX-5和DVAX-6(SEQ ID NO1，3-6)对流感病毒毒感染引起的流感等人呼吸道的传染性疾病的治疗和预防的作用。
具体实施例方式
在本发明的上下文中，所使用的术语除非另外说明，一般具有本领域的普通技术人员通常理解的含义。特别地，下列术语具有如下的含义优选地，本发明的含CpG单链脱氧寡核苷酸具有如下所示的序列DVAX-15’-TCgTCgggTgCgACgTCgCAgggggg-3’DVAX-35’-TCgTCgTTTCgTCgTTgggg-3’DVAX-45’-TCgACgTTCgTCgTTCgTCgTTC-3’DVAX-55’-TCggggACgATCgTCgggggg-3’DVAX-65’-ggATCgATCgATCgATgggggg-3’其中的磷酸二酯键可以是部分硫化的，全部硫化的，也可以是未硫化的。
本发明的CpG单链脱氧核苷酸可通过已知的方法生产，例如采用固相亚磷酰胺三酯法进行生产。以下的实施例详细地例举了一种生产本发明的人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸的方法。
在预防和治疗由SARS病毒感染引起的人流感等呼吸道的传染性疾病时，这些人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸的一次用药剂量为1-5000微克。
本发明的人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸的使用方式包括单独应用、两种或两种以上联合应用、与治疗或预防流感病毒引发的感染性疾病的药物或疫苗混合使用、与治疗和预防由流感病毒感染病毒引起的感染性疾病的药物或疫苗通过交联剂共价偶联使用。
应用方式包括粘膜(包括呼吸道、消化道和泌尿生殖道黏膜)表面应用，滴眼，皮下、肌肉注射应用，胃肠应用，腹腔应用，静脉注射等常用的方式应用。
下面结合具体的制备实施例和生物学效果实施例，并参照附图进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
实施例在如下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，例如合成采用固相亚磷酰胺三酯法。在如下实施例中，所用试剂的来源、商品名和/或有必要列出其组成成分者，均只标明一次。在其后所用相同试剂如无特殊说明，不再赘述上述内容。
实施例1人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸的制备采用固相亚磷酰胺三酯法合成人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸。
1、试剂和材料三氯乙酸(Trichloroacetic Acid，TCA)、可控多孔玻璃(Controlled Pore Glass)、DMT(二甲氧基三苯甲基)、四氮唑活化剂、乙酸酐、N-甲基咪唑、A、T、C、G四种核苷酸单体、ABI DNA合成仪、高效液相色谱层析仪等2、方法脱保护基用三氯乙酸(Trichloroacetic Acid，TCA)脱去连结在可控多孔玻璃(Controlled Pore Glass)上的核苷酸的保护基团二甲氧基三苯甲基(DMT)，获得游离的5’-羟基端，以供下一步缩合反应。
活化将亚磷酰胺保护的核苷酸单体与四氮唑活化剂混合并进入合成柱，形成亚磷酰胺四唑活性中间体(其3’-端已被活化，但5’-端仍受DMT保护)，此中间体将与可控多孔玻璃上的已脱保护基的核苷酸发生缩合反应。
连接亚磷酰胺四唑活性中间体遇到可控多孔玻璃上已脱保护基的核苷酸时，将与其5’-羟基发生亲合反应，缩合并脱去四唑，此时合成的寡核苷酸链向前延长一个碱基。
封闭缩合反应后为了防止连在可控多孔玻璃上的未参与反应的5’-羟基在随后的循环反应中被延伸，常通过乙酰化来封闭此端羟基，一般乙酰化试剂是用乙酸酐和N-甲基咪唑等混合形成的。
氧化缩合反应时核苷酸单体是通过亚磷酯键与连在可控多孔玻璃上的寡核苷酸连接，而亚磷酯键不稳定，易被酸、碱水解，此时常用碘的四氢呋喃溶液将亚磷酰转化为磷酸三酯，得到稳定的寡核苷酸。
经过以上五个步骤后，一个脱氧核苷酸就被连到可控多孔玻璃的核苷酸上，同样再用三氯乙酸脱去新连上的脱氧核苷酸5’-羟基上的保护基团DMT后，重复以上的活化、连接、封闭、氧化过程即可得到-DNA片段粗品。最后对其进行切割、脱保护基(一般对A、C碱基采用苯甲酰基保护；G碱基用异丁酰基保护；T碱基不必保护；亚磷酸用腈乙基保护)、纯化(常用的有HAP，PAGE，HPLC，C18，OPC等方法)、定量等合成后处理即可得到符合实验要求的寡核苷酸片段。
未硫化的CpG单链脱氧寡核苷酸在ABI 3900 DNA合成仪上合成；全硫化及部分硫化CpG单链脱氧寡核苷酸的合成采用置换法，在ABI 394 DNA合成仪上合成。
实施例2、人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸的抗流感病毒作用1、人外周血单个核细胞的分离仪器设备和器材低温冰箱、二氧化碳孵箱、超净工作台、倒置显微镜、液氮罐、蒸馏水器、真空泵、细胞培养瓶、滤菌器、滤过瓶、各种规格的吸管、加样器、滴管、血球计数板、水平式离心机等。
试剂和材料肝素抗凝的人全血来自两个正常献血员。
长春市中心血站。
聚蔗糖-泛影葡胺比重1.077±0.001，北京鼎国生物技术有限公司。
IMDM培养液1000ml含庆大霉素10万单位。0.22微米的滤膜抽滤除菌、分装。
方法用聚蔗糖-泛影葡胺淋巴细胞分层液分离人外周血的单个核细胞。分层液与肝素抗凝外周血的体积比约为2∶1。水平离心(1,000xg，20min)。用吸管吸取含单个核细胞的液带，置入另离心管中。加入等体积的无血清培养基。1,000g离心15min，弃上清。重复洗涤两次。弃上清，用2ml培养基重悬细胞。计细胞数。
2、人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸抗流感病毒作用的测定用含10％胎牛血清的IMDM培养液调人外周血单个核细胞的终浓度为3×106个/毫升。加此细胞悬液于12孔培养板，每孔2ml。加人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸(6.25μg/ml)。
设DVAX-1对照加人工合成的含GpC单链脱氧寡核苷酸(5’TgCTTgggTggCAgCTgCCAgggggg-3’)培养液对照不加人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸。37℃，5％二氧化碳孵箱培养48小时，收集上清，检测其抗流感病毒的活性。
用5％胎牛血清IMDM调节生长状态良好的Vero细胞(ATCC)浓度至3×105个/ml。将细胞接种于96孔平底培养板，每孔100μl。将含CpG单链脱氧寡核苷酸CpG刺激上清用5％胎牛血清IMDM稀释10倍后，加样，每孔加入100μl(此时，每孔体积200μl，即100μl细胞悬液+100μl稀释后的含CpG单链脱氧寡核苷酸CpG刺激人上清或对照上清)。设干扰素对照，流感病毒对照和正常Vero细胞对照。37℃5％CO2孵箱培养24小时。吸弃上清，每孔加入2％FBS IMDM稀释的流感病毒液(长春生物制品研究所)200μl，继续培养48-72小时。待病毒对照孔细胞80-100％发生病变，而细胞对照孔细胞状态良好时，终止培养，用结晶紫染色的方法判定细胞病变的程度。吸弃培养液。每孔加200μl 0.5％结晶紫染液，37℃，15分钟。流水冲掉结晶紫染液。0.5％结晶紫染液结晶紫0.5克，NaCl0.85克，溶于50毫升无水乙醚。加3毫升甲醛，47毫升蒸馏水。照相记录结果。按图-1所示加样，结晶紫染色后的结果见图2。
序列表<110>长春华普生物技术有限公司<120>具有抗流感病毒的含CpG单链脱氧寡核苷酸<160>5<210>1<211>26<212>DNA<213>人工合成的<400>1tcgtcgggtg cgacgtcgca gggggg26<210>3<211>20<212>DNA<213>人工合成的<400>3tcgtcgtttc gtcgttgggg20
<210>4<211>23<212>DNA<213>人工合成的<400>4tcgacgttcg tcgttcgtcg ttc23<210>5<211>21<212>DNA<213>人工合成的<400>5tcggggacga tcgtcggggg g 21<210>6<211>22<212>DNA<213>人工合成的<400>6ggatcgatcg atcgatgggg gg2权利要求
1.人工合成的具有SEQ ID No 1所示序列的单链脱氧寡核苷酸用于制备抗流感病毒的制品的用途。
2.人工合成的具有SEQ ID No 1所示序列的单链脱氧寡核苷酸用于制备用于诱生细胞产生抗流感病毒物质的制品的用途。
3.人工合成的具有SEQ ID No 1所示序列的单链脱氧寡核苷酸用于制备用于抵抗流感病毒引起的人流感呼吸道感染性疾病的物质的用途。
4.权利要求1-3所述的任一单链脱氧寡核苷酸，其磷酸二酯键是非硫化的，或部分硫化的，或完全硫化的。
全文摘要
本发明提供了系列的人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸，它们由含一个或多个CpG的脱氧寡核苷酸单链DNA分子构成，能够刺激人外周血单个核细胞(PBMC)产生抗流感病毒的物质，这些物质可作用于细胞使其抵抗流感病毒的攻击；提供了人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸的抗流感病毒作用和对流感病毒引起的人流感等呼吸道感染治疗和预防作用。
文档编号A61P31/00GK101023957SQ20061014085
公开日2007年8月29日 申请日期2003年7月25日 优先权日2003年7月25日
发明者王丽颖, 包木胜, 于永利 申请人:长春华普生物技术有限公司