制备聚合物结合物的方法

专利名称：：制备聚合物结合物的方法制备聚合物结合物的方法发明领域本发明涉及制备聚合物结合物的改进方法。特别地，本发明涉及制备并纯化生物活性部分结合物例如蛋白质的聚合物的改进方法。
背景技术：
：这些年来，聚合物与生物活性部分例如蛋白质、多肽或小分子的结合(conjugation)作为提高效率同时通常降低该部分的一个或多个消极方面的方式日益普及。特别地，利用聚亚烷基氧化物(PAO)或更具体地，聚乙二醇(PEG)的聚合物结合已经广泛地被接受用于设计治疗用途的部分有毒或免疫原性药物的有效衍生物。仅举几个例子，美国专利No.5，643，575;5，919，455;5,605，976描述了非抗原性的聚合物、其制备和与生物活性部分结合的方法。此处引入上述每篇的内容作为参考。尽管这些专利提供了改进生物活性部分例如酶、蛋白质和其它肽以及多肽的用途的有价值的方法，但是仍需要改进结合方法。例如，上述'575专利公开了生产支化PEG衍生物并使蛋白质与之结合的方法。其中公开的一种方法包括利用过量三功能分子例如赖氨酸乙酯，与活化mPEG衍生物例如琥珀酰亚胺基碳酸酯(SC)-mPEG结合。虽然该方法提供了所需活化支化聚合物和得到的结合物，己经发现在某些环境下更经济地提供更高纯度所需结合物是合乎需要的。过去，已经提出利用柱色谱除去任何未反应的起始材料或副产物。例如参见美国专No.5,932,462。该技术是昂贵的，不便于大批生产，并可能导致明显收率下降。非常合乎需要的是在生产最终产物之前，消除或钝化剩余的起始材料和副产物，其可能与形成所需支化聚合物-治疗结合物竞争。这将挽回收率损失。因此，已经寻找可选择方案，特别是商业生产的情况，其中关键的是使生物活性部分的损失最小化。本发明提供了一种制备活化PEG接头和它们随后结合至生物活性部分的新的改进方法。此外本发明满足了未满足的需要，提供了一种经济有效的结合方法，具有超过现有技术的改进纯度和收率。发明概述本发明一个实施方式中，提供了一种制备活化聚合物和用其生产聚合物结合物的新方法。本发明的这方面中第一步包括将可活化的聚合物残基例如mPEG-OH与能够在可活化聚合物残基上提供离去基团的活化剂反应，并提供第一反应混合物，该混合物包含活化的聚合物残基，例如mPEG-琥珀酰亚胺基碳酸酯(在下文中称为SC-PEG)和优选痕量的可活化聚合物残基。此处使用的活化剂实例包括二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)或光气(或三光气)和N-羟基琥珀酰亚胺(在下文中称为NHS)的组合物。此外在以下详细说明部分中讨论活化剂/离去基团。第二步骤需要将第一反应混合物与具有至少一个保护基的多功能连接部分反应，所述保护基即不与活化聚合物残基例如赖氨酸乙酯反应的官能团。在第一反应混合物的活化聚合物残基相对于多功能连接部分的活性基团摩尔过量的条件下进行第二步骤，从而形成第二反应混合物。第二反应混合物包含第一反应混合物和中间聚合物，例如(PEGhLys乙酯，其得自活化的聚合物残基与多功能连接部分的反应。下一步中，用第一猝灭剂例如苯乙胺或苄胺猝灭第二反应混合物，以钝化活化聚合物残基，形成第三反应混合物，其包含中间聚合物结合物等。然后，将第二猝灭剂例如TBDMSiCl加入至第三反应混合物，以钝化其中可活化的聚合物残基，从而形成第四反应混合物，其包含中间聚合物结合物。第一和第二猝灭剂可以任何次序加入，只要不将它们同时加入。然而，优选首先加入第一猝灭剂，其后加入第二猝灭剂。然后用去保护剂处理第四反应混合物，以除去保护基例如强碱如LiOH，以去保护乙酯，或强酸例如TFA，以去保护叔丁基酯。然后中和中间聚合物，即PEG化的多功能连接部分，以形成第五反应混合物。然后第五反应混合物与另一活化剂或能够活化用于连接生物活性部分的中间聚合物的化合物例如NHS反应，以形成第六反应混合物。然后包含活化聚合物的第六反应混合物与生物活性部分反应，形成所需聚合物结合物。用于本发明目的，关于生物活性部分公开了该方法。然而应该理解该术语也包括靶向剂和诊断剂。不同于现有技术方法，该第六反应混合物包含所需活化聚合物，没有与生物活性部分反应的竞争中间物。本发明另一个方面中，例如通过透滤、尺寸排阻、离子交换柱、亲和层析柱或其它普通技术人员已知的技术，从最终反应混合物分离所需聚合物结合物。应当理解分离技术的选择取决于形成的单个最终结合物，可以不需过多实验作出该选择。作为本发明的结果，为技术人员提供了一种方法，其中有效和高收率地提供了所需聚合物结合物。它容易适于大批量或工业规模，避免使用昂贵、费时的柱色谱法分离所需活化PEG接头的步骤。一个特别优选生产(PEG)2Lys-多肽结合物的实施方式中，优选的猝灭剂形成mPEG胺氨基甲酸酯和甲硅垸基封端mPEG，两者对多肽结合都是惰性的，并容易在提纯期间与最终PEG多肽结合物分离。不需过多实验，根据此处提供的说明，其它和进一步的优点对于普通技术人员是显而易见的。图l示意图解了本说明书中公开的反应步骤。图2-3示意图解了实施例中公开的反应流程。详细说明A.概述本发明方法用于制备多种聚合物(PEG)结合物。尽管可在相当大的范围内选择在本发明的方法中制备的反应混合物的各种成分，在每个阶段的成分特性是相似的，足够使得可以概述本方法。现在参考图l，其中提供了在下文公开的反应的示意图。B.第一反应混合物利用公知的聚合物或PEG活化技术形成第一反应混合物。这产生包含即可活化聚合物残基例如PEG-OH和活化的聚合物残基例如SC-PEG的溶液。可以利用已知技术例如重结晶，容易地除去过量小分子试剂。用于本发明目的，可活化聚合物残基可以包括任何已知化合物，但是本发明优选方面中，使用聚亚垸基氧化物(POA)或聚乙二醇(PEG)基化合物。该化合物的非限定列举包括mPEG-OH、mPEG-NH2、mPEG-C02H、mPEG-SH和mPEG-卤素例如Cl。更优选实施方式中，可活化的聚合物残基是mPEG-OH。其中对于合成此处公开的聚合物结合物，合适的离去基团包括，但是不限于，部分例如N-羟基苯并三唑基、卤素、N-羟基邻苯二甲酰亚胺基(phthdimidyl)、对硝基苯氧基、咪唑基、N-羟基琥珀酰亚胺基、噻唑烷基硫酮，或其它对于普通技术人员显而易见的良好离去基团。用于本发明目的，离去基团被理解为能够被亲核基团例如NH2、OH、SH或其它在多功能分子上发现的反应性氨基(亲核基团)取代的基团。优选的能够在聚合物残基上提供离去基团的活化剂实例包括但是不限于DSC/吡啶或NHS/三光气以生产SC-PEG，2-巯基噻唑烷/EDC/DMAP以生产T-PEG，(即PEG-2-巯基噻唑烷氨基甲酸酯)、N-羟基邻苯二甲酰亚胺基(phthalamidyl)/DMAP以生产BSC-PEG(即PEG-N-羟基邻苯二甲酰亚胺基碳酸酯等)。某些用于本发明方法的优选的活化聚合物残基实例包括PEG化领域普通技术人员已知的。许多是可商购的，例如来自Huntsville，AL的Nektar。合适的活化聚合物残基非限定列举包括其它对于普通熟练技术人员显而易见的。更优选方面中，活化的聚合物残基是SC-mPEG。即使从供应商购买活化聚合物残基，很可能存在一些痕量杂质，即反应期间产生mPEG-OH或一些PEG-OH。因此，用该化合物生产的反应混合物中应该猝灭PEG-OH或使用其它起始材料。通常，在约室温下在惰性溶剂例如四氢呋喃(THF)、甲苯(TOL)、二氯甲烷(DCM)、氯仿(CHCl3)、二甲基甲酰胺(DMF)或其混合物中进行该反应。C.第二反应混合物第一反应混合物形成后，它与具有至少一个与活化聚合物残基不反应的官能团的多功能连接部分反应。在第一反应混合物中活化聚合物残基优选以相对于多功能连接部分摩尔过量存在的条件下，进行该反应。通常，在约室温进行该反应。当使用优选的SC-PEG时，优选在约2CTC约50'C形成第二反应混合物，更优选约25'C约35。C。虽然赖氨酸和赖氨酸酯例如赖氨酸乙酯是多种公知和优选的具有至少一个保护基的，即官能团不与活化聚合物残基反应的，多功能连接部分中的两种，当然普通技术人员认识到也可以使用其它化合物，其中保护基。例如，可以使用l，3-二氨基-2-丙醇、二亚乙基三胺、丙二酰氯等。该备选择物质的非限定列举通常包括取代的垸基二胺、三胺、天然和非天然氨基酸衍生物，例如丙二酸酯衍生物和二羟基烷基化合物或二硫代烷基化合物。得到的反应产生第二反应混合物，其中包含第一反应混合物和新形成的中间聚合物结合物，其得自活化聚合物残基与多功能连接部分的反应。D.第三和第四反应混合物中间聚合物结合物形成后，单独将第一和第二猝灭剂加入第二反应混合物，以分别形成第三和第四反应混合物。具体地，可以通过将第二反应混合物与第一猝灭剂反应，以钝化其中活化的聚合物残基，形成第三反应混合物。其后，将第二猝灭剂加入第三反应混合物，以钝化其中可活化的聚合物残基，并形成第四反应混合物。因此第四反应混合物包括l)活化用于连接至所关心的耙(在后面的步骤中)的中间聚合物，2)钝化的起始材料，和3)副产物，其在生物活性蛋白质、多肽等与其反应时与所需活化聚合物竞争。可选择的本发明实施方式中，通过将第二反应混合物与第二猝灭剂反应产生第三反应混合物，使得首先钝化其中可活化的聚合物残基。然后该可选择的第三反应混合物与第一猝灭剂反应，以钝化其中活化聚合物残基，并形成可选择的第四反应混合物。使用的猝灭剂量被认为是足够量。用于本发明目的，"足够的"试剂量是对于第一猝灭剂和第二猝灭剂钝化其中活化聚合物残基的量，该量足够钝化其中可活化的聚合物残基。合适的第一猝灭剂是包含游离胺、游离硫醇或游离羟基的化合物，例如半胱氨酸、苄胺、正丁胺、苯乙胺、C-末端封端氨基酸例如封端甘氨酸或封端丙氨酸和其混合物。当然，第一猝灭剂的选择取决于方法中使用的活化聚合物残基(即mPEG-SC等)的性质。合适的第二猝灭剂包括含甲硅烷基或酰氯，并能够与其中发现的可活化的聚合物残基反应的化合物。第二猝灭剂的选择还是取决于方法中使用的可活化的聚合物残基(即mPEG-OH、mPEG-NH2等))的性质。合适的试剂的非限定列举包括四丁基二甲基甲硅垸基氯(TBDMSiCl)、三甲基甲硅垸基氯(TMSiCl)MeI、MeS04、CF3S03Me，Me3OBF4。例如，当使用mPEG-OH时，优选第二猝灭剂是TBDMSiCl。E.第五反应混合物使用有效量去保护剂，即强酸或强碱，去保护第四反应混合物中的中间聚合物上的保护基。合适的碱包括但是不局限于氢氧化锂、氢氧化钾、叔丁氧钾、丁基锂和氨基钠。合适的酸可以选自三氟乙酸CTFA)、硫酸、磷酸和盐酸等。优选，加入氢氧化锂以去保护，随后用盐酸中和。其后，中和第四混合物，以形成第五反应混合物。然后通过与合适的活化剂反应而活化第五反应混合物，即与能够活化其中用于连接生物活性部分的中间聚合物结合物的化合物反应。该步骤产生包含其中待形成的活化聚合物的第六反应混合物。合适的能够活化中间物的化合物实例包括上述形成第一反应混合物的"活化剂"。合乎需要的是使得活化聚合物连接至目标氨基，优选离去基团是NHS。F.聚合物结合物第六反应混合物包含两种钝化的聚合物残基和一种活化的支化聚合物接头，其现在适用于与靶生物活性剂反应，不需进一步提纯，并形成聚合物结合物。这些活化支化聚合物可以是之前提到的，通常可以给出美国专利No.5,643，575，5，919，455和6,113,906中公开。一种特别优选的活化支化聚合物是mPEG—o支化peg包含得自本发明方法的离去基团、生物活性化合物、靶向部分或诊断剂的聚合物结合物通常为通式(R)n-L-D其中R是聚合物残基；L是多功能连接部分例如赖氨酸、二氨基丙醇、合适的氨基酸，有或者没有芳族基；D是由离去基团、生物活性部分、靶向部分和诊断剂组成的组的成n是正整数，优选2。更优选，结合物符合下列通式的一个:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>和<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>其中Rw是相同或不同的聚合残基；Ym独立是0、S或NR3，其中R3选自H(优选)、Cl6院基和取代的垸基、&.6支化垸基和取代的支化烷基以及(:4.8环垸基；J是双功能的连接部分；D是离去基团，生物活性化合物、靶向部分或诊断剂。这方面中，Y2和Y4优选是0，而Y^Y3、Y5和Y6是0、S或NH。本发明的其它聚合物结合物包括:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>其中(a)是约l约5的整数；Z是O，NR4，S，SO或S02;其中R4是H、Q.s烷基、Q.s支化烷基、Q.s取代的垸基、芳基或芳烷基；(m)是0或l;(p)是正整数，优选约1约6，D是离去基团，生物活性化合物、靶向部分或诊断剂。聚合物残基如上所述，R，R,和R2是聚合物残基。优选，各自是水溶性的聚合物残基，其优选是基本上非抗原性的，例如聚亚烷基氧化物(PAO)，更优选聚乙二醇。用于说明而非限定的目的，聚乙二醇(PEG)残基部分可以选自R6-0-(CH2CH20)x-，R6-0-(CH2CH20)x-CH2C(0)-0-，R6-0-(CH2CH20)x-CH2CH2NR5-，和R6-0-(CH2CH20)x-CH2CH2S-，其中x是聚合度，即约10约2，300;Rs选自氢、Cw烷基、(:2.6烯基、Cw炔基、Cw2支链垸基、C^环垸基、Cl6取代的院基、C2-6取代的烯基、C2—6取代的炔基、C3—8取代的环烷基、芳基取代的芳基、芳烷基、C^杂烷基、取代的C^杂烷基、C^垸氧基烷基、苯氧基烷基和d-6杂垸氧基；和R6是加帽基团(cappinggroup),即甲基、乙基、苄基等。一个特别优选实施方式中，R选自CH3-0-(CH2CH20)x-，CH3-0-(CH2CH20)x-CH2C(0)-0-、CH3-0-(CH2CH20)x-CH2CH2NH-和CHr0-(CH2CH20)x-CH2CH2S-，其中x是正整数，选择x使得总重均分子量为约200约120，000Da(道尔顿)。优选，总重均分子量为约2,000约80,000Da，更优选约10,000约40,000Da。许多方面中，取决于本领域技术人员的需要，最优选结合物的聚合物部分总分子量为约5,000约40，000Da。此处包括的聚合物优选在室温下是水溶性的。该聚合物的非限定列举包括聚亚烷基氧化物均聚物例如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇、聚氧化乙烯化多元醇、其共聚物和其嵌段共聚物，条件是保持嵌段共聚物的水溶性。双功能的连接部分"J"J可以是任何连接基团，其有助于将生物活性部分连接至脂肪族连接基团。非限定列举包括-NHC(0)CH2OCH2C(0)-;-NHC(0)CH2NHCH2C(0)-;-NHC(0)CH2SCH2C(0)-;-NHC(0)CH2CH2CH2C(0)-;或-NHC(0)CH2CH2C(0)-;其中R"Rs和R9选自与R6限定相同的基团；t是正整数，优选约1约12。G.分离聚合物结合物另一个方面中，上述方法进一步包括从混合物7的副产物分离或隔离聚合物结合物的步骤。这可以使用任何本领域接受适用于实现该结果的方法完成。优选，使用的方法是可以高效率用于商业系列的方法。考虑到透滤或尺寸排阻色谱是最通常用于实现所需结果的。然而，取决于熟练工人的个别需要，也可以使用离子交换、亲合性和疏水性色谱。例如，可以用水稀释反应混合物，并装入用SPSepharoseFF树脂填充的柱上。然后用合适的缓冲剂例如PBS(磷酸盐)缓冲剂洗涤该柱，以除去全部惰性PEG加上反应期间水化的PEG。然后，用不同梯度的缓冲剂洗去具有两个或更多个连接位点聚合物结合物，之后以高纯度，例如>90-95%纯度洗脱所需聚合物结合物。H.生物活性部分其中D是生物活性化合物的那些通式(I)方面中，该合适化合物的非限定列举包括有机化合物、酶、蛋白质、多肽等的残基。除了上述，生物活性化合物也可以是酶、蛋白质、多肽、单克隆抗体、寡核苷酸、免疫结合物，例如SS1P、单链抗原结合蛋白质(SCA)，例如CC49的残基，及其片段也是预期的。合适的蛋白质包括但是不局限于多肽、酶、肽等，其具有至少一个可用于聚合物连接的基团，例如e-氨基、半胱氨酸硫基(cystinylthio)、N-末端氨基，包括具有生理学或药理学活性的材料以及能够在有机溶剂中催化反应的那些材料。所关心的蛋白质、多肽和肽包括，但是不局限于血红蛋白、血清蛋白例如血液因子，包括因子VII、VIII和IX;免疫球蛋白、细胞因子例如白细胞介素，即IL-1IL-13等，a，e和Y干扰素、集落刺激因子包括粒细胞集落刺激因子，血小板衍生的生长因子和磷脂酶活化蛋白质(PLAP)以及胸腺素al和促胰液素。其它具有普通的生物或治疗用途的蛋白质包括胰岛素、植物蛋白质例如植物凝血素和篦麻蛋白、肿瘤坏死因子和相关蛋白质、生长因子例如转化生长因子，例如TGFa或TGFP、VEGF、TNFa、病毒蛋白质趋化因子和表皮生长因子、激素、生长调节素、促红细胞生成素、色素激素、下丘脑释放因子、抗利尿激素、催乳激素、绒毛膜促性腺激素、促卵泡激素、甲状腺刺激激素、组织纤溶酶原激活剂等。所关心的免疫球蛋白包括IgG、IgE、IgM、IgA、IgD和其片段。一些蛋白质例如白介素、干扰素和集落刺激因子也以非糖基化形式存在，通常作为使用重组细胞技术的产物。该非糖基化变型也在本发明蛋白质范围中。所关心的酶包括碳水化合物特异性的酶、蛋白水解酶、氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶和连接酶。不限于特定的酶，所关心的酶实例包括天门冬氨酰胺酶、精氨酸酶、精氨酸脱氨基酶、腺苷脱氨酶、超氧化物歧化酶、内毒素酶、过氧化氢酶、糜蛋白酶、脂酶、尿酸酶、二磷酸腺苷酶、酪氨酸酶和胆红素氧化酶。所关心的碳水化合物特异性的酶包括葡萄糖氧化酶、glucodases、半乳糖苷酶、葡糖脑苷脂酶、葡糖醛酸酶等。此处还包括表现出体内生物活性的生物聚合物的任何部分。这包括氨基酸序列、核酸(DNA、RNA)、肽核酸(PNA)、抗体片段、单链结合蛋白，参见例如美国专利No.4，946，778，其中公开内容此处引入作为参考，结合分包括融合抗体或片段、多克隆抗体、单克隆抗体和催化抗体。可以使用本领域普通技术人员已知的技术，例如组织培养、从动物来源提取，或用重组DNA方法制备或分离蛋白质或其部分。还考虑了蛋白质、多肽、氨基酸序列等的转基因源。该材料得自转基因的动物，即老鼠、猪、牛等，其中蛋白质在牛奶、血液或组织中表达。还考虑转基因的昆虫和杆状病毒表达体系作为来源。此外，突变型蛋白质，例如突变型干扰素也在本发明范围内。其它所关心的蛋白质是过敏原蛋白质例如豚草，抗原E，蜜蜂毒液、壁虱过敏原等。上述说明了适用于本发明的蛋白质。应该理解此处限定的没有具体提到但是具有可以使用的氨基的那些蛋白也被考虑，并且在本发明范围内。本发明发明优选方面中，含氨基或羟基化合物是生物活性化合物，其适用于治疗动物，例如哺乳动物，包括人所需治疗的病症的药用或诊断用途。上述列举是说明性的，不用于限定化合物，其可以改变。普通技术人员将认识到可以类似地改变其它该化合物/组合物，不需过多实验。应该理解没有具体提到但是具有合适的连接基团的生物活性材料也在本发明范围之内。诊断剂D为诊断剂的通式(I)的那些方面中，合适的试剂的非限定列举包括染料、螯合剂和同位素标记的化合物和其它标记化合物例如绿色荧光蛋白质(GFP)。靶向部分D为靶向部分的那些通式(I)方面中，合适试剂的非限定列举包括，肽例如TAT肽和U-7肽、单链抗体例如，CC49和小分子，例如牛磺酸和生物素。本发明的优选方面中，生物活性化合物是适用于治疗动物，例如哺乳动物，包括人的需要这种治疗中的药用或诊断用途的化合物。上述列举是说明性的，不用于限定化合物，其可以改变。普通技术人员将认识到可以类似地改变其它该化合物/组合物，不需过多实验。应该理解未具体说明但是具有合适的连接基团的生物活性材料也在本发明范围之内。I.体内诊断本发明的另一个方面中，诊断剂是选择用于诊断或成像目的的标签。因此，合适的标签的制备是通过连接任何合适部分例如氨基酸残基至任何本领域标准的发射同位素、辐射不透过的标记、磁共振标记、或其它适于磁共振成像的非放射性同位素标记、荧光型标记、表现出可见颜色的标记和/或能够在紫外线、红外或电化学刺激下发荧光的标记，以允许外科手术过程期间对肿瘤组织成像。任选，将该诊断标签并入和/或连接到结合的治疗性部分，允许监测动物或病人内治疗性生物活性材料的分布。本发明另一个方面中，易于用本领域已知方法，用任何合适的标记包括例如放射性同位素标记，制备本发明加标签的结合物。仅举例来说，这包括131碘、125碘、""锝和/或'n铟，以生产用于活体内选择性吸收进入肿瘤细胞的放射免疫成像(radioimmunoscintigraphic)。例如，存在许多本领域已知的连接肽至Tc-99m的方法，包括，仅举例来说，美国专利No.5,328,679;5,888,474;5,997,844;和5,997,845所示方法，此处引入作为参考。也可以使用其它放射性同位素例如"C，"N等。广泛地，用于病人肿瘤组织的解剖学定位，给怀疑具有肿瘤的病人或动物服药结合物标签。令标记的免疫球蛋白定位在(一个或多个)肿瘤位点足够时间后，例如通过目视，用X射线照相、计算机横断断层成像、MRI、用仪器检测荧光标签，用光扫描装置例如Y照相机，或任何适于所选标签性质的其它方法或设备，检测由标记产生的信号。然后将检测信号转变为肿瘤位点的图像或解剖和/或生理学的鉴定。图像使得可以定位活体内肿瘤，并设计合适的治疗对策。在标签部分本身是治疗剂的实施方式中，检测的信号为在处理期间解剖定位提供证据，为随后的诊断和治疗干预提供基准。实施例下列实施例用来为本发明提供进一步理解，无论如何不是限定本发明有效范围。粗体提供的参考数字相应于图2-3中所示化合物。PEG2合成实施例l第一反应混合物化合物l在氮气下将20kmPEG-OH(125g，6.24mmol)与甲苯(1.88L)共沸2小时，以除去375ml溶剂。冷却溶液至50。C。加入三光气(1.24g，4.18mmol)和吡啶(0.99g，12.47mmol)，并在50。C搅拌反应溶液3小时。然后加入N-羟基琥珀酰亚胺(1.79g，15.59mmol)和吡啶(1.23g，15.59mmol)。在5CTC搅拌反应溶液超过20小时，随后过滤除去吡啶盐。在4(TC真空下完全除去甲苯溶剂。在无水二氯甲垸(400ml)中溶解残余物。将乙醚(2.50L)缓慢加到溶液中，以析出产物。在乙腈(875ml)中再溶解该粗制品，随后缓慢加入异丙醇(3.75L)，以析出白色固体。过滤该固体，并用异丙醇和醚洗涤。在4(TC真空下干燥该分离的固体，以得到第一反应混合物(112g，5.55mmol，89%)，其包含化合物1和2。13CNMR(75.5MHz,CDCI3)S25.0，58.6，67.9-71.4(PEG)，151，168.1,实施例2第二和第三反应混合物在氮气下无水氯仿(50ml)中溶解化合物l和2的第一反应混合物(5.0g，0.25mmo1)。加入1-赖氨酸乙酯二氢氯化物(26mg，O.lOmmol)和三乙胺(42mg，0.41mmo1)。加热反应溶液至3(TC，并在30。C搅拌20小时，以得到包含化合物l、2和4的第二反应混合物。冷却该第二反应混合物至室温，随后加入苄胺(53.2mg，0.5Ommo1)，以猝灭第一反应混合物中过量的活化的PEG。在室温下搅拌该反应溶液20小时。在30。C真空下除去溶剂。在无水二氯甲垸(15ml)中溶解残余物。将乙醚(IOOml)缓慢加到溶液中，以析出产物。在乙腈(10ml)中再溶解该粗制品，随后缓慢加入异丙醇(150ml)，以析出白色固体。过滤该固体，并用异丙醇和醚洗涤。在40'C真空下干燥分离的固体，以得到化合物l、4和5的第三反应混合物(4.5g，90重量％)。13CNMR(75.5MHz，CDC13)S13.84，21.91，29.06，31.70，40.06，44.38(节胺)，53.27,58.55，60.85，63.26，63.71，68.97-71,41(PEG)，126.88-127.95(节胺)，155.32，155.88，171.60.实施例3第四反应混合物在无水二氯甲烷(40ml)中溶解包含化合物l、4和5的第三反应混合物(4.23g)，随后加入叔丁基二甲基甲硅烷基氯化物(8mg，0.05mmo1)和三乙胺(26mg，0.26mmo1)。在室温氮气下搅拌反应溶液20小时。在真空下除去溶剂。在无水二氯甲垸(15ml)中溶解残余物。将乙醚(IOOml)缓慢加到溶液中，以析出产物。在乙腈(IOml)中再溶解该粗制品，随后缓慢加入异丙醇(125ml)，以析出白色固体。过滤该固体，并用异丙醇和醚洗涤。在4(TC真空下干燥分离的固体，以得到化合物4、5和6的第四反应混合物(3.8g，93重量％)。13CNMR(75.5MHz，CDC13)S13.79，21.85，28.98，31.59，39.99，44.38(节胺)，53.20，58.49，60.76，63.20，63.64，68.91-71.37(PEG)，126.84-127.89(节胺)，155.29，155.84，171.54.实施例4第五反应混合物在水中(20ml)完全溶解化合物4、5和6的第四反应混合物(3.46g)。加入氢氧化锂一水合物(5.4mg，0.13mmo1)，并在室温下搅拌反应溶液20小时。调节溶液的pH为22.5,随后用二氯甲垸(100ml)萃取两次。用硫酸镁干燥合并的有机层。在真空下除去溶剂。在无水二氯甲烷(15ml)中溶解残余物。将乙醚(100ml)缓慢加到溶液中，以析出产物。过滤该固体，并用醚洗涤。在4(TC真空下干燥分离的固体，以得到包含化合物5、6和7的第五反应混合物(3.0g，87重量％)。13CNMR(75.5MHz，CDC13)S21.8，28.98，31.62，40.06，44.50(苄胺)，52.88，58.55，63.23，63.63，65.29-72.27(PEG)，126.87-127.95(苄胺)，155.29，155.84，172.40.实施例5第六反应混合物在氮气下无水二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺的混合溶剂中溶解包含化合物5、6和7的第五反应混合物(2.22g)、N-羟基琥珀酰亚胺(38mg,0.33mmol)和N，N-二异丙基乙胺(85mg，0.66mmol)。用冰浴冷却该溶液至0。C，并加入l-[3-(二甲胺)丙基]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。从(TC至室温搅拌反应溶液过夜。在真空下除去溶剂。在无水二氯甲垸(7ml)中溶解残余物。将乙醚(50ml)缓慢加入溶液，以析出产物。在乙腈(4.5ml)中再溶解该粗制品，随后缓慢加入异丙醇(70ml)，以析出白色固体。过滤该固体，并用异丙醇和醚洗涤。在40'C真空下干燥分离的固体，以得到包含化合物5、6和8的第六反应混合物(2.07g，93重量％)。13CNMR(75.5MHz，CDC13)S21.46，25.17，28.80，31.38，39.74，44.44(节胺)，51.72，58.55，63.34，64.03，69.12-71.41(PEG),126.93-127.95(节胺)，155.07，155.97，167.51，168.19.实施例6PEG2-IFN0-lb(单PEG化PEG2干扰素0-lb)通过在50mM磷酸钠、50mM氯化钠、0.05%Zwittergent3-14中，pH=7.9，将纯IFNP-lb(5ml，0.45mg/ml)与包含化合物5、6和8的第六反应混合物(38mg)反应，合成PEG化的IFNP-113(单？￡0化？￡02干扰素e-lb)。在25'C搅拌反应混合物1.5小时。通过加入甘氨酸(9.5ul，1M甘氨酸溶液)猝灭PEG化反应，然后用2N乙酸降低pH至6.5。根据RP-HPLC(参见表l)，以产率39。/。获得单PEG化结合化合物9(支化-PEG化蛋白质)。没有直链PEG化(1/2PEG)IFN0-lb。下列过程用于分离纯单PEG化IFN3-lb化合物9。用水稀释猝灭的反应混合物，以调节导电率至约5ms，然后装入用SPSepharoseFF树脂填充的柱上，该柱预先用20mM磷酸钠平衡，pH6.5，流速5ml/分钟。用平衡缓冲剂洗涤柱，以从第六反应混合物除去全部的惰性PEGs，加上反应期间水解的PEG。以10柱体积平衡缓冲剂中75mM氯化钠，洗出PEG2-IFNP-lb寡物(HiPEG)。然后用10柱体积平衡缓冲剂中225mM氯化钠洗脱所需单PEG化PEG2-IFNP-lb化合物9。最终分离收率是约30%，基于IFN-e。表l.PEG化后的RP-HPLC后分析<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>注释单PEG-单PEG化的PEGrIFN/5-lb;HiPEG:二/三PEG化PEG2-EFNi8-lb;天然物=IFNjS-lb;1/2PEG-直链PEG-IFNjS-lb。实施例7使用得自Nektar相同分子量的PEG2-NHS代替支化活化PEG8，以及用于实施例6的第六反应混合物，以相同的结合条件制备对比PEG化IFNP-lb。在与干扰素反应之前，使用柱色谱纯化该对比PEG2-NHS。PEG化后再次进行RP-HPLC分析。结果列于以下表2中。表2.PEG化后的RP-HPLC分析<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>上述结果表明，当与现有技术方法相比时，本发明方法提供了有利结果，而且不增加成本，与干扰素反应之前不需柱提纯PEG2-NHS。本发明方法得到的Hi-PEG(多PEG)部分明显少于在可商购的PEGrNHS中发现的。新方法减少了约一半Hi-PEG的收率X。权利要求1.一种制备活化的聚合物的方法，包括a)将可活化的聚合物残基与能够在其上提供离去基团的活化剂反应，以提供包含活化的聚合物残基和可活化的聚合物残基的第一反应混合物；b)在其中所述第一反应混合物的活化的聚合物残基相对于所述多功能连接部分过量的条件下，将所述第一反应混合物与其上具有不与所述活化的聚合物残基反应的保护基的多功能连接部分反应，以形成包含所述第一反应混合物和中间聚合物的第二反应混合物，其中所述中间聚合物包含由所述活化的聚合物残基与所述多功能连接部分反应产生的保护基；c)用足够量的第一猝灭剂猝灭所述第二反应混合物，以钝化其中活化的聚合物残基，形成包含所述中间聚合物的第三反应混合物；d)将足够量的第二猝灭剂加到所述第三反应混合物中，以钝化其中可活化的聚合物残基，并形成包含所述中间聚合物的第四反应混合物；e)从中间聚合物除去保护基，并中和所述第四反应混合物，以形成第五反应混合物；f)将所述第五反应混合物与能够活化其中用于连接生物活性部分的中间聚合物的化合物反应，并形成包含活化的聚合物的第六反应混合物。2.权利要求l的方法，进一步包括将所述第六反应混合物与生物活性化合物、靶向部分或诊断剂反应，以形成聚合物结合物。3.权利要求2的方法，进一步包括分离聚合物结合物。4.权利要求3的方法，其中通过透滤或尺寸排阻色谱进行所述分离。5.权利要求2的方法，其中所述聚合物结合物具有以下通式(R)n-L-D其中R是聚合物残基；L是多功能脂肪族连接部分；D是由生物活性部分、靶向部分和诊断剂组成的组的成员；n是正整数。6.权利要求5的方法，其中R是k亚垸基氧化物。7.权利要求6的方法，其中所述聚亚烷基氧化物是聚乙二醇。8.权利要求7的方法，其中所述聚乙二醇具有约200约120,000道尔顿的重均分子量。9.权利要求8的方法，其中所述聚乙二醇具有约2,000约80,000道尔顿的重均分子量。10.权利要求9的方法，其中所述聚乙二醇具有约10，000约40，000道尔顿的重均分子量。11.权利要求l的方法，其中所述可活化的聚合物残基选自mPEG-OH、mPEG-NH2、mPEG-C02H、mPEG-S02和mPEG-卣素。12.权利要求ll的方法，其中所述活化聚合物残基是mPEG-OH。13.权利要求l的方法，其中所述活化的聚合物残基选自14.<image>imageseeoriginaldocumentpage3</image><formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>15.权利要求l的方法，其中所述具有至少一个不与所述活化的聚合物残基反应的官能团的多功能连接部分选自取代的烷基二胺、三胺、天然和非天然氨基酸衍生物和丙二酸酯衍生物。16.权利要求15的方法，'其中所述具有至少一个不与所述活化的聚合物残基反应的官能团的多功能连接部分选自赖氨酸、二氨基烷基、二羟基烷基和二硫代垸基。17.权利要求15的方法，其中所述具有至少一个不与所述活化的聚合物残基反应的官能团的多功能脂肪族连接部分是赖氨酸、赖氨酸酯或赖氨酸乙酯。18.权利要求l的方法，其中所述第一猝灭剂为包含游离胺、游离硫醇或游离羟基的化合物。19.权利要求18的方法，其中所述第一猝灭剂选自半胱氨酸、苄胺、正丁胺、苯乙胺、C-末端保护的氨基酸和其混合物。20.权利要求l的方法，其中所述第二猝灭剂是包含甲硅烷基或酰氯基的化合物。21.权利要求20的方法，其中所述第二猝灭剂选自TBDMSiCl、TMSiCl、Mel、MeS04、CF3S03A^QMe3OBF4。22.权利要求21的方法，其中所述第二猝灭剂是TBDMSiCl。23.权利要求21的方法，其中能够活化中间聚合物结合物的化合物是N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。24.权利要求2的方法，其中生物活性化合物选自蛋白质、肽、多肽、酶、寡核苷酸、单链结合抗原(SCA)、抗体、抗体片段和天然或合成的药用化学品。25.权利要求24的方法，其中所述蛋白质是干扰素。26.权利要求25的方法，其中所述干扰素是a、e或Y干扰素。27.权利要求2的方法，其中所述聚合物结合物选自<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>禾口<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>其中Rw是相同或不同的聚合残基；Yw独立是O、S或NR,。，其中R,o选自H、d-6垸基和取代的烷基.<:3.6支链烷基和取代的支链烷基以及<:4.8环垸基；J是双功能连接部分；D是生物活性化合物、耙向部分或诊断剂。28.权利要求l的方法，其中所述可活化的聚合物残基是mPEG-OH;能够提供离去基团的活化剂是N-羟基琥珀酰亚胺基(succinidyl);活化的聚合物残基是mPEG-琥珀酰亚胺基碳酸酯，第一猝灭剂是苄胺；第二猝灭剂是TBMSiCl;能够活化用于连接生物部分的中间聚合物结合物的化合物是N-羟基琥珀酰亚胺基。29.权利要求28的方法，其中所述N-羟基琥珀酰亚胺基活化的中间聚合物结合物进一步与生物活性化合物反应。30.—种制备活化的聚合物的方法，包括a)将可活化的聚合物残基与能够在其上提供离去基团的活化剂反应，以提供包含活化的聚合物残基和可活化的聚合物残基的第一反应混合物；b)在其中所述第一反应混合物的活化的聚合物残基相对于所述多功能连接部分过量的条件下，将所述第一反应混合物与其上具有不与所述活化的聚合物残基反应的保护基的多功能连接部分反应，以形成包含所述第一反应混合物和中间聚合物的第二反应混合物，其中所述中间聚合物包含由所述活化聚合物残基与所述多功能连接部分反应产生的保护基；c)用足够量的第一猝灭剂猝灭所述第二反应混合物，以钝化其中可活化的聚合物残基，形成包含所述中间聚合物的第三反应混合物；d)将足够量的第二猝灭剂加到所述第三反应混合物中，以钝化其中活化的聚合物残基，并形成包含所述中间聚合物的第四反应混合物；e)从中间聚合物除去保护基，并中和所述第四反应混合物，以形成第五反应混合物；f)将所述第五反应混合物与能够活化其中用于连接生物活性部分的中间聚合物的化合物反应，并形成包含活化的聚合物的第六反应混合物。全文摘要本发明公开了一种有效地大规模制备聚合物结合物例如支化PEG-多肽结合物的方法，而不用柱色谱提纯活化PEG接头以除去杂质。文档编号A61K47/48GK101163507SQ200680004004公开日2008年4月16日申请日期2006年1月31日优先权日2005年2月4日发明者乌德春,理查德·B·格林沃尔德,洪赵申请人:安龙制药公司