用于药物用途的蛋白酶的制作方法

专利名称：：用于药物用途的蛋白酶的制作方法
技术领域：
：本发明涉及蛋白酶的药物用途，所述蛋白酶涉及源自地衣芽孢杆菌C6a"/ws//c/zem/o^mX)的丝氨酸蛋白酶(SEQIDNO:2的氨基酸1-274)，在所述用途中任选地将该蛋白酶与脂肪酶和/或淀粉酶组合。医学适应症(medicalindication)的实例是治疗消化性病症(digestivedisorder)、胰腺外分泌机能不全(pancreaticexocrineinsu伍ciency)(PEI)、胰腺炎、嚢性纤维化、I型糖尿病和/或n型糖尿病。
背景技术：
：已知几种以胰酶补充剂形式存在的商业药物用于治疗胰腺外分泌机能不全。这些产品的活性组分是消化酶，主要为淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶，其通常产生于胰腺并分泌至小肠上部(十二指肠)。这些药物中使用的酶源自牛或猪的胰腺，然而市场也存在含有微生物酶的产品，例如产品Nortase⑧，其包含来自米根霉(i^&opwwy加e)的月旨肪酶、来自米曲霉(J^wg/〃ww^加e)的蛋白酶和来自米曲霉的淀粉酶。US5614189(EP600868)描述源自疏棉状腐质霉(^Twm'co/"/"m^/"o")的脂肪酶在胰酶替代疗法中的用途，例如在对患有嚢性纤维化的患者的治疗中。所述脂肪酶来自疏棉状腐质霉DSM4109，具有SEQIDNO:14的氨基酸1-269的氨基酸序列。WO00/54799描述在治疗I型和n型糖尿病中，有脂肪分解、蛋白水解和淀粉分解活性的、生理上可以接受的酶混合物的用途。WO02/060474描述来自德氏根霉(//n'zopwA/emar)的浓缩脂肪酶、来自蜂蜜曲霉(^pe^///^me〃ez^)的中性蛋白酶和来自米曲霉的淀粉酶在对消化不良的治疗中的用途。WO01/62280描述在哺乳动物中治疗或预防胃肠病症时，与多功能交联剂交联的特定的非真菌脂肪酶晶体、蛋白酶和淀粉酶的用途，其中所述脂肪酶晶体在从约2.0至9.0的pH范围内具有活性。优选的脂肪酶来自假单胞菌属CRse^fomo"a力，优选的淀粉酶来自芽孢杆菌属(Sa"'〃附)或曲霉菌(A^ergz7/w力，优选的蛋白酶是菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶或无花果蛋白酶。EP0828509描述在对外分泌胰腺机能不全的治疗中，特定的酸稳定性淀粉酶的用途，任选地可与特定的酸稳定性脂肪酶和/或蛋白酶组合。优选的淀粉酶来自黑曲霉(Aperg///^"/取r)，优选的脂肪酶来自少根根霉(i/zizopwa^r/n'zM》或爪唾才艮審(A/zz.zopus/avam'citf)。WO91/00345描述许多用于洗涤剂组合物中的丝氨酸枯草杆菌蛋白酶(serinesubtilisinprotease)及其改进的变体。WO2005/115445(在本申请的优先权日后公布)描述蛋白酶的药物用途，所述蛋白酶涉及源自拟诺卡氏菌属菌种(A^carafcp^sp.)NRRL18262的蛋白酶(该蛋白酶具有本引用文献中SEQIDNO:1的氨基酸1-188的氨基酸序列)，任选地将所述蛋白酶与脂肪酶和/或淀粉酶组合。医学适应症和本发明中相同。WO02/077187公开具有改变的T-细胞表位的解淀粉芽孢杆菌(Bac/〃wamj;/o/^we/ac/em)枯草杆菌蛋白酶及其各种用途。对药物组合物提出权利要求。WO01/12795公开蛋白水解酶组合物的药物用途。优选的蛋白酶来自米曲霉、黑曲霉、酱油曲霉(Js/erg/〃M^/"e)、黄曲霉(Ay/7^"g/〃us/fl/vws)、泡盛曲霉(^^perg7'〃z^awamon')或才古草芽孑包4干菌C6acz7/iwsw6"/h)。WO2004/078773公开如何将蛋白酶如枯草杆菌蛋白酶保持在非活性状态，所述非活性状态能够在外部信号的请求时激活。在其它用途中公开原枯草杆菌蛋白酶(pro-subtilisin)在伤口清洁制剂中的用途，和如何引发活性枯草杆菌蛋白酶的形成。优选的蛋白酶是ProD-枯草杆菌蛋白酶或ProD-负载枯草杆菌蛋白酶(ProD-loadedsubtilisin)(Yabuta等，J.Biol.Chem.278:15246-51，2003)。US2002/0081703公开用于降低非人蛋白质变应原性的方法，其中用人枯草杆菌蛋白酶中的类似区域(analogousregion)鉴定和代替表位。对包含人枯草杆菌蛋白酶的药物组合物提出权利要求。在本领域中需要可供选择的，优选改进的酶，所述酶用于药物用途，特别用于上述医学适应症(medicalindication)。发明简述本发明提供可供选择的，优选改进的酶，所述酶用于医疗用途，特别用于治疗消化性病症、胰腺外分泌机能不全(PEI)、胰腺炎、嚢性纤维化、I型糖尿病和/或II型糖尿病。所述新酶是蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶。优选地，用于本发明的用途的酶在体内和/或体外有改进的效能；改进的pH稳定性分布；改进的pH活性分布；对蛋白酶的降解稳定；在胆汁盐存在时稳定；和/或具有降低的变应原性。本发明涉及用作药物的蛋白酶，其中所述蛋白酶与SEQIDNO:2的氨基酸1-274有至少50%同一性，任选地将该蛋白酶与脂肪酶和/或淀粉酶组合。本发明还涉及这些蛋白酶在生产药物中的用途，所述药物用来治疗消化性病症、PEI、胰腺炎(急性和/或慢性)、嚢性纤维化、I型糖尿病和/或II型糖尿病，这些用途任选地还包含脂肪酶和/或淀粉酶的用途。此外本发明还涉及药物组合物，其包含这样的蛋白酶，以及至少一种可药用的辅助材料，任选地包括脂肪酶和/或淀粉酶。本发明还涉及消化性病症、PEI、胰腺炎(急性和/或慢性)、嚢性纤维化、I型糖尿病和/或II型糖尿病的治疗方法，其通过施用治疗上有效量的这样的蛋白酶，任选地与脂肪酶和/或淀粉酶一起施用。发明详述整本发明涉及蛋白酶的药物用途，所述蛋白酶与SEQIDNO:2的氨基酸1-274的蛋白酶具有至少50%的同一性，所述蛋白酶是源自地衣芽孢杆菌的丝氨酸蛋白酶，也称作枯草芽孢杆菌蛋白酶Carisberg。本发明还涉及这些蛋白酶用于产生药物的用途，所述药物用来治疗消化性病症、PEI、胰腺炎、囊性纤维化、I型糖尿病和/或II型糖尿病。本发明还涉及药物组合物，其包含这样的脂肪酶，和至少一种可药用的辅助材料；以及通过施用治疗上有效量的这样的蛋白酶治疗上述疾病的方法。在下文中，用于本发明的组合物、方法和用途中的蛋白酶称作"本发明的蛋白酶"。在优选实施方案中，本发明的蛋白酶与SEQIDNO:2的氨基酸l-274具有至少51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%或至少60%的同一性程度。在其它优选实施方案中，本发明的蛋白酶与SEQIDNO:2的氨基酸1-274具有至少61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%或至少70%的同一性程度。在更进一步优选的实施方案中，本发明的蛋白酶与SEQIDNO:2的氨基酸1-274具有至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%或至少80%的同一性程度。在其它优选的实施方案中，本发明的蛋白酶与SEQIDNO:2的氨基酸l-274具有至少81%、82%、83%、84%、85%、86°/。、87%、88°/。、89%或至少90%的同一性程度。在最优选的实施方案中，本发明的蛋白酶与SEQIDNO:2的氨基酸1-274具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%的同一性程度。在本文中，术语"蛋白酶"定义为水解肽一建的酶。它包括任何属于EC3.4酶组的酶(包括其中全部十三个亚类，这些酶在下文中称作"属于EC3.4,.-组")。EC号参考NC-IUBMB，AcademicPress,SanDiego，California的EnzymeNomenclature1992，包括分别在Eur.J.Biochem.1994,223，1-5;Eur.J.Biochem.1995,232,1-6;Eur.J,Biochem.1996,237,1-5;Eur.J.Biochem.1997,250，1-6;andEur.J.Biochem.1999，264,610-650中公布的补充材料1-5。所述命名法经常性地补充和更新；参见，例如环球网http:〃www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html。根据蛋白酶的催化机制将它们分成下述组丝氨酸蛋白酶(S)、半胱氨酸蛋白酶(C)、天冬氨酸蛋白酶(A)、金属蛋白酶(M)，和未知的或尚未分类的蛋白酶(U),参见HandbookofProteolyticEnzymes,A丄Barrett，N.D.Rawlings,J.F.Woessner(eds)，AcademicPress(1998)(在下文中称作"手册")，特别是简介部分。在另一个实施方案中，本发明的蛋白酶是丝氨酸蛋白酶。术语丝氨酸蛋白酶指丝氨酸肽酶和它们的同族异种体(clan)，如手册所定义，具体参见1-175章。丝氨酸蛋白酶是肽酶，其中的催化机制依赖于作为攻击肽键的亲核试剂发挥作用的丝氨酸残基的羟基。在更进一步的实施方案中，本发明的蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶和/或源自枯草杆菌蛋白酶家族。术语枯草杆菌蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶家族包括所有SB族(ClanSB)丝氨酸蛋白酶，特别是其S8家族(FamilySB)(手册中第93章介绍SB族)。为了测定指定的蛋白酶是否是枯草杆菌蛋白酶，参考手册和其中说明的原理。这种测量能够针对所有类型的蛋白酶进行，所述蛋白酶可以是天然存在的或野生型蛋白酶；或者基因工程或合成蛋白酶。在具体实施方案中，本发明的蛋白酶中催化三联体(catalytictriad)的顺序是Asp-His-Ser。在另一个具体实施方案中，本发明的蛋白酶的三级结构包括a-螺旋和p-折叠。SB族包括内肽酶和外肽酶。在更进一步具体的实施方案中，本发明的蛋白酶是内肽酶。内肽酶表现出对N-和C-末端阻断的肽底物的活性，所述底物与所述蛋白酶的特异性相关。在具体实施方案中，本发明的蛋白酶不是ProD-枯草杆菌蛋白酶或ProD-负载的枯草杆菌蛋白酶(Yabuta等，J.Biol.Chem.278:15246-51,2003)。在另一个具体实施方案中，本发明的蛋白酶不是野生型枯草芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶，和/或不源自枯草芽孢杆菌。因此，在第一方面，本发明的蛋白酶选自下组(a)属于EC3.4,.-酶组的蛋白酶；(b)丝氨酸蛋白酶；(c)肽酶SB族的枯草杆菌蛋白酶；和(d)S8家族的枯草杆菌蛋白酶。在第二方面，本发明的蛋白酶源自微生物，例如源自真菌，或源自细菌。细菌的实例是芽孢杆菌属的菌抹，如嗜碱芽孢杆菌(^a"7/^a/y^/o/7/n7w"、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌C5ac说^6rev&)、克劳氏芽孢杆菌0^"7/附daww力、环状芽孢杆菌(Ba"7/w">cw/ara)、凝结芽孢杆菌(5"c/〃wcoagwAmy)、灿烂芽孢杆菌CBacz7/t^/m^力、迟緩芽孢杆菌CBac说w/e"&力、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌(5ac〃/usmegafen.wm)、肠膜芽孢4f菌(万"c/〃wj、纳豆芽孢杆菌(^a"7/^wa加)、短小芽孢杆菌(5a"'〃wpw;w7w力、芽孢杆菌属菌种(5a"-〃wssp.)、嗜热月旨肪芽孑包杆菌(万a"7/wWeflraAe7770//7//1^)、枯草芽孢杆菌、枯草芽孑包杆菌纳豆变种(Bacillussubtilisvarnatto)或苏云金芽孢杆菌(5acz'〃wsf/wn7^&"^)的菌抹；特别是解淀粉芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、迟緩芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、肠膜芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、芽孢杆菌属菌种、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌纳豆变种的菌抹；优选地衣芽孢杆菌菌抹。在本上下文中，术语"源自，，包括可从或已从野生型菌抹获得的酶；以及，优选地，具有至少一个取代、插入和/或缺失至少一个氨基酸残基的所述酶的变体。术语变体还包括改组的(shufflant)、杂合的、嵌合的酶和共有酶(consensusenzyme)。变体可以用本领域任何已知方法产生，^口定点i秀变(site-directedmutagenesis)、卩逸才几突变、共有书亍生方法(consensusderivationprocesses)(EP897985)和基因改组(geneshuffling)(WO95/22625、WO96/00343)等。下述为本发明的蛋白酶的实例，其源自芽孢杆菌属的菌抹并且涉及下述蛋白酶SEQIDNO:2的氨基酸1-274的蛋白酶Swissprotsubt—bacli登录号P00780(源自地衣芽孢杆菌，SEQIDNO:5的氨基酸1-274);Swissprotsubn—bacna登录号P35835(源自纳豆芽孢杆菌，SEQIDNO:6的氨基酸1-275);Swissprotsubt—bacpu登录号P07518(源自短小芽孢杆菌，SEQIDNO:7的氨基酸1-275);Swissprotsubt—bacsu登录号P04189(源自枯草芽孢杆菌，SEQIDNO:8的氨基酸1-275);Swissprotsubt一bacst登录号P29142(源自嗜热脂肪芽孢杆菌，SEQIDNO:9的氨基酸1-275);Swissprotsubt—bacam登录号P00782(源自解淀粉芽孢杆菌，SEQIDNO:10的氨基酸1-275);Swissprotsubs—bacle登录号P29600(源自迟缓芽孢杆菌，SEQIDNO:11的氨基酸1-269);Swissprotelya一baccs登录号P41362(源自克劳氏芽孢杆菌，SEQIDNO:12的氨基酸1-269);和Swissprotelya_bacya登录号P20724(源自芽孢杆菌属菌种，SEQIDNO:13的氨基酸1-268);以及它们的变体，如上所定义。本发明的蛋白酶的其它具体实例是下述商业产品中包含的蛋白酶PurafectMA、Purafect、PurafectOx(变体M222S)、PurafectPrime(Y217L)、Properase(S87N+S101G+V104N)、FN3(N76D+SI03A+VI041)、FN4(S101G+S103A+V104I+G159D+A232V+Q236H+Q245R+N248D+N252K)-SEQIDNO:10的成熟部分的所有优选变体并可从Genencor/Danisco以商业方法获得；Blap(SEQIDNO:11的成熟部分，具有S99D+S101R+S103A+V104I+G160S)、BLAPR(具有S3T+V4I+V199M+V205I+L217D的Blap),和BLAPX(具有S3T+V4I+V205I的Blap)-全部来自Henkel/Kemira;和来自Kao的KAP(A230V+S256G+S259N)。在第三方面，本发明的蛋白酶是，或者能够^皮视为，SEQIDNO:2的蛋白酶的变体，即它包含SEQIDNO:2的氨基酸1-274中一个或多个氨基酸的取代、缺失和/或插入中的至少一个。优选地，氨基酸改变的性质是较不重要的(ofaminornature),即保守的氨基酸取代或插入，其不显著影响蛋白质的折叠和/或活性；小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端甲硫氨酸残基；小接头肽；或通过改变净电荷或其它功能，例如多组氨酸序列(poly-histidinetract)、抗原表位(antigenicepitope)或结合域来促进纯化的小延伸。在本文的上下文中，术语"小，，独立地表明多至25个氨基酸残基。在优选实施方案中，术语"小"独立地表明多至24、23、22、21或多至20个氨基酸残基。在其它的优选实施方案中，术语"小"独立地表明多至19、18、17、16、15、14、13、12、11或多至IO个氨基酸残基。在进一步优选的实施方案中，术语"小，，独立地表明多至9、8、7、6、5、4、3、2或多至1个氨基酸残基。在可供选择的实施方案中，术语"小"独立地表明多至40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27或多至26个氨基酸残基。保守取代的实例是在以下组之内碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(丝氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和丙氨酸)、芳族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸組(甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸和曱硫氨酸)。可供选择地，保守取代的实例是在以下组之内碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和曱硫氨酸)。通常不改变比活性(specificactivity)的氨基酸取代是本领域已知的，并且由例如H.NeurathandR丄.Hill,1979,77zePrafe/似，AcademicPress,NewYork描述。最普遍发生的交换是AWSer、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gy、AWThr、Ser/Asn、Ala賜、Ser/Gly、Tyr/Phe、A旨ro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。SEQIDNO:5-13的任何成熟蛋白酶部分的优选变体，例如SEQIDNO:13的氨基酸1-268的优选变体，包含一个或多个氨基酸的取代、缺失和/或插入中的至少一个(与亲本或祖先酶比较，例如，与SEQIDNO:13的氨基酸1-268比较)，如上述就SEQIDNO:2的氨基酸1-274的变体所解释的。更优选这些变体具有保守氨基酸取代或插入、小缺失、小接头或具有小延伸，同样如上述就SEQIDNO:2的氨基酸1-274的变体所解释的。本发明的蛋白酶变体的具体实例是SEQIDNO:11的变体99aE(参见实施例4)。在第四方面，本发明的蛋白酶具有与SEQIDNO:2的氨基酸l-274的差异不多于25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12或不多于11个氨基酸的氨基酸序列；或者，它与SEQIDNO:2的氨基酸1-274的差异不多于IO、9、8、7、6、5、4、3、2或不多于1个氨基酸。在可供选择的实施方案中，本发明的蛋白酶具有与SEQIDNO:2的氨基酸l-274的差异不多于40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27或不多于26个氨基酸的氨基酸序列。SEQIDNO:5-13的任何成熟蛋白酶部分的优选变体，例如SEQIDNO:7的氨基酸1-275的优选变体，具有与SEQIDNO:5-13中任一的成熟部分(例如SEQIDNO:7的氨基酸l-275)的差异不多于25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12或不多于11个氨基酸的氨基酸序列；或者，它们与SEQIDNO:5-13中任一的成熟部分(例如SEQIDNO:7的氨基酸l-275)的差异不多于10、9、8、7、6、5、4、3、2或不多于1个氨基酸。在第五方面，本发朋的蛋白酶是SEQIDNO:2的等位变体(优选为其成熟部分的等位变体)、SEQIDNO:5-13中任一的等位变体(优选为它们的成熟部分中任一的等位变体)或任何这些序列的具有蛋白酶活性的片段。术语等位变体表示占据相同染色体基因座的基因的任何两种或两种以上可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。术语片段在本文中定义为从SEQIDNO:2的氨基酸1-274的氨基和/或羧基末端，或者从SEQIDNO:5-13中任一的氨基和/或羧基末端，优选从其成熟部分，缺失一个或多个氨基酸的多肽。优选地，缺失小数目的氨基酸，小如上述所定义。更优选地，片段包含至少244、245、246、247、248、249或至少250个氨基酸。最优选地，片段包含至少251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272或至少273个氨基酸残基。总而言之，本发明的一个实施方案涉及用于药物用途的蛋白酶，其中a)所述蛋白酶包含选自下组的氨基#列SEQIDNO:2的氨基酸l-274、SEQIDNO:5的氨基酸1-274、SEQIDNO:6的氨基酸1-275、SEQIDNO:7的氨基酸1-275、SEQIDNO:8的氨基酸1-275、SEQIDNO:9的氨基酸1-275、SEQIDNO:10的氨基酸1-275、SEQIDNO:11的氨基酸1-269、SEQIDNO:12的氨基酸1-269和SEQIDNO:13的氨基酸1-268;和/或b)所述蛋白酶是选自下组的氨基酸序列的变体SEQIDNO:2的氨基酸1-274、SEQIDNO:5的氨基酸1-274、SEQIDNO:6的氨基酸1-275、SEQIDNO:7的氨基酸1-275、SEQIDNO:8的氨基酸1-275、SEQIDNO:9的氨基酸1-275、SEQIDNO:10的氨基酸1-275、SEQIDNO:11的氨基酸1-269、SEQIDNO:12的氨基酸1-269和SEQIDNO:13的氨基酸1-268,其中所述变体与相应氨基S吏序列的差异不多于25个氨基酸，并且其中(i)与相应的氨基酸序列相比，所述变体包含一个或多个氨基酸的取代、缺失和/或插入中的至少一个；和/或(ii)与相应的氨基酸序列相比，所述变体包含至少一个小缺失；和/或(iii)与相应的氨基酸序列相比，所述变体包含至少一个小的N-或C-末端延伸；和/或c)所述蛋白酶是具有选自下组的氨基酸的蛋白酶的变体SEQIDNO:2的氨基酸1-274、SEQIDNO:5的氨基酸1-274、SEQIDNO:6的氨基酸1-275、SEQIDNO:7的氨基酸1-275、SEQIDNO:8的氨基酸1-275、SEQIDNO:9的氨基酸1-275、SEQIDNO:10的氨基酸1-275、SEQIDNO:11的氨基酸1-269、SEQIDNO:12的氨基酸1-269和SEQIDNO:13的氨基酸1-268;和/或d)所述蛋白酶是具有选自下组的氨基酸的蛋白酶的片段SEQIDNO:2的氨基酸1-274、SEQIDNO:5的氨基酸1-274、SEQIDNO:6的氨基酸1-275、SEQIDNO:7的氨基酸1-275、SEQIDNO:8的氨基酸1-275、SEQIDNO:9的氨基酸1-275、SEQIDNO:10的氨基酸1-275、SEQIDNO:11的氨基酸1-269、SEQIDNO:12的氨基酸1-269和SEQIDNO:13的氨基酸1-268。具体而言，本发明涉及用于药物用途的蛋白酶，其中所述蛋白酶具有选自下组的氨基酸序列SEQIDNO:2的氨基酸1-274、SEQIDNO:5的氨基酸1-274、SEQIDNO:6的氨基酸1-275、SEQIDNO:7的氨基酸1-275、SEQIDNO:8的氨基酸1-275、SEQIDNO:9的氨基酸1-275、SEQIDNO:10的氨基酸1-275、SEQIDNO:11的氨基酸1-269、SEQIDNO:12的氨基酸1-269和SEQIDNO:13的氨基酸1-268。在另一个具体实施方案中，本发明的蛋白酶可以与其它蛋白酶组合使用。其它蛋白酶的实例是哺乳动物蛋白酶，和微生物蛋白酶。优选的哺乳动物蛋白酶是胰腺提取物，例如来自猪或牛(ox)，如胰酶制剂(pancreatin)。胰酶制剂可以以未包覆(未加工)产品的形式使用，或者以配方产品(formulatedproducts)的形式(包有肠溶衣的(entericcoated)(提供对胃酸的抗性)，或非功能性包覆的(包覆的，但不提供对胃酸的抗性))使用。胰酶制剂可能包含另外的酶活性组分，如胰脂肪酶、BSSL(BileSaltStimulatedLipase)和/或胰淀粉酶。优选的微生物蛋白酶源自细菌或真菌菌抹，例如源自曲霉属菌4朱，如米曲霉或蜂蜜曲霉，具体而言产品Prozyme6TM(中性、碱性蛋白酶EC3.4.21.63)，可从AmanoPharmaceuticals,Japan以商业方法获得。任选地，将本发明的蛋白酶与脂肪酶组合使用，有或没有淀粉酶，如下文进一步解释的。在本文的上下文中，脂肪酶指羧酸脂水解酶EC3丄1,,其包括活性如EC3.1.1.3三醜甘、油月旨肪酵、EC3.1.1.4石粦月旨酵A1、EC3.1.1.5;容血石粦月旨酵、EC3.1.1.26半乳糖酯酶(galactolipase)、EC3.1.1.32磷月旨酶Al、EC3丄1.73阿魏酸脂酶。在具体实施方案中，脂肪酶是EC3丄I.3三酰甘油脂肪酶。在具体实施方案中，脂肪酶是哺乳动物脂肪酶，例如来自猪或牛的胰腺提取物，如胰酶制剂。胰酶制剂可以以未包覆(未加工)产品的形式使用，或者以配方产品的形式(包有肠溶衣的，或非功能性包覆的，如上所述)使用。胰酶制剂可能包含另外的酶活性组分，如胰蛋白酶、BSSL(BileSaltStimulatedLipase),和/或胰淀粉酶。脂肪酶可以是^:生物脂肪酶，例如源自细菌或真菌菌抹，如芽孢杆菌属、假单胞菌属、曲霉属或根霉属(i/7izop"s)。脂肪酶可以具体源自根霉属的菌抹，如爪哇根霉、米根霉或德氏根霉，例如产品LipaseDAmano2000(也一尔4乍LipaseD2)，其可乂人AmanoPharmaceuticals,Japan以商业方法获得。在进一步具体的实施方案中，脂肪酶是重组产生的微生物脂肪酶，例如源自真菌如腐质霉属(7/ww/co/a)或根毛霉属CR/n'zomwcor)，源自酵母如念珠菌属(C朋AWfl)，或源自细菌如假单胞菌属。在优选实施方案中，脂肪酶源自疏棉状腐质霉或米赫才艮毛霉(i/^omwcor脂'e/ze/)的菌才朱。疏棉状腐质霉(与细毛嗜热霉(77zmwowyc^/a"wgz'"ow力同义)月旨肪酶(SEQIDNO:14)在EP305216中描述，具体的脂肪酶变体在下述文献中描述，例如WO92/05249、WO92/19726、WO94/25577、WO95/22615、WO97/04079、WO97/07202、WO99/42566、WO00/32758、WO00/60063、WO01/83770、WO02/055679和WO02/066622。优选的疏棉状腐质霉脂肪酶变体是包含SEQIDNO:15的氨基酸l-269或2-269的脂肪酶，如下述(i)SEQIDNO:15的氨基酸+1至+269，(ii)SEQIDNO:15的氨基酸-5至+269，(iii)SEQIDNO:15的氨基酸-4至+269;(iv)SEQIDNO:15的氨基酸誦3至+269;(v)SEQIDNO:15的氨基酸-2至+269;(vi)SEQIDNO:15的氨基酸-1至+269，(vii)SEQIDNO:15的氨基酸+2至+269，以及(viii)(i)-(vii)脂肪酶中的两种或更多种的任何混合物-以及它们的变体。在具体实施方案中，脂肪酶选自(i)、(ii)的脂肪酶和(i)与(ii)的任意混合物。(i)与(ii)的优选混合物包含至少5%,优选至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或至少95%的脂肪酶(i),百分比使用Edman方法通过N-末端测序确定，如要求DK专利申请200500929的优选权的PCT申请中实施例5所述)。其它优选混合物是(a)包含35-75。/。的脂肪酶(ii)，优选40-70%,更优选45-65。/。的脂肪酶(ii)的组合物；(b)包含20-60%,优选25-55%,更优选30-50%,最优选35-47。/。的脂肪酶(i)的组合物；(c)包含多至30。/。，优选多至25%，更优选多至20°/。，最优选多至16%的脂肪酶(vii)的组合物；和(d)(a)、(b)和/或(c)的任意组合，如包含45_65°/。的脂肪酶(ii)、35-47。/。的脂肪酶(i),和多至16。/。的脂肪酶(vii)的组合物。SEQIDNO:14和15的脂肪酶可例如按美国专利号5，869，438所述制备(美国专利中的SEQIDNO:1是编码SEQIDNO:14的脂肪酶的DNA序列)。SEQIDNO:15的脂肪酶可例如通过在合适的宿主细胞中重组表达DNA序列而制备，所述DNA序列是美国专利的SEQIDNO:1的修饰序列，所述修饰反映出本文的SEQIDNO:14和15之间的氨基酸差异。这些修饰可以用定点诱变实现，如本领域所了解的。真菌脂肪酶另外的实例是EP785994中所述来自特异腐质霉的角质酶(cutinase)，和EP869167中所述来自尖镰孢(Fwsan'i^o;c^pwwm)的磷脂酶。酵母脂肪酶的实例是来自南极假丝酵母(Ca"&Waa"torc"ca)的脂肪酶A和B，其中脂肪酶A在EP652945中有所描述，并且脂肪酶B由例如Uppenberg等在Structure,2(1994)，293中描述。细菌脂肪酶的实例是EP214761中所述源自洋葱々i单月包菌ce/7flc/a)的月旨肪酵。在优选实施方案中，脂肪酶与SEQIDNO:15的脂肪酶是至少70%同一的，优选与SEQIDNO:15的氨基酸1-269是至少70%同一的。在另外的优选实施方案中，对于SEQIDNO:15的同一性程度，优选对于其氨基酸1-269的同一性程度，是至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%。在可选的实施方案中，对于SEQIDNO:15的同一性程度，优选对于其氨基酸1-269的同一性程度，是至少约50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%或至少69%。在还进一步优选的实施方案中，脂肪酶，如哺乳动物胰脂肪酶，是1，3-位特异性的脂肪酶。任选地，本发明的蛋白酶，和或不和上述的脂肪酶一起，与淀粉酶组合使用。在本文的上下文中，淀粉酶是催化淀粉与其它直链和支链的寡糖和多糖的内部水解(endo-hydorlysis)的酶。淀粉的直链淀粉部分富含1,4-a-糖苦键，而支链淀粉部分更支链化，不仅包含1,4-a-糖苷键，也包含1,6-a-糖苷键。在具体实施方案中，淀粉酶是属于EC3.2.1.1组的酶。在具体实施方案中，淀粉酶是哺乳动物淀粉酶，例如来自猪或牛的胰腺提取物，如胰酶制剂。胰酶制剂可以以未包覆(未加工)产品的形式使用，或者以配方产品的形式(包有肠溶衣的，或非功能性包覆的)使用。胰酶制剂可能还包含另外的酶活性组分，如胰蛋白酶、BSSL和/或胰脂肪酶。淀粉酶还可以是微生物淀粉酶，例如源自细菌或真菌菌抹，如芽孢杆菌属、假单胞菌属、曲霉属或根霉属。淀粉酶可以特别地源自曲霉属的菌林，如黑曲霉、米曲霉或蜂蜜曲霉，例如源自米曲霉的产品AmylaseA1，其可乂人AmanoPharmaceuticals，Japan以商业方法获得，或源自蜂蜜曲霉的AmylaseECTM，其可从Extract-Chemie,Germany以商业方法获得。真菌淀粉酶的其它实例是黑曲霉淀粉酶(SWISSPROTP56271),其也在WO89/01969的实施例3中描述，和米曲霉淀粉酶。米曲霉淀粉酶的变体的实例在WO01/34784中描述。源自地衣芽孢杆菌的a-淀粉酶是细菌a-淀粉酶的实例。该淀粉酶，例如，在WO99/19467中描述，其中还描述有其它同源的细菌a-淀粉酶，例如，源自解淀粉芽孢杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌的淀粉酶，以及它们的变体。其它淀粉酶变体的实例是美国专利号4,933,279、EP722490和EP904360中描述的那些。优选的淀粉酶是包含下述序列的淀粉酶SEQIDNO:16的氨基酸1-481(如其氨基酸1-4S1、1-484或1-486),SEQIDNO.'17的氨基酸1-481,和/或SEQIDNO:18的氨基酸1-483。在优选实施方案中，淀粉酶与下述的任一是至少70%同一的:(i)SEQIDNO:16的氨基酸1-481，(ii)SEQIDNO:17的氨基酸1-481,和/或(iii)SEQIDNO:18的氨基酸1-483。SEQIDNO:16-18的淀粉酶可例如按共同待审的丹麦专利申请号200500931所述的制备，所述申请的标题为"用作医疗用途的淀粉酶(AmylasesforPharmaceuticalUse)",由PharmaceuticalsGmbH和NovozymesA/S于2005年6月24日提出申i青。在(i)、(ii)或(m)中任一的其它优选实施方案中，对于SEQIDNO:16、17或18的对应部分的同一性程度是至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%。在可供选择的实施方案中，对于SEQIDNO:16、17或18的对应部分的同一性程度是至少约50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%或至少69%。就本发明而言，酶的特别优选的组合为下述(i)SEQIDNO:2的氨基酸1-274的蛋白酶，与包含SEQIDNO:15的氨基酸1-269或2-269的脂肪酶组合；(ii)SEQIDNO:2的氨基酸l-274的蛋白酶，与包含SEQIDNO:16的氨基酸1-481(如其氨基酸1-481、1-484或l-486)的淀粉酶组合；(iii)SEQIDNO:2的氨基酸1-274的蛋白酶，与具有SEQIDNO:17的氨基酸1-481的淀粉酶组合；(iv)SEQIDNO:2的氨基酸1-274的蛋白酶，与具有SEQIDNO:18的氨基酸1-483的淀粉酶组合；(v)SEQIDNO:2的氨基酸1-274的蛋白酶，与包含SEQIDNO:16的氨基酸1-481(如其氨基酸1-481、1-484或l-486)的淀粉酶，和包含SEQIDNO:15的氨基酸1-269或2-269的脂肪酶组合；(vi)SEQIDNO:2的氨基酸1-274的蛋白酶，与具有SEQIDNO:17的氨基酸1-481的淀粉酶，和包含SEQIDNO:15的氨基酸1-269或2-269的脂肪酶组合；和(vii)SEQIDNO:2的氨基酸1-274的蛋白酶，与具有SEQIDNO:18的氨基酸1-483的淀粉酶，和包含SEQIDNO:15的氨基酸1-269或2-269的脂肪酶组合。因此，本发明的一个实施方案涉及与脂肪酶和/或淀粉酶组合用于药物用途的蛋白酶，其中(i)所述蛋白酶是本文定义的蛋白酶;(U)所述脂肪酶包含SEQIDNO:15的氨基酸2-269;并且(iii)所述淀粉酶是选自下组的淀粉酶a)包含SEQIDNO:16的氨基酸1-481的淀粉酶，b)具有SEQIDNO:17的氨基酸1-481的淀粉酶，和c)具有SEQIDNO:18的氨基酸1-483的淀粉酶。具体而言，本发明涉及与脂肪酶和/或淀粉酶组合用于药物用途的蛋白酶，其中(i)所述蛋白酶包含或优选是，或具有，SEQIDNO:2的氨基酸1-274;(ii)所述脂肪酶包含SEQIDNO:15的氨基酸2-269;并且(iii)所述淀粉酶是选自下组的淀粉酶a)包含SEQIDNO:16的氨基酸1-481的淀粉酶，b)具有SEQIDNO:17的氨基酸1-481的淀粉酶，和c)具有SEQIDNO:18的氨基酸1-483的淀粉酶。酶的其它优选组合是下述(i)与SEQIDNO:2的氨基S臾1-274具有至少50%同一性的蛋白酶，和与SEQIDNO:15的氨基酸1-269具有至少50%同一性的脂肪酶组合；(ii)与SEQIDNO:2的氨基酸1-274具有至少50%同一性的蛋白酶，和与SEQIDNO:16的氨基酸1-481具有至少50%同一性的淀粉酶组合；(iii)与SEQIDNO:2的氨基酸1-274具有至少50%同一性的蛋白酶，和与SEQIDNO:17的氨基酸1-481具有至少50%同一性的淀粉酶组合；(iv)与SEQIDNO:2的氨基酸1-274具有至少50°/。同一性的蛋白酶，和与SEQIDNO:18的氨基酸1-483具有至少50%同一性的淀粉酶组合；(v)与SEQIDNO:2的氨基酸1-274具有至少50%同一性的蛋白酶，和与SEQIDNO:16的氨基酸1-481具有至少50%同一性的淀粉酶，及与SEQIDNO:15的氨基酸1-269具有至少50%同一性的脂肪酶组合；(vi)与SEQIDNO:2的氨基酸1-274具有至少50%同一性的蛋白酶，和与SEQIDNO:17的氨基酸1-481具有至少50%同一性的淀粉酶，及与SEQIDNO:15的氨基酸1-269具有至少50%同一性的脂肪酶组合；和(vii)与SEQIDNO:2的氨基酸1-274具有至少50°/。同一性的蛋白酶，和与SEQIDNO:18的氨基酸1-483具有至少50%同一性的淀粉酶，及与SEQIDNO:15的氨基酸1-269具有至少50%同一性的脂肪酶组合。在(i)-(vii)的优选实施方案中，每个同一性程度独立为，至少51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%65%、66%、67%、68。/。、69%、70%77%、78%、79%、80%、81%、82%89%、90%、91%、92%、93%、94%因此，本发明的一个实施方案涉及与脂肪酶和/或淀粉酶组合用于药物用途的蛋白酶，其中(i)所述蛋白酶选自下组a)与SEQIDNO:2的氨基酸1-274具有至少50%同一性的蛋白酶；b)包含选自下組的氨基酸序列的蛋白酶SEQIDNO:2的氨基酸1-274、SEQIDNO:5的氨基酸1-274、SEQIDNO:6的氨基酸1-275、SEQIDNO:7的氨基酸1-275、SEQIDNO:8的氨基酸1-275、、59%、60%、61%、62%、63%、64%、、71%、72%、73%、74%、75%、76%、、83%、84%、85%、86%、87%、88%、、95%、96%、97%、98%或至少99%。SEQIDNO:9的氨基酸l-275、SEQIDNO:10的氨基酸1-275、SEQIDNO:11的氨基S交1-269、SEQIDNO:12的氨基酸1-269和SEQIDNO:13的氨基酸1-268;c)选自下组的氨基酸序列的变体的蛋白酶SEQIDNO:2的氨基酸1-274、SEQIDNO:5的氨基酸1-274、SEQIDNO:6的氨基酸1-275、SEQIDNO:7的氨基酸1-275、SEQIDNO:8的氨基酸1-275、SEQIDNO:9的氨基酸1-275、SEQIDNO:10的氨基酸1-275、SEQIDNO:11的氨基酸1-269、SEQIDNO:12的氨基酸1-269和SEQIDNO:13的氨基酸1-268,其中所述变体与相应氨基酸序列的差异不多于25个氨基酸，并且其中(i)与相应的氨基酸序列相比，所述变体包含一个或多个氨基酸的取代、缺失和/或插入中的至少一种；和/或(ii)与相应的氨基酸序列相比，所述变体包含至少一个小缺失；和/或(iii)与相应的氨基酸序列相比，所述变体包含至少一个小的N-或C-末端延伸；d)蛋白酶，其是具有选自下组的氨基酸的蛋白酶的等位变体SEQIDNO:2的氨基酸1-274、SEQIDNO:5的氨基酸1-274、SEQIDNO:6的氨基酸1-275、SEQIDNO:7的氨基酸1-275、SEQIDNO:8的氨基酸1-275、SEQIDNO:9的氨基酸1-275、SEQIDNO:10的氨基酸1-275、SEQIDNO:11的氨基酸1-269、SEQIDNO:12的氨基酸1-269和SEQIDNO:13的氨基酸1-268;e)蛋白酶，其是具有选自下组的氨基酸的蛋白酶的片段SEQIDNO:2的氨基酸1-274、SEQIDNO:5的氨基酸1-274、SEQIDNO:6的氨基酸1-275、SEQIDNO:7的氨基酸1-275、SEQIDNO:8的氨基酸1-275、SEQIDNO:9的氨基酸1-275、SEQIDNO:10的氨基酸1-275、SEQIDNO:11的氨基酸1-269、SEQIDNO:12的氨基酸1-269和SEQIDNO:13的氨基酸1-268;和f)具有选自下组的氨基酸序列的蛋白酶SEQIDNO:2的氨基酸1-274、SEQIDNO:5的氨基酸1-274、SEQIDNO:6的氨基酸1-275、SEQIDNO:7的氨基酸1-275、SEQIDNO:8的氨基酸1-275、SEQIDNO:9的氨基酸1-275、SEQIDNO:10的氨基酸1-275、SEQIDNO:11的氨基酸1-269、SEQIDNO:12的氨基酸1-269和SEQIDNO:13的氨基酸1-268;(ii)所述脂肪酶与具有SEQIDNO:15的氨基酸1-269的脂肪酶有至少70%同一性；并且(iii)所迷淀粉酶与选自下组的淀粉酶有至少70%同一性a)具有SEQIDNO:16的氨基酸1-481的淀粉酶，b)具有SEQIDNO:17的氨基酸1-481的淀粉酶，和c)具有SEQIDNO:18的氨基酸1-483的淀粉酶。通常而言，蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶(下文称作"酶"，即本发明的酶)可以是天然或野生型酶(获得自动物，特别是哺乳动物，例如人或猪的酶；获得自植物，或获得自微生物)，也可以是任何其显示期望的酶活的突变体、变体、片段等，以及合成酶，如改组、杂交或嵌合酶，和共有酶。在特定的实施方案中，酶是低变应原性变体，将所述酶设计成当曝露于动物包括人时产生降低的免疫应答。术语免疫应答可以理解为由曝露于酶的动物的免疫系统产生的任何反应。免疫应答的一种类型是变应性应答，其导致曝露的动物中IgE的水平增加。低变应原性变体可以使用本领域已知的技术制备。例如可将酶与聚合物基团屏蔽部分(polymermoietiesshieldingportion)或者免疫应答涉及的酶的表位结合。与聚合物的结合可涉及聚合物对酶的体外化学偶联，例如，如WO96/17929、WO98/30682、WO98/35026和/或WO99/00489所述。所述结合可以另外或可选地涉及聚合物对酶的体内偶联。这种结合可以用下述方法实现编码酶的核酸序列的基因工程，在酶中插入编码额外糖基化位点的共有序列和在能够将酶糖基化的宿主中表达酶，参见例如WO00/26354。提供低变应原性变体的另一种方法是编码酶的核酸序列的基因工程，以引起酶的自寡聚，致使所述酶单体可屏蔽其它酶单体的表位，并且由此降低寡聚体的变应原性。这些产品和它们的制备在例如WO96/16177中有所描述。免疫反应涉及的表位可以由各种方法鉴定，如WO00/26230和WO01/83559中所述的噬菌体展示方法，或EP561907中所述的随机方法。一旦将表位鉴定，可通过已知的基因操作技术，如定向诱变(参见例如WO00/26230、WO00/26354和/或WO00/22103)改变它的氨基S吏序列以产生改变的酶的免疫性质，和/或可在足够接近表位处进行聚合物的结合，以使聚合物屏蔽所述表位。在具体实施方案中，酶为(i)在pH2-8稳定，优选也在pH3-7稳定，更优选在pH4-6稳定；(ii)在pH4-9，优选4-8有活性;(iii)对胃蛋白酶和其它消化蛋白酶(如月夷蛋白酶(pancreasprotease),即主要为月夷蛋白酶(trypsin)和月夷凝乳蛋白酶)的降解稳定；和/或(iv)在胆汁盐存在下稳定和/或有活性。优选地，本发明的蛋白酶是酸稳定的，这表示即使在持续曝露于酸性环境后，纯蛋白酶仍然保持有活性。优选地，保留活性是已知用于药物用途的比较蛋白酶的保留活性的1.1、1.2、1.3、1.5、1.6、1.8、2.0、2.5和3.0倍高。在进一步具体的实施方案中，酸稳定性指将纯蛋白酶稀释到相当于A280=1.0，之后在緩沖液(100mM琥珀酸、100mMHEPES、100mMCHES、100mMCABS、1mMCaCl2、150mMKC1、0.010/0TritonX-100,pH3.5)中于37。C温育2小时，如使用WO01/58276的实施例2C中所述试验方法测定的(底物Suc-AAPF-pNA，pH9.0，25°C)，所述纯蛋白酶的活性是参照活性(referenceactivity)的至少40%(或至少45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或至少97%)。术语参照活性指相同蛋白酶在以下处理之后的蛋白酶活性将所述蛋白酶以纯的形式温育，稀释至A28o=1.0,在緩沖液(IOOmM琥珀酸、100mMHEPES、100mMCHES、100mMCABS、lmMCaCl2、150mMKCl、0.01%TritonX-100，pH9.0)中于5。C温育2小时，其中所述酶活性用如上所述方法确定。术语A280=l.O指所述纯蛋白酶的这样的浓度(稀释度)其在1cm通径长度(pathlength)的比色皿中，于280nm相对于緩冲液空白产生1.0的吸光度。术语纯蛋白酶指A28o/A26()比率在1.70以上或等于1.70的样品(参见WO01/58276的实施例2E),并且通过扫描考马斯染色的SDS-PAGE凝胶测得所述样品在对应于所述蛋白酶的条带中具有该样品扫描密度的至少95%(参见WO01/58276的实施例2A)。术语"与......组合"指根据本发明的蛋白酶、脂肪酶和/或淀粉酶的组合用途。組合用途可以是同时的、重叠的或顺序的，这三个术语通常按照医师的处方来解释。术语"同时的，，指酶同时有活性的环境，例如当它们作为一种或多种单独的药物产品同时施用时，或者如果将它们在一种和同样的药物组合物中施用时。术语"顺序的，，指这样的情况，其中一种和/或两种酶先作用，而第二种和/或第三种酶随后作用。顺序的作用能够这样获得将所述酶作为单独的药物制剂施用，中间有期望的间歇；或者作为一种药物组合物施用，其中对所述酶进行不同的配制(区分)，例如为了获得不同的释放时间，提供改进的产品稳定性，或为了最优化酶剂量。术语"重叠的，，指这样的情况，其中酶活性时期既不完全是同时的，也不完全是顺序的，即存在特定的时期，其中两种酶或全部酶都有活性。术语"一"，例如当用于本发明的酶的上下文中时，指至少一种。在具体实施方案中，"一"表示"一种或多种"或"至少一种"，其也表示一种、两种、三种、四种、五种等。用参数"同一性，，描述两个氨基酸序列之间的相关性。对于本发明，通过使用来自EMBOSS软件包(http:〃emboss.org)2.8.0版的Needle程序，确定两个氨基酸序列之间的比对。Needle程序运行Needleman,S.B.andWunsch,C.D,(1970)J.Mol.Biol.48,443-453所述的全局比对算法(globalalignmentalgorithm)。Y吏用的耳又头巨卩车(substitutionmatrix)是BLOSUM62,缺口开放罚分(gapopeningpenalty)是10，缺口延伸罚分(gapextensionpenalty)是0.5。本发明的氨基酸序列("发明序列"；例如SEQIDNO:2的氨基酸1-274)与不同的氨基酸序列("外源序列"；例如WO2005/115445的SEQIDNO:1的氨基酸1-188)之间的同一性程度这样计算将两个序列的比对中完全匹配的氨基酸数目，除以"发明序列"的长度或"外源序列"的长度中较短的一个。结果以百分比同一性表示。当"发明序列"和"外源序列"在重叠中的同样位置具有同一的氨基酸残基时(在下述比对实例中用T表示)，则发生完全匹配。序列的长度是序列中氨基酸残基的数目(例如SEQIDNO:2的长度是274)。在下述完全假设的比对实例中，重叠是序列1的氨基酸序列"HTWGER-NL";或序列2的氨基酸序列"HGWGEDANL"。在所述实例中，缺口用"-"表示。假设的比对实例序歹'J1:ACMSHTWGER—NL序歹寸2:HGWGEDANLAMNPS因此，序列1对序列2的同一性百分比是6/12=0.5,对应于50%。在具体实施方案中，多肽的氨基酸序列与(w池)，或对于(to),SEQIDNO:2的氨基酸1-274的同一性百分比用如下方法确定i)使用Needle程序比对两个氨基S吏序列，使用BLOSUM62置换矩阵，缺口开放罚分为10，并且缺口延伸罚分为0.5;ii)计算比对中完全匹配的数目；iii)将完全匹配的数目除以两个氨基酸序列中最短序列的长度，和iv)将iii)中除法的结果转换成百分比。或者，两个氨基酸序列的同一性程度可以用程序"比对，，确定，所述程序"比对"为Needleman-Wunsch比对(即全局比对)。将序列通过所述程序比对，使用默认的记分矩阵BLOSUM50。缺口的第一个残基的罚分是12,对于缺口其它残基的罚分是2。Needleman-Wunsch算法在Needleman，S.B.andWunsch,C.D.,(1970),JournalofMolecularBiology,48:443-453中有描述，并且所述比对程序由Myers和W.Miller在"OptimalAlignmentsinLinearSpace"CABIOS(computerapplicationsinthebiosciences)(1988)4:11-17中描述。"比对"是FASTA软件包v20u6版的一部分(参见W.R.PearsonandD.J.Lipman(1988),"ImprovedToolsforBiologicalSequenceAnalysis",PNAS85:2444-2448,和W.R.Pearson(1990)"RapidandSensitiveSequenceComparisonwithFASTPandFASTA"MetodsinEnzymology183:63-98)。本发明的任何酶的样品序列或测试序列，与指定序列之间的同一性程度可以按照如下方法确定使用程序"比对，，来比对所述两个序列。确定比对中完美匹配的数目("N-完美-匹配")(完美匹配指比对中相同位置上为相同的氨基酸残基)。也确定两个进行比对的序列的共有长度(commonlength),即比对(重叠)中氨基酸的总数，包括比对产生的拖尾和前导缺口，如果存在任何这样的缺口("N-重叠")。将同一性程度作为"N-完美-匹配"和"N-重叠，，之间的比率计算(如果要转换成同一性百分比，则乘以100)。样品序列或测试序列与特定序列之间的同一性程度可以按照如下方法确定使用软件"比对"来比对所述序列。确定比对中完美匹配的lt目("N-完美-匹配")(完美匹配指比对中的相同位置上是相同的氨基酸残基)。确定样品序列的长度(氨基酸残基数)("N-样品")。将同一性程度作为"N-完美-匹配"和"N-样品，，之间的比率计算(如果要转换成同一性百分比，则乘以100)。样品序列或测试序列与特定序列之间的同一性程度也可以按照如下方法确定使用软件"比对"来比对所述序列。确定比对序列中完美匹配的数目("N-完美-匹配")(完美匹配指比对中的相同位置上是相同的氨基酸残基)。确定指定序列的长度(氨基酸残基数)("N-指定")。将同一性程度作为"N-完美-匹配"和"N-指定，，之间的比率计算(如果要转换成同一性百分比，则乘以100)。优选地，重叠是指定序列的至少20。/。("N-重叠"如上所定义，除以指定序列中氨基酸的数目("N-指定，，)，乘以100),更优选为至少25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或至少95%。这表示当将样品序列与指定序列比对时，指定序列的氨基酸的至少20%(优选25-95%)最终包括于重叠中。或者，重叠是指定序列的至少20。/。("N-重叠"如上所定义，除以如上所定义的"N-样品"，乘以100)，更优选为至少25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或至少95%。这表示当与指定序列比对时，样品序列的氨基酸的至少20°/。(优选25-95°/。)最终包括于重叠中。本发明的酶的活性能够使用任何合适的试验方法测定。通常，可使试验-pH和试-睑-溫度适合于所述酶。试-睑-pH值的实例是pH2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。试验-温度的实例是30、35、37、40、45、50、55、60、65、70、80、90或95。C。优选的pH值和温度是在生理范围，如pH值4、5、6、7或8，和温度30、35、37或40。C。例如，蛋白酶活性能够使用任何试验测定，其中使用底物，所述底物包括相应于所迷蛋白酶的特异性的肽键。实验部分包括了合适的酶试验方法的实例，具体参见实施例2。其它实例是用于脂肪酶和淀粉酶活性的FIP或Ph.Eur.试验。药物在本文的上下文中，术语"药物"指化合物，或化合物的混合物，其治疗、预防和/或减轻疾病的症状，优选治疗和/或减轻疾病的症状。药物可以由医师开出处方，或者可以是非处方(over-the-counter)产品。药物组合物本发明的酶的分离、纯化和浓缩可以通过常规方法进行。例如，它们可以通过常规方法从发酵培养液中回收，所述常规方法包括但不限于，离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，并用本领域已知的各种方法进一步纯化，所述方法包括但不限于，层析(例如，离子交换、亲和、疏水、色谱聚焦和尺寸排阻)、电泳方法(例如，制备型等电聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或萃取(参见，例如，ProteinPurification,J.画CJansonandLarsRyden，editors,VCHPublishers,NewYork,1989)。本发明的纯蛋白酶的制备在本文的实施例1中描述。在这个实例中，从地衣芽孢杆菌生产菌抹中，用定点诱变缺失编码所谓组分C蛋白酶(SEQIDNO:4,由SEQIDNO:3编码)的基因，如本领域所知。缺失这个基因的另一种方法可以是，例如，传统突变(classicalmutation),例如美国专利号4,266,031所述，优选与现有技术的高通量筛选方法组合使用。在实施例1中，表达SEQIDN0:2的蛋白酶的细胞源自地衣芽孢杆菌的野生型菌抹，即菌抹ATCC14580，其可从美国典型培养物保藏中心ATCC(AmericanTypeCultureCollection)公开获得。可以优选地将编码本发明的蛋白酶的基因的一个或多个额外拷贝插入该细胞中，所述基因例如编码SEQIDNO:2的氨基酸1-274的基因。这可以例如按WO02/00907所述，使用例如WO99/43835中公开的启动子实现。在具体实施方案中，将每个酶的浓缩固体或液体制备物单独制备。这些浓缩物也可以，至少部分地，单独进行配制，如下所详细解释的。在进一步具体的实施方案中，将酶以固体浓缩物形式包括于本发明的药物组合物中。酶能够通过本领域已知的各种方法形成固态。例如，固态可以是结晶，其中酶分子以高度有序的形式排列；或者是沉淀物，其中酶分子排列形式有序性较低，或者是无序形式。结晶可以例如在接近酶的pi的pH和低电导率实现，所述电导率例如10mS/cm或更低，如EP691982所述。各种沉淀方法在本领域已知，包括用盐沉淀，如硫酸铵，和/或硫酸钠；用有机溶剂沉淀，如乙醇，和/或异丙醇；或者用聚合物，如PEG(聚乙二醇)。或者，酶能够用本领域已知的各种方法通过去除溶剂(通常为水)而从溶液沉淀，所述方法例如冻干、蒸发(例如在减少的压力下)，和/或喷雾干燥。在进一步具体的实施方案中，酶的固体浓缩物中活性酶蛋白的含量为固体浓缩物中总蛋白含量的至少50%(重量/重量)。在还进一步具体的实施方案中，活性酶蛋白的含量相对于固体浓缩物的总蛋白含量是至少55、60、65、70、75、80、85、90或至少95%(重量/重量)。蛋白含量能够如本领域已知的进行测量，例如通过密度计扫描考马斯染色的SDS-PAGE凝胶；通过使用商业试剂盒，如ProteinAssayESL,定购号1767003,其可从Roche以商业方法获得；或根据WO01/58276的实施例8所述的方法。优选地，用密度计扫描考马斯染色的SDS-PAGE凝胶进行测定时，蛋白酶酶蛋白组成根据本发明使用的固体蛋白酶浓缩物的至少50%，更优选至少55、60、65、70、75、80、85、90、92、94、95、96或至少97%。本发明的药物组合物包含酶，所述酶优选以浓缩酶制备物的形式，更优选以固体浓缩物的形式，并有至少一种可药用的辅助材料或补充(subsidiary)材料，如(i)至少一种载体和/或赋型剂；或(ii)至少一种载体、赋型剂、稀释剂，和/或佐剂。任选的其它组分的非限定性实例(全部为可药用的)是崩散剂(disintegrator)、润滑剂、緩沖剂、增湿剂、防腐剂、增香剂、溶剂、增溶剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂、推进剂和媒介物(vehicle)。通常，根据所述医学适应症，可以针对本领域已知的所有施用方式来设计本发明的组合物，优选包括肠内施用(通过消化道)。因此，组合物可以为固体、半固体、液体或气体形式，如片剂、胶嚢、粉剂、颗粒剂(granule)、微球(microsphere)、软膏、乳膏(cream)、泡沫、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶、微球、洗剂(lotion)和气溶胶。医务工作者将了解选择最合适的施用途径，并理所应当地避免潜在的危险或不利的施用途径。下述方法和辅助材料因此也仅作为示例性而绝非用以限制。对于固体口服制备物，所述酶能够单独使用或与合适的添加剂组合使用，以制成小丸(pellet)、微丸(micropdlet)、片剂、微片剂、粉剂、颗粒剂或胶嚢，例如，与常规载体组合使用，如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或马铃薯淀粉；与赋型剂或粘合剂组合使用，如结晶状或微结晶状纤维素、纤维素衍生物、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；与崩散剂组合使用，如玉米淀粉、马铃薯淀粉或欺曱基纤维素钠；与润滑剂组合使用，如巴西棕榈蜡、白蜡、虫胶、无水胶状硅石(waterlesscolloidsilica)、从1500到20000的聚乙二醇(PEG，也称作macrogol)，特别是PEG4000、PEG6000、PEG8000，聚维酮，滑石，monolein或硬脂酸镁；并且如果需要，与稀释剂、佐剂、緩沖剂、润湿剂、防腐剂如对羟基苯曱酸曱酯(E218)、着色剂如二氧化钛(E171),和增香剂如蔗糖、糖精、橙油、柠檬油和香兰素组合使用。口服制备物是用于治疗PEI的医学适应症的优选制备物的实例。还能够将所述酶非常常规地配制成液体口服制备物,通过将它们溶解、悬浮或乳化在水溶剂如水中，或非水溶剂中，如植物性或其它类似的油、合成的脂肪族酸甘油酯、高级脂肪族酸的酯、丙二醇、聚乙二醇如PEG4000，或低级醇，如直链或支链C1-C4醇，例如2-丙醇；并且如果需要，与常规补充材料或添加剂组合使用，如增溶剂、佐剂、稀释剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂。此外，所述酶可通过与各种基底(bases)例如乳化基底(emulsifyingbase)或水溶性基底(water-solublebase)混合制成栓剂用于直肠施用。所述栓剂可包括在体温熔化而在室温固化的媒介物如可可豆油、碳蜡和聚乙二醇。使用脂质体作为递送媒介物也是一种通常可能感兴趣的方法。脂质可以是已知的脂质体形成脂质的任何有用组合，包括阳离子或两性离子的脂质，例如磷脂酰胆碱。剩余的脂质通常将是中性或酸性脂质，例如胆固醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油等。对于制备脂质体，可以使用Kato等(1991)J.Biol.Chem.266:3361所述的方法。可以提供用于口服或直肠施用的单位剂型如浆、酏剂、粉剂和悬浮剂，其中每剂量单位，例如，一茶匙、一大汤匙、胶嚢、片剂或栓剂，包含预先定量的酶。相似地，用于注射的单位剂型可将酶包含在作为无菌水、生理盐水或其它可药用载体的溶液的组合物中。术语"单位剂型"用于本文指适合作为人和动物受试者单元剂量(unitarydosage)的物理上的离散单位(physicallydiscreteunit),每单位含有预先定量的酶，所计算的量足以产生期望效果。在具体实施方案中，本发明的药物组合物用于肠内施用，优选口服施用。在进一步具体的实施方案中，口服组合物是(i)包含酶晶体的液体组合物；(ii)(高度)纯化酶的沉淀的液体悬浮液；(iii)包含固体或溶解的酶的凝胶；(iv)固定化酶或吸附于颗粒上的酶等的液体悬浮剂；或(v)以含酶粉剂、小丸、颗粒剂或微球形式存在的固体组合物，如果需要，以片剂、胶嚢等形式存在的固体组合物，可任选地将所述固体组合物包覆，例如用酸稳定的包覆物。在组合物的另一个具体的实施方案中，对酶进行区分(compartmentalize),即彼此分离，例如通过分离包覆的方法。在组合物的还进一步具体的实施方案中，将蛋白酶与组合物的其它酶组分分隔，所述其它酶组分如脂肪酶和/或淀粉酶。酶的剂量变化很大，其依赖于所施用的特定的酶、施用频率、施用方式、症状的严重性和受试者对副作用的易感性等。一些特定的酶可能比其它的酶更有效。本发明的酶的固体口服制备物的实例包含(i)本发明的蛋白酶，其包含与SEQIDNO:2的氨基酸1-274具有至少50%同一性的氨基酸序列；(ii)脂肪酶，其与具有SEQIDNO:15的氨基酸1-269的脂肪酶有至少70%同一性；和(iii)淀粉酶，其与选自下组的淀粉酶具有至少70。/。同一性a)具有SEQIDNO:16的氨基酸1-481的淀粉酶，b)具有SEQIDNO:17的氨基酸1-481的淀粉酶，和c)具有SEQIDNO:18的氨基酸1-483的淀粉酶；其中优选地，(i)、(ii)和(iii)的酶的预期每日临床剂量如下(全部以mg酶蛋白每kg体重(bw)表示)对于(i)的蛋白酶0.005-500、0.01-250、0.05-100或0.1-50mg/kgbw;对于(ii)的脂肪酶0.01-1000、0.05-500、0.1-250或0.5-100mg/kgbw;对于(iii)的淀粉酶0.001-250、0.005-100、0.01-50或0.05-10mg/kgbw。本发明的酶的固体口服制备物的优选实例包含(i)包含，优选具有，SEQIDNO:2的氨基酸1-274的蛋白酶；(ii)包含SEQIDNO:15的氨基酸2-269的脂肪酶，和/或(iii)包含SEQIDNO:16的氨基酸1-481的淀粉酶。(i)、(ii)和(iii)的酶的预期每日临床剂量的实例如下(全部以mg酶蛋白每kg体重(bw)表示)对于(i)的蛋白酶0.05-100、0.1-50或0.5-25mg/kgbw;对于(ii)的脂肪酶0.1-250、0.5-100或1-50mg/kgbw;对于(iii)的淀粉酶0.01-50、0.05-10或0.1-5mg/kgbw。为了口服施用时更好的稳定性，可对酰胺(肽)键以及氨基和羧基末端进行修饰。例如，可将羧基末端酰胺化。本发明的药物组合物的具体实施方案，其适合于治疗消化性病症、PEI、胰腺炎、嚢性纤维化、i型糖尿病和/或n型糖尿病，可通过将本发明的酶并入小丸中来制备。所述小丸通常可包含10-90%(重量/重量，相对于所得小丸的干重)生理上可以接受的有机聚合物，10-90%(重量/重量，相对于所得小丸的干重)的纤维素或纤维素衍生物，和80-20%(重量/重量，相对于所得小丸的干重)的酶，每种情况下，使有机聚合物、纤维素或纤维素衍生物和酶的总量满足100%。生理上可以接受的有机聚合物可选自下组聚乙二醇1500、聚乙二醇2000、聚乙二醇3000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000、聚乙二醇10000、聚乙二醇20000、羟丙基曱基纤维素、聚氧化乙烯(polyoxyethylen)、聚氧化乙烯-聚氧化丙烯共聚物(copolymersofpolyoxyethylene-polyoxypropylen)和所述有机聚合物的混合物。聚乙二醇4000优选作为生理上可以接受的有机聚合物。纤维素或纤维素衍生物可以例如选自纤维素、乙酸纤维素、纤维素脂肪酸酯、硝酸纤维素、纤维素醚、羧曱基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、曱基纤维素、曱基乙基纤维素和甲基羟丙基纤维素。纤维素，特别是微晶纤维素优选作为纤维素或纤维素衍生物。所得小丸可以用合适的肠溶衣包覆，用其它非功能性包覆物包覆或不进行这种包覆地直接使用。此外，可将所得小丸填充入胶嚢如硬明胶胶嚢或不含明胶的胶嚢，所述胶嚢的大小适合治疗上文详细描述的病症或疾病。在本发明的实施方案中，产生自不同酶类型，特别是产生自脂肪酶、蛋白酶和/或淀粉酶的小丸，可以填充入所述胶嚢。当用不同酶类型填充胶嚢时，通过向胶嚢添加指定量的脂肪酶、蛋白酶和/淀粉酶中的任一种，可使单一酶类型(即脂肪酶、蛋白酶或淀粉酶)的定量适合于某种适应症组或某种患者亚组的特定需要，即可产生其中脂肪酶蛋白酶淀粉酶的特定比例不同的胶嚢。本发明的脂肪酶的优选药物组合物在WO2005/092370中描述，特别是包含本文提到的优选赋形剂的制剂。在特别优选的实施方案中，药物组合物包含单、二和三酰基甘油酯和聚乙二醇(PEG)C6-C22脂肪族羧酸的单和二酯的聚乙二醇甘油酯(macrogolglyceride)混合物，并且也可能包含小部分的甘油和游离聚乙二醇。包含于聚乙二醇甘油酯混合物中的聚乙二醇(PEG)优选为平均每分子有6个到最多40个环氧乙烷单元的PEG,或优选为分子量在200-2000的PEG。本发明的另一个方面提供本发明的酶的药物组合物，其包含由表面活性剂、共表面活性剂(co-surfactant)和亲脂相组成的体系，所述体系具有大于或等于10的HLB(亲水-亲脂平衡，Hydrophilic-LipophilicBalance)和高于或等于30。C的熔点。在优选实施方案中，所述体系具有10-16的HLB,优选12-15，和30-60(TC的熔点，优选在40-50(TC。具体而言，通过HLB值和熔点表征的体系是单、二和三酰基甘油酯与聚乙二醇(PEG)和脂肪族羧酸的单和双酯的混合物，所述脂肪族羧酸具有8-20个碳原子，优选8-18个，而聚乙二醇优选每分子具有大约6至大约32个环氧乙烷单元，并且所述体系任选地包含游离甘油和/或游离聚乙二醇。这种体系的HLB值优选用PEG的链长调控。这种体系的熔点通过脂肪酸的链长、PEG的链长和脂肪酸链的饱和度调控，并且因此受到制备聚乙二醇甘油酯混合物的起始油(startingoil)的调控。"C8-C18脂肪族羧酸"指混合物，其中将辛酸(C8)、癸酸(CIO)、月桂酸(C12)、肉豆蔻酸(C14)、椋榈酸(C16)和硬脂酸(C18)以重要而可变的比例包含在内，如果这些酸是饱和的，则还包括相应的不饱和C8-C18羧酸。这些脂肪酸的比例可以根据起始油而变化。这样的单、二和三酰基甘油酯和聚乙二醇(PEG)与脂肪族羧酸的单和二酯的混合物，其中所述脂肪族羧酸带有8-18个碳原子，所述混合物可以例如用聚乙二醇和起始油的反应获得，其中聚乙二醇的分子量在200-1500,并且所述起始油由带有脂肪酸的甘油三酸酯混合物组成，所述脂肪酸选自包含以下脂肪酸的组辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚麻酸，单独存在或者作为混合物。任选地，这种反应的产物也可包含小比例的甘油和游离聚乙二醇。这些混合物可以商业方法获得，例如以商品名Gelucire⑧。本发明的一个有优势的实施方案提供商品名为Gelucire⑧的商品，特别是"Gelucire⑧50/13"和/或"Gelucire⑧44/14",所述商品代表适合用于根据本发明的药物制备物中的混合物。Gelucire50/13是混合物，包含单、二和三酰基甘油酯和聚乙二醇的单和二酯，分别具有40%-50。/。的棕榈酸(C16)和48。/。-58。/。的硬脂酸(C18),组成结合脂肪酸(boundfattyacid)的主要部分。在每种情况下辛酸(C8)和癸酸(C10)的比例少于3%，并且在每种情况下月桂酸(C12)和肉豆蔻酸(C14)的比例少于5%。Gelucire44/14是混合物，包含单、二和三酰基甘油酯和聚乙二醇的单和二酯，各比例为棕榈酸(C16)4-25。/。，硬脂酸(C18)5-35%，辛酸(C8)少于15%，癸酸(C10)少于12%,月桂酸(C12)30-50。/。和肉豆蔻酸(C14)5-25%。Gelucire44/14能够例如通过使用棕榈仁油和聚乙二醇1500的醇解/酯化反应制备。本发明的优选实施方案提供本发明的酶的药物组合物，其包含的体系含有单、二和三酰基甘油酯与C8-C18脂肪族羧酸的聚乙二醇单和二酯的混合物，并还可能含有小比例的甘油和游离聚乙二醇，所述体系具有在40。C-55。C的熔点和在12—15的HLB值。更优选地，所述体系具有在44。C-50。C的熔点和在13-14的HLB值。或者，所述体系具有大约44。C的熔点和14的HLB值，或所述体系具有大约5(TC的熔点和13的HLB值。处理方法
技术领域：
：本发明的蛋白酶，任选地与脂肪酶和/或淀粉酶(本发明的酶)组合，在对动物中各种疾病或病症的治疗处理和/或预防处理中是有用的。术语"动物"包括所有动物，特别是人类。动物的实例是非反刍动物和反刍动物，如绵羊、山羊和牛，例如肉牛(cattlebeef)和奶牛。在具体实施方案中，动物是非反刍动物。非反刍动物包括单胃动物，例如马、猪(包括但不限于，小猪、正在生长的猪(growingpigs)和母猪(sow));家禽，如火鸡、鸭和小鸡(chickens)(包括:但不限于雏鸡(broilerchick)、蛋鸡(layer));牛犊(youngcalves);宠物如猫和狗；和鱼(包括但不限于鲑鱼(salmon)、鳟鱼(trout)、罗非鱼(tilapia)、鲶鱼(catfish)和鲤鱼(carp));和曱壳类动物(包括但不限于河奸(shrimp)和对虫下(prawn))。在具体实施方案中，动物是哺乳动物，更具体为人类。例如，所述酶对于消化性病症如消化不良或胃弱(dyspepsia)等的治疗有用，所述消化性病症经常由消化酶的产生不足和/或向胃肠道的分泌不足引起，所述消化酶通常分泌自胃和胰腺。此外，所述酶对PEI的治疗特别有用。PEI能够4吏用Borgstr6m测试(JOP.JPancreas(Online)2002;3(5):116-125)验证，并且它可能由以下疾病和症状导致如胰腺癌、胰腺和/或胃的外科手术，例如胰腺的全部或部分切除术、胃切P余术、后胃肠分-危术(postgastrointestinalbypasssurgery)(侈'H口BillrothII式胃肠造口吻合术)；慢性胰腺炎；施-戴综合征(ShwachmanDiamondSyndrome);胰腺或总胆管的管梗阻(例如来自肿瘤)；和/或嚢性纤维化(遗传性疾病，其中厚粘液阻塞胰腺管)。所述酶也可以对急性胰^^炎的治疗有用。所述酶对消化性病症的作用效果可以如EP0600868中概括描述的测定；其中实施例2描述用于测定在胃条件下的脂肪酶稳定性测试的体外消化测试，而实施例3描述用于测定在存在胆汁盐时脂肪酶活性的体外消化测试。可以针对蛋白酶和淀粉酶建立相应的测试。WO02/060474也公开了合适的测试，例如(l)用于测定猪的测试飼料中脂质消化的体外测试，和(2)用胰腺机能不全的猪进行的体内试验，测定其中脂肪、蛋白和淀粉的消化性。在具体实施方案中，使用实施例3中用于蛋白酶效能的体内筛选测试测定本发明的蛋白酶的效能。作为另一个实例，酶对I型和/或II型糖尿病(D/Wefesme/^w)的治疗有用，以逐渐减少晚期并发症为目的。可以用WO00/54799所述的一个或多个方法来确定酶对糖尿病的效果，例如通过控制糖基化血红蛋白的水平，血糖水平，低血糖发作(hypoglycaemicattack),脂溶性维生素如维生素A、D和E的状态，胰岛素的必需每日剂量，体重指标和高血糖期。在具体实施方案中，本发明的蛋白酶不用作清创剂，和/或不用在伤口康复中。本文描述和提出权利要求的发明不限于本文公开的特定实施方案范围，因为这些实施方案旨在说明本发明的几个方面。任何相当的实施方案应包含于本发明的范围内。事实上，除了本文所示和所述之外对本发明的各种修饰，根据前面的描述，对本领域的技术人员是显而易见的。这些修饰也应包含于所附权利要求的范围内。在发生沖突的情况下，按照包括定义在内的本
发明内容为准。本文引用的各种文献，所述文献的公开通过引用完全并入本文。实施例实施例l:纯化的地衣芽孢杆菌蛋白酶的制备如下制备SEQIDNO:1的氨基酸1-274的地衣芽孢杆菌蛋白酶的纯制备物材寿+和方法TY培养液胰蛋白胨20g/1,酵母提取物5g/l，FeCl2'4H207mg/1,MnCl2-4H201mg/l，MgS04-7H2015mg/1,pH7.3。PS-1培养液蔗糖100g，大豆粉(Soybeanmeal)40g，Na2HPCV12H20(Merck6579)10g，CaC035g,PluronicPE6100(BASF)0.1ml,力口自来K(tapwater)至1000ml。发酵通过缺失编码另一个蛋白酶的基因(SEQIDNO:3)得到源自地衣芽孢杆菌ATCC14580的菌抹，将所述菌株在TY琼脂培养基(用2%琼脂固化的TY培养液)上37。C过夜增殖，接种到包含100mlPS-l培养液的摇瓶中。将摇瓶以225rpm的摇动速度于"。C温育卯小时。纯化絮凝发酵液，将细胞通过离心从含酶的液体中分离。对上清的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳显示，有相对分子量大约为31kDa的强条带，其对应于期望的蛋白酶。在pH7和9,在P/。脱脂乳琼脂平板上出现大的澄清区(dearingzone),也确认上清中存在强蛋白酶活性。作为下一步，将离心得到的液体进行精细过滤(polishfilter)以除去残余的悬浮固体，然后使用适当的膜通过超滤进行浓缩，即膜的截留值(cut-offvalue)在蛋白酶的大小以下。最后将浓缩物过滤除菌(germ-filter)。用100mMH3B03,10mM琥珀酸/NaOH,2mMCaCl2,pH7.0将100ml过滤除菌的液体浓缩物稀释10倍。所得蛋白酶溶液的pH为7.0。将其中120ml施加于100ml杆菌肽-琼脂糖柱(UpFrontChromatography,目录号600-0100),所述柱用100mMH3B03，10mM琥珀酸/NaOH,2mMCaCl2，pH7.0平4軒。在用平衡缓冲液彻底清洗柱后，将柱用lOOmMH3B03,10mM琥珀酸/NaOH,2mMCaCl2,1MNaCl，pH7.0，25%(体积/体积)异丙醇分步洗脱(step-elute)。将杆菌肽-硅石步骤重复7次(共8次)。合并所有洗出液(420ml)，用脱矿质水将洗出液稀释至15L。将稀释的蛋白酶的pH用20%CH3COOH调至pH6.0，并施加于400mlSP-sepharoseFF柱，该柱用50mMH3B03，5mM琥珀酸/NaOH,lmMCaCl2，pH6.0平衡。将柱用平衡緩沖液彻底清洗，用超过3倍柱容积的线性NaCl梯度(O-0.5M)洗脱柱。通过在1.4LG"sephadex柱上的緩沖液交换，将洗脱的蛋白酶峰(200ml)转移至20rnMHEPES/NaOH,100mMNaCl,lmMCaCl2,pH7.0(HEPES是4-(2-羟乙基)-l-(哌。秦乙磺酸))。将緩冲液交换后的蛋白酶(340ml)在0.22n过滤单元(如Coming，目录号431097)上过滤。实施例2:酶试验蛋白酶Suc-AAPF-pNA试验底物Suc-AAPF-pNA(SigmaS-7388)。试-验纟爰沖液100mM琥珀酸、100mMHEPES(SigmaH画3375)、100mMCHES(SigmaC-2885)、100mMCABS(SigmaC-5580)、lmMCaCl2、150mMKCl、0.01%TritonX-IOO，用HC1或NaOH调至pH9.0。试验温度25°C。将300^稀释的蛋白酶样品与1.5ml试验緩沖液混合，通过加入1.5mlpNA底物(50mg溶于l.OmlDMSO中，并用0.01%TritonX-100进一步稀释45x)开始活性反应，在混合后，用分光光度计监控A柳的增加作为对蛋白酶活性的测量。在活性测量之前稀释蛋白酶样品，以确保所有活性测量结果都在试验的剂量-应答曲线的线性部分中。蛋白酶FIP试验也可以4吏用FIP^式马全(F6d6rationInternationalePharmaceutique)测定蛋白酶活性，1FIP-单位=1Ph.Eur,单位(欧洲药典)。该试'睑和其它FIP试验一起，在F6d6rationInternationalePharmaceutique,ScientificSection:InternationalCommissionforthestandardisationofpharmaceuticalenzymes,a)"PharmaceuticalEnzymes,"Editors:R.Ruyssen,口A.Lauwers,E.StoryScientia,Ghent,Belgium(1978),b)EuropeanPharmacopoeia中描述。也可参见DeemesteretalinLauwersA，Scharp6S(eds):PharmaceuticalEnzymes,NewYork,MarcelDekker,1997,p.343-385。该试验可以用来确定胰酶制剂(p肌creatin)中的蛋白酶活性。为了确定微生物蛋白酶的FIP活性，可以省略通过添加肠激酶的激活步骤。原理在pH7.5和35。C的温度用蛋白酶水解底物酪蛋白。通过加入三氯乙酸使反应停止，将不降解的酪蛋白过滤去除。通过在275nm处的分光光度法测量确定溶液中残余的肽的量。活性的定义将蛋白酶的活性根据未由三氯乙酸的5.0%(重量/体积，即5.0g/100ml)溶液沉淀的肽的量来确定，参考FIP活性已知的胰腺参照粉末(蛋白酶参照标准)。材料和方法酪蛋白;容液将1.25g酪蛋白(干物质)，例如Calbiochem号218680,悬浮于水中，直至得到实际上澄清的溶液。将pH调至8.0,用水稀释溶液至100ml的终体积。在此处和下文中，水指去离子水。硼酸盐緩沖液pH7.5:将2.5g氯化钠、2.85g四硼酸二钠和10.5g硼酸溶于卯Oml水中，将pH调至pH7.5+/-0.1，并用水稀释至1000ml。滤纟氏折制的滤器具有125mm直径，例如Schleicher&Schuell号1574%。滤纸测试通过滤器过滤5ml5.0%三氯乙酸。滤液在275nm处的吸光度应该小于0.04,使用未过滤的三氯乙酸溶液作为空白。蛋白酶参照标准蛋白酶(月夷&%)可/人InternationalCommissiononPharmaceuticalEnzymes,CentreforStandards,Harelbekestraat72，B-9000Ghent,Belgium以商业方法获得。标准品具有以FIP/Ph.Eur.-单位/g表示的标记活性(A)。准确称重相当于大约130蛋白酶-FIP/Ph.Eur,单位的量。加入一抹刀尖(aspatulatipof)的海沙，用几滴冰冷的0.02M氯化4丐(pH6.0-6.2)润湿，全部用平端的玻璃棒碾碎。用大约90ml相同的冰冷氯化钓溶液稀释，并在水浴中搅拌悬浮液15至30分钟。将pH调至6.1,用相同的氯化钙溶液将体积调至lOOml。用pH7.5的硼酸盐緩冲液将5.0ml的这种悬浮液稀释至100ml。对于活性测试，将1.0、2.0和3.0ml的这种溶液用作参照(下文中称作Sl、S2和S3，S表示标准)。测试悬浮液如上所述制备蛋白酶参照标准的方法制备样品悬浮液，使用的样品量相当于大约260FIP/Ph.Eur.-单位。将pH调至6.1，加水至100ml。将5.0ml这种溶液与5ml氯化4丐溶液混合。将5ml这样的稀释液进一步用硼酸盐緩冲液稀释至100ml。将2.0ml这种溶液用于试验(下文中样品称作Un,未知活性的样品，数目用n表示)。试验步骤(活性测试)针对三种参照悬浮液(S1、S2、S3)和样品悬浮液(Un)进行试验，全部进行三次重复测定。每种样品一个空白是足够的(分别称作Slb、S2b、S3b和Unb)。制备不加样品/标准品的盲样品(blind)(B),作为分光光度计的补偿液体。如下将硼酸盐緩冲液加入试管中盲样品(B)3.0ml;样品(Un)1.0ml;标准品(S1、S2和S3)分别为2.0、1.0和0ml。向Sl、S2和S3中分别加入1.0、2.0和3.0ml蛋白酶参照标准品。向样品(Un)试管加入2.0ml测试悬浮液。向所有盲样品(Slb、S2b、S3b、Unb和B)中加入5ml三氯乙酸，然后立即混合。所有试管用玻璃塞封口，与底物溶液一起置于恒温(35+A0.5。C)水浴中。当温度达到平衡时，在时间零点，向试管S1、S2、S3和Un中加入2.0ml酪蛋白溶液，然后立即混合。恰好30分钟后，向Sl、S2、S3和Un的每个试管中加入5.0ml三氯乙酸，然后立即混合。从水浴中取出试管，于室温放置20分钟，使蛋白质完全沉淀。每个试管中的内容物用相同的滤器过滤两次，使用来自试管B的滤液作为补偿液体测量275nm处滤液的吸收(abso卬tion)。相对于标准品(S1、S2、S3)的已知标记活性(A)计算以FIP单位表示的样品(Un)的活性。吸收值减去相应的盲样品值(例如Sl的吸光度减去Slb的吸光度)应该在0.15-0.60的区间内。蛋白质AU试验变性的血红蛋白(0.65%(重量/重量)于含脲的6.7mMKH2PCVNaOH緩冲液中，pH7.50)在25。C用蛋白酶降解IO分钟，用三氯乙酸(TCA)将不降解的血红蛋白沉淀，并过滤去除。用Folin&Ciocalteu的苯酚试剂(将1体积Folin-CiocalteuPhenolReagentMerck9001.0500加入2体积脱矿质水)确定滤液中TCA可溶的血红蛋白降解产物，所述苯酚试剂与几种氨基酸一起得到蓝色(在750nm测定)。活性单位(AU)参照标准品测定和定义。变性的血红蛋白底物可以如下制备将1154g脲(Hamstoff，Merck8487)溶于1000ml脱矿质水中，加入240.3gNaOH,然后缓慢地加入63.45g血红蛋白(Merck4300)，接着加入315.6gKH2P04，并且加脱矿质水至3260g。将pH调至7.63。更多细节和合适的Alcalase标准品可向NovozymesA/S,Krogshoejvej36,DK-2880Bagsvaerd,Denmark(试验号EB-SM-0349.0l)请求获得。脂肪酶pNP试验底物对硝基苯基(pNP)戊酸试验pH:7.7试验温度40°C反应时间25分钟带有黄色的消化产物在405nm有特征吸收。用分光光度法确定它的量。一个脂肪酶单位是在给定试验条件下，每分钟释放1微摩尔可滴定的丁酸的酶量。更详细的试验描述AF95/6-GB可向NovozymesA/S,Krogshoejvej36，DK-2880Bagsvaerd,Denmark请求获得。脂肪酶LU试验在这个试-睑中，0.16M三丁酸甘油酯(tributyrin)(甘油三丁酸酯，Merck1.01958.000)在pH7.00和30。C(+/-1°。)的脂肪酶催化降解,通过用0.025M脱气的(de-gassed)、不含C02的氬氧化钠(Sodiumhydroxidetitrisol,Merck9956)对释》丈的丁酸进行恒-pH滴定(pH-stattitration)来跟踪。将滴定剂的消耗作为时间的函数记录。将底物用0.6%w/v阿拉伯树胶乳化剂乳化(20.0g阿拉伯树胶、89.5gNaCl、2.05gKH2PO4、加水至1.51，放置直至全部溶解，加入2700ml甘油，调节pH至4.5。将90ml三丁酸甘油酯与300ml阿拉伯树胶乳化剂和1410ml脱矿质水(demineralisedwater)混合，并且4吏用例如Silverson乳化剂L4RT于7000rpm均质化3分钟，然后调节至pH4.75)。脂肪酶样品首先在0.1M甘氨酸緩冲液(glycinbuffer)pH10.8中稀释，然后在脱矿质水中稀释，使活性水平为1.5-4.0LU/ml。将15ml乳化的底物溶液倒入滴定容器。加入1.0ml样品溶液，并且在滴定过程中将pH保持在7.0。测定为维持恒定的pH每分钟加入的滴定剂的量。活性计算基于滴定曲线线性范围的平均斜率。可以使用已知活性的标准品作为校验水平(levelcheck)。1LU(脂肪酶单位)是在上述给定试验条件下，每分钟释放1微摩尔可滴定的丁酸的酶量。1kLU(千脂肪酶单位)-IOOOLU。更详细试-验说明EB-SM-0095.02可向NovozymesA/S,Krogshoejvej36,DK-2880Bagsvaerd,Denmark请求获得。脂肪酶恒定pH试验试验基于在0.65mM胆汁盐存在下从橄榄油乳剂中由脂肪酶催化释放脂肪酸。将底物用作为乳化剂的阿拉伯树胶乳化(将175g橄榄油用630ml阿拉伯树胶溶液(4000ml水中的474.6g阿拉伯树胶、64g氯化钙)在搅拌器中乳化15分钟；冷却至室温后，使用4MNaOH将pH调节至pH6.8-7.0)。为了测定，将19ml乳剂和10ml胆汁盐溶液(将492mg胆汁盐溶于水中，并补充至500ml)在反应容器中混合并加热至36.9°C至37.5°C。通过加入1.0ml酶溶液开始反应。释放的酸通过加入0.1M氢氧化钠自动于pH7.0滴定，共进行5分钟。从第一分钟和第五分钟之间滴定曲线的斜率计算活性。为了校准，在三种不同活性水平测定标准品。淀粉酶底物Phadebas片剂(PharmaciaDiagnostics;交联、不溶、蓝色的淀4分聚合物，将其与牛血清白蛋白和緩冲物质混合，并制成片剂)。试-险温度37°C试验pH:4.3(或7.0,如果需要)反应时间20分4中在悬浮于水中后，将淀粉用a-淀粉酶水解，得到可溶的蓝色片段。所得蓝色溶液于620nm测得的吸光度是a-淀粉酶活性的函数。一个真菌a-淀粉酶单位(lFAU)是在标准试验条件每小时分解5.26g淀粉(Merck,AmylumsolubileErg.B.6,批号9947275)的酶量。更详细的试验说明APTSMYQI-3207可向NovozymesA/S，Krogshoejvej36,DK-2880Bagsvaerd，Denmark请求获^曰付。实施例3:地衣芽孢杆菌蛋白酶的体内筛选测试在雌性G6ttingen迷你猪(Ellegaard)中测试实施例1的纯化的地衣芽孢杆菌蛋白酶，以胰酶制剂作为基准(benchmark)。通过结扎胰管诱导迷你猪的胰腺外分泌机能不全(PEI)，并且配以回盲折返插管(ileo-caecalre-entrantcannula),上述全部在氟烷麻醉下进行，体重为大约25kg,如Tabelingetal.，J.1999，Studiesonnutrientdigestibilities(pre-caecalandtotal)inpancreaticduct-ligatedpigsandtheeffectsofenzymesubstitution,J.Anim,Physiol.A.Anim.Nutr.82:251-263(下文中称为"Tabeling1999")和Gregoryetal.,J.1999.Growthanddigestioninpancreaticductligatedpigs,Effectofenzymesupplementationin"BiologyofthePancreasinGrowingAnimals"(SGPierzynowski&R.Zabielskieds),ElsevierScienceBV,Amsterdam,pp381-393(下文中称为"Gregoryetal1999，，)中所述。在研究开始之前，允许用至少4周的时间从外科手术中恢复。在研究开始前，通过粪便胰凝乳蛋白酶测试(可从ImmundiagnostikAGWiesenstrasse4，D-64625Bensheim，Germany以商业方法获得，目录号为K6990)确定每头猪的PEI状态。在研究过程中，将猪圈养在改良的代谢笼(modifiedmetabolismcage)中'采用12:12小时的明-暗循环，而且允许自由饮水，并每日喂食两餐。为了评估蛋白酶效能，将喂食猪的250g测试餐与1升水和0.625gCr203(三氧化二铬标记)混合，并在喂食前即刻混合入不同量的蛋白酶(O、1000、2500、6000FIPU蛋白酶/餐(蛋白酶FIP单位，参见实施例2))。测试餐包含21.4%蛋白质、51.9%淀粉和2.6%脂肪，并具有下述组合物(g/100g干物质)鱼粉3.5、家禽肉粉10.2、小麦粉29.5、带壳/脱壳稻(shelledrice)14、马铃薯淀粉ll、玉米淀粉14、酪蛋白5.9、纤维素粉4.3、维生素、矿物质和痕量元素7.6(按照猪的营养需要，参见例如，WO01/58276的表A)。在回肠中第一次出现食物标记(绿色食糜)后，收集回肠食糜并置于冰上，持续进行8小时，在分析前于-2(TC储存。在单独的测定之间允许有至少一天的沖洗(washout)。筒而言之，将冷冻样品冷冻干燥，并分析干物质(DM)和粗蛋白。在103°C溫育8小时后冻干，然后才艮据重量估计DM。根据氮(N)乘以因子6.25计算粗蛋白，即斗且蛋白(g/kg)=N(g/kg)x6.25,如AnimalNutrition,4thedition,Chapter13(Eds.P.McDonald,R.A.EdwardsandJ.F.D.Greenhalgh,LongmanScientificandTechnical,1988，ISBN0-582-40903-9)中所述。通过Kjeldahl方法(NaumannandBassler，1993,DiechemischeUntersuchungvonFuttermitteln.3editionVDLUFA-Verlag,Darmstadt,Germany(VDLUFA=VerbandDeutscherLandwirtschaftlicherUntersuchungs-undForschungsanstalten))石角定含氮量。根据下述公式计算表观盲肠前(pre-caecal)蛋白质消化性<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage39</formula>其中Cr203和蛋白质用g/100g干物质表示。0203的量可以用本领域已知的方法确定，优选通过氧化成#^酸盐并测定其在365nm处的消光来确定。如Petry和Rapp在ZeitungfiirTierphysiologie(1970),vol.27，p.181-189中所述。本研究的结果在表l中描述。表l:酶补充对表观蛋白质消化性的影响<table>complextableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>数值是平均值士SD。从表1中的结果显而易见的是，根据本发明的SEQIDNO:2的蛋白酶与已知胰酶制剂制备物表现出相同的活性。本发明的蛋白酶引起在蛋白质消化性上大的且依赖于剂量的改进，其在测试的最低剂量已显示出高效的改进。实施例4:蛋白酶的体外测试在体外测试各种蛋白酶在才莫拟消化条件下降解蛋白质的能力。蛋白酶测试下述本发明的枯草杆菌蛋白酶SEQIDNO:1的氨基酸1-274的地衣芽孢杆菌蛋白酶；SEQIDNO:10的氨基酸1-275的解淀粉芽孢杆菌蛋白酶，和SEQIDNO:11的氨基酸1-269的迟緩芽孢杆菌蛋白酶的变体99aE(在SEQIDNO:11的氨基酸1-269中，在第99个氨基酸残基S(Ser)后插入一个E(Glu))。这些蛋白酶均与SEQIDNO:1的氨基酸1-274具有50%以上的百分比同一性。为了比较，也将一些本发明之外的枯草杆菌蛋白酶包括在内，即来自BacillushalmapalusNCIB12513的蛋白酶(在WO88/01293和WO98/012005(SEQIDNO:42，芽孢杆菌属菌种JP170)中都有描述)，和来自芽孢杆菌属菌种NCIMB40339的蛋白酶(在WO92/017577中作为芽孢杆菌属菌种TY145描述)。这些蛋白酶均与SEQIDNO:1的氨基酸1-274具有50%以下的百分比同一性。此外，将WO2005/115445中描述的非枯草杆菌蛋白酶拟诺卡氏菌属蛋白酶(其中的SEQIDNO:1的氨基酸l-188)包括在内以作比较。该蛋白酶与SEQIDNO:1的氨基酸l-274也具有50%以下的同一性。最后，将胰酶制剂包括在内作为阳性对照。蛋白酶在酶蛋白^出上均以相等剂量施用，即72、36、18和9mg酶蛋白(EP)每餐(250g)。蛋白酶酶蛋白的量根据A，的值和氨基酸序列(氨基酸组成)来计算，使用S.C.Gill&RH.vonHippel,AnalyticalBiochemistry182,319-326,(1989)中列出的原理。材料和方法胆汁盐(即牛磺胆酸钠(sodiumtaurocholate)BRP，lot2,来自Ph.Eur或FIP,也可由例如LGCpromochem以商业方法获得，500g/mol)、胃蛋白酶(Merck,VL317492437(1.07192))、胰酶制剂(来自SolvayPharmaceuticals)。蛋白酶餐51.9%淀粉、21.3%蛋白质和2.6%脂肪/脂质。体外模型将蛋白酶饮食(proteasediet)溶于0.1MHC1中至0.2g饮食/mL的浓度。将pH调至pH3.0(模拟胃的条件)。在微孔板(MTP)的每孔中加入100^L饮食浆、20jiL胃蛋白酶(在脱矿质水(Milli-Q)中的终浓度为70mg/L)和30pL蛋白酶(或在无酶对照中加入Milli-Q)。于37。C、700rpm温育1小时。在1小时温育结束时，测得pH为3.4。为了将pH提高至6.0(模拟肠的条件)，每孔中加入25nL混合的pH5/9缓冲液(0.8MMES、0.8M咪唑、0.8M醋酸钠，pH5.0或pH9.0;40%pH5和60%pH9緩冲液)。此外，加入25(iL胆汁盐(终浓度为5mM),于37°C、700rpm温育2小时。在体外培育后，将MTP于2700rpm(1500g)、4。C离心10分钟，收集上清用于进一步研究。确定游离氨基(OPA)通过与OPA(0-酞二醛(0-phthaldialdehyde》的反应来测定游萬氨基，从而分析体外消化的上清。OPA测定的步骤如下将20)iL稀释的体外上清转移至新的MTP，并加入200OPA试剂(将80mgOPA溶于2ml96%乙醇中；3.8g十水合四硼酸二钠、1ml10%SDS、88mgDTT和所述OPA-乙醇溶液，用Milli-Q水加至100mL)。测定340nm的吸光度。测定试验中包括一ff丝氨酸标准品(0.5mg/mL-0.0078mg/mL)。下面的表2以水解的mM氨基表示结果。结果为两次重复测定的平均值，也示出了标准偏差(s.d.)。只给出了每餐72mg酶蛋白的结果，因为在该测试中，用较低酶剂量的结果无法在酶之间进行适当地区別。表2<table>complextableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>表2的结果显示本发明的蛋白酶(SEQ1、SEQIO)在此体外模型中性能非常好。对于不是本发明的一部分的蛋白酶JP170和TY145则不是这样。事实上，不考虑拟诺卡氏菌属蛋白酶，其是完全不同类型的蛋白酶并且不包括在本发明中，显示出与本发明的SEQIDNO:1的百分比同一性和在此模型中的性能之间存在关联(％同一性越高，性能越好)。在如上所述进行的单独实验中，我们测试了本发明的迟緩芽孢杆菌蛋白酶变体(SEQ11变体)的体外性能，其中也将拟诺卡氏菌属蛋白酶包含在内用于比较。剂量-应答结果显示于下面的表3中。表3<table>complextableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table><table>complextableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>首先，这些结果表明良好的剂量-应答关系。其次，需要注意的是本发明的蛋白酶(SEQ11变体)也表现非常好，特别是在剂量为72mgEP/餐时。SEQ11变体甚至表现得非常符合上述与SEQIDNO:1的百分比同一性和性能之间的关联(相对于拟诺卡氏菌属蛋白酶，其也包括在这两个实验中)。实施例5:药用蛋白酶组合物(A)高强度小丸按照如实施例1所述制备SEQIDNO:1的氨基酸1-274的蛋白酶过滤除菌的液体浓缩物，并喷雾干燥。测得的喷雾干燥的蛋白酶粉中蛋白酶蛋白质含量为58.5%。将粉末状的1125g喷雾干燥的蛋白酶与微晶纤维素(450g)和聚乙二醇4000(Macrogol4000;675g)在商业上可获得的混合器中进行干式预混合。加入异丙醇(460g;100%)，所得湿物质继续于室温完全混合。然后将均质化的物质在商业上可获得的挤压机中挤压以形成圆柱型小丸，所述挤压机装有冲孔模(piercingdie),所述冲孔模的孔直径为0.8mm。在挤压时小珠温度(beadtemperature)不超过50。C。产生的挤压物用商业上可获得的制粒机(spheronizer),通过加入必要量的异丙醇100%(54.5g)滚圆成球形小丸。将小丸在大约40。C的产品温度在商业上可获得的真空干燥机(来自Voetsch)中干燥。产品温度不超过45°C。然后通过使用带有0.7和1.4mm筛的机械筛选机分离干燥的小丸。收集20.7mm并且S1.4mm的筛选级分，并且以每份200mg小丸填入尺寸2的胶嚢中。所得干燥小丸的酶蛋白浓度为大约29.3%(w/w)。(B)较低强度小丸与(A)中提供的实例近似，以2250g的批次大小如下制备具有较低蛋白酶含量的小丸作为药物使用562.5g粉末形式的喷雾干燥的蛋白酶(测得的蛋白酶蛋白质含量为58.5%)、微晶纤维素(1125g)、聚乙二醇4000(562.5g)、用于润湿的异丙醇(700g)和用于滚圆的异丙醇(61.2g)。所得干燥小丸的蛋白酶浓度为大约14.6%(w/w)。通过应用用于来自胰腺粉末的蛋白酶的FIP方法来测定由实例(A)和(B)所得小丸的蛋白水解活性，其中对所述方法进行修饰，即省略活化步骤。相对于起始的粉状蛋白酶材料，每种情况下小丸中的蛋白水解活性均不存在损失。然后才艮氺居Pharm.Eur.2.9.1(Section"Disintegrationoftabletsandcapsules")测试由实例(A)和(B)所得小丸的崩散性(测试溶液水-500mL，37°C)。来自实例(A)的小丸在3分钟内完成崩散。来自实例(B)的小丸在11分钟内完成崩散。实施例6:蛋白酶和淀粉酶的药物组合物如下制备包含淀粉酶和蛋白酶的高强度小丸如DK200500931所述制备淀粉酶的液体浓缩物(过滤除菌的超滤液)，所述淀粉酶具有SEQIDNO:16的氨基酸1-486。将所述液体浓缩物喷雾干燥。喷雾干燥的淀粉酶粉末中测得的淀粉酶蛋白含量为37%。将粉末形式的喷雾干燥的淀粉酶(398.5g)连同实施例5中制备的喷雾干燥的蛋白酶粉末(746.5g;测得的蛋白酶蛋白含量为58.5%)、微晶纤维素(458g)和聚乙二醇4000(Macrogol4000;687g)在商业上可获得的搅拌器中进行干式预混合。加入异丙醇100%(460g)，将所得湿物质继续在室温彻底混合。然后将均质化的物质在商业上可获得的挤压机中挤压形成圆柱型小丸，所述挤压机装有沖孔模，所述冲孔模的孔直径为0.8mm。挤压时小珠温度不超过50。C。产生的挤压物用商业上可获得的制粒机(spheronizer)通过加入必要量的异丙醇100%(58g)滚圓成球形小丸。使用大约40。C的供给温度在商业上可获得的真空干燥机(来自Voetsch)中干燥小丸。产品温度不超过45。C。然后使用具有0.7和1.4mm筛的机械筛选机分离干燥的小丸。收集S0.7mm和^1.4mm的筛级分，并且可以每份200mg填充到尺寸2的胶嚢中。所得干燥小丸的蛋白酶浓度为大约19.1%(w/w)，并且所得干燥小丸的淀粉酶浓度为大约6.4%(w/w)。根据上述方法测试所得小丸的蛋白水解和淀粉分解活性。在每种情况下，分别相对于起始的粉状蛋白酶或淀粉酶材料，在蛋白水解或淀粉分解活性中均不存在损失。实施例7:在蛋白酶存在下脂肪酶的体内稳定性和效能如下测试在存在本发明蛋白酶(所述蛋白酶具有SEQIDNO:1的氨基酸l-274)的条件下，SEQIDNO:15的疏棉状腐质霉脂肪酶变体的稳定性和效能在体内试验中测试纯化的脂肪酶，如要求丹麦申请号200500929的优先权的PCT申请的实施例2中所述，但剂量根据胰腺FIP试验中估计的脂肪酶单位而定，所述FIP试—验也在此参考文献中有描述。也如该参考专利申请中所述来估计消化性值(脂肪吸收系数；CFA)。将脂肪酶单独测试，并且以各种剂量组合与蛋白酶组合进行测试。通过使用胰腺FIP试验确定蛋白酶活性(参见实施例1)。结果显示于下表4中，给出的是平均CFA(%)值，并示出了标准偏差(sd)。表4<table>complextableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>对于测试的两种脂肪酶剂量中的每一种，不加蛋白酶和加入两种不同剂量的蛋白酶的结果之间不存在显著差异。因此能够得出结论，蛋白酶对体内的脂肪酶无反作用。权利要求1.与SEQIDNO2的氨基酸1-274具有至少50％同一性的蛋白酶，所述蛋白酶用作药物。2.根据权利要求1的蛋白酶，其中a)所述蛋白酶包含选自下组的氨基酸序列SEQIDNO:2的氨基酸1-274、SEQIDNO:5的氨基酸1-274、SEQIDNO:6的氨基酸1-275、SEQIDNO:7的氨基酸1-275、SEQIDNO:8的氨基酸1-275、SEQIDNO:9的氨基酸1-275、SEQIDNO:10的氨基酸1-275、SEQIDNO:11的氨基酸1-269、SEQIDNO:12的氨基酸1-269和SEQIDNO:13的氨基酸1-268;和/或b)所述蛋白酶是选自下组的氨基酸序列的变体SEQIDNO:2的氨基酸1-274、SEQIDNO:5的氨基酸1-274、SEQIDNO:6的氨基酸1-275、SEQIDNO:7的氨基酸1-275、SEQIDNO:8的氨基酸1-275、SEQIDNO:9的氨基酸1-275、SEQIDNO:10的氨基酸1-275、SEQIDNO:11的氨基酸1-269、SEQIDNO:12的氨基酸1-269和SEQNO:13的氨基酸1-268,其中所述变体与相应的氨基S拼列的差异不多于25个氨基酸，并且其中(i)和相应的氨基酸序列比较，所述变体包含一个或多个氨基酸的取代、缺失和/或插入中至少一种；和/或(ii)和相应的氨基S交序列比较，所述变体包含至少一个小缺失；和/或(iii)和相应的氨基酸序列比较，所述变体包含至少一个小的N-或C-末端延伸；和/或c)所述蛋白酶是具有选自下组的氨基酸的蛋白酶的等位变体SEQIDNO:2的氨基酸1-274、SEQIDNO:5的氨基酸1-274、SEQIDNO:6的氨基酸1-275、SEQIDNO:7的氨基酸1-275、SEQIDNO:8的氨基酸1-275、SEQIDNO:9的氨基酸1-275、SEQIDNO:10的氨基酸1-275、SEQIDNO:11的氨基酸1-269、SEQIDNO:12的氨基酸1-269和SEQIDNO:13的氨基酸1-268;和/或d)所述蛋白酶是具有选自下组的氨基酸的蛋白酶的片段SEQIDNO:2的氨基酸1-274、SEQIDNO:5的氨基酸1-274、SEQIDNO:6的氨基酸1-275、SEQIDNO:7的氨基酸1-275、SEQIDNO:8的氨基酸1-275、SEQIDNO:9的氨基酸1-275、SEQIDNO:10的氨基酸1-275、SEQIDNO:11的氨基酸1-269、SEQIDNO:12的氨基酸1-269和SEQIDNO:13的氨基酸1-268。3.根据权利要求2的蛋白酶，其中所述蛋白酶具有选自下组的氨基酸序列SEQIDNO:2的氨基酸1-274、SEQIDNO:5的氨基酸1-274、SEQIDNO:6的氨基酸1-275、SEQIDNO:7的氨基酸1-275、SEQIDNO:8的氨基酸1-275、SEQIDNO:9的氨基酸1-275、SEQIDNO:10的氨基酸1-275、SEQIDNO:11的氨基酸1-269、SEQIDNO:12的氨基酸1-269和SEQIDNO:13的氨基酸1-268。4.权利要求l-3任一项的蛋白酶，与脂肪酶或淀粉酶组合，用作药物。5.权利要求l-3任一项的蛋白酶，与脂肪酶和淀粉酶组合，用作药物。6.根据权利要求4或5的与脂肪酶和/或淀粉酶组合的蛋白酶，其中(i)所述脂肪酶与具有SEQIDNO:15的氨基酸1-269的脂肪酶有至少70%的同一性；并且(ii)所述淀粉酶与选自下组的淀粉酶有至少70%的同一性a)具有SEQIDNO:16的氨基酸1-481的淀粉酶，b)具有SEQIDNO:17的氨基酸1-481的淀粉酶，和c)具有SEQIDNO:18的氨基酸1-483的淀粉酶。7.根据权利要求4或5的与脂肪酶和/或淀粉酶组合的蛋白酶，其中(i)所述蛋白酶具有SEQIDNO:2的氨基酸1-274;(ii)所述脂肪酶包含SEQIDNO:l5的氨基酸2~269;并且(iii)所述淀粉酶是选自下组的淀粉酶a)包含SEQIDNO:16的氨基酸1-481的淀粉酶，b)具有SEQIDNO:17的氨基酸1-481的淀粉酶，和c)具有SEQIDNO:18的氨基酸1-483的淀粉酶。8.权利要求1-3任一项所定义的蛋白酶用于制备药物的用途，所述药物用于治疗消化性病症、胰腺外分泌机能不全、胰腺炎、嚢性纤维化、I型糖尿病和/或II型糖尿病。9.权利要求8的用途，还包含脂肪酶或淀粉酶的用途。10.权利要求8的用途，还包含脂肪酶和淀粉酶的用途。11.权利要求9或10的用途，其中所述脂肪酶和/或淀粉酶如权利要求6或7所定义。12.药物组合物，其包含权利要求l-3任一项定义的蛋白酶，连同至少一种可药用的辅助材料。13.权利要求12的组合物，其还包含脂肪酶或淀粉酶。14.权利要求12的组合物，其还包含脂肪酶和淀粉酶。15.权利要求13或14的组合物，其中所述脂肪酶和/或淀粉酶如权利要求6或7所定义。16.用于治疗消化性病症、胰腺外分泌机能不全、胰腺炎、嚢性纤维化、I型糖尿病和/或II型糖尿病的方法，所述方法通过施用治疗上有效量的权利要求1-3任一项所定义的蛋白酶进行。17.权利要求16的方法，其还包括施用治疗上有效量的脂肪酶或淀粉酶。18.权利要求16的方法，其还包括施用治疗上有效量的脂肪酶和淀粉酶。19.权利要求17或18的方法，其中所述脂肪酶和/或淀粉酶如权利要求6或7所定义。全文摘要涉及SEQIDNO2的氨基酸1-274的蛋白酶，即源自地衣芽孢杆菌的丝氨酸蛋白酶的药物用途，所述蛋白酶也称作枯草杆菌蛋白酶Carlsberg，在所述用途中将该蛋白酶任选地与脂肪酶和/或淀粉酶组合。医学适应症的实例是治疗消化性病症、胰腺外分泌机能不全(PEI)、胰腺炎、囊性纤维化、I型糖尿病和/或II型糖尿病。文档编号A61K38/48GK101203238SQ200680022643公开日2008年6月18日申请日期2006年6月16日优先权日2005年6月24日发明者克劳斯·C·富格尔桑格,彼得·C·格雷戈里,艾伦·斯文德森申请人:诺维信公司;索尔维医药有限责任公司