专利名称：三唑衍生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及化合物以及化合物的应用，在所述应用中，抑制、调控和/或调节激酶的信号转导，特别是TGF-β受体激酶的信号转导起作用，本发明还涉及包含这些化合物的药物组合物以及所述化合物用于治疗由激酶诱导的疾病的用途。
转化生长因子β是TGF-β超家族的原型，该家族是一族高度保守的多功能生长因子，在胚胎发育和成年生物体中都具有重要功能。在哺乳动物中，已经鉴别了三种TGF-β亚型(TGF-β1、2和3)，其中TGF-β1是最常见的亚型(Kingsley(1994)Genes Dev 8133-146)。TGF-β3仅在例如间叶细胞中表达，而TGF-β1在间叶细胞和上皮细胞中表达。TGF-β作为前体蛋白原合成，以非活性形式释放至细胞外基质中(Derynck(1985)Nature 316701-705；Bottinger(1996)PNAS 935877-5882)。除了被切掉的也被称为潜伏性相关肽(LAP)并与成熟区域保持关联的前体区域之外，潜伏性TGF-β结合蛋白四种亚型(LTBP 1-4)之一也可与TGF-β结合(Gentry(1988)MolCell Biol 84162-4168，Munger(1997)，Kindey Int 511376-1382)。非活性复合体的活化是TGF-β发挥生物作用的必须步骤，但是其机理还没能完全澄清。但是例如通过纤溶酶、血浆转谷氨酰胺酶或凝血栓蛋白进行蛋白水解加工当然是必须的步骤(Munger(1997)Kindey Int 511376-1382)。活化的配体TGF-β通过膜上的三个TGF-β受体即广泛表达的I型和II型受体以及III型受体贝塔聚糖和Endoglin介导其生物学作用，其中Endoglin只在内皮细胞中表达(Gougos(1990)J Biol Chem 2648361-8364，Loeps-Casillas(1994)J Cell Biol 124557-568)。
两种III型TGF-β受体都缺乏能够促进信号向细胞内传递的胞内激酶结构域。由于III型TGF-β受体与全部三种TGF-β亚型都以高亲和力结合，并且II型TGF-β受体对与III型受体结合的配体亲和力也很高，因此认为其生物学功能在于调控用于I型和II型TGF-β受体配体的可利用性(Lastres(1996)J Cell Biol 1331109-1121；Lopes-Casillas(1993)Cell 731435-1344)。结构密切相关的I型和II型受体具有丝氨酸/苏氨酸激酶结构域，负责在胞浆区域内传递信号。II型TGF-β受体与TGF-β结合，然后I型TGF-β受体加入该信号传递复合体中。II型受体的丝氨酸/苏氨酸结构域在组成上具有活性，在所谓的I型受体的GS结构域中能够磷酸化该复合体的丝氨酰基残基。该磷酸化激活I型受体的激酶，现在I型受体能自己磷酸化细胞内信号介导因子SMAD蛋白，从而引发胞内信号传递(总结于Derynck(1997)Biochim Biophys Acta 1333F105-F150)。
SMAD家族的蛋白质是全部TGF-β家族受体激酶的底物。迄今为止，已经鉴别了8个SMAD蛋白，其可分为3组(1)受体相关型SMAD(R-SMAD)是TGF-β受体激酶的直接底物(SMAD1、2、3、5、8)；(2)共用型SMAD，其在信号转导级联中与R-SMAD作用(SMAD4)；和(3)抑制型SMAD(SMAD6、7)，其抑制上述SMAD蛋白的活性。各种R-SMAD中，SMAD2和SMAD3是TGF-β特异性信号介导因子，在TGF-β信号级联中，SMAD2/SMAD3被I型TGF-β受体磷酸化，使之能够与SMAD4相互作用。然后所得的SMAD2/SMAD3与SMAD4的复合体可以转位至细胞核内，在这里直接或通过其它蛋白引发TGF-β调控基因的转录(总结于Itoh(2000)Eru J Biochem 2676954-6967；Shi(2003)Cell 113685-700)。
TGF-β的功能谱很广，并且依赖于细胞类型和分化状态(Roberts(1990)Hand-book of Experimental Pharmacology419-472)。TGF-β可影响的细胞功能包括细胞凋亡、增殖、分化、移动性和细胞粘附。因此，TGF-β在多种不同的生物过程中发挥重要作用。在胚胎发育期间，TGF-β在形态形成位点、特别是具有上皮细胞-间质细胞相互作用的区域表达并诱导重要的分化过程(Pelton(1991)J Cell Biol 1151091-1105)。TGF-β在未分化状态干细胞的自我更新和保持中也发挥关键作用(Mishra(2005)Science 31068-71)。此外，TGF-β还在免疫系统的调控中发挥重要作用。其通常具有免疫抑制作用，因为它可以抑制淋巴细胞增殖并限制组织巨噬细胞的活性。因此TGF-β可使炎症反应再次消退从而帮助预防过度的免疫反应(Bogdan(1993)Ann NY Acad Sci 685713-739，总结于Letterio(1998)Annu RevImmunol 16137-161)。TGF-β的另一功能是调控细胞增殖。TGF-β抑制内皮细胞、上皮细胞和造血细胞的生长，但促进间质细胞的生长(Tucker(1984)Science 226705-707，Shipley(1986)Cancer Res 462068-2071，Shipley(1985)PNAS 824147-4151)。TGF-β的另一重要功能是调控细胞粘附和细胞间相互作用。TGF-β通过诱导胞外基质蛋白例如纤维结合蛋白和胶原蛋白促进细胞外基质的累积。此外，TGF-β减少降解基质的金属蛋白酶和金属蛋白酶抑制剂的表达(Roberts(1990)Ann NY Acad Sci 580225-232；Ignotz(1986)J Biol Chem 2614337-4345；Overall(1989)J BiolChem 2641860-1869，Edwards(1987)EMBO J 61899-1904)。
TGF-β的广泛作用范围意味着TGF-β在很多生理状态例如伤口愈合和病理过程例如癌症和纤维化中发挥重要作用。TGF-β是伤口愈合中的关键性生长因子之一(总结于O’Kane(1997)Int J Biochem Cell Biol 2979-89)。在肉芽组织形成期，TGF-β在损伤位点从血小板中释放出来，然后在巨噬细胞中调控其自身生成，并诱导例如单核细胞分泌其它生长因子。伤口愈合中最重要的功能包括刺激炎症细胞的化学趋向性，合成胞外基质并调控伤口愈合过程中涉及的所有重要细胞类型的增殖、分化和基因表达。
在病理条件下，这些TGF-β介导的作用、特别是调控胞外基质(ECM)生成的作用可导致纤维化或皮肤疤痕(总结于Border(1994)N Engl J Med3311286-1292)。
对于纤维变性疾病、糖尿病性肾病和肾小球肾炎，已显示TGF-β促进肾细胞肥大和胞外基质的病理性累积。通过用抗TGF-β抗体处理中断TGF-β信号转导路径可防止肾小球系膜基质扩张、肾功能进行性减弱和在糖尿病动物中减少糖尿病性肾小球肾病中已形成损伤的数目(Border(1990)346371-374，Yu(2004)Kindney Int 661774-1784，Fukasawah(2004)Kindney Int 6563-74，Sharma(1996)Diabetes 45522-530)。
TGF-β在肝脏纤维化中也发挥重要作用。TGF-β刺激对于肝脏纤维化发展所必需的肝星形细胞的活化以生成成肌纤维细胞，而成肌纤维细胞是肝硬化发展过程中胞外基质的主要生成者。与此相似，已显示中断TGF-β信号转导路径可降低实验模型中的纤维化(Yata(2002)Hepatology 351022-1030；Aria(2003)BMC Gastroenterol 329)。TGF-β在癌症的形成过程中也发挥关键功能(总结于Derynck(2001)Nature Genetics29117-129；Elliott(2005)J Clin Onc 232078-2093)。在癌症发展早期，TGF-β对抗癌症形成，这种肿瘤抑制作用主要基于TGF-β抑制上皮细胞分裂的能力。相反，在肿瘤晚期，TGF-β促进癌症生长和转移灶的形成，其可归因于多数上皮肿瘤发展为对TGF-β的生长抑制作用产生耐受，而且TGF-β也通过其它机理同时支持癌细胞的生长。这些机理包括促进血管发生、免疫抑制作用，其促进肿瘤细胞生长并避免免疫系统的控制功能(免疫监视)和促进转移灶的形成和增强其侵袭性。肿瘤细胞侵袭性原型的形成是转移灶形成的主要前提。TGF-β通过其调控细胞粘附、运动性和胞外基质形成的能力促进这一过程。此外，TGF-β诱导细胞的上皮原型向侵袭性间质原型转变(EMT)。在一些研究中，TGF-β表达与预后不良之间的密切相关性也可以证明TGF-β在促进癌症生长中的重要作用。尤其是在前列腺癌、乳腺癌、肠癌和肺癌患者中发现TGF-β水平升高(Wikstrom(1998)Prostate 3719-29；Hasegawa(2001)Cancer 91964-971；Friedman(1995)CancerEpidemiol Biomarkers Prev 4549-54)。
由于上述的TGF-β对癌症的促进作用，抑制TGF-β信号转导路径例如通过抑制TGF-βI型受体来抑制该路径是一种可能的治疗概念。很多临床前实验已显示中断TGF-β信号转导路径的确抑制癌症生长。因此，用可溶性TGF-βII型受体治疗降低了随时间发展为侵袭性乳腺癌的转基因小鼠中转移灶的形成(Muraoka(2002)J Clin Invest 1091551-1559，Yang(2002)J Clin Invest 1091607-1615)。
表达有缺陷的TGF-βII型受体的肿瘤细胞系显示减弱的肿瘤和转移灶生长(Oft(1998)Curr Biol 81243-1252，McEachern(2001)Int J Cancer 9176-82，Yin(1999)J Clin Invest 103197-206)。
“其特征为TGF-β活性增强”的情况包括其中TGF-β合成受到刺激从而导致TGF-β水平升高的情况、或其中TGF-β潜伏性蛋白被不期望地活化或转化为活性TGF-β蛋白的情况、或其中TGF-β受体上调的情况、或其中TGF-β蛋白在疾病部位与细胞或胞外基质的结合力增强的情况。因此，在每种情况下，“活性增强”都是指在无论由于什么原因造成的TGF-β的生物学活性到达不期望的高水平的情况。
已发现多种疾病与TGF-β生成过多有关。
TGF-β胞内信号转导路径的抑制剂可用于治疗纤维增殖性疾病。具体而言，纤维增殖性疾病包括与不受调控的TGF-β活性和过度纤维化有关的肾脏病症，包括肾小球肾炎(GN)，例如肾小球系膜增殖性GN、免疫GN、新月体GN。其它肾脏病症包括糖尿病性肾病、肾间质纤维化、接受环孢茵素的移植患者的肾纤维化、以及HIV相关肾病。胶原血管病症包括进行性系统性硬化症、多发性肌炎、组织硬化、皮肌炎、嗜酸性筋膜炎、局限性硬皮病、或与雷诺综合征的发病有关的病症。由TGF-β活性过度导致的肺纤维化包括成人呼吸窘迫综合征、特发性肺纤维化和通常与自身免疫病症例如系统性红斑狼疮和局限性硬皮病、化学接触或过敏有关的间质性肺纤维化。具有纤维增殖性特征的另一自身免疫疾病是类风湿关节炎。
与纤维增殖性病症有关的眼病包括伴随增殖性玻璃体视网膜病的视网膜复置术、伴随眼内人工晶状体植入的内障摘除术、青光眼后引流术与TGF-β过度生成有关。
与TGF-β1生成过度有关的纤维化疾病可分为慢性病症例如肾、肺、肝的纤维化和急性病症例如真皮疤痕化和再狭窄(Chamberlain，J.Cardiovascular Drug Reviews，19(4)329-344)。肿瘤细胞对TGF-β1的合成和分泌也可导致免疫抑制，在患有侵袭性脑瘤或乳腺瘤的患者中可见(Arteaga等，(1993)J.Clin.Invest.922569-2576)。TGF-β1可剧烈改变利十曼原虫感染小鼠的过程(Barral-Netto等，(1992)Science 257545-547)。TGF-β1使疾病恶化，而TGF-β1抗体则在遗传上易感的小鼠中停止了疾病的进展。遗传上耐受的小鼠在施用TGF-β1后变得对利十曼原虫感染易感。
有关TGF-β1对胞外基质沉积的深刻影响的综述见(Rocco和Ziyadeh(1991)，Contemporary Issues in Nephrology v.23，Hormones，autocoidsand the kidney.Ed.Jay Stein，Churchill Livingston，New York pp.391-410；Roberts等，(1998)Rec.Prog.Hormone Res.44157-197)，其影响包括刺激胞外基质组分合成并抑制其降解。由于肾小球的结构和滤过性质在很大程度上由肾小球系膜和肾小球膜的胞外基质组成决定，因此TGF-β1对肾脏具有深刻影响这一点并不令人惊讶。在增殖性肾小球肾炎(Border等，(1990)Kidney Int.37689-695)和糖尿病性肾病(Mauer等，(1984)J.Clin.Invest.741143-1155)中肾小球系膜基质的累积很明显，也是所述疾病的主要病理学特征。在人糖尿病性肾小球硬化症(神经病变晚期)中TGF-β1水平升高(Yamamoto等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.901814-1818)。TGF-β1在多种哺乳动物模型中在肾纤维化的发病过程中是重要的介导因子(Phan等，(1990)Kidney Int.37426；Okuda等，(1990)J.Clin.Invest.86453)。针对TGF-β1的抗血清(Border等，(1990)Nature 346371)和可以与TGF-β1结合的胞外基质蛋白、即核心蛋白多糖(Border等，(1992)Nature 360361-363)显示能够抑制实验诱导的大鼠肾小球肾炎。
过度的TGF-β1导致真皮疤痕组织形成。注射至大鼠愈合伤口边缘的TGF-β1中和抗体已显示抑制疤痕形成而不干扰伤口愈合速度或伤口抗拉强度(Shah等，(1992)Lancet 339213-214)。同时伤口的血管发生、巨噬细胞和单核细胞数目都下降，疤痕组织中破坏的胶原纤维沉积量也下降。
在气囊血管成形术后，由于平滑肌细胞增殖和动脉内胞外基质沉积导致的动脉壁进行性增厚的因素之一可能是TGF-β1。再狭窄的动脉直径可被这种增厚减少90％，由于直径的减少大部分是由于胞外基质而不是平滑肌细胞体造成的，因此可能通过简单地降低广泛的胞外基质沉降而使这些血管开放至50％。在体内转染了TGF-β1基因的未损伤的猪动脉中，TGF-β1的基因表达与胞外基质合成和增生有关(Nabel等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9010795-10763)。TGF-β1诱导的增生不象PDGF-BB诱导的那样广泛，但含有TGF-β1转染子的胞外基质更为广泛。在该转基因猪模型中，胞外基质沉积与FGF-1(FGF的一种分泌型)诱导的增生无关(Nabel(1993)Nature 362844-846)。
在几种类型的癌症中，肿瘤生成的TGF-β1可能是有害的。MATLyLu大鼠前列腺癌细胞(Stainer和Barrack(1992)Mol.Endocrinol 615-25)和MCF-7人乳腺癌细胞(Arteaga等，(1993)Cell Growth and Differ.4193-201)在用表达小鼠TGF-β1的载体转染后变得致肿瘤性和转移性更强。TGF-β1与人前列腺癌和胃癌晚期的血管发生、转移和预后不良有关(Wikstrom，P.等，(1998)(Prostate 3719-29；Saito，H.等，(1999)Cancer 861455-1462)。在乳腺癌中，预后不良与TGF-β水平升高有关(Dickson等，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84837-841；Kasid等，(1987)Cancer Res.475733-5738；Daly等，(1990)J.Cell Biochem.43199-211；Barrett-Lee等，(1990)Br.J Cancer 61612-617；King等，(1989)J.Steroid Biochem.34133-138；Welch等，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 877678-7682；Walker等，(1992)Eur.J.Cancer 238641-644)，用他莫西芬治疗诱导的TGF-β1(Butta等，(1992)Cancer Res.524261-4264)与他莫西芬治疗乳腺癌失败有关(Thompson等，(1991)Br.J.Cancer 63609-614)。抗TGF-β1抗体抑制MDA-231人乳腺癌细胞在无胸腺小鼠中的生长(Arteaga等，(1993)J.Clin.Invest.922569-2576)，施用该抗体与脾脏自然杀伤细胞活性增高有相关性。用潜伏性TGF-β1转染的CHO细胞NK活性下降，在裸鼠中肿瘤生长加快(Wallick等，(1990)J.Exp.Med.1721777-1784)。因此，乳腺肿瘤分泌的TGF-β可能引起内分泌免疫抑制。TGF-β1血浆浓度高表明乳腺癌晚期患者预后不良(Anscher等，(1993)N.Engl.J.Med.3281592-1598)。在高剂量化疗和自体骨髓移植之前循环中TGF-β水平高的患者罹患肝静脉闭塞性疾病(所有患者的15-50％，死亡率高达50％)和特发性间质性肺炎(所有患者的40-60％)的风险较高。这些结果的含义是1)TGF-β1血浆水平升高可用于鉴别高风险患者和2)TGF-β1的减少可降低这些用于乳腺癌患者的普通治疗的发病率和死亡率。
很多恶性细胞分泌转化生长因子β(TGF-β)，它是高效的免疫抑制剂，表明TGF-β生成可能是一种肿瘤逃避宿主免疫监视的重要机理。在带瘤宿主中建立TGF-β信号转导被破坏的白细胞亚群是一种癌症免疫疗法的潜在手段。T细胞中TGF-β信号转导被破坏的转基因动物模型能够根除通常是致死性的过度表达TGF-β的淋巴肿瘤EL4(Gorelik和Flavell，(2001)Nature Medicine 7(10)1118-1122)。
TGF-β在肿瘤细胞中分泌的下调可恢复宿主免疫原性，T细胞对TGF-β不敏感则导致分化的加速和自身免疫，这些因素对于在耐受的宿主中对抗表达自体抗原的肿瘤而言可能是需要的。TGF-β的免疫抑制作用也与艾滋病患者中的一个亚群有关，这些患者中根据其CD4/CD8细胞计数预计其免疫反应水平较低(Garba等，J.Immunology (2002)1682247-2254)。TGF-β中和抗体能够在培养物中逆转这种作用，表明TGF-β信号转导抑制剂可用于逆转这个亚群的艾滋病患者的免疫抑制。
在癌症发生早期，TGF-β1可作为高效的肿瘤抑制子，并可介导一些化学保护剂的作用。但是，在恶性新生瘤的发育和进展过程中的某一点，肿瘤细胞似乎可以逃避TGF-β依赖性生长抑制，同时在微环境中出现生物活性TGF-β。在真核细胞中过度表达TGF-β的转基因系统中，TGF-β的这种肿瘤抑制/肿瘤促进的双重作用得到了最清晰的澄清。尽管转基因系统更加耐受良性皮肤损伤的形成，但是其中的转移转化速度却大大增加(Cui等，(1996)Cell 86(4)531-42)。原发性肿瘤中恶性细胞生成的TGF-β1似乎随着肿瘤分期的进展而增加。在多种主要上皮癌中进行的研究表明人类癌症对TGF-β生成量的增加在肿瘤进展过程中出现的相对较晚。此外，这种与肿瘤有关的TGF-β为肿瘤细胞提供了选择性优势并促进肿瘤生长。TGF-β1对细胞间相互作用和细胞与间质之间的相互作用的影响可导致其具有更高的侵袭和转移倾向性。
由于肿瘤相关TGF-β是活化淋巴细胞集落扩增的高效抑制剂，因此其可使肿瘤细胞逃避免疫监视。TGF-β还抑制血管生成抑制素的生成。癌症治疗方法例如放疗和化疗诱导肿瘤中生成活化的TGF-β，从而选择耐受TGF-β生长抑制作用的恶性细胞过度生长。因此，这些抗癌治疗增加风险，使生长性和侵袭性都得以增强的肿瘤加速发育。这种情况下，靶向TGF-β介导的信号转导路径的活性剂可能是一种非常有效的治疗策略。肿瘤细胞对TGF-β的耐受已经显示可以抵消放疗和化疗的多种细胞毒性效应，间质中TGF-β的治疗依赖性活化可能更有害，因为TGF-β使微环境更利于肿瘤生长，可能产生导致纤维化的组织损伤。研制TGF-β信号转导抑制剂单独使用或者可以与其它疗法组合使用都可能有利于治疗晚期癌症。
所述化合物适合于治疗癌症和受TGF-β影响的其它疾病状态，方法是通过将所述化合物施用于所述患者而在有需要的患者中抑制TGF-β。TGF-β还可用于对抗动脉粥样硬化(T.A.McCaffreyTGF-ps and TGF-βReceptors in AtherosclerosisCytokine and Growth factor Reviews 2000，11，103-114)和阿尔茨海默病(Masliah，E.；Ho，G.；Wyss-Coray，T.Functional Role of TGF-βin Alzheimer’s Disease Microvascular InjuryLessons from Trangenic MiceNeurochemistry International 2001，39，393-400)。
已发现本发明的化合物及其盐具有非常有价值的药理学性质，同时耐受性良好。
具体而言，其具有TGF-β受体I激酶抑制性质。
本发明的化合物优选表现出有利的生物学活性，所述生物学活性可以在酶分析法例如本文描述的分析法中容易地证明。在这种酶分析法中，本发明的化合物优选表现出并引起抑制作用，通常可由IC50值在一适当的范围内来证明，优选其为微摩尔级，更优选在纳摩尔级。
如本文所述，这些信号转导路径与多种疾病有关。因此，本发明的化合物可用于预防和/或治疗通过与一条或多条所述的信号转导路径相互作用而依赖于所述信号转导路径的疾病。
因此，本发明涉及作为本文所述的信号转导路径的促进剂或抑制剂，优选作为抑制剂的本发明的化合物。因此本发明优选涉及作为TGF-β信号转导路径的促进剂或抑制剂，优选作为抑制剂的本发明的化合物。
本发明还涉及本发明的一种或多种化合物用于治疗和/或预防疾病的用途，所述疾病优选是本文描述的由TGF-β活性增高引起、介导和/或传播的疾病。
因此本发明涉及作为药物和/或药物活性成分用于治疗和/或预防所述疾病的本发明的化合物、本发明的化合物用于制备用于治疗和/或预防所述疾病的药物的用途，以及用于治疗所述疾病的方法，其包括将本发明的一种或多种化合物施用于需要这种治疗的患者。
宿主或患者可以属于任何哺乳动物物种，例如灵长类、特别是人类；啮齿类，包括小鼠、大鼠和仓鼠；兔、马、奶牛、狗、猫等。动物模型可用于实验研究，为治疗人类疾病提供模型。
具体细胞对于本发明化合物的敏感性可以通过体外试验来确定。通常将细胞培养物与各种不同浓度的本发明化合物混合一段足以使活性剂诱导细胞死亡或抑制迁移的时间，通常为约1小时至1星期。体外实验可以使用活检样品培养的细胞。然后计数在处理之后仍然存活的细胞数目。
根据具体使用的化合物、具体疾病、患者状态等，剂量可以变化。治疗剂量通常足以显著降低靶组织中不期望细胞的数量，同时保持患者的生存力。治疗通常持续至已经发生细胞负担显著降低，例如细胞负担降低至少约50％，并且可以持续至基本上在体内检测不到不期望的细胞为止。
为鉴别信号转导路径并检测各个信号转导路径之间的相互作用，很多科学家开发了合适的模型或模型系统，例如细胞培养模型(例如Khwaja等，EMBO，1997，16，2783-93)和转基因动物模型(例如White等，Oncogene，2001，20，7064-7072)。为确定信号转导级联的某些阶段，可使用相互作用的化合物以调节信号(例如Stephens等，Biochemical J.，2000，351，95-105)。本发明的化合物还可用作试剂用于在动物和/或细胞培养模型中或者在本申请所述的临床疾病中测试激酶依赖性信号转导路径。
激酶活性的测量是本领域技术人员熟知的技术。用于测定激酶活性的使用底物例如组蛋白(例如Alessi等，FEBS Lett.1996，399，3，pp333-338)或碱性髓磷脂蛋白的遗传测试系统描述于文献中(例如Campos-Gonzalez，R.和Glenney，Jr.，J.R.1992，J.Biol.Chem.267，pp 14535)。
为鉴别激酶抑制剂，可利用各种分析系统。在闪烁近似分析(Sorg等，J.of Biomolecular Screening，2002，7，11-19)和Flashplate分析中，测量蛋白质或肽底物被γATP放射性磷酸化的水平。在抑制性化合物的存在下，可检测到放射性信号减弱或根本检测不到放射性信号。此外，合适的分析方法还有均相时间分辨荧光共振能量转移(HTR-FRET)和荧光极化(FP)技术(Sills等，J.of Biomolecular Screening，2002，191-214)。
其它非放射性ELISA分析方法使用特异性的磷酸抗体(磷酸-AB)。磷酸-AB只与磷酸化的底物结合。使用二级过氧化物酶结合的抗山羊抗体可通过化学发光法检测到这种结合(Ross等，2002，Biochem.J.，即将发表，手稿BJ20020786)。
现有技术 DE 2 409 308描述了作为药物活性成分的化合物“B2”、“B3”、“B4”、“B5”、“B8”、“B9”、“B10”、“B12”、“B14”、“B16”、“B17”、“B19”、“B20”，其具有镇痛和/或炎性作用。
E.Szarvasi等在Eur.J.Med.1978，13，113-119中描述了作为药物活性成分的化合物“B1”、“B6”、“B7”、“B11”、“B13”、“B15”、“B18”、“B21”、“B22”，其具有镇痛和/或炎性作用。
DE 2 318 673中描述了其它的三唑并-1，5-苯并二氮杂
类化合物。
L.Kosychova等在Chemistry of Heterocyclic Compounds，Vol.40，811-815(2004)中描述了其它用于抗击肿瘤的5，6-二氢-4H-1，2，4-三唑并-a]-1，5苯并二氮杂
化合物。
V.Ambrogi等在II Farmaco 48，665-676(1993)中描述了对中枢神经系统具有活性的1，4-苯并噻嗪和1，5-苯并噻氮
类化合物。
WO 03/042211 A1中公开了作为TGF-β抑制剂的其它三唑类衍生物。
WO 2004/026307 A1中也描述了作为TGF-β抑制剂的其它三唑类衍生物。
WO 02/094833中描述了作为TGF-β抑制剂的二环吡咯衍生物。
发明概述 本发明涉及选自于下组的化合物
及其可药用衍生物、溶剂合物、盐、互变异构体和立体异构体，包括它们的各种比例的混合物。
本发明还涉及这些化合物的旋光异构体(立体异构体)、对映体、外消旋体、非对映体以及水合物和溶剂合物。术语化合物的溶剂合物是指惰性溶剂分子加合至化合物中，由于相互的吸引力而形成。例如溶剂合物有一水合物或二水合物或醇化物。
术语可药用衍生物是指例如本发明化合物的盐和所谓的前药化合物。
术语前药衍生物是指通过例如烷基或酰基基团、糖或寡肽修饰的本发明的化合物，其在生物体内被迅速裂解形成本发明的有效化合物。这些也包括本发明化合物的可生物降解的聚合物衍生物，例如Int.J.Pharm.115，61-67(1995)所述。
表达法“有效量”是指药物或药学活性成分在组织、系统、动物或人类中引发例如研究者或医师追求或期望的生物学或医学响应的量。此外，表达法“治疗有效量”是指与没有接受该量的相应个体相比，产生以下结果的量改善治疗、愈合、预防或消除疾病、症状、病症、主诉、病状或副作用或者同时减缓疾病、主诉或病症的进展。
表达法“治疗有效量”还包括可有效增强正常生理功能的量。
本发明还涉及本发明化合物的混合物的用途，例如两种非对映体的混合物，例如其比例为1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶10或1∶1000。特别优选立体异构体化合物的混合物。
根据本身已知的方法制备本发明的化合物和用于制备它们的原料，如文献中所述(例如标准工具书例如Houben-Weyl，Methoden derorganischen Chemie[有机化学方法]，Georg-Thieme-Verlag，Stuttgart)，精确地在适合于所述反应的已知条件下进行。还可以采用本身已知的但本文没有更详细描述的变化形式。
优选通过使四氢苯并[b][1，4]二氮杂
-2-硫酮衍生物与碳酰肼类化合物反应制备本发明的化合物。
反应通常在惰性溶剂中进行。取决于使用的条件，反应时间从几分钟至14天不等，反应温度为约-15至150℃，通常为30-130℃，特别是60-120℃。
合适的惰性溶剂有例如烃类例如己烷、石油醚、苯、甲苯或二甲苯；氯代烃类例如三氯乙烯、1，2-二氯乙烷、四氯化碳、氯仿或二氯甲烷；醇类例如甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇、正丁醇或叔丁醇；醚类例如二乙醚、二异丙醚、四氢呋喃(THF)或二恶烷；甘醇醚例如乙二醇一甲醚或一乙醚、乙二醇二甲醚；酮类例如丙酮或丁酮；酰胺类例如乙酰胺、二甲基乙酰胺或二甲基甲酰胺(DMF)；腈类例如乙腈；亚砜例如二甲亚砜(DMSO)；二硫化碳；羧酸例如甲酸或乙酸；硝基化合物例如硝基甲烷或硝基苯；酯类例如乙酸乙酯或所述溶剂的混合物。
特别优选1-丁醇。
用三溴化硼在标准条件下处理适合于裂解醚类。
药用盐和其它形式 所述本发明的化合物可以以它们最终的非盐形式应用。另一方面，本发明也包括可药用盐形式的这些化合物的用途，所述盐可以通过本领域已知的方法衍生自多种有机和无机酸和碱。大部分本发明化合物的可药用盐形式可以通过常规方法制备。如果本发明化合物包含羧基基团，它的适当的盐之一可以通过将该化合物与适当的碱反应得到相应的碱加成盐来形成。此类碱为例如碱金属氢氧化物，包括氢氧化钾、氢氧化钠和氢氧化锂；碱土金属氢氧化物，如氢氧化钡和氢氧化钙；碱金属醇盐，例如乙醇钾和丙醇钠；以及多种有机碱，如哌啶、二乙醇胺和N-甲基谷氨酰胺。也包括本发明化合物的铝盐。在某些本发明化合物的情况中，酸加成盐可以通过将这些化合物用可药用的有机和无机酸处理来形成，所述酸例如氢卤酸，如盐酸、氢溴酸或氢碘酸；其它无机酸和它们相应的盐，如硫酸盐、硝酸盐或磷酸盐等；以及烷基-和单芳基磺酸盐，如乙磺酸盐、甲苯磺酸盐和苯磺酸盐；以及其它有机酸和它们相应的盐，如乙酸盐、三氟乙酸盐、酒石酸盐、马来酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、苯甲酸盐、水杨酸盐、抗坏血酸盐等。因此，本发明化合物的可药用酸加成盐包括下列乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、精氨酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸氢盐、溴化物、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、辛酸盐、氯化物、氯苯甲酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、磷酸二氢盐、二硝基苯甲酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、半乳糖酸盐(得自半乳糖二酸)、半乳糖醛酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、谷氨酸盐、甘油磷酸盐、半琥珀酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、马尿酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、碘化物、羟乙基磺酸盐、异丁酸盐、乳酸盐、乳糖酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、扁桃酸盐、偏磷酸盐、甲磺酸盐、甲基苯甲酸盐、磷酸一氢盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、草酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、苯基乙酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、膦酸盐、邻苯二甲酸盐，但本发明不限于这些盐。
另外，本发明化合物的碱盐包括铝、铵、钙、铜、铁(III)、铁(II)、锂、镁、锰(III)、锰(II)、钾、钠和锌盐，但本发明不限于这些盐。对于上文所述的盐，优选为铵盐；碱金属钠和钾的盐，以及碱土金属钙和镁的盐。衍生自可药用的有机无毒碱的本发明化合物的盐包括伯胺、仲胺和叔胺的盐，被取代的胺的盐，也包括天然存在的被取代的胺，环胺和碱性的离子交换树脂的盐，例如精氨酸、甜菜碱、咖啡因、氯普鲁卡因、胆碱、N，N′-二苄基乙二胺(苄星)、二环己基胺、二乙醇胺、二乙胺、2-二乙基氨基乙醇、2-二甲基氨基乙醇、乙醇胺、乙二胺、N-乙基吗啉、N-乙基哌啶、葡糖胺、氨基葡糖、组氨酸、海巴明(hydrabamine)、异丙基胺、利多卡因、赖氨酸、葡甲胺、N-甲基-D-葡糖胺、吗啉、哌嗪、哌啶、聚胺树脂、普鲁卡因、嘌呤、可可碱、三乙醇胺、三乙胺、三甲胺、三丙胺和三(羟甲基)甲胺(氨基丁三醇)的盐，但这并不用于限制本发明。
包含碱性含氮基团的本发明的化合物可以用如下物质将其季铵化(C1-C4)烷基卤化物，例如甲基、乙基、异丙基和叔丁基氯化物、溴化物和碘化物；二(C1-C4)烷基硫酸酯，例如二甲基、二乙基和二戊基硫酸酯；(C10-C18)烷基卤化物，例如癸基、十二烷基、月桂基、肉豆蔻基和十八烷基氯化物、溴化物和碘化物；以及芳基(C1-C4)烷基卤化物，例如苄基氯化物和苯乙基溴化物。水溶性和油溶性的本发明的化合物均可使用此类盐制备。
优选的上文所述的药用盐包括乙酸盐、三氟乙酸盐、苯磺酸盐、柠檬酸盐、富马酸盐、葡糖酸盐、半琥珀酸盐、马尿酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、羟乙基磺酸盐、扁桃酸盐、葡甲胺、硝酸盐、油酸盐、膦酸盐、新戊酸盐、磷酸钠、硬脂酸盐、硫酸盐、磺基水杨酸盐、酒石酸盐、硫代苹果酸盐、甲苯磺酸盐和氨基丁三醇，但这并不用于限制本发明。
碱性的本发明化合物的酸加成盐可以以常规方法，通过将游离碱形式与足量的所需酸反应来形成盐。游离碱可以以常规方法，通过将该盐形式与碱反应并且将游离碱分离而再生。游离碱形式在某些方面不同于它们相应的盐形式，如某些物理性质(例如在极性溶剂中的溶解度)；然而，就本发明的目的而言，盐与它们各自的游离碱形式是相当的。
如前文所述，可药用的本发明化合物的碱加成盐可以由金属或胺形成，例如碱金属和碱土金属或有机胺。优选的金属为钠、钾、镁和钙。优选的有机胺为N，N’-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、N-甲基-D-葡糖胺和普鲁卡因。
酸性的本发明的化合物的碱加成盐可以以常规方法，通过将游离酸形式与足量的所需碱反应来形成盐。游离酸可以以常规方法，通过将该盐形式与酸反应并且将游离酸分离而再生。游离酸形式在某些方面不同于它们相应的盐形式，如某些物理性质(例如在极性溶剂中的溶解度)；然而，就本发明的目的而言，盐与它们各自的游离酸形式是相当的。
如果本发明的化合物包含一个以上能形成此类可药用盐的基团，那么本发明也包含多盐。典型的多盐形式包括例如二酒石酸盐、二乙酸盐、二富马酸盐、二葡甲胺、二磷酸盐、二钠盐和三盐酸盐，但这并不用于限制本发明。
如上文所述，可知本文中的术语“可药用盐”是指包含一种盐形式的本发明化合物的活性成分，特别是如果这种盐形式使活性成分的药代动力学性质与之前使用的活性成分的游离形式或活性成分的任何其它盐形式相比有所改善时。活性成分的可药用盐形式可以为该活性成分首次提供之前没有的所需药代动力学性质，并且甚至可以对该活性成分关于其体内治疗效果方面的药效学具有积极的作用。
另外，本发明涉及包含至少一种本发明化合物和/或其可药用的衍生物、溶剂合物和立体异构体，包括其所有比例的混合物，以及任选的赋形剂和/或辅剂的药物。
药物制剂可以以剂量单位的形式给药，该剂量单位包含每剂量单位预定量的活性成分。该剂量单位可以包含例如0.5mg-1g、优选1mg-700mg、特别优选5mg-100mg的本发明化合物，具体剂量取决于所治疗的疾病、给药方式和患者的年龄、体重和状况，或者药物制剂可以以剂量单位的形式给药，该剂量单位包含每剂量单位预定量的活性成分。优选的剂量单位制剂为包含上文所述日剂量或分份剂量或其相应部分的活性成分的那些制剂。另外，此类药物制剂可以应用药学领域所熟知的方法来制备。
药物制剂可以通过任何所需的适当方法给药，例如通过口服(包括口腔或舌下)、直肠、鼻、局部(包括口腔、舌下或经皮)、阴道或非胃肠(包括皮下、肌内、静脉内或真皮内)方式给药。此类制剂可以应用所有药学领域已知的方法通过例如将活性成分与赋形剂或辅剂混合来制备。
适用于口服给药的药物制剂可以以分开的单位给药，如胶囊剂或片剂；散剂或颗粒剂；在水或非水液体中的溶液剂或混悬剂；可食用的泡沫剂或泡沫食物；或者水包油液体乳剂或油包水液体乳剂。
因此，例如，在以片剂或胶囊剂形式口服给药的情况下，可以将活性成分与口服、无毒并且可药用的惰性赋形剂如乙醇、甘油、水等混合。散剂可以通过将化合物粉碎成适当的细粉末并将其与以类似方法粉碎的药物赋形剂混合来制备，所述赋形剂是例如可食用的碳水化合物，如淀粉或甘露醇。也可以应用矫味剂、防腐剂、分散剂和染料等。
胶囊剂可以通过制备如上所述的粉末混合物并且将其填入成形的明胶壳中来制备。助流剂和润滑剂如高分散硅酸、滑石粉、硬脂酸镁、硬脂酸钙或固体形式的聚乙二醇，可以在填充操作前加入到粉末混合物中。同样可以加入崩解剂或增溶剂例如琼脂、碳酸钙或碳酸钠，以便在服用胶囊剂后提高药物的利用度。
另外，如果需要或必须，也可以向混合物中掺入适当的粘合剂、润滑剂和崩解剂以及染料。适当的粘合剂包括淀粉、明胶、天然糖(如葡萄糖或β-乳糖、用玉米制备的甜味剂)、天然的和合成的橡胶(如阿拉伯胶、黄蓍胶或海藻酸钠)、羧甲基纤维素、聚乙二醇、蜡等。这些剂型中所用的润滑剂包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等。崩解剂包括但不限于淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土、黄原胶等。片剂通过例如制备粉末混合物、制粒或干法压制混合物、加入润滑剂和崩解剂并压制全部混合物以得到片剂来配制。粉末混合物可以通过如上文所述将以适当方法粉碎的化合物与稀释剂或基质混合，并任选地与粘合剂(例如羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶或聚乙烯吡咯烷酮)、溶解阻滞剂(如石蜡)、吸收加速剂(如季盐)和/或吸附剂(如膨润土、高岭土或磷酸二钙)混合来制备。粉末混合物可以通过用粘合剂(如糖浆、淀粉浆、阿拉伯胶浆或纤维素或聚合物材料的溶液)将其润湿并且挤压过筛来制粒。作为制粒的替代方案，粉末混合物可以通过压片机操作，压制成形状不一的团块，该团块粉碎后形成颗粒。颗粒可以通过加入硬脂酸、硬脂酸盐、滑石粉或矿物油来润滑，以避免其粘附于片剂冲模。然后压制已润滑的混合物以得到片剂。本发明的化合物也可以与自由流动的惰性赋形剂混合，然后不经制粒或干法压制步骤直接压制得到片剂。可以存在透明的或不透明的保护层，该保护层包括紫胶密封层、糖或聚合物材料层和蜡抛光层。可以向这些包衣剂中加入染料以便区分不同的剂量单位。
口服的液体例如溶液剂、糖浆剂和酏剂，可以以剂量单位形式制备，以使其包含预定量的化合物。糖浆剂可以通过将化合物溶于含有合适矫味剂的水溶液中来制备，而酏剂可以应用无毒醇介质制备。混悬剂可以通过将化合物分散于无毒介质中来制备。也可以加入增溶剂和乳化剂(如乙氧基化的异十八烷醇和聚氧乙烯山梨醇醚)、防腐剂、矫味添加剂(如薄荷油或天然的甜味剂或糖精)或者其它的人工甜味剂等。
如果需要，口服给药的剂量单位制剂可以装入微囊中。该制剂也可以以延长或延缓释放的方式制备，例如通过包衣或将微粒材料包埋于聚合物、蜡等中。
本发明化合物及其盐、溶剂合物以及有生理学功能的衍生物也可以以脂质体传递系统的形式给药，例如单层小囊泡、单层大囊泡和多层囊泡。脂质体可以由各种磷脂例如胆固醇、硬脂胺或磷脂酰胆碱形成。
本发明化合物及其盐、溶剂合物和有生理学功能的衍生物可以用与该化合物分子偶联的单克隆抗体作为单一载体来传递。化合物也可以与作为靶向药物载体的可溶性聚合物偶联。此类聚合物可包括聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羟丙基甲基丙烯酰氨基苯酚、聚羟乙基天冬氨酰氨基苯酚或聚氧乙烯聚赖氨酸，其可以被棕榈酰基取代。另外，化合物还可以与一类适合获得药物控释的可生物降解的聚合物偶联，该聚合物是例如聚乳酸、聚-ε-己内酯、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚二羟基吡喃、聚氰基丙烯酸酯和水凝胶的交联或两亲的嵌段共聚物。
适于经皮给药的药物制剂可以以用于长时间紧密接触受体表皮的独立硬膏剂的形式给药。因此，例如活性成分可以从硬膏剂通过如Pharmaceutical Research，3(6)，318(1986)中所述的离子电渗疗法传递。
适于局部给药的药用化合物可以配制为软膏剂、乳膏剂、混悬剂、洗剂、散剂、溶液剂、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气雾剂或油剂。
对于眼或其它外部组织例如口腔和皮肤的治疗而言，制剂优选以局部软膏剂或乳膏剂的形式来应用。在制剂为软膏剂的情况下，活性成分可以与石蜡或易与水混溶的软膏剂基质共同应用。或者，活性成分可以用水包油型乳膏剂基质或油包水型乳膏剂基质配制成乳膏剂。
适于局部应用于眼部的药物制剂包括滴眼剂，其中活性成分溶于或混悬于合适载体中，特别是水性溶剂中。
适于局部应用于口腔的药物制剂包括锭剂、软锭剂和漱口剂。
适于直肠给药的药物制剂可以以栓剂或灌肠剂的形式给药。
适于鼻腔给药的药物制剂(其中载体物质为固体)包括具有粒径例如20-500微米范围内的粗粉剂，其以鼻吸的方式给药，即通过鼻道从接近鼻腔的装有粉末的容器内快速吸入。用液体作为载体物质的适于以鼻喷雾剂或滴鼻剂的形式给药的制剂包括活性成分的水或油溶液。
适于吸入给药的药物制剂包括细颗粒的粉末或喷雾，其可以通过多种类型的具有气雾剂、喷雾器或吹入器的加压分散器来产生。
适于阴道给药的药物制剂可以以阴道栓剂、阴道塞、乳膏剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂或喷雾制剂给药。
适于胃肠外给药的药物制剂包括含有抗氧化剂、缓冲剂、抑茵剂和溶质的水性和非水无菌注射液，通过所述溶质使该制剂与被治疗的患者的血液等张；以及水性和非水无菌混悬液，其可以包含助悬介质和增稠剂。这些制剂可以以单剂量或多剂量的容器进行给药，例如密封的安瓿和小瓶，并存贮于冷冻干燥(冻干)状态下，从而仅需在临用之前加入无菌液体载体，例如注射用水。依照处方制备的注射溶液和混悬液可以由无茵粉末、颗粒和片剂制备。
不言而喻，除了上文所特别指出的组分外，对于特定类型的制剂而言，制剂中也可以包含本领域常用的其它物质；因此，例如适于口服给药的制剂可以包含矫味剂。
本发明化合物的治疗有效量取决于多种因素，包括例如动物的年龄和体重、需要治疗的具体病症及其严重性、制剂的性质以及给药方法，并且最终由主治医生或兽医确定。然而，本发明的化合物用于治疗肿瘤生长(例如结肠或乳腺癌)的有效量，通常为每日0.1-100mg/kg受体(哺乳动物)体重，特别是每日1-10mg/kg体重。因此，对于体重为70kg的成年哺乳动物而言，每日的实际量通常为70-700mg，其中该剂量可以作为单剂量每日给药，或者通常以一系列的部分剂量(如2、3、4、5或6次)每日给药，但总的日剂量不变。其盐或溶剂合物或有生理学功能的衍生物的有效量可以确定为本发明化合物本身的有效量的分数。可以推断适于上述其它病症的治疗的类似剂量。
本发明还涉及包含至少一种本发明化合物和/或其可药用的衍生物、溶剂合物和立体异构体，包括其所有比例的混合物以及至少一种其他药物活性成分的药物。
本发明也涉及药盒，该药盒包括单独包装的 (a)有效量的本发明化合物和/或其可药用的衍生物、溶剂合物和立体异构体，包括其所有比例的混合物， 以及 (b)有效量的其他药物活性成分。
所述药盒包括适当的容器，如盒、单独的瓶、袋或安瓿。该药盒可以包括例如单独的安瓿，每个安瓿包含有效量的本发明化合物和/或其可药用的衍生物、溶剂合物和立体异构体，包括其所有比例的混合物， 以及有效量的溶解或冻干形式的其他药物活性成分。
用途 选自于下组的本发明的化合物
及其可药用衍生物、盐、溶剂合物、互变异构体和立体异构体、包括它们的各种比例的混合物适合用作药物活性成分用于哺乳动物、特别是人类，用于制备治疗和/或对抗癌症、肿瘤生长、转移灶生长、纤维化、再狭窄、HIV感染、阿尔茨海默病、动脉粥样硬化和/或促进伤口愈合的药物。
特别优选其用于治疗所述疾病是实体瘤的用途。
所述实体瘤优选选自于鳞状上皮瘤、膀胱癌、胃癌、肾癌、头颈癌、食道癌、宫颈癌、甲状腺癌、肠癌、肝癌、脑癌、前列腺癌、泌尿生殖道癌、淋巴系统癌、胃癌、喉癌和/或肺癌。
实体瘤进一步优选选自于肺腺癌、小细胞肺腺癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、结肠癌和乳腺癌。
进一步优选用于治疗血液肿瘤和免疫系统肿瘤的用途，优选治疗选自于急性髓细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、急性淋巴性白血病和/或慢性淋巴性白血病的用途。
本发明的化合物还适合于与已知的抗癌剂组合。这些已知的抗癌剂包括以下各项雌激素受体调节剂、雄激素受体调节剂、类维生素A受体调节剂、细胞毒性剂、抗增殖剂、异戊二烯基蛋白转移酶抑制剂、HMG辅酶A还原酶抑制剂、HIV蛋白酶抑制剂、逆转录酶抑制剂和其它血管发生抑制剂。本发明的化合物特别适合于与放疗同时施用。抑制VEGF与放疗的协同作用在现有技术中已有描述(参见WO 00/61186)。
“雌激素受体调节剂”是指以任何机理干扰或抑制雌激素与受体结合的化合物。雌激素受体调节剂的实例包括但不限于他莫西芬、雷洛昔芬、艾多昔芬、LY353381、LY117081、托瑞米芬、氟维斯群、4-[7-(2，2-二甲基)-1-氧代丙氧基-4-甲基-2-[4-[2-(1-哌啶基)-乙氧基]苯基]-2H-1-苯并吡喃-3-基-苯基-2，2-二甲基-丙酸酯、4，4’-二羟基苯甲酮-2，4-二硝基苯基腙和SH646。
“雄激素受体调节剂”是指以任何机理干扰或抑制雄激素与受体结合的化合物。雄激素受体调节剂的实例包括非那司提和其它5α还原酶抑制剂、尼鲁米特、氟它米特、比卡鲁胺、利阿唑、醋酸阿比特龙。
“类维生素A受体调节剂”是指以任何机理干扰或抑制类维生素A与受体结合的化合物。类维生素A受体调节剂的实例包括但不限于贝沙罗汀、维甲酸、13-顺视黄酸、9-顺式维甲酸、α-二氟甲基鸟氨酸、ILX23-7553、反式-N-(4’-羟基苯基)维甲胺和N-4-羧基苯基-维甲胺。
“细胞毒性剂”是指主要通过直接作用于细胞功能或抑制或干扰细胞减数分裂而导致细胞死亡的化合物，包括烷化剂、肿瘤坏死因子、嵌入剂、微管抑制剂和拓扑异构酶抑制剂。
细胞毒性剂的实例包括但不限于替拉扎明、Sertenef、恶病质素、异环磷酰胺、他索纳明、氯尼达明、卡铂、六甲密胺、泼尼莫司汀、二溴卫矛醇、雷莫司汀、佛替姆丁、奈达铂、奥沙利铂、替莫唑胺、庚铂、磷雌氮芥、甲苯磺酸英丙舒凡、氯乙环磷酰胺、嘧啶亚硝脲、二溴螺氯铵、嘌嘧替派、洛铂、沙铂、甲基丝裂霉素、顺铂、伊罗夫文、右异环磷酰胺、顺胺二氯(2-甲基吡啶)铂、苄基鸟嘌呤、葡磷酰胺、GPX100、(反式，反式，反式)双mu-(己烷-1，6-二胺)-mu-[二胺-铂(II)双[二胺(氯)铂(II)]四氯化物、二氮丙定基-精氨、三氧化砷、1-(11-十二烷基氨基-10-羟基十一烷基)-3，7-二甲基黄嘌呤、佐柔比星、去甲氧基柔红霉素、柔红霉素、比山群、米托蒽醌、吡喃阿霉素、吡萘非特、戊柔比星、氨柔比星、抗瘤酮、3’-脱氨基-3’-吗啉基-13-脱氧-10-羟基去甲柔红霉素、Annamycin、加柔比星、依利奈法德、MEN10755和4-脱甲氧基-3-脱氨基-3-氮丙啶基-4-甲基磺酰基柔红霉素(参见WO 00/50032)。
微管蛋白抑制剂的实例包括紫杉醇、长春碱、3’，4’-二脱氢-4’-脱氧-8’-去甲长春碱(norvincaleukoblastine)、多西紫杉醇(docetaxol)、根霉素、多拉司他汀、米伏布林羟乙基磺酸盐、奥瑞他汀(auristatin)、西马多丁、PRP109881、BMS184476、长春氟宁、Cryptophycin、2，3，4，5，6-五氟-N-(3-氟-4-甲氧基苯基)苯磺酰胺、脱水长春碱、N，N-二甲基-L-缬氨酰基-L-缬氨酰基-N-甲基-L-缬氨酰基-L-脯氨酰基-L-脯氨酸-叔丁基酰胺、TDX258和BMS188797。
拓扑异构酶抑制剂有例如托泊替康、Hycaptamine、依立替康、卢比替康、6-乙氧基丙酰基-3’，4’-O-外苯亚甲基教酒菌素、9-甲氧基-N，N-二甲基-5-硝基吡唑并[3，4，5-kl]吖啶-2-(6H)丙胺、1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3’，4’b，7]吲嗪并[1，2b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮、勒托替康、7-[2-(N-异丙基氨基)乙基]-(20S)喜树碱、BNP1350、BNPI1100、BN80915、BN80942、磷酸鬼臼乙叉甙、鬼臼噻吩甙、索布佐生、2’-二甲基氨基-2’-脱氧鬼臼乙叉甙、GL331、N-[2-(二甲基-氨基)乙基]-9-羟基-5，6-二甲基-6H-吡啶并[4，3-b]咔唑-1-甲酰胺、Asulacrine、(5a，5aB，8aa，9b)-9-[2-[N-[2-(二甲基氨基)乙基]-N-甲基氨基]乙基]-5-[4-羟基-3，5-二甲氧基苯基]-5，5a，6，8，8a，9-六氢呋喃并(3’，4’6，7)萘(2，3-d)-1，3-二氧代-6-酮、2，3-(亚甲二氧基)-5-甲基-7-羟基-8-甲氧基苯并[c]菲啶鎓、6，9-双[(2-氨基-乙基)氨基]苯并[g]异喹啉-5，10-二酮、5-(3-氨基丙基氨基)-7，10-二羟基-2-(2-羟基乙基氨基甲基)-6H-吡唑并[4，5，1-de]-吖啶-6-酮、N-[1-[2-(二乙基氨基)乙基氨基]-7-甲氧基-9-氧代-9H-硫代-占吨-4-基甲基]甲酰胺、N-(2-(二甲基氨基)乙基)吖啶-4-甲酰胺、6-[[2-(二甲基氨基)乙基]氨基]-3-羟基-7H-茚并[2，1-c]喹啉-7-酮和地美司钠。
“抗增殖剂”包括反义RNA和DNA寡核苷酸例如G3139、ODN698、RVASKRAS、GEM231和INX3001以及抗代谢剂例如依诺他滨、嘧福禄、喃氟啶、喷司他丁、脱氧氟尿苷、曲美沙特、氟达拉滨、卡培他滨、加洛他滨、阿糖胞苷十八烷基磷酸钠、氟替滨钠水合物(fosteabine sodiumhydrate)、雷替曲塞、Paltitrexid、乙嘧替氟、噻唑呋林、地西他滨、诺拉曲塞、培美曲塞、奈拉滨、2’-脱氧-2’-亚甲基胞啶、2’-氟亚甲基-2’-脱氧胞啶、N-[5-(2，3-二氢苯并呋喃基)磺酰基]-N’-(3，4-二氯苯基)脲、N6-[4-脱氧-4-[N2-[2(E)，4(E)-十四碳二烯酰基]甘氨酰基氨基]-L-甘油-B-L-吡喃甘露庚糖基]腺嘌呤、Aplidine、Ecteinascidin、曲沙他滨、4-[2-氨基-4-氧代-4，6，7，8-四氢-3H-嘧啶并[5，4-b]-1，4-三嗪-6-基-(S)-乙基]-2，5-噻吩酰基-L-谷氨酸、氨基喋呤、5-氟尿嘧啶、阿拉诺新、11-乙酰基-8-(氨基甲酰氧基甲基)-4-甲酰基-6-甲氧基-14-氧杂-1，11-二氮杂四环-(7.4.1.0.0)十四-2，4，6-三烯-9-基乙酸酯、苦马豆碱、洛美曲索、右丙亚胺、蛋氨酸酶、2’-氰基-2’-脱氧-N4-棕榈酰基-1-B-D-阿糖呋喃胞嘧啶和3-氨基吡啶-2-甲醛硫代缩氨基脲。“抗增殖剂”还包括除了“血管发生抑制剂”项下列出的生长因子的单克隆抗体例如曲妥单抗和肿瘤抑制基因例如p53，其可通过重组病毒介导的基因转移递送(参见例如美国专利6,069,134)。
测定抑制剂对TGF-β介导的作用的抑制效力的体外(酶)分析 作为例子，测试抑制剂消除TGF-β介导的生长抑制的能力。
将肺上皮细胞系Mv1Lu细胞以确定的细胞密度接种于96孔微量滴定板上，在标准条件下培养过夜。第二天，将培养基用含有0.5％FCS和1ng/ml TGF-β的培养基替换，加入确定浓度的受试物质，通常是5倍系列稀释的形式。溶剂DMSO的浓度恒定为0.5％。两天后，用结晶紫将细胞染色。从固定的细胞中提取出结晶紫之后，在550nm处用分光光度计测量吸收度。其可用于定量测定存在的粘附细胞，因此可定量培养过程中细胞的增殖情况。
表1TGF-β的抑制 测试TGF-βI型受体激酶抑制剂的细胞分析 激酶分析在384孔Flashplate中进行。
将31.2nM GST-ALK5、439nM GST-SMAD2和3mM ATP(0.3μCi33P-ATP/孔)在总体积为35μl的培养基(20mM HEPES、10mM MgCl、5mM MnCl、1mM DTT、0.1％BSA、pH7.4)中在30℃下在不含或含有受试物质(5-10个浓度)的条件下培养45分钟。用25μl200mM EDTA溶液终止反应，30分钟后在室温下抽吸过滤。用100μl 0.9％NaCl溶液将各孔洗涤三次。在TopCount中测量放射性。用RS1计算IC50值。
上下文中的全部温度都是℃。以下实施例中，“常规后处理”是指在需要时加入水，在需要时将pH调节至2-10，取决于终产物的组成，用乙酸乙酯或二氯甲烷萃取混合物，分离各相，有机相用硫酸钠干燥并蒸发，产物经硅胶色谱纯化和/或经结晶法纯化。硅胶上的Rf值；洗脱剂乙酸乙酯/甲醇9∶1。
质谱(MS) EI(电子冲击电离)M+ FAB(快速原子轰击)(M+H)+ ESI(电子喷雾电离)(M+H)+ APCI-MS(大气压化学电离质谱)(M+H)+ 保留时间Rt[分钟]由HPLC测定 柱Chromolith SpeedROD，50x4.6mm2(定单号1.51450.0001，从默克公司购买) 梯度5.0分钟，t＝0分钟，A∶B＝95∶5，t＝4.4分钟A∶B ＝25∶75，t＝4.5分钟-5.0分钟A∶B＝0∶100 流速3.00ml/min 洗脱剂A水+0.1％TFA(三氟乙酸) 洗脱剂B乙腈+0.08％TFA 波长220nm 实施例1 (R，S)-8-羟基-4-甲基-1-(6-甲基吡啶-2-基)-5，6-二氢-4H-2，3，6，10b-四氮杂苯并[e]甘菊环(“A1”)的制备以与如下方案类似的方案进行
1.15-甲氧基-2-硝基苯胺的制备 将10g 5-氯-2-硝基苯胺溶于100ml甲醇中，加入32.3g甲醇钠。将反应混合物在沸腾下回流18小时。冷却后，将混合物蒸发至干，加入500ml水，过滤分离粗产物。干燥后得到9.15g 5-甲氧基-2-硝基苯胺。
1.2(R，S)-3-(5-甲氧基-2-硝基苯基氨基)-2-甲基-丙酸的制备 将9.15g 5-甲氧基-2-硝基苯胺溶于60ml THF中，加入6.5ml 2-甲基丙烯腈和1.35ml 40％苄基三甲基铵氢氧化物在甲醇中的溶液。将反应混合物在沸腾下加热约20小时，冷却后，蒸发得到油状残余物。将粗产物溶于400ml甲醇和150ml水中，加入150ml 32％氢氧化钠溶液。将混合物在沸腾下加热3小时，冷却、蒸发，经常规后处理得到8.9g(R，S)-3-(5-甲氧基-2-硝基苯基氨基)-2-甲基-丙酸，为粗产物。
1.3(R，S)-8-甲氧基-4-甲基-1-(6-甲基吡啶-2-基)-5，6-二氢-4H-2，3，6，10b-四氮杂苯并[e]甘菊环的制备 将所得的8.9g(R，S)-3-(5-甲氧基-2-硝基苯基氨基)-2-甲基-丙酸溶于40ml水和40ml乙酸中，加入8.4g锌(粗粉)，将混合物在沸腾下加热18小时。经水性后处理得到2.35g(R，S)-7-甲氧基-3-甲基-1，3，4，5-四氢苯并[b]-1，4-二氮杂
-2-酮，其不经纯化即用于后续反应。将粗产物溶于25ml吡啶中，加入5.1g 2，4-双(4-甲氧基苯基)-2，4-二硫代-1，3，2，4-二硫杂二磷杂环丁烷，将混合物在110℃下加热3小时。冷却后，将混合物进行水性后处理，通过加入乙醚使粗产物沉淀。干燥后得到2.34g(R，S)-7-甲氧基-3-甲基-1，3，4，5-四氢苯并[b]-1，4-二氮杂
-2-硫酮。将其与6-甲基吡啶-2-碳酰肼一起在5ml 1-丁醇中在110℃加热17小时。冷却并经水性后处理后，将油状粗产物经制备型HPLC纯化。得到78mg(R，S)-8-甲氧基-4-甲基-1-(6-甲基吡啶-2-基)-5，6-二氢-4H-2，3，6，10b-四氮杂苯并[e]甘菊环。
1.4将60mg(R，S)-8-甲氧基-4-甲基-1-(6-甲基吡啶-2-基)-5，6-二氢-4H-2，3，6，10b-四氮杂苯并[e]甘菊环溶于2.5ml二氯甲烷中，滴加162μl三溴化硼。在室温下反应6小时之后，将混合物蒸发至干，粗产物经制备型HPLC纯化得到40mg“A1”。
经类似方法得到以下化合物
以下实施例涉及药物 实施例A注射小瓶 用2N的盐酸将100g式I的活性成分和5g磷酸氢二钠在3L重蒸水中的溶液调节至pH 6.5，无菌过滤，转移至注射小瓶内，在无菌条件下冻干并在无菌条件下密封。每个注射小瓶含有5mg活性成分。
实施例B栓剂 将20g式I的活性成分与100g大豆卵磷脂和1400g可可脂的混合物融化，倒入模具中并使之冷却。每个栓剂含有20mg活性成分。
实施例C溶液剂 通过将1g式I的活性成分、9.38g的NaH2PO4·2H2O、28.48g的Na2HPO4·12H2O和0.1g的苯扎氯铵溶于940ml重蒸水中来制备溶液剂。将pH调至6.8，将该溶液配制到1L并通过辐射消毒。该溶液可以用作滴眼液。
实施例D软膏剂 在无菌条件下将500mg式I的活性成分与99.5g凡士林混合。
实施例E片剂 将1kg式I的活性成分、4kg乳糖、1.2kg土豆淀粉、0.2kg滑石粉和0.1kg硬脂酸镁的混合物按照常规方法压制获得片剂，按此种方法制备的片剂每片包含10mg活性成分。
实施例F糖锭剂 按照类似于实施例E的方法压制片剂并随后按照常规方法用蔗糖、土豆淀粉、滑石粉、西黄蓍胶和染色剂的包衣剂进行包衣。
实施例G胶囊剂 将2kg式I的活性成分按照常规方法装入硬明胶胶囊中，按此种方法制备的每粒胶囊包含20mg活性成分。
实施例H安瓿剂 将1kg式I的活性成分在60L重蒸水中的溶液进行无菌过滤，转移至安瓿中，在无菌条件下冻干并在无茵条件下密封。每个安瓿包含10mg活性成分。
权利要求
1.选自于下组的化合物
及其可药用衍生物、溶剂合物、盐、互变异构体和立体异构体，包括它们的各种比例的混合物。
2.含有至少一种权利要求1所述的化合物和/或其可药用衍生物、盐、溶剂合物、互变异构体和立体异构体，包括它们的各种比例的混合物以及任选的赋形剂和/或辅剂的药物。
3.选自于下组的化合物及其可药用衍生物、盐、溶剂合物、互变异构体和立体异构体、包括它们的各种比例的混合物在制备用于治疗和/或对抗癌症、肿瘤生长、转移灶生长、纤维化、再狭窄、HIV感染、阿尔茨海默病、动脉粥样硬化和/或促进伤口愈合的药物中的用途
4.权利要求3的用途，其中所述肿瘤选自于鳞状上皮瘤、膀胱癌、胃癌、肾癌、头颈癌、食道癌、宫颈癌、甲状腺癌、肠癌、肝癌、脑癌、前列腺癌、泌尿生殖道癌、淋巴系统癌、胃癌、喉癌、肺癌、肺腺癌、小细胞肺腺癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、结肠癌、乳腺癌、血液肿瘤和免疫系统肿瘤、急性髓细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、急性淋巴性白血病、慢性淋巴性白血病。
5.权利要求3中所述的化合物和/或其生理学可接受的盐和溶剂合物在制备用于治疗实体瘤的药物中的用途，其中治疗有效量的权利要求3中所述的化合物与选自以下的化合物组合施用1)雌激素受体调节剂、2)雄激素受体调节剂、3)类维生素A受体调节剂、4)细胞毒性剂、5)抗增殖剂、6)异戊二烯基蛋白转移酶抑制剂、7)HMG辅酶A还原酶抑制剂、8)HIV蛋白酶抑制剂、9)逆转录酶抑制剂和10)其它血管发生抑制剂。
6.权利要求3中所述的化合物和/或其生理学可接受的盐和溶剂合物在制备用于治疗实体瘤的药物中的用途，其中治疗有效量的权利要求3中所述的化合物与放疗和选自以下的化合物组合施用1)雌激素受体调节剂、2)雄激素受体调节剂、3)类维生素A受体调节剂、4)细胞毒性剂、5)抗增殖剂、6)异戊二烯基蛋白转移酶抑制剂、7)HMG辅酶A还原酶抑制剂、8)HIV蛋白酶抑制剂、9)逆转录酶抑制剂和10)其它血管发生抑制剂。
全文摘要
新的三唑衍生物是TGF-β受体I激酶的抑制剂，其可用于治疗肿瘤。
文档编号A61K31/38GK101346383SQ200680048791
公开日2009年1月14日 申请日期2006年11月24日 优先权日2005年12月23日
发明者B·塞尚, C·阿门特, H·格雷纳尔, U·格拉德勒, G·赫尔策曼 申请人:默克专利有限公司