专利名称：9－脂肪氨基取代小檗碱衍生物及其制备方法与作为抗癌药物的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新药物化合物，具体的说，涉及一种9-脂肪氨基取代小檗碱衍生物及其制备方法与作为抗癌药物的应用。
背景技术：
癌症是威胁人类健康和生命安全的主要疾病。抗癌药物的研究与开发一直是化学家和药物学家关注的热点。寻找高效、高选择性、毒副作用小的抗癌药物是药物研究开发的重要方向之一。
以DNA为靶点设计合成抗癌药物，特别是针对具有重要生理意义的端粒DNA及原癌基因DNA的特殊高级结构设计合成小分子抑制剂，是发展新型抗癌药物的重要方法。与端粒DNA，以及原癌基因c-myc DNA相互作用的小分子化合物具有一些共同的结构特征具有三个或者更多的近似平面芳环结构；一条或者几条在生理条件下带正电荷的侧链。它们的抗癌作用的机制主要是通过与端粒DNA或原癌基因c-myc DNA相互作用，抑制癌细胞的端粒酶活性，或c-myc基因的表达，从而抑制癌细胞的复制。
小檗碱是一种生物碱，是黄连等重要中药的主要有效成分。小檗碱具有良好的抗菌和抗炎作用，也有一定的抗癌活性。以小檗碱的母核为基础进行结构改造，是发现具有更好抗癌活性先导化合物的一条可行途径。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术存在的不足，提供一类新的9-脂肪氨基取代小檗碱衍生物。
本发明的另一个目的是提供上述9-脂肪氨基取代小檗碱衍生物的制备方法。
本发明的进一步目的是提供上述9-脂肪氨基取代小檗碱衍生物在制备抗癌药物中的应用。
本发明根据一些与端粒DNA或c-myc DNA相互作用的小分子化合物的结构特征，在保留小檗碱母体骨架的情况下，在9-位引入一条脂肪氨基侧链，得到可与端粒DNA或原癌基因c-myc DNA相互作用很强的的9-脂肪氨基取代的小檗碱类衍生物。而小檗碱本身与端粒DNA或原癌基因c-myc DNA相互作用很弱。
9-脂肪氨基取代小檗碱衍生物，其通式如式(I) 其中，n选自1～5；R1、R2可以相同，也可以不同，分别选自H、C1-6的烷基、哌啶基、吗啉基、哌嗪基、吡噁啉基。
上述9-脂肪氨基取代小檗碱衍生物的制备方法，包括如下步骤在高温和真空条件下，将小檗碱1的9-甲氧基转变成9-羟基2；再与α，ω-二溴烷烃[Br-(CH2)n-Br]进行烷基化反应；所得化合物3再与取代胺化合物(R1-NH-R2)反应，产物经离子树脂交换得到9-脂肪氨基取代小檗碱衍生物4。反应通式见式(II)。
发明人在长期的研究中发现，与小檗碱相比较，9-脂肪氨基取代的小檗碱衍生物与富含鸟嘌呤的端粒DNA以及原癌基因c-myc DNA具有很强的相互作用，显示对癌细胞中的端粒/端粒酶具有很好的抑制活性，对原癌基因c-myc的表达有很强的抑制作用。进一步实验证明，本发明涉及的9-脂肪氨基取代的小檗碱衍生物对多种癌细胞株具有显著的抑制作用，而对正常细胞毒性小，可用于制备抗肿瘤药物。
本发明的9-脂肪氨基取代小檗碱衍生物可与药学上可接受的辅助剂混合，制备各种剂型，如片剂、丸剂、胶囊、注射剂、悬浮剂或乳剂等等。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果本发明的9-脂肪氨基取代小檗碱衍生物与富含鸟嘌呤的端粒DNA以及原癌基因c-mycDNA具有很强的相互作用，显示对癌细胞中的端粒/端粒酶具有很好的抑制活性，对原癌基因c-myc的表达有很强的抑制作用。实验证明，本发明的9-脂肪氨基取代小檗碱衍生物对多种癌细胞株具有显著的抑制作用，而对正常细胞毒性小，可用于制备抗肿瘤药物。
具体实施例方式
实施例1化合物2的合成将0.1mol干燥的盐酸小檗碱置于真空干燥箱中，升温至190℃，在10-15mmHg压力下反应15min，得暗红色粉末固体，粗品用氯仿/甲醇(V/V＝9∶1)柱层析洗脱，得鲜红色固体粉末2。
产率78％；1H NMR(CD3OD/CDCl3，300MHz)δ9.23(s，1H)，8.47(s，1H)，8.07(d，1H，J＝9.1)，7.90(d，1H，J＝9.1)，7.50(s，1H，)，6.93(s，1H)，6.06(s，2H)，4.37(t，2H，J＝6.5)，4.02(s，3H)，3.10(t，2H，J＝6.5)；FAB-MS m/z321[M]+；元素分析C19H15NO4，理论值C，71.02；H，4.71；N，4.36.实测值C，71.38；H，4.95；N，4.57.
化合物2实施例2化合物3a的合成将0.05mol化合物2溶于300ml乙腈中，加入0.12mol的1，3-二溴丙烷于70-80℃反应3小时，趁热抽滤，固体用乙腈洗涤2次，粗品用氯仿/甲醇(V/V＝9∶1)柱层析洗脱，得鲜黄色固体3a。
产率62％；1H NMR(CD3OD/CDCl3，300MHz)δ9.72(s，1H)，8.51(s，1H)，8.09(d，1H，J＝9.0)，7.92(d，1H，J＝9.0)，7.47(s，1H，)，6.88(s，1H)，6.01(s，2H)，4.85(t，2H，J＝5.5)，4.34(t，2H，J＝6.2)，4.05(s，3H)，3.32(t，2H，J＝6.7)，3.00(t，2H，J＝5.5)，2.25(m，2H)；FAB-MSm/z442[M-Br]+；元素分析C22H21Br2NO4，理论值C，50.50；H，4.05；N，2.68.实测值C，50.24；H，4.33；N，2.41 化合物3a实施例3化合物3b的合成方法同实施例2，所不同的是用1，2-二溴乙烷代替1，3-二溴丙烷，得鲜黄色固体3b。
产率62％；1H NMR(CD3OD/CDCl3，300MHz)δ9.69(s，1H)，8.57(s，1H)，8.03(d，1H，J＝9.1)，7.89(d，1H，J＝9.1)，7.45(s，1H，)，6.94(s，1H)，6.04(s，2H)，4.91(t，2H，J＝5.6)，4.46(t，2H，J＝6.0)，4.07(s，3H)，3.72(t，2H，J＝6.0)，3.02(t，2H，J＝5.6)；FAB-MS m/z428[M-Br]+；元素分析C21H19Br2NO4，理论值C，49.53；H，3.76；N，2.75.实测值C，49.40；H，3.54；N，2.93
化合物3b实施例4化合物4a的合成将0.01mol化合物3a溶于30ml乙腈中，加入0.02mol二甲胺盐酸盐，于80℃反应3小时，冷却，抽滤，粗品用氯仿/甲醇(V/V＝9∶1)柱层析洗脱后，固体经Dowex离子交换树脂交换，得到鲜黄色固体粉末4a。
产率52％；1H NMR(DMSO-d6，300MHz)δ9.70(s，1H)，8.88(s，1H)，8.16(d，1H，J＝9.2)，8.01(d，1H，J＝9.2)，7.75(s，1H)，7.06(s，1H)，6.13(s，2H)，4.90(t，2H，J＝5.5)，4.31(t，2H，J＝5.7)，4.04(s，3H)，3.36(t，2H，J＝7.8)，3.20(t，2H，J＝5.7)，2.85(s，6H)，2.22(m，2H)；FAB-MS m/z407[M-Cl]+；元素分析C24H27ClN2O4，理论值C，65.08；H，6.14；N，6.32.实测值C，65.27；H，6.42；N，6.05.
化合物4a实施例5化合物4b的合成方法同实施例4，所不同的是用二乙胺代替二甲胺盐酸盐，产物为鲜黄色固体粉末4b。
产率58％；1H NMR(DMSO-d6，300MHz)δ9.73(s，1H)，8.90(s，1H)，8.20(d，1H，J＝9.1)，8.04(d，1H，J＝9.1)，7.78(s，1H)，7.09(s，1H)，6.16(s，2H)，4.92(t，2H，J＝5.6)，4.36(t，2H，J＝5.8)，4.07(s，3H)，3.38(t，2H，J＝7.5)，3.22(m，6H)，2.24(m，2H)，1.26(t，6H，J＝7.2)；FAB-MS m/z435[M-Cl]+；元素分析C26H31ClN2O4，理论值C，66.30；H，6.63；N，5.95.实测值C，66.61；H，6.37；N，6.21 化合物4b实施例6化合物4c的合成方法同实施例4，所不同的是用哌嗪代替二甲胺盐酸盐，产物为鲜黄色固体粉末4c。
产率29％；1H NMR(CD3OD/CDCl3，300MHz)δ9.93(s，1H)，8.50(s，1H)，7.94(d，1H，J＝9.2)，7.88(d，1H，J＝9.1)，7.47(s，1H)，6.82(s，1H)，6.02(s，2H)，5.01(t，2H，J＝5.7)，4.46(t，2H，J＝5.5)，4.02(s，3H)，3.49(t，2H，J＝5.5)，3.24-3.16(m，8H)，2.94(t，2H，J＝7.6)，2.38(m，2H)；FAB-MS m/z448[M-Cl]+；元素分析C26H30ClN3O4，理论值C，64.52；H，6.25；N，8.68.实测值C，64.77；H，6.06；N，8.74.
化合物4c实施例7化合物4d的合成方法同实施例4，所不同的是用哌啶代替二甲胺盐酸盐，产物为鲜黄色固体粉末4d。
产率48％；1H NMR(CD3ODCDCl3，300MHz)δ9.69(s，1H)，8.55(s，1H)，7.97(d，1H，J＝9.3)，7.94(d，1H，J＝9.3)，7.52(s，1H)，6.88(s，1H)，6.09(s，2H)，4.93(t，2H，J＝6.2)，4.42(t，2H，J＝6.3)，4.08(s，3H)，3.24(t，2H，J＝6.3)，2.62(t，2H，J＝7.7)，.2.51(brs，4H)，2.12(m，2H)；1.64(m，4H)，1.51(m，2H)；FAB-MS m/z447[M-Cl]+；元素分析C27H31ClN2O4，理论值C，67.14；H，6.47；N，5.80.实测值C，67.25；H，6.70；N，5.53.
化合物4d实施例8化合物4e的合成方法同实施例4，所不同的是用吗啉代替二甲胺盐酸盐，产物为鲜黄色固体粉末4e。
产率60％；1H NMR(CD3OD/CDCl3，300MHz)δ9.65(s，1H)，8.48(s，1H)，7.92(d，1H，J＝9.1)，7.88(d，1H，J＝9.1)，7.46(s，1H)，6.80(s，1H)，6.01(s，2H)，4.90(t，2H，J＝6.3)，4.39(t，2H，J＝6.4)，4.01(s，3H)，3.67(t，4H，J＝4.4)，3.19(t，2H，J＝6.4)，2.62(t，2H，J＝7.4)，2.51(t，4H，J＝4.4)；2.09(m，2H)；FAB-MS m/z449[M-Cl]+；元素分析C26H29ClN2O5，理论值C，64.39；H，6.03；N，5.78.实测值C，64.66；H，5.89；N，6.02.
化合物4e实施例9化合物4f的合成方法同实施例4，所不同的是用化合物3b代替3a，用二乙胺代替二甲胺盐酸盐，产物为鲜黄色固体粉末4f。
产率42％；1H NMR(DMSO-d6，300MHz)δ9.81(s，1H)，9.00(s，1H)，8.19(d，1H，J＝9.2)，8.06(d，1H，J＝9.2)，7.76(s，1H)，7.07(s，1H)，6.14(s，2H)，4.89(t，2H，J＝5.5)，4.51(t，2H，J＝4.0)，4.07(s，3H)，3.68(t，2H，J＝4.0)，3.34(m，4H)，3.22(t，2H，J＝5.5)，1.29(t，6H，J＝7.0)；FAB-MS m/z421[M-Cl]+；元素分析C25H29ClN2O4，理论值C，65.71；H，6.40；N，6.13.实测值C，65.45；H，6.65；N，6.28.
化合物4f实施例10化合物4g的合成方法同实施例4，所不同的是用化合物3b代替3a，用二异丙胺代替二甲胺盐酸盐，产物为鲜黄色固体粉末4g。
产率20％；1H NMR(CD3OD/CDCl3，300MHz)δ9.86(s，1H)，8.58(s，1H)，8.02(d，1H，J＝9.0)，7.97(d，1H，J＝9.0)，7.56(s，1H，)，6.90(s，1H)，6.11(s，2H)，4.96(t，2H，J＝5.7)，4.39(t，2H，J＝6.7)，4.11(s，3H)，3.30(m，2H)，3.13(t，2H，J＝6.7)，3.02(t，2H，J＝5.7)，1.11(d，12H，J＝6.3)；FAB-MS m/z449[M-Cl]+；元素分析C27H33ClN2O4，理论值C，66.86；H，6.86；N，5.78.实测值C，66.71；H，6.92；N，5.57.
化合物4g实施例119-脂肪氨基取代小檗碱衍生物对端粒酶的抑制作用选择部分具有代表性的化合物，采用TRAP法进行无细胞体系端粒酶活性测定。从人乳腺癌细胞株MCF-7中提取总蛋白(内含端粒酶)，将一定量的总蛋白提取液与待测药物混合加入TRAP反应混合液中，PCR反应后利用荧光凝胶成像仪或荧光酶标仪进行检测，通过吸光值计算抑制端粒酶活性达50％时的化合物浓度，以IC50tel表示，结果如表1所示。结果表明，式(I)化合物在体外对端粒酶有明显抑制作用。因此本发明的9-脂肪氨基取代小檗碱衍生物可用于制备以端粒酶为靶点的抗癌药物。
表1式(I)化合物对端粒酶活性的抑制作用(IC50tel/M)
实施例129-脂肪氨基取代小檗碱衍生物对c-myc DNA表达的抑制作用选择部分具有代表性的化合物，采用RT-PCR法进行c-myc癌基因转录水平测定。处于对数生长期的淋巴瘤细胞株K562中加入不同浓度的9-脂肪氨基取代小檗碱衍生物，作用96小时后，从细胞中提取总RNA，以c-myc特异引物进行RT-PCR，电泳后测定条带光密度值，计算抑制c-myc表达达50％时的化合物浓度，以IC50表示，结果如表2所示。结果表明式(I)化合物对细胞内癌基因c-myc的转录表达有明显抑制作用。因此本发明的9-脂肪氨基取代的小檗碱衍生物可用于制备以癌基因c-myc为靶点的抗癌药物。
表2式(I)化合物对c-myc基因表达的抑制作用(IC50/M)
实施例139-脂肪氨基取代小檗碱衍生物对肿瘤细胞生长的抑制作用选择部分具有代表性的化合物，以四种肿瘤细胞株NCI-H460(人肺腺癌细胞株)、GLC-82(人肺腺癌细胞株)、MCF-7(人乳腺癌细胞株)，采用MTT法进行体外细胞毒测定。对数生长期细胞加入不同浓度的9-脂肪氨基取代的小檗碱衍生物，作用48小时后，测定其吸光度。分别计算抑制细胞生长达50％时的化合物浓度，以IC50值表示，结果如表3所示。结果表明式(I)化合物在体外对这三种肿瘤细胞株均具有较强的抑制作用。因此本发明的9-脂肪氨基取代的小檗碱衍生物可用于制备抗癌的药物。
表3式(I)化合物对肿瘤细胞株生长的抑制作用(IC50/M)
实施例149-脂肪氨基取代小檗碱衍生物急性毒性试验选择部分具有代表性的化合物(如4c)，进行急性毒性试验。取18-22克小鼠随机分六组，每组10只小鼠，分别用生理盐水、DMSO2.5ml/kg、4c 500mg/kg、4c 200mg/kg、4c 100mg/kg、4c 50mg/kg处理，观察14天，结果可见500mg/kg组小鼠45％死亡，即4c对小鼠的急性毒性LD50值大约为500mg/kg。因此本发明的9-脂肪氨基取代的小檗碱衍生物的急性毒性较小，可用于制备抗癌药物。
权利要求
1.9-脂肪氨基取代小檗碱衍生物，其通式如式(I) 其中，n选自1～5；R1、R2可以相同，也可以不同，分别选自H、C1-6的烷基、哌啶基、吗啉基、哌嗪基、吡噁啉基。
2.权利要求1所述9-脂肪氨基取代小檗碱衍生物的制备方法，其特征在于包括如下步骤在高温和真空条件下，将小檗碱的9-甲氧基转变成9-羟基；再与Br-(CH2)n-Br进行烷基化反应；所得化合物再与R1-NH-R2反应，产物经离子树脂交换得到9-脂肪氨基取代小檗碱衍生物。
3.权利要求1所述9-脂肪氨基取代小檗碱衍生物在制备抗癌药物中应用。
全文摘要
本发明公开了一种9－脂肪氨基取代小檗碱衍生物及其制备方法与作为抗癌药物的应用。本发明根据一些与端粒DNA或c－myc DNA相互作用的小分子化合物的结构特征，在保留小檗碱母体骨架的情况下，在9－位引入一条脂肪氨基侧链，得到可与端粒DNA或原癌基因c－myc DNA相互作用很强的的9－脂肪氨基取代的小檗碱类衍生物。显示对癌细胞中的端粒/端粒酶具有很好的抑制活性，对原癌基因c－myc的表达有很强的抑制作用。实验证明，本发明的9－脂肪氨基取代小檗碱衍生物对多种癌细胞株具有显著的抑制作用，而对正常细胞毒性小，可用于制备抗肿瘤药物。
文档编号A61P35/00GK101050213SQ20071002798
公开日2007年10月10日 申请日期2007年5月14日 优先权日2007年5月14日
发明者黄志纾, 古练权, 张万金, 欧田苗, 卢宇靖 申请人:中山大学