制备抗糖抗原的特异性抗体的方法

专利名称：：制备抗糖抗原的特异性抗体的方法制备抗糖抗原的特异性抗体的方法
技术领域：
：本发明用途于免疫诊断和免疫治疗领域，且更具体地说，本发明涉及用于制备抗胂瘤相关糖类抗原的抗体的化合物。背景已知糖类在几个生物和生理通路中起重要作用。事实上已经发现它们促成蛋白质稳定性或对降解的抗性，促成胞内信号传导的调节和将糖蛋白靶向至膜或细胞器，并且涉及免疫识别[作为一般参考文献参见Varki,A.;67，6/'o7柳1993,3，97130，Bertozzi,C丄，Kiessling,L丄；5We"ce2001，291，2357-64，Angeloni，S.;67,co6/o7柳2005，15(1)，31-41〗。除此之外，几项研究和研究计划发现糖类及其衍生物，例如聚糖也参与某些细胞的肿瘤性修饰。事实上[如以下文献中报导的Hakomori，S.;Chapter4//7Montreuil，J.，VIiegenthart,J.F.G.，Schachter，H.(editors)Glycoproteinsanddisease.Elsevier,Amsterdam,1996或者KobataA.;Cancercellsandmetastasis.Chapter3/"Montreuil,J.，VIiegenthart,J.F.G.,Schachter,H.(editors)67ycoprofe//sa/7f/d/sease.Elsevier,Amsterdam,1996或Kumamoto等A/oc力e边/ca/"/opA/s/ca/AesearcACo迈/Bii刀/ca^.o/JS1998,247，514—7或Hakomori,S.;PA^S2002，"(l6)，10231-33],已经观察到已知存在于细胞膜上的聚糖通常表现出结构修饰，例如在癌细胞膜中比在正常细胞膜中高度支化。同样，除任何结构修饰外，就正常细胞而言还观察到在膜糖类中组成上的改变。作为在肿瘤形成过程中起作用的糖部分的额外实例，例如唾液酸(参见TheMerckIndex;XIIIEd.;No.8558),即作为神经氨酸相5关化合物成员的9-碳原子氨基糖。事实上已经观察到某些肿瘤形式的高度转移活性可能与细胞膜中唾液酸的浓度增加十分相关，由此产生了转移现象中胞外基质细胞的粘附能力下降(作为参考文献参见Varki,A.等细e/〃a/so/"^/coWo/og/.Co/d〃flr6wZa6or"or/,ress，Co/d5^r//7g〃ar6or,/arir1999)。另外，例如如Sames，D.等在胞&re1997，389，587-91或Dwek，M.V.等("/'//caC//边/'ca1998，271,191-202)或Burchel1等("7/co6/o/og/1999，9(12)，1307-ll)或Taylor-Papadimitriou等Woc嵐肠;一1999，1455,301-13)或Hanisch等(67/co6/o/o^r2000，10(5)，439-49)或Schuman,J.等(67ycoco/2乂i^"e/owvs/2000，17，835-48)所报导的，在复杂的糖化合物内，高度糖基化的糖蛋白类改变的MUC1似乎促成了肿瘤细胞的转移潜能，所述MUC1显示出大量O-糖残基并且在上皮表面提供保护层且参与细胞-细胞相互作用，信号传导和转移(作为参考文献参见ParryS，SilverraanHS等,Biochem.Biophys.Res.Commun.2001;11;283(3):715-20)。尽管已经发现大量分子改变与肿瘤的每单个发育或进展期相关，但是它们之间的确切关系尚不完全了解。作为肺瘤的特征，在糖类中发现的表型改变一般称作肿瘤相关糖类抗原(下文缩写为TACAs)。在最广泛已知的TACAs中，有分别常称作TF和Tn的表位Gal-P-1—3-GalNAc-ot-O.Ser/Thr和GalNAc-a-0.Ser/Thr(参见下文的化学结构)。TF抗原(Gal_P-l一3-GalNAc-a-0.Ser/Thr)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>Tn抗原(GalNAc-cc-O.Ser/Thr)由上文报导的式中，Tn免疫决定簇基团是与丝氨酸或苏氨酸羟基a连接的GalNAc残基，它在糖蛋白的氨基-末端区中出现。由此通过酶P-半乳糖基转移酶的作用形成Ga卜p-1—3-GalNAc-ot-0.Ser/Thr(TF抗原)，其中取自Gal-核苷酸的半乳糖残基添加到Tn残基上。已经研究了在正常组织中出现的这些抗原以便验证它们对病理性组织的特异性(例如，参见Cao，Histochem.CellBiol.1996，106，197-207)。此外，发现TF和Tn抗原以免疫反应形式在约90°/。癌组织中过表达至显著程度(作为参考文献参见Springer,G.F.;&/e/7ce1984，224,1198-206)并且其在人癌中的相对比例经常与癌本身的攻击性相关。几项研究的结果也提示在转移过程的早期，TF和Tn抗原在肿瘤细胞与相邻正常细胞之间的粘附现象中起关键作用(作为参考文献参见Kischikawa等在Jpn.J.CancerRes.1999，90，326-32中所述)。在癌细胞中特异性过表达的糖类抗原的分离和结构鉴定，且由此TF和Tn的分离和结构鉴定代表了研发肺瘤性疾病的治疗和诊断策略的第一步基于糖类的免疫治疗和免疫诊断(例如，参见Allen在J.Am.Chem.Soc.，2001，123,1890-7中所述)。本领域中众所周知免疫治疗涉及刺激抗有害物的天然身体防御，即免疫系统，所述的有害物诸如微生物、污染物质、化学制品、食品等。因此，设想特征在于在其膜上的TACAs表达改变的癌细胞可以代表人或动物免疫系统的靶标。发现通过合适的肿瘤抗原，诸如，例如Tn或TF抗原对免疫系统的刺激可以成为抗肿瘤的富有希望的治疗工具。Toyokuni等(作为参考文献参见Bioorg.Med.Chem.1994,2，119-32)描述了通过使用进一步与绵羊血清白蛋白，Starbust⑧树状聚体和三棕榈酰基-S-甘油基半胱氨酰基丝氨酸(P3CS)缀合的一聚化、二聚化和三聚化Tn抗原制备完全合成的糖类疫苗。Lo-Man等(例如，参见J.Immunol.2001，166，2849-54)披露了开发完全合成的免疫原，它称作多抗原糖肽并且基于具有四个臂的树状聚体赖氨酸核。Kuduk等(作为参考文献参见J.Am.Chem.Soc.1998，120,12474-12485)描述了KLH、BSA和脂肽(pam)在Tn和TF抗原群集化中的用途，而Dziadek等(Angew.Cem.Int.Ed.2005，44,7624-7630)披露了制备包含TACAs和BSA和MUC1肽的化合物的类似方法。Kagan等(作为参考文献参见CancerImmunol.I咖unother.2005，54，424-430)描述了对几种Tn缀合物的试验Tn单糖，在三元苏氨酸骨架上制备的Tn(c)和在部分或完全糖基化MUCl骨架上制备的Tn。然而，上述报导的缀合的化合物的主要局限在于当作为疫苗使用时，它们导致产生的所需抗体量极少，此外，最终回收了其非特异性混合物(例如,参见Grigalevicius等，BioconjugateChemistry,2005，16,1149-1159)。我们目前发现了TF和Tn抗原的新的缀合的化合物，其可以用作抗肿瘤治疗中的疫苗。此外，本发明的缀合的化合物能够克服现有技术中TACAs缀合的化合物的上述缺陷。本发明的描述因此，本发明的第一个目的在于包含直接或通过任意合适的连接体缀合至多聚体支架的多个Tn或TF抗原的化合物，所述的多聚体支架选自阳离子化的牛血清白蛋白(cBSA)、藻酸盐或葡聚糖。在本说明书中，并且除非另作陈述，否则我们将术语多聚体支架指定为任意上述支架，如具有多聚体结构的cBSA、藻酸盐或葡聚糖。在本发明范围内的多聚体支架中，有牛血清白蛋白(BSA),即高度免疫原性的蛋白质，它可以通过在天冬氨酸或谷氨酸残基上引入烷氨基而进一步被修饰，由此获得阳离子化的牛血清白蛋白(cBSA)。根据8本发明，cBSA的分子量约包括约65-约77Kda。有关cBSA及其制备的一般参考文献例如参见Domen等，J,Immunol.1987，139，(10)，3195-8。藻酸盐是不同分子量的多糖链混合物(作为实例，参见TheMerckIndex,XIIIEd.，No.239)。一般而言，根据本发明，藻酸盐的分子量是约130，000-约170,000，且更优选约140，000-约160，000。最终，就有关葡聚糖的一般参考文献例如参见TheMerckIndex,XIIIEd.，No.2965。本发明优选的缀合的化合物包含cBSA和藻酸盐，且甚至更优选它们包含cBSA。如上所述，上述多聚体支架直接(通过共价鍵)或通过合适的连接体与多个Tn或TF抗原缀合。连接体的合适的实例包括直链或支链的、合成或天然的氨基酸及其衍生物，包括，例如合适的肽或糖类，本领域技术人员知识范围内的其它类似的连接体。更优选所述的氨基酸或肽包含2-约10个碳原子。然而，根据本发明的优选实施方案，所述缀合的化合物包含直接与选择的支架连接的上述抗原。只要涉及Tn和TF抗原，其结构式已经在上文中报导，那么它们就通过曱酰氨基键(carboxamidobond)，即任意的其氨基或羧基与剩余部分(例如支架)连接。除非另作陈述，否则我们将术语"多个Tn或TF抗原"指定为超过一个所述抗原直接或通过合适的连接体与多聚体支架连接。一般而言，在本发明的缀合的化合物中，与多聚体支持物连接的抗原数量可以根据构成多聚体支架自身并且具有合适的反应功能基团(例如氨基，羧基)的单体单元的数量，以及适合于合成所述缀合的化合物的操作实验条件而变化很大。特别地，就包含cBSA的本发明的缀合的化合物的情况，Tn或TF抗原的约5-约30个部分，例如Tn或TF抗原的约10-约20个部分可以与每一cBSA分子连接。同样，就包含藻酸盐的本发明的缀合的化合物的情况，Tn或TF抗原的约200-约250个部分，例如Tn或TF抗原的约220-约230个部分可以与每一藻酸盐分子连接。根据一个优选实施方案，本发明涉及包含与多个Tn抗原直接连接的cBSA的缀合的化合物。根据另一个优选实施方案，本发明涉及包含与多个Tn抗原直接连接的藻酸盐的缀合的化合物。根据本发明的另一个目的提供了制备上述报导的缀合的化合物的方法，该方法包括下列步骤1)将多聚体支架中的任意一种溶于合适的緩冲水溶液；2)向步骤(l)的溶液中加入缩合试剂和适量的选择的Tn或TF抗原，其各自在有缩合试剂存在下任选地连接至合适的连接体；和3)混合并且搅拌由步骤(2)得到的溶液以合适的时间段，并且回收获得的产物。上述方法及其任意的变化形式如每个步骤(1)中所述在合适的緩冲水溶液中进行，诸如2-吗啉-乙磺酸(MES);合适的浓度为，例如25mM，而合适的pH包括约4.5-约7，优选6.5。只要涉及步骤(2)，选择的抗原的量为能够使所述抗原和所述的支架按照预定摩尔比反应的量，从而获得本发明的目的缀合的化合物。上述反应在有任意合适的通常适合于形成甲酰氨基键的缩合试剂存在下进行。优选所述的缩合试剂为单独或与l-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)的组合的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。上述缩合试剂优选以轻微化学计算过量的量使用。本领域技术人员从上文中可以清楚地看到，连接体无论何时存在，在与支架进行偶联前均已经与选择的抗原键合(例如连接)，或备选地，它可以首先与支架键合(例如连接)，使得产生的中间体化合物随后与选择的抗原偶联。在这方面，这些可选择的变化形式均在本发明的范围内。此外，因为抗原和支架本身或通过任意合适的连接体偶联，其中通过形成曱酰氨基键，例如-CONH-或-NHCO-,所以本领域技术人员清楚任选存在于抗原、支架乃至连接体自身中任一上并且易于在上述操作条件下反应生成不需要的副产物的任意其它反应基团需要按照众所周知的方法适当保护/脱保护。根据本发明，步骤(3)中终产物的回收通过常规方法进行，包括，例如透析和冻干。在该方法和其任意变化形式中，反应剂以及任意的起始原料，包括各自任选与连接体偶联的选择的抗原和支架，并且所述连接体自身均为公知的化合物或可以按照本领域公知的常规方法制备它们。按照公知方法测定本发明化合物的取代程度，即与每一支架连接的Tn或TF抗原残基的数量。作为实例，通过4吏用来自支顶孢属(Jcre迈o//"iZ7s/7.)的酶oc-N-乙酰基半乳糖苷酶，按照该酶制造商[Seikagaku(Tokyo,Japan)]提示的实验条件，通过酶促反应测定包含cBSA的本发明化合物的取代程度。更具体地说，例如，就Tn抗原而言，通过在pH4.5和37°C下，将0.25ml含Tn抗原与0.05ml酶(具有约13U/ml的活性)的底物混合物在柠檬酸盐緩冲液中孵育2小时进行水解。然后通过添加pH9.8的0.2M硼酸盐緩沖液使反应猝灭。通过如材料和方法部分中进一步描述的毛细管电泳法对来自Tn抗原的所得糖残基，即N-乙酰半乳糖胺(GalNac)进行定量。由此通过对缀合的化合物的冻干样品进行的自动化元素分析测定包含藻酸盐或葡聚糖的本发明化合物的取代程度。然后将取代程度的测定结果(参见实验部分的实施例3和4)，即与每一支架连接的Tn或TF抗原残基的数量表示为部分百分比。因此，例如藻酸盐的15%取代程度表示100个重复单糖单元中有15个与Tn或TF抗原的一个分子连接。如上所述，本发明的缀合的化合物可以应用于治疗和预防，且更具体地说，它们可以用作抗肿瘤的疫苗。ii因此，本发明的另一个目的在于药物组合物，其包含缀合的化合物，其中多个Tn或TF抗原直接或通过任意合适的连接体与选自阳离子化的牛血清白蛋白(cBSA)、藻酸盐或葡聚糖的多聚体支架连接；和就一般制药实施而言药学上可接受的赋形剂，包括溶剂、栽体、緩冲剂、稳定剂等。一般而言，在本发明的药物组合物中可以适当包括任意合适的赋形剂，其制备可以按照本领域技术人员众所周知的一般方法进行。因此，本发明的另一个目的在于包含直接或通过合适的连接体与选自阳离子化的牛血清白蛋白(cBSA)、藻酸盐或葡聚糖的多聚体支架缀合的多个Tn或TF抗原的化合物，其用于治疗或预防。另外，本发明的另一个目的是治疗或预防肿瘤的方法，该方法包括对哺乳动物给予适量的本发明的缀合的化合物，其中多个TF或Tn抗原直接或通过任意合适的连接体与选自阳离子化的牛血清白蛋白(cBSA)、藻酸盐或葡聚糖的多聚体支架连接，或其任意的药物组合物。就想要目的而言，适量的本发明的缀合的化合物是一般用于包括给予抗原及其衍生物的治疗或预防目的的那些，并且可以按照选择的合适的治疗方案确定。另外，本发明的另一个目的在于包含直接或通过合适的连接体与选自阳离子化的牛血清白蛋白(cBSA)、藻酸盐或葡聚糖的多聚体支架缀合的多个Tn或TF抗原的化合物在制备用于治疗或预防肿瘤的药物或疫苗中的用途。根据另一个实施方案，本发明的缀合的化合物还可以用于制备抗Tn或TF抗原的特异性抗体。一般而言，可以通过在生产单克隆抗体中应用的众所周知的方法制备上述抗体(下文称作mAbs)。为了本发明的目的，使用动物进行的实验包括仅用于产生mAbs的正常小鼠。按照国家管理条例建立的动物管理标准将它们圏养在动物设施中，并且按照个别研究所的指南按照批准的认可方案饲养。他们也由兽医定期检查并且在认可的动物设施中由合格的动物管理员处理。就有关单克隆抗体制备的一般参考文献而言，例如，参见K6hler,G.，Milstein,C.;/Va&i*e1975,256,495-7。作为实例，请求保护的制备指定抗体的方法由此可以包括下列步骤1)BALB/c小鼠免疫接种；2)处死动物并且切除脾；3)通过体细胞杂交(融合)使产生抗体的细胞永生化；4)在HAT培养基中选择杂交细胞；5)通过ELISA测定进行筛选以便获得最具特异性的克隆；和6)亚克隆。步骤(1)的免疫接种通过注射本发明的缀合的化合物进行。优选该缀合的化合物为其中多个Tn抗原直接与cBSA连接的化合物。按照公知方法进行步骤2)，3)，4)和6)。具体而言，根据本发明，只要步骤涉及(5)，那么酶联免疫吸附测定(更好地称作ELISA)包括在固定相上使用选择的Tn或TF抗原，相当于用于免疫接种的Tn或TF抗原在与本发明的支架缀合时，被适当固定。更具体地说，所述多聚体支架为生物素化的多聚体支架，使得它可以通过链霉抗生物素蛋白/生物素键连接/固定在固相支持物上。ELISA为用于检测和定量物质，例如蛋白质、抗体和激素的测定法。ELISA的第一步需要将特异性抗原固定在ELISA平板上；然后将含本发明的待选择的抗体的样品加入到固相中，并且进行孵育使得固定化抗原与互补抗体之间可以形成复合物。然后进行洗涤以便除去未结合的物质。另一个步骤包括加入针对已形成的复合物并且与合适的酶连接的第二抗体[最常用的酶为辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP)]。最终，作为一个实例，随后添加合适的色原导致颜色强度变化，这由与固定化抗原结合的抗体的数量来决定，并且只要后者变化，那么就可以对存在于样品中的抗体量进行评估。就本发明ELISA技术的一般参考，参见下文的实验部分。我们特别观察到，为了ELISA,将所选择的抗原固定在固相上可以通过固定本发明生物素化的缀合的化合物来便利地进行。在这方面，已证实抗原-生物素化的藻酸盐缀合物的固定在检测来源于本发明任意缀合的化合物自身接种的抗体中特别具有选择性。换句话说，当免疫接种和抗体制备遵循对小鼠适当接种本发明的选择的缀合的化合物时，例如在Tn与cBSA之间缀合，ELISA试验可以通过将含由此产生的抗体的样品添加到含本发明的生物素化的缀合的化合物,优选与相同TACA，即Tn抗原的生物素化的藻酸盐缀合物的固相中来便利地进行。从上文中，本领域技术人员清楚当涉及TF抗原及其缀合的化合物时可以应用类似的考虑。因此，本发明的另一个目的在于包含直接或通过任意合适的连接体与生物素化的多聚体支架缀合的多个Tn或TF抗原的化合物，所述的生物素化的多聚体支架选自生物素化的藻酸盐、生物素化的阳离子化的牛血清白蛋白(生物素化的cBSA)或生物素化的葡聚糖。优选生物素化的多聚体支架为生物素化的藻酸盐。在这方面，如上所述定义cBSA、藻酸盐和葡聚糖。同样，与本发明的生物素化的支架连接的Tn或TF抗原数量如上所述。生物素(参见TheMerckIndex,XIIIEd.,No.1231)为已知在与蛋白质或多肽的羧化反应中起作用的天然的生长因子。当生物素选择性结合尤其是用于体外制备固体床的链霉抗生物素蛋白时，在分离和纯化技术中生物素可以与待固定在所述固相上的分子有用地连接。在生物素衍生物中，N-(+)-生物素基-L-赖氨酸酰肼可以有用地用于使多聚体支架生物素化。具体地，其为具有如下所示化学式的商购化合物14N-s-(+)-生物素基-L-赖氨酸酰肼生物素与多聚体，即cBSA、藻酸盐或葡聚糖的连接通过这些多聚体化合物的任意羧基随机进行。就本发明的缀合的化合物的制备而言，其中所述多聚体支架为生物素化的多聚体支架，所述方法包括下列步骤1)将所述多聚体支架中的任意一种溶于合适的緩沖水溶液；2)在有适当缩合试剂存在下向步骤(l)的溶液中加入适量的生物素或生物素化试剂；3)向由步骤(2)得到的溶液中加入适当的缩合试剂和适量的选择的Tn或TF抗原，其各自任选与合适的连接体连接；和4)混合并且搅拌来自步骤(3)的所得溶液以适当的时间段，并且回收获得的产物。就上述方法而言，适量的生物素和生物素化试剂属于本领域技术人员的知识范围以便得到所需的生物素化的多聚体。然而，就具体涉及的用于本发明方法的操作条件及其细节而言，参见下述实验部分。优选的缩合试剂为，例如单独使用或与EDC组合的NHS。因此，本发明的另一个目的在于包含与适当固定在固相上的生物素化的藻酸盐、生物素化的cBSA或生物素化的葡聚糖连接的Tn或TF抗原的缀合的化合物在用于检测通过固定化技术产生的抗体的ELISA试验中的用途，其中Tn或TF是那些分别与cBSA、藻酸盐或葡聚糖缀合的相同Tn或TF抗原。根据本发明的一个实施方案，特别优选包含与适当固定在固相上的生物素化的藻酸盐连接的Tn或TF抗原的缀合的化合物在通过ELISA试验对通过固定化技术产生的抗体的检测中的用途，并且该化合物包括那些与cBSA、藻酸盐或葡聚糖缀合的相同Tn或TF抗原。一般而言，除非另作陈述，将与生物素化的多聚体缀合的Tn或TF抗原适当固定在固相上包括用链霉抗生物素蛋白包被微量滴定ELISA平板孔，用生物素化的多聚体与Tn或TF之间的选择的缀合物填充孔并且孵育以适当的时间段。上述操作条件为本领域众所周知并且其细节报导在实验部分中。由此本发明产生和选择的抗体还可以用于治疗目的。另外，因为它们选择性靶向特异性肿瘤部位或组织，所以可以按照公知方法，使用诊断或治疗活性化合物使它们适当功能化。事实上，因为它们选择性攻击和结合在其表面上表达Tn和/或TF抗原的肿瘤细胞，所以它们还可以作为栽体起作用，从而将治疗活性部分带到肿瘤部位或组织，或者将诊断性部分带到那些部位或組织以能够显影。一般而言，使用治疗或诊断活性化合物的功能化可以包括使所述抗体与给定的抗肿瘤药或本领域中公知的可检测标记反应。从上文中，本领域技术人员清楚抗体和治疗或诊断活性部分可以直接或可备选地通过本领域中公知的任意合适的连接体或间隔体彼此连接。这些连接体可以包括，但不限于本领域中通常公知的取代或未被取代的烷基链、聚乙二醇衍生物、氨基酸间隔体、糖或脂肪族或芳族间隔体。本发明的诊断性部分的合适的实例包括，例如适合于磁共振成像(MRI)的顺磁金属螯合物、适合于X-射线成像的放射性标记、适合于超声检测的超声微球或脂质体或光学成像染料。在顺磁螯合物中，优选的金属元素是具有20-31、39、42、43、44、49和57-83的原子数的那些。更优选选自如下的顺磁金属离子Fe(2+)、Fe(3+)、Cu(2+)、Ni(2+)、Rh(2+)、Co(2+)、Cr(3+)、Gd(3+)、Eu(3+)、Dy(3+)、Tb(3+)、Pm(3+)、Nd(3+)、Tm(3+)、Ce(3+)、Y(3+)、Ho(3+)、Er(3+)、La(3+)、Yb(3+)、Mn(3+)、Mn(2+)，其中Gd(3+)为最优选的。有机螯合物是具有一个或多个极性基团的分子，所述的极性基团作为顺磁金属的配体起作用并且与之络合。合适的螯合物是本领域公知的并且包括含亚甲基膦酸基团、亚甲基羰基羟胺酸(methylenecarbohydroxamine)基团、羧基亚乙基基团或羧基亚甲基基团。螯合物的实例包括，但不限于二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、1，4，7，lO-四氮杂环十四烷-1，4，7,10-四乙酸(D0TA)、乙二胺四乙酸(EDTA)和1，4，8,11-四氮杂环十四烷-l，4，8，ll-四乙酸(TETA)。其他的螯合配体是亚乙基双-(2-羟基-苯基甘氨酸)(EHPG)及其衍生物，包括5-Cl-EHPG、5Br-EHPG、5-Me-EHPG、5t-Bu-EHPG和5sec-Bu-EHPG;苯并二乙烯三胺五乙酸(苯并-DTPA)及其衍生物，包括二苯并-DTPA、苯基-DTPA、二苯基-DTPA、千基-DTPA和二节基DTPA;双-2(羟基千基)-乙二胺二乙酸(HBED)及其衍生物，含至少3个碳原子，更优选至少6个碳原子和至少2个杂原子(0和/或N)的大环化合物类，这些大环化合物可以由一个环或两个或三个彼此在杂环元素上连接的环组成，例如苯并-DOTA、二苯并-DOTA和苯并-NOTA,其中NOTA为1，4，7-三氮杂环壬烷N,N、N"-三乙酸、苯并-TETA、苯并-DOTMA，其中DOTMA为1，4，7，10-四氮杂环十四烷-1，4，7，10-四(甲基四乙酸)和苯并-TETMA,其中TETMA为1，4，8，11-四氮杂环十四烷-1，4，8，11-(甲基四乙酸)；1，3-丙二胺四乙酸的(PDTA)和三乙烯四胺六乙酸(TTHA)衍生物；1，5，IO-N，N'，N"-三(2，3-二羟基苯甲酰基)-三儿茶酸(LICAM)和1，3，5-N，r，N"-三(2，3-二羟基苯甲酰基)氨甲基苯(MECAM)的衍生物，(4S)-4-(4-乙氧基千基)-3，6，9-三羧酸酯基曱基)-3，6，9-三氮杂十一烷二酸-二钠(EOB-DTPA)，N，N-双[2-[双(羧甲基)氨基]乙基]-L-谷氨酸(DTPA-GLU),N，N-双[2-[双(羧甲基)氨基]乙基]-L-赖氨酸(DTPA-LYS)，DTPA单-或双-酰胺衍生物，诸如N，N-双[2-[羧甲基[(甲基氨基曱酰基)曱基]-氨基]乙基]甘氨酸(DTPA-BMA),1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7-三乙酸(D03A)，10-(2-羟丙基)-1，4，7，IO-四氮杂环十二烷-1，4，7-三乙酸(HPD03A),4-羧基-5，8，11-三(羧甲基)-1-苯基-2-氧杂-5，8，ll-三氮杂十三烷-13-酸(B0PTA)，2-甲基-l，4，7，10-四氮杂环十二烷-l，4，7，10-四乙酸(MCTA)，(，，，"，，，，)-四甲基-l，4，7，10-四氮杂环十二烷-l，4，7，10-四乙酸(DOTMA)，3，6，9，15-四氮杂双环〖9.3.l]十五-l(15)，11，13-三烯-3，6，9-三乙酸(PCTA)和6-[双(羧甲基)氨基]-四氢-6-甲基-lH-l，4-二吖庚因-1，4(5H)-二乙酸(AAZTA)及其衍生物，通常参见国际专利申请W003/008390，将该文献引入本文作为参考。本发明包括的有代表性的螯合物和螯合基团的实例描述在W098/18496、W086/06605、W091/03200、W095/28179、W096/23526、W097/36619、PCT/US98/01473、PCT/US98/20182和U.S.4,899,755中，将所用这些文献引入本文作为参考。上述化合物，特别是指定用于诊断用途的那些，且甚至更具体地说是用于MRI的那些均可以按照本领域公知的常规方法制备。图1例证了单克隆抗体的生产技术。图2表示在生物素化的藻酸盐-Tn缀合的化合物(Alg-Tn)测试的，Tn-cBSA免疫接种后小鼠"#1"和小鼠"#2"血清的ELISA结果;藻酸盐(Alg)和Tn抗原(Tn)是使用的参照物。图3表示抗Tn杂交瘤选择的实例。在图中，报导了在生物素化的藻酸盐-Tn缀合的化合物上测试的克隆上清液的吸收度值。下列实施例更详细披露了本发明；尽管未明确包括，但是认为其它类似的用途在本申请的范围内。实验部分封并和才法N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N-乙酰半乳糖胺、2-氨苯曱酸(2-AA)、氰基硼氢化钠和生物素来自SigmaChemicalCo.(St.Louis.，M0)，Ns-(+)-生物素基-L-赖氨酸酰肼、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和2-吗啉乙磺酸(MES)—水化物来自Fluka(Buchs，Switzerland)，来自支顶孢属的ot-N-乙酰氨基半乳糖苷酶来自Seikagaku(Tokyo,Japan),PBS(磷酸盐緩冲盐水；CambrexBioScience,Verviers，Belgium)，Tween20(Sigma-Aldrieh，St.Louis;MO)，卵白蛋白(Sigma-Aldrich，St.Louis,M0)ABTS过氧化物酶底物(Sigma-Aldrich，St.Louis,M0)，缀合的抗小鼠IgG-过氧化物酶(AmershamBiosciences,Freiburg,Germany),链霉生物素蛋白(Sigma-Aldrich，St.Louis,M0)。毛勿f在豕高效毛细管电泳系统来自Hewlett-Packard(Agilent，Waldbrorm,Germany),ModelHP3DCE，其带有HPChemstation软件。通过将糖的水溶液与^f生溶液(0.25M2-AA,在99%甲醇和1%乙酸中的0.159M氰基硼氢化钠)混合，使用2-AA对GalNAc(标准品或因BSA-Tn水解产生)进行衍生。将该溶液在60。C下加热5小时。在毛细管电泳分析前，用水将样品稀释5次。分析条件报导在表A中。在每次试验前，使用氢氧化钠(2min，985mbar)和操作緩冲液(4min,985mbar)对毛细管进行洗涤。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表1-HPLC-UV实验条件议器安装了L-62Q0泵、AS-200A自动采样器和L-4500ADiode<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>表2-HPLC-MS实验条件议器安装了MS泵，自动采样器和PDA检测器的HPLCSURVEYORThe函Finnigan系统，与具有电喷射离子化(ESI)的LCQDECAXPPlusThermoFinnigan质讀_仪结合。Xcalibur软件用于成像系统和数据。实施例1cBSA-Tn缀合的化合物的制备将Tn抗原(1mg)和^M(2mg)溶于含MES緩冲液(O.2M)，pH6的溶液中；加入轻微化学计算过量的EDC和NHS，并且将该混合物搅拌2小时。然后透析该溶液并且冻千且由此回收标题化合物。通过按照类似方式操作并且通过使用本发明的任意合适的抗原和任意合适的多聚体支架，可以获得下列化合物-藻酸盐-Tn缀合的化合物；-葡聚糖-Tn缀合的化合物；-cBSA-TF缀合的化合物；-藻酸盐-TF缀合的化合物；-葡聚糖-TF缀合的化合物。实施例2生物素化的藻酸盐-Tn缀合的化合物的制备1)藻酸盐的生物素化分离自Z腫/"ar/sAy/7er6oreai7的藻酸盐由ProtanA/S(Norway)提供并且通过在异丙醇中沉淀而纯化。将30mg(0.15mmol-重复单元)的藻酸盐溶于10mLpH6的MES緩冲液(0.2M)。然后加入轻微化学计算过量的EDC和NHS;然后加入N-s-(+)-生物素基-L-赖氨酸酰肼(3.2mg)并且将该溶液搅拌6-8小时，然后透析并且冻干。通过按照类似方式操作并且通过使用本发明的任意合适的多聚体支架和任意合适的生物素化的部分可以获得生物素化的-cBSA和生物素化的-葡聚糖。2)使用Tn对生物素化的藻酸盐的衍生将14mg(0.071mmol)生物素化的藻酸盐溶于5.0mL的0.2MpH6.0的MES緩冲液中。溶解后，加入EDC(33.9mg)和NHS(4.7mg)并且在10min后，加入0,6mg(1.95X10-3mmol,0.027eq)P-GalNAc-oc-O-Ser。将该溶液搅拌8h，透析并且冻干且由此回收标题化合物。通过按照类似方式操作，在步骤(1)中以任意生物素化的支架为原料，也可以使用TF抗原衍生/缀合那些相同的生物素化的支架。实施例3实施例1的缀合的化合物的取代程度的测定所用实验条件为上述说明书中所述酶的供应商指示的那些。得到的上述实施例1的化合物的摩尔取代程度为3%。实施例4实施例2的缀合的化合物的取代程度的测定通过元素分析对包含藻酸盐或葡聚糖作为多聚体支架的本发明的缀合的化合物的取代程度进行测定。得到的上述实施例2的化合物的摩尔取代程度为15%。实施例5抗-Tn和抗-TF抗体的生产和选择按照本发明说明书中披露的优选方法生产抗-Tn和抗-TF抗体，并且在本文中报导如下1)通过3次腹膜内注射在Ribi，s(MPL+TDMAdijuvantSystem;Sigma)中适当乳化的200jagTn-cBSA，对2只8-周龄雌性BALB/c小鼠进行免疫接种；以观察免疫反应。随后另外静脉内注射在PBS中适当稀释的20jug选择的缀合的化合物；2)处死动物并且切除脾；3)通过体细胞杂交(融合)使产生抗体的细胞永生化；4)在HAT培养基中选择杂交细胞；5)进行ELISA试验以便获得最具特异性的克隆；和6)进行亚克隆。按照公知方法进行上述披露方法的步骤2)，3)，4)和6)(参见本发明上文说明书中的参考文献)。按照下列实施例6中披露的方法进行步骤5)。实施例6抗体的选择22按照本发明说明书中披露的方法进行的ELISA试验如下进行-在4'C下用碳酸盐緩冲液100mMpH9.6中的10jag/ml链霉抗生物素蛋白对微量滴定平板孔包被过夜；-在用PBS洗涤后，用100jig/oilofTn-生物素化的藻酸盐缀合物填充孔，并且在37。C下孵育lh;-在室温下使用PBS洗涤3次；-使用PBS卵白蛋白的1%溶液在37°C下封闭lh;-在室温下使用PBS洗涤3次；-将小鼠血清杂交瘤上清液加入到孔中，并且在37。C下孵育lh;-4吏用PBSTween的0.02%溶液洗涤3次；-加入抗-小鼠IgG-HRP缀合的二次抗体并且在室温下孵育lh;-在室温下^f吏用PBSTween的0.02%溶液洗涤3次；-力口入0.5mg/mlABTS过氧化物酶底物；-在405nm处，对ELISA平板上的结合抗原进行比色定量。权利要求1.一种包含直接或通过任意合适的连接体缀合至多聚体支架的多个Tn或TF抗原的化合物，所述的多聚体支架选自阳离子化的牛血清白蛋白(cBSA)、藻酸盐或葡聚糖。2.权利要求l的化合物，其中所述多聚体支架为cBSA。3.权利要求1的化合物，其中所述抗原直接与所述多聚体支架连接。4.权利要求1的化合物，其中所述抗原通过任意合适的连接体与所述多聚体支架缀合。5.权利要求4的化合物，其中所述连接体选自直链或支链的、合成或天然的氨基酸及其衍生物，合适的肽和糖类。6.权利要求5的化合物，其中所述氨基酸或糖类连接体包含2-10个碳原子。7.权利要求l的化合物，其中多个Tn抗原直接与cBSA连接。8.权利要求l-7中任意一项的化合物用作药物的用途。9.权利要求8的用途，用于制备抗肿瘤的疫苗。10.—种药物组合物，其包含有效量的权利要求1-7的化合物中任意一种与合适的溶剂和一种或多种药学上可接受的赋形剂。11.一种治疗肿瘤的方法，其包括对哺乳动物给予有效量的权利要求1-7的化合物或其任意的药物组合物。12.—种用于制备权利要求l-7中任意一项的化合物的方法，该方法包括下列步骤1)将所述多聚体支架中的任意一种溶于合适的緩冲水溶液中；2)向步骤(l)的溶液中加入缩合试剂和适量的Tn或TF抗原，其各自在有缩合试剂存在下任选地连接至合适的连接体；和3)混合并且搅拌由步骤(2)得到的溶液以适当的时间段，并且回收获得的产物。13.—种用于制备抗-Tn抗体或of抗-TF抗的方法，其包括下列步骤1)BALB/c小鼠免疫接种；2)处死动物并且切除脾；3)通过体细胞杂交(融合)使产生抗体的细胞永生化；4)在HAT培养基中选择杂交细胞；5)通过ELISA测定进行篩选以获得最具特异性的克隆；6)亚克隆；其中步骤(l)包括注射权利要求1-7中任意一项的化合物，其中所述抗原分别为Tn或TF。14.一种包含多个直接或通过任意合适的连接体缀合至生物素化的藻酸盐的Tn或TF抗原的化合物。15.权利要求14的化合物，其中生物素化的藻酸盐直接连接至Tn或TF抗原。16.—种用于制备权利要求14或15的缀合的化合物中任意一种的方法，其包括下列步骤1)将藻酸盐溶于緩冲溶液；2)向上述获得的溶液中加入适量的生物素或生物素化试剂；3)向由步骤(2)得到的溶液中加入适量的Tn或TF抗原，其各自任选地连接至合适的连接体，所述的连接体选自直链或支链的、合成或天然的氨基酸及其衍生物，合适的肽和糖类；和4)混合并且搅拌所得溶液以适当的时间段，并且回收获得的产物。17.权利要求14或15的缀合的化合物在选择抗-Tn或抗-TF抗原中的用途。18.—种用于选择抗-Tn或抗-TF抗体的ELISA试验，其包括下列步骤1)用链霉抗生物素蛋白包被微量滴定孔平板；2)在由步骤1)获得的固相上固定权利要求14或15中任意一项的缀合的化合物。19.权利要求13产生和/或权利要求18选择的抗体。20.权利要求19的抗体，进一步用治疗性或诊断性部分功能化。全文摘要本发明涉及用于刺激抗体产生的新化合物。所述的化合物包含糖肿瘤抗原和多聚体支架。本发明还包括在用于选择针对糖抗原的抗体的ELISA测定中使用的缀合的化合物。文档编号A61K39/385GK101472609SQ200780022959公开日2009年7月1日申请日期2007年6月19日优先权日2006年6月20日发明者A·科斯洛维,A·科罗巴蒂,C·坎帕,C·达努斯,F·尤格瑞,S·鲍利迪申请人:伯拉考成像股份公司