专利名称：：一种具有抗肿瘤活性的药物组合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种药物组合物，特别是涉及一种化合物5,6-二甲咕吨酮-4-乙酸(DMXAA)或其药学上可接受的盐或酯和选自糖肽类抗生素、放线菌素类、丝裂霉素类、糖苷类抗生素、秋水仙属生物碱、榄香烯类、芳香化酶抑制剂、LH-RH受体拮抗剂、动物类抗肿瘤药或生长抑素类似物的药物中的任意一种的协同组合，它们具有更强的抗肿瘤活性。
背景技术：
：肿瘤的生长依赖肿瘤内部血管网络的形成，在癌细胞和相关巨噬细胞释放的血管内皮细胞生长因子促进下，大量新生血管形成，癌细胞持续增生，氧气和葡萄糖大量消耗，酸性代谢产物堆积，刺激新生血管形成，新血管又促进癌细胞群体的迅速膨胀，循环往复，肿瘤不断扩大。因此，阻止血管的形成和功能将是肿瘤治疗的重要途径。血管生成抑制剂是一类能够破坏或抑制血管生成，有效地阻止肿瘤生长和转移的药物，是目前抗肿瘤靶向治疗研究的一个新靶点，它为肿瘤的治疗开辟了一条新的途径。以肿瘤血管作为靶向的成败关键在于找出肿瘤血管与正常组织内部血管之间的差异。现有资料表明，与正常组织血管相比，肿瘤血管内皮细胞增生迅速，新生血管多；对低氧环境和酸性代谢产物更加敏感。由于与癌细胞相互靠近，癌细胞又可能改变其血管内皮细胞的特性，从而制备以肿瘤血管为特异攻击目标的化学和生物制剂成为可能。DMXAA作为一种新型的肿瘤血管生成抑制剂，能够诱导肿瘤细胞及宿主细胞内部激活的巨噬细胞释放肿瘤坏死因子(TNF-cO、干扰素等免疫因子的产生。当TNF-a以及干扰素等免疫因子的含量达到一定水平后.既能够直接杀死癌细胞，抑制人表皮微血管内皮细胞和人毛细血管内皮细胞的增殖、迁移，还能够引起血管内皮细胞损伤，产生出血性和凝固性坏死，使肿瘤组织中心性坏死，从而达到肿瘤治疗的目的。5，6-二甲基咕吨酮-4-乙酸(DMXAA)由下式表示目前已完成DMXAA化合物的I期临床试验。临床试验表明它在人体可耐受剂量下不可逆地抑制肿瘤血流效果显著。作为第一批抗血管药物之一，其抗血管活性产生长时间的抑制肿瘤血流作用，导致广泛的出血性坏死区域。但是，有研究表明由充分灌注的外周中的存活细胞快速再生出肿瘤，显然DMXAA不太可能具有作为单一试剂或药物的临床用途。因此，寻求DMXAA与其它抗肿瘤药物的组合应用更为重要。
发明内容本发明就是为了解决上述技术问题，而提供一种具有抗肿瘤活性的药物组合物，目的是增强DMXAA抗肿瘤活性。为了达到上述目的本发明是这样实现的。本发明一方面提供了一种具有抗肿瘤活性的药物组合物的组合方法，所述方法包括给需要这种治疗的哺乳动物，包括人同时或顺序的施用有效量的DMXAA或其药学上可接受的盐或酯和有效量的选自糖肽类抗生素、放线菌素类、丝裂霉素类、糖苷类抗生素、秋水仙属生物碱、榄香烯类、芳香化酶抑制剂、LH-RH受体拮抗剂、动物类抗肿瘤药、生长抑素类似物的药物中的任意一种药物。另一方面，本发明提供了一种DMXAA或其药学上可接受的盐或酯用于制备与选自糖肽类抗生素、放线菌素类、丝裂霉素类、糖苷类抗生素、秋水仙属生物碱、榄香烯类、芳香化酶抑制剂、LH-RH受体拮抗剂、动物类抗肿瘤药、生长抑素类似物的药物同时或顺序给药以治疗癌症的药物的应用。另一方面，本发明提供了一种选自糖肽类抗生素、放线菌素类、丝裂霉素类、糖苷类抗生素、秋水仙属生物碱、榄香烯类、'芳香化酶抑制剂、LH-RH受体拮抗剂、动物类抗肿瘤药、生长抑素类似物的药物用于制备与DMXAA或其药学上可接受的盐或酯同时或顺序给药以治疗癌症的药物的应用。另一方面，本发明提供了DMXAA或其药学上可接受的盐或酯用于制备与选自糖肽类抗生素、放线菌素类、丝裂霉素类、糖苷类抗生素、秋水仙属生物碱、榄香烯类、芳香化酶抑制剂、LH-RH受体拮抗剂、动物类抗肿瘤药、生长抑素类似物的药物的组合。优选的糖肽类抗生素为平阳霉素。优选的放线菌素类为放线菌素D。优选的丝裂霉素类为丝裂霉素C。优选的糖苷抗生素为光辉霉素。优选的秋水仙属生物碱为秋水仙碱。优选的榄香烯类为榄香烯。优选的芳香化酶抑制剂为来曲唑。优选的LH-RH受体拮抗剂为亮丙瑞林。优选的动物类抗肿瘤药为去甲斑蝥素。优选的生长抑素类似物为生长抑素。因此，在本发明中，选自糖肽类抗生素、放线菌素类、丝裂霉素类、糖苷类抗生素、秋水仙属生物碱、榄香烯类、芳香化酶抑制剂、LH-RH受体拮抗剂、动物类抗肿瘤药、生长抑素类似物的药物可以是例如选自平阳霉素、放线菌素D、丝裂霉素C、光辉霉素、秋水仙碱、榄香烯、来曲唑、亮丙瑞林、去甲斑蝥素、生长抑素的药物。在本发明的实施方案中，选自糖肽类抗生素、放线菌素类、丝裂霉素类、糖苷类抗生素、秋水仙属生物碱、榄香烯类、芳香化酶抑制剂、LH-RH受体拮抗剂、动物类抗肿瘤药、生长抑素类似物的药物可以是例如选自平阳霉素、放线菌素D、丝裂霉素C、光辉霉素、秋水仙碱、来曲唑、亮丙瑞林、去甲斑蝥素、生长抑素的药物。本发明的优点和效果如下通过大量实验，我们发现，顺序或同时地组合DMXAA或其药学上可接受的盐或酯和选自糖肽类抗生素、放线菌素类、丝裂霉素类、糖苷类抗生素、秋水仙属生物碱、榄香烯类、芳香化酶抑制剂、LH-RH受体拮抗剂、动物类抗肿瘤药、生长抑素类似物的药物中的任意一种，优选选自平阳霉素、放线菌素D、丝裂霉素C、光辉霉素、秋水仙碱、榄香烯、来曲唑、亮丙瑞林、去甲斑蝥素或生长抑素的药物中的任意一种，实现了DMXAA抗肿瘤活性的增强。下面通过实施例及试验数据进一步对本发明进行详细说明。具体实施例方式DMXAA或其药学上可接受的盐或酯和选自糖肽类抗生素、放线菌素类、丝裂霉素类、糖苷类抗生素、秋水仙属生物碱、榄香烯类、芳香化酶抑制剂、LH-RH受体拮抗剂、动物类抗肿瘤药、生长抑素类似物的药物可以同时或顺序给药。优选DMXAA或其药学上可接受的盐或酯和选自糖肽类抗生素、放线菌素类、丝裂霉素类、糖苷类抗生素、秋水仙属生物碱、榄香烯类、芳香化酶抑制剂、LH-RH受体拮抗剂、动物类抗肿瘤药、生长抑素类似物的药物中的任意一种以增效比率存在。其中"增效比率"用于表示DMXAA或其药学上可接受的盐或酯和选自糖肽类抗生素、放线菌素类、丝裂霉素类、糖苷类抗生素、秋水仙属生物碱、榄香烯类、芳香化酶抑制剂、LH-RH受体拮抗剂、动物类抗肿瘤药、生长抑素类似物的药物进行组合时，组合的抗肿瘤活性大于单独的DMXAA或单独的选自糖肽类抗生素、放线菌素类、丝裂霉素类、糖苷类抗生素、秋水仙属生物碱、榄香烯类、芳香化酶抑制剂、LH-RH受体拮抗剂、动物类抗肿瘤药、生长抑素类似物的药物的抗肿瘤活性。因此，如果各组分以增效比率存在，则它们的组合发生协同作用。可以成功地抑制肿瘤的DMXAA和糖肽类抗生素如平阳霉素的增效比率范围为100:11:20的DMXAA:糖肽类抗生素，适宜的增效比率范围为25:11:10，优选的比例范围为10:11:5。可以成功地抑制肿瘤的DMXAA和放线菌素类如放线菌素D的增效比率范围为1000:11:1的DMXAA:放线菌素类，适宜的增效比率范围为1000:11:1，优选的比例范围为500:11:1。可以成功地抑制肿瘤的DMXAA和丝裂霉素类如丝裂霉素C的增效比率范围为200:11:1的DMXAA:丝裂霉素类，适宜的增效比率范围为100:11:1，优选的比例范围为50:15:1。可以成功地抑制肿瘤的DMXAA和糖苷类抗生素如光辉霉素的增效比率范围为100:11:5的DMXAA:糖苷类抗生素，适宜的增效比率范围为80:11:3，优选的比例范围为50:11:1。可以成功地抑制肿瘤的DMXAA和秋水仙属生物碱如秋水仙碱的增效比率范围为20:11:10的DMXAA:秋水仙属生物碱，适宜的增效比率范围为10:11:5，优选的比例范围为5:11:2。可以成功地抑制肿瘤的DMXAA和榄香烯类如榄香烯的增效比率范围为10:11:5的DMXAA:榄香烯类，适宜的增效比率范围为5:11:3，优选的比例范围为3:11:2。可以成功地抑制肿瘤的DMXAA和芳香化酶抑制剂如来曲唑的增效比率范围为20:11:10的DMXAA:芳香化酶抑制剂，适宜的增效比率范围为10:11:5，优选的比例范围为5:11:3。可以成功地抑制肿瘤的DMXAA和LH-RH受体拮抗剂如亮丙瑞林的增效比率范围为10:11:10的DMXAA:LH-RH受体拮抗剂，适宜的增效比率范围为5:11:3，优选的比例范围为2:11:2。可以成功地抑制肿瘤的DMXAA和生长抑素类似物如生长抑素的增效比率范围为200:11:1的DMXAA:生长抑素类似物，适宜的增效比率范围为100:11:1，优选的比例范围为50:15:1。可以成功地抑制肿瘤的DMXAA和动物类抗肿瘤药如去甲斑蝥素的增效比率范围为100:11:1的DMXAA:动物类抗肿瘤药，适宜的增效比率范围为50:11:1，优选的比例范围为20:12:1。在一个实施方案中，选自糖肽类抗生素、放线菌素类、丝裂霉素类、糖苷类抗生素、秋水仙属生物碱、榄香烯类、芳香化酶抑制剂、LH-RH受体拮抗剂、动物类抗肿瘤药、生长抑素类似物的药物是平阳霉素。在一个实施方案中，选自糖肽类抗生素、放线菌素类、丝裂霉素类、糖苷类抗生素、秋水仙属生物碱、榄香烯类、芳香化酶抑制剂、LH-RH受体拮抗剂、动物类抗肿瘤药、生长抑素类似物的药物是放线菌素D。在一个实施方案中，选自糖肽类抗生素、放线菌素类、丝裂霉素类、糖苷类抗生素、秋水仙属生物碱、榄香烯类、芳香化酶抑制剂、LH-RH受体拮抗剂、动物类抗肿瘤药、生长抑素类似物的药物是丝裂霉素C。在一个实施方案中，选自糖肽类抗生素、放线菌素类、丝裂霉素类、糖苷类抗生素、秋水仙属生物碱、榄香烯类、芳香化酶抑制剂、LH-RH受体拮抗剂、动物类抗肿瘤药、生长抑素类似物的药物是光辉霉素。在一个实施方案中，选自糖肽类抗生素、放线菌素类、丝裂霉素类、糖苷类抗生素、秋水仙属生物碱、榄香烯类、芳香化酶抑制剂、LH-RH受体拮抗剂、动物类抗肿瘤药、生长抑素类似物的药物是秋水仙碱。在一个实施方案中，选自糖肽类抗生素、放线菌素类、丝裂霉素类、糖苷类抗生素、秋水仙属生物碱、榄香烯类、芳香化酶抑制剂、LH-RH受体拮抗剂、动物类抗肿瘤药、生长抑素类似物的药物是榄香烯。在一个实施方案中，选自糖肽类抗生素、放线菌素类、丝裂霉素类、糖苷类抗生素、秋水仙属生物碱、榄香烯类、芳香化酶抑制剂、LH-RH受体拮抗剂、动物类抗肿瘤药、生长抑素类似物的药物是来曲唑。在一个实施方案中，选自糖肽类抗生素、放线菌素类、丝裂霉素类、糖苷类抗生素、秋水仙属生物碱、榄香烯类、芳香化酶抑制剂、LH-RH受体拮抗剂、动物类抗肿瘤药、生长抑素类似物的药物是亮丙瑞林。在一个实施方案中，选自糖肽类抗生素、放线菌素类、丝裂霉素类、糖苷类抗生素、秋水仙属生物碱、榄香烯类、芳香化酶抑制剂、LH-RH受体拮抗剂、动物类抗肿瘤药、生长抑素类似物的药物是生长抑素。在一个实施方案中，选自糖肽类抗生素、放线菌素类、丝裂霉素类、糖苷类抗生素、秋水仙属生物碱、榄香烯类、芳香化酶抑制剂、LH-RH受体拮抗剂、动物类抗肿瘤药、生长抑素类似物的药物是去甲斑蟊素。作为抗肿瘤药剂所需的DMXAA或其药学上可接受的盐或酯和选自糖肽类抗生素、放线菌素类、丝裂霉素类、糖苷类抗生素、秋水仙属生物碱、榄香烯类、芳香化酶抑制剂、LH-RH受体拮抗剂、动物类抗肿瘤药、生长抑素类似物的药物的组合数量，最终由临床医生根据病情实际情况决定其变化。DMXAA或其药学上可接受的盐或酯和选自糖肽类抗生素、放线菌素类、丝裂霉素类、糖苷类抗生素、秋水仙属生物碱、榄香烯类、芳香化酶抑制剂、LH-RH受体拮抗剂、动物类抗肿瘤药、生长抑素类似物的药物可以任何适宜的形式给药。DMXAA可以根据JournalofMedicinalChemistry34(1):217-22，1991年1月所述的方法进行制备。糖肽类抗生素、放线菌素类、丝裂霉素类、糖苷类抗生素、秋水仙属生物碱、榄香烯类、芳香化酶抑制剂、LH-RH受体拮抗剂、动物类抗肿瘤药、生长抑素类似物是已知的药物。本发明包含了上述的适宜和优选的所有组合。下面将通过以下实施例说明本发明，而不是用于对其进行限定。实施例lDMXAA与平阳霉素的协同组合材料细胞株人肺癌A549细胞和肝癌SMMC-7721细胞试验用药的配制:DMXAA临用前用5%的碳酸氢钠溶解，然后用RPM1640培养液配成需要浓度；平阳霉素(PYM)临用前生理盐水溶解，然后用RPMI1640培养液配成需要浓度。细胞培养人肺癌A549细胞和肝癌SMMC-7721细胞接种于无菌培养瓶中，加入适量RPMI1640培养液，于37X:、5%C02及饱和湿度的培养箱中培养。细胞呈单纯贴壁生长，每2-3天传代1次。传代时用3g/L胰蛋白酶消化1min，用培养液吹打制成细胞悬液，按需要的浓度接种。方法1、DMXAA与平阳霉素(PYM)联合用药协同抑制人肺癌A549细胞将DMXAA和平阳霉素(PYM)以单药和联合用药的形式分为DMXAA组(50[ig/mL)，平阳霉素(PYM)(100、10、lpg/mL),联合组(DMXAA:50pg/mL与PYM:100、10、ljig/mL)。取对数生长期的人肺癌A549细胞，以5xl()3个/孔接种于两块96孔培养板中，每孔体积100^iL，培养16小时后弃原液，按上面分组所示加入DMXAA和新鲜培养液50pL/孔，对照组加入50^L新鲜培养液，每组设4个复孔。继续培养4小时，然后加入平阳霉素50pL/孔，在37'C、5%C02条件下培养24h后弃去上清，用RPMI1640培养液lOOpL清洗细胞，除去RPMI1640培养液后，每孔加入20MLMTT(5g/L)，继续培养4h后，每孔加入150pLDMSO溶解，振荡10分钟，于酶标仪492'nm处检测，计算抑制率，并以浓度为横坐标、抑制率为纵坐标绘制抑制曲线，其联合用药的效应采用Webb氏分数乘积法进行计算。抑制率(。/。)-[A492(对照)一A492(给药组)]/[A492(对照)一A492(空白对照)]xl00X2、DMXAA与平阳霉素(PYM)联合用药协同抑制人肝癌SMMC-7721细胞将DMXAA和平阳霉素(PYM)以单药和联合用药的形式分为DMXAA组(50pg/mL)，平阳霉素(PYM)(IO、5、2.5pg/mL),联合组(DMXAA:5(Hig/mL与PYM:10、5、2.5pg/mL)。取对数生长期的肝癌SMMC-7721细胞，以5xl()3个/孔接种于两块96孔培养板中，每孔体积100nL，培养16小时后弃原液，按上面分组所示加入DMXAA和新鲜培养液50nL/孔，对照组加入50pL新鲜培养液，每组设4个复孔。继续培养4小时，然后加入细胞毒类抗癌药50pL/孔，37°C，5%<:02条件下培养24h后弃去上清，用RPMI1640培养液100清洗细胞，除去RPM1640培养液后，每孔加入20pLMTT(5g/L)，继续培养4h后，每孔加入150^L的DMSO溶解，振荡10分钟，于酶标仪492nm处检测，计算抑制率，并以浓度为横坐标、抑制率为纵坐标绘制抑制曲线，其联合用药的效应采用Webb氏分数乘积法进行计算。抑制率(％)=[A92(对照)一A92(给药组)]/[A92(对照)_A92(空白对照)]x100%3、Webb氏分数乘积法计算公式(fa)2=1_[1—(fa)l][l—(fa)2](fa)l、(fa)2分别表示两药的抑制率(fa)1，2表示计算的理论相加效应。如果联合用药的效应大于理论相加效应，则表示协同。结果1、DMXAA与平阳霉素(PYM)联合用药对人肺癌A549细胞的抑制作用表1为DMXAA，平阳霉素(PYM)单独给药和联合用药对人肺癌A549细胞的作用结果(OD值和抑制率)。从表中可以看出DMXAA单独给药对人肺癌A549细胞几乎没有抑制作用(抑制率^).54Q^)，平阳霉素与DMXAA联合用药后对人肺癌A549细胞的抑制率升高。用Webb氏分数乘积法进行计算合并用药的效应，联合用药的效应大于理论相加效应(即实际抑制率〉(fa)1，2)，DMXAA与平阳霉素(PYM)联合用药具有协同效应。表1.DMXAA,平阳霉素(PYM)单独给药与联合用药对人肺癌A549细胞生长的抑制作用G士》<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>2、DMXAA与平阳霉素(PYM)联合用药对人肝癌SMMC-7721细胞的抑制作用表2为DMXAA，平阳霉素(PYM)单独给药和联合用药对人肝癌SMMC-7721细胞的作用结果(OD值和抑制率)。从表中可以看出DMXAA单独给药对人肝癌SMMC-7721细胞抑制作用很小(抑制率^10^)，平阳霉素(PYM)与DMXAA联合用药后对人肝癌SMMC-7721细胞的抑制率显著升高，抑制率最高可增加36.82%。用Webb氏分数乘积法进行计算联合用药的效应，联合用药的效应大于理论相加效应(S卩实际抑制率〉(fa)1,2)，DMXAA与平阳霉素联合用药具有协同效应。表2.DMXAA,平阳霉素单独给药与联合用药对人肝癌SMMC-7721细胞生长的抑制作用(^士力<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>实施例2DMXAA与放线菌素D的协同组合材料细胞株人肺癌A549细胞和肝癌SMMC-7721细胞试验用药的配制:DMXAA临用前用5%的碳酸氢钠溶解，然后用RPM1640培养液配成需要浓度；放线菌素D临用前生理盐水溶解，然后用RPMI1640培养液配成需要浓度。细胞培养人肺癌A549细胞和肝癌SMMC-7721细胞接种于无菌培养瓶中，加入适量RPMI1640培养液，于37。C、5%C02及饱和湿度的培养箱中培养。细胞呈单纯贴壁生长，每2-3天传代1次。传代时用3g/L胰蛋白酶消化lmin,用培养液吹打制成细胞悬液，按需要的浓度接种。方法1、DMXAA与放线菌素D(AMD)联合用药协同抑制人肺癌A549细胞将DMXAA和放线菌素D(AMD)以单药和联合用药的形式分为DMXAA组(50pg/mL)，放线菌素D(10、1、0.1pg/mL)，联合组(DMXAA:50pg/mL与AMD:10、1、0.1^ig/mL)。取对数生长期的人肺癌A549细胞，以5xl(^个/孔接种于两块96孔培养板中，每孔体积100^iL，培养16小时后弃原液，按上面分组所示加入DMXAA和新鲜培养液50mL/孔，对照组加入50pL新鲜培养液，每组设4个复孔。继续培养4小时，然后加入放线菌素D(AMD)50nL/孔，于37°C、5XC02条件下培养24h后弃去上清，用RPMI1640培养液lOO^L清洗细胞，除去RPMI1640培养液后每孔加入20nLMTT(5g/L),继续培养4h后，每孔加入150pLDMSO溶解，振荡10分钟，于酶标仪492nm处检测，计算抑制率，并以浓度为横坐标、抑制率为纵坐标绘制抑制曲线，其联合用药的效应采用Webb氏分数乘积法进行计算。抑制率(％)=[夂92(对照)—A492(给药组)]/[A492(对照)一A492(空白对照)]x100x2、DMXAA与放线菌素D(AMD)联合用药协同抑制人肝癌SMMC-7721细胞将DMXAA和放线菌素D(AMD)以单独给药和联合用药的形式分为DMXAA组(50i^ig/mL)，放线菌素D(O.l、0,05、0.025pg/mL),联合组(DMXAA:50pg/mL与AMD:0.1、0.05、0.025ng/mL)。取对数生长期的肝癌SMMC-7721细胞，以5xl()S个/孔接种于两块96孔培养板中，每孔体积100nL，培养16小时后弃原液，按上面分组所示加入DMXAA和新鲜培养液50pL/孔，对照组加入50pL新鲜培养液，每组设4个复孔。继续培养4小时，然后加入放线菌素D(AMD)50pL/孔，于37°C、5%032条件下培养24h后弃去上清，用RPM1640培养液IOOmL清洗细胞，除去RPMI1640培养液后每孔加入20mLMTT(5g/L)，继续培养4h后，每孔加入150jaLDMSO溶解，振荡10分钟，于酶标仪492nm处检测，计算抑制率，并以浓度为横轴、抑制率为纵轴绘制抑制曲线，其联合用药的效应采用Webb氏分数乘积法进行计算。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>3、Webb氏分数乘积法计算公式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>其中(fa)l、(fa)2分别表示两药的抑制率(fa)1,2表示计算的理论相加效应。如果联合用药的效应大于理论相加效应，则表示协同。结果1、DMXAA与放线菌素D(AMD)联合用药对人肺癌A549细胞的抑制表3为DMXAA,放线菌素D(AMD)单独给药和联合用药对人肺癌A549细胞的作用结果(OD值和抑制率)。从表中可以看出DMXAA单独给药对人肺癌A549细胞几乎没有抑制作用(抑制率^).54%)，放线菌素D(AMD)与DMXAA联合用药后对人肺癌A549细胞的抑制率升高。用Webb氏分数乘积法进行计算联合用药的效应，联合用药的效应大于理论相加效应(即实际抑制率〉(fa)1，2)，DMXAA与放线菌素D(AMD)联合用药具有协同效应。表3.DMXAA,放线菌素D(AMD)单独给药与联合用药给药对人肺癌A549细胞生长的抑制作用(;士S)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>2、DMXAA与放线菌素D(AMD)联合用药对人肝癌SMMC-7721细胞的抑制表4为DMXAA，放线菌素D(AMD)单独给药和联合用药对人肝癌SMMC-7721细胞的作用结果(OD值和抑制率)。从表中可以看出DMXAA单独给药对人肝癌SMMC-7721细胞抑制作用很小(抑制率^0%)，放线菌素D(AMD)与DMXAA联合用药后对人肝癌SMMC-7721细胞的抑制率显著升高，抑制率最高可增加66.21%。用Webb氏分数乘积法进行计算联合用药的效应，联合用药的效应大于理论相加效应(即实际抑制率〉(fa)1,2)，DMXAA与放线菌素D(AMD)联合用药具有协同效应。表4.DMXAA,放线菌素D(AMD)单独给药与联合用药给药对人肝癌SMMC-7721细胞生长的抑制作用(;切)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>实施例3DMXAA与丝裂霉素(MMC)的协同组合材料细胞株人肺癌A549细胞和肝癌SMMC-7721细胞试验用药的配制:DMXAA临用前用5%的碳酸氢钠溶解，然后用RPM1640培养液配成需要浓度；丝裂霉素(MMC)临用前生理盐水溶解，然后用RPMI1640培养液配成需要浓度。细胞培养-人肺癌A549细胞和肝癌SMMC-7721细胞接种于无菌培养瓶中，加入适量RPMI1640培养液，于37'C，5%C02及饱和湿度的培养箱中培养。细胞呈单纯贴壁生长，每2-3天传代l次。传代时用3g/L胰蛋白酶消化lmin，用培养液吹打制成细胞悬液，按需要的浓度接种。方法1、DMXAA与丝裂霉素(MMC)联合用药协同抑制人肺癌A549细胞将DMXAA和丝裂霉素(MMC)以单独药和联合用药的形式分为DMXAA组(50ng/mL)，丝裂霉素(MMC)(2、1、0.5|xg/mL)，联合组(DMXAA:50pg/mL与MMC:2、1、0.5|xg/mL)。取对数生长期的人肺癌A549细胞，以5xl()3个/孔接种于两块96孔培养板中，每孔体积100ML,培养16小时后弃原液，按上面分组所示加入DMXAA和新鲜培养液50nL/孔，对照组加入50pL新鲜培养液，每组设4个复孔。继续培养4小时，然后加入丝裂霉素(MMC)50^iL/孔，在37°C、5XC02条件下培养24h后弃去上清，用RPMI1640培养液100nL清洗细胞，除去RPMI1640培养液后，每孔加入20MLMTT(5g/L)，继续培养4h后，每孔加入150pLDMSO溶解，振荡10分钟，于酶标仪492nm处检测，计算抑制率，并以浓度为横坐标、抑制率为纵坐标绘制抑制曲线，其联合用药的效应采用Webb氏分数乘积法进行计算。抑制率(％)=[^92(对照)一~92(给药组)]/[A492(对照)一A492(空白对照)]x100x2、DMXAA与丝裂霉素(MMC)协同抑制人肝癌SMMC-7721细胞将DMXAA和丝裂霉素(MMC)以单药和联合用药的形式分为DMXAA组(50^ig/mL)，丝裂霉素(MMC)(2、1、0.5|xg/mL)，联合组(DMXAA:50^ig/mL与MMC:2、1、0.5pg/mL)。取对数生长期的肝癌SMMC-7721细胞，以5xl()3个/孔接种于两块96孔培养板中，每孔体积100nL，培养16小时后弃原液，按上面分组所示加入DMXAA和新鲜培养液50mL/孔，对照组加入50pL新鲜培养液，每组设4个复孔。继续培养4小时，然后加入丝裂霉素(MMC)50pL/孔，在37°C、5XC02条件下培养24h后弃去上清，用RPMI1640培养液lOO^iL清洗细胞，除去RPMI1640培养液后，每孔加入20MLMTT(5g/L)，继续培养4h后，每孔加入150^LDMSO溶解，振荡10分钟，于酶标仪492nm处检测，计算抑制率，并以浓度为横坐标、抑制率为纵坐标绘制抑制曲线，其联合用药的效应采用Webb氏分数乘积法进行计算。抑制率(％)=[~92(对照)一~92(给药组)]/[A492(对照)一A492(空白对照)]X100%3、Webb氏分数乘积法计算公式(fa)l，2=l—[1—(fa)l][l—(fa)2]其中(fa)l、(fa)2分别表示两药的抑制率(fa)1，2表示计算的理论相加效应。如果联合用药的效应大于理论相加效应，则表示协同。结果1、DMXAA与丝裂霉素(MMC)联合用药对人肺癌A549细胞的抑制表5为DMXAA，丝裂霉素(MMC)单独给药和联合用药对人肺癌A549细胞的作用结果(OD值和抑制率)。从表中可以看出DMXAA单独给药对人肺癌A549细胞几乎没有抑制作用(抑制率^).54%)，丝裂霉素(MMC)与DMXAA联合用药后对人肺癌A549细胞的抑制率升高。用Webb氏分数乘积法进行计算联合用药的效应，联合用药的效应大于理论相加效应(即实际抑制率〉(fa)1，2)，DMXAA与丝裂霉素(MMC)联合用药具有协同效应。表5.DMXAA,丝裂霉素(MMC)单独给药与联合用药对人肺癌A549细胞生长的抑制作用(&力<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>2、DMXAA与丝裂霉素(MMC))联合用药对人肝癌SMMC-7721细胞的抑制作用表6为DMXAA，丝裂霉素(MMC)单独给药和联合用药对人肝癌SMMC-7721细胞的作用结果(OD值和抑制率)。从表中可以看出DMXAA单独给药对人肝癌SMMC-7721细胞抑制作用很小(抑制率^10^)，丝裂霉素(MMC)与DMXAA联合用药后对人肝癌SMMC-7721细胞的抑制率显著升高，抑制率最高可增加60.38%。用Webb氏分数乘积法进行计算联合用药的效应，联合用药的效应大于理论相加效应(即实际抑制率〉(fa)1，2)，DMXAA与丝裂霉素(MMC)联合用药具有协同效应。表6.DMXAA,丝裂霉素(MMC)单独给药与联合用药对人肝癌SMMC-7721细胞生长的抑制作用G士》实施例4DMXAA与榄香烯(EE)的协同组合材料细胞株人肺癌A549细胞和肝癌SMMC-7721细胞试验用药的配制:DMXAA临用前用5%的碳酸氢钠溶解，然后用RPM1640培养液配成需要浓度；榄香烯(EE)临用前生理盐水溶解，然后用RPMI1640培养液配成需要浓度。细胞培养人肺癌A549细胞和肝癌SMMC-7721细胞接种于无菌培养瓶中，加入适量RPMI1640培养液，于37"C、5%C02及饱和湿度的培养箱中培养。细胞呈单纯贴壁生长，每2-3天传代l次。传代时用3g/L胰蛋白酶消化lmin，用培养液吹打制成细胞悬液，按需要的浓度接种。方法1、DMXAA与榄香烯(EE)联合用药协同抑制人肺癌A549细胞抑制率(％)DMXAA(50pg/mL)MMC(2.5|ig/mL)DMXAA(50ng/mL)+MMC(2.5ng/mL)MMC(5pg/mL)DMXAA(50pg/mL)+MMC(5|ig/mL)MMC(10ng/mL)DMXAA(50ng/mL)+MMC(10pg/mL)细胞对照空白对照将DMXAA和榄香烯(EE)以单独给药和联合用药的形式分为DMXAA组(50pg/mL)，榄香烯(EE)(80、40、20|_ig/mL)，联合组(DMXAA:50pg/mL与EE:80、40、20pg/mL)。取对数生长期的人肺癌A549细胞，以5xl(^个/孔接种于两块96孔培养板中，每孔体积100ml,培养16小时后弃原液，按上面分组所示加入DMXAA和新鲜培养液50(iL/孔，对照组加入50^iL新鲜培养液，每组设4个复孔。继续培养4小时，然后加入榄香烯(ee)50ml/孔，在37'c、5%<302条件下培养24h后弃去上清，用RPMI1640培养液IO(VL清洗细胞，除去RPMI1640培养液后，每孔加入2(VLMTT(5g/L)，继续培养4h后，每孔加入150^LDMSO溶解，振荡IO分钟，于酶标仪492nm处检测，计算抑制率，并以浓度为横坐标、抑制率为纵坐标绘制抑制曲线，其联合用药的效应采用Webb氏分数乘积法进行计算。抑制率(％)=[~92(对照)一A啦(给药组)]/[A492(对照)一A492(空白对照)]X100X2、DMXAA与榄香烯(EE)联合用药协同抑制人肝癌SMMC-7721细胞将DMXAA和榄香烯(EE)以单药和联合用药的形式分为DMXAA组(50pg/mL)，榄香烯(EE)(20、10、5pg/mL)，联合组(DMXAA:50pg/mL与EE:20、10、5pg/mL)。取对数生长期的肝癌SMMC-7721细胞，以5xl(^个/孔接种于两块96孔培养板中，每孔体积100nL，培养16小时后弃原液，按上面分组所示加入DMXAA和新鲜培养液5(HiL/孔，对照组加入50ML新鲜培养液，每组设4个复孔。继续培养4小时，然后加入榄香烯(EE)50mL/孔，在37-c、5%c02条件下培养24h后弃去上清，用RPMI1640培养液100pL清洗细胞，除去RPMI1640培养液后，每孔加入20^LMTT(5g/L),继续培养4h后，每孔加入150^LDMSO溶解，振荡IO分钟，于酶标仪492nm处检测，计算抑制率，并以浓度为横坐标、抑制率为纵坐标绘制抑制曲线，其联合用药的效应采用Webb氏分数乘积法进行计算。抑制率(％)=[夂92(对照)—A492(给药组)]/[A492(对照)一A492(空白对照)]X100X3、Webb氏分数乘积法计算公式(<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>其中(fa)l、(fa)2分别表示两药的抑制率(fa)1,2表示计算的理论相加效应。如果联合用药的效应大于理论相加效应，则表示协同。结果1、DMXAA与榄香烯(EE)联合用药对人肺癌A549细胞的抑制表为DMXAA，榄香烯(EE)单独给药和联合用药对人肺癌A549细胞的作用结果(OD值和抑制率)。从表中可以看出DMXAA单独给药对人肺癌A549细胞几乎没有抑制作用(抑制率^).54%)，榄香烯(EE)与DMXAA联合用药后对人肺癌A549细胞的抑制率升高。用Webb氏分数乘积法进行计算联合用药的效应，联合用药的效应大于理论相加效应(即实际抑制率〉(fa)1，2，DMXAA与榄香烯(EE)联合用药具有协同效应。<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>DMXAA(50ng/mL)+NCTD(80ng/mL)0.377±0.02243.74细胞对照0.600±0.05—空白对照_0.098±0.005_一2、DMXAA与榄香烯(EE))联合用药对人肝癌SMMC-7721细胞的抑制表8为DMXAA，榄香烯(EE)单独给药和联合用药对人肝癌SMMC-7721细胞的作用结果(OD值和抑制率)。从表中可以看出DMXAA单独给药对人肝癌SMMC-7721细胞抑制作用很小(抑制率^10%)，榄香烯(EE)与DMXAA联合用药后对人肝癌SMMC-7721细胞的抑制率显著升高，抑制率最高可增加40%。用Webb氏分数乘积法进行计算联合用药的效应，联合用药的效应大于理论相加效应(即实际抑制率>(fa)1，2)，DMXAA与榄香烯(EE)联合用药具有协同效应。表8.DMXAA,榄香烯(EE)单独给药与联合用药对人肝癌SMMC-7721细胞生长的抑制作用(;^)。<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>实施例5DMXAA与去甲斑蝥素的协同组合材料.*细胞株人肺癌A549细胞和肝癌SMMC-7721细胞试验用药的配制:DMXAA临用前用5%的碳酸氢钠溶解，然后用RPM1640培养液配成需要浓度；去甲斑蝥素临用前生理盐水溶解，然后用RPMI1640培养液配成需要浓度。细胞培养人肺癌A549细胞和肝癌SMMC-7721细胞接种于无菌培养瓶中，加入适量RPMI1640培养液，于37-C、5Q%C02及饱和湿度的培养箱中培养。细胞呈单纯贴壁生长，每2-3天传代1次。传代时用3g/L胰蛋白酶消化lmin，用培养液吹打制成细胞悬液，按需要的浓度接种。方法1、DMXAA与去甲斑蟊素(NCTD)联合用药协同抑制人肺癌A549细胞将DMXAA和去甲斑蟊素(NCTD)以单药和联合用药的形式分为DMXAA组(50^ig/mL)，去甲斑蟊素(NCTD)(IO、5、2.5pg/mL)，联合组(DMXAA:50|ig/mL与NCTD:10、5、2.5ng/mL)。取对数生长期的人肺癌A549细胞，以5xl()3个/孔接种于两块96孔培养板中，每孔体积100pL,培养16小时后弃原液，按上面分组所示加入DMXAA和新鲜培养液50^iL/孔，对照组加入50^iL新鲜培养液，每组设4个复孔。继续培养4小时，然后加入去甲斑蟊素(NCTD)50nL/孔，在37°C、5XC02条件下培养24h后弃去上清，用RPMI1640培养液lOOpL清洗细胞，除去RPMI1640培养液后每孔加入20^LMTT(5g/L)，继续培养4h后，每孔加入150ixLDMSO溶解，振荡10分钟，于酶标仪492nm处检测，计算抑制率，并以浓度为横坐标，抑制率为纵坐标绘制抑制曲线，其联合用药的效应采用Webb氏分数乘积法进行计算。抑制率(％)=[八492(对照)一A492(给药组)]/[A492(对照)一A492(空白对照)]X100X2、DMXAA与去甲斑蟊素(NCTD)联合用药协同抑制人肝癌SMMC-7721细胞将DMXAA和去甲斑蟊素(NCTD)以单药和联合用药的形式分为DMXAA组(50pg/mL)，去甲斑蟊素(NCTD)(O.l、0.05、0.025|xg/mL)，联合组(DMXAA:50pg/mL与NCTD:20、10、5pg/mL)。取对数生长期的肝癌SMMC-7721细胞，以5><103个/孔接种于两块96孔培养板中，每孔体积IOOmL，培养16小时后弃原液，按上面分组所示加入dmxaa和新鲜培养液50ml/孔，对照组加入50mL新鲜培养液，每组设4个复孔。继续培养4小时，然后加入细胞毒类抗癌药50mL/孑L，37°C，5XC02条件下培养24h后弃去上清，用100pL1640清洗细胞，除去1640后每孔加入20nLMTT(5g/L)，继续培养4h后，每孔加入150DMSO溶解，振荡10分钟，于酶标仪492nm处检测，计算抑制率，并以浓度为横轴，抑制率为纵轴绘制抑制曲线，其联合用药的效应采用Webb氏分数乘积法进行计抑制率(％)=[92(对照)一A492(给药组)]/[A492(对照)一A492(空白对照)]X100%3、Webb氏分数乘积法计算公式(fa)l，2=l—[1—(fa)l][l—(fa)2]其中(fa)l、(fa)2分别表示两药的抑制率(fa)1,2表示计算的理论相加效应。如果联合用药的效应大于理论相加效应，则表示协同。结果DMXAA与去甲斑蟊素(NCTD)联合用药对人肺癌A549细胞的抑制表9为DMXAA，去甲斑蟊素(NCTD)单独给药和联合用药对人肺癌A549细胞的作用结果(OD值和抑制率)。从表中可以看出DMXAA单独给药对人肺癌A549细胞几乎没有抑制作用(抑制率^).54%)，、去甲斑蟊素(NCTD)与DMXAA联合用药后对人肺癌A549细胞的抑制率升高。用Webb氏分数乘积法进行计算联合用药的效应，联合用药的效应大于理论相加效应(即实际抑制率〉(fa)l,2)，DMXAA与去甲斑蟊素(NCTD)联合用药具有协同效应。表9.DMXAA，去甲斑蟊素(NCTD)单独给药与联合用药对人肺癌A549细胞生长的抑制作用(;:t0组别OD值抑制率(％)DMXAA(50pg/mL)0.598±0.1030.54NCTD(2.5pg/mL)0.575±0.0854.65DMXAA(50ng/mL)+NCTD(2.5ng/mL)0.562±0,0747.15NCTD(5ng/mL)0.509±0.03617,23DMXAA(50ng/mL)+NCTD(5jig/mL)0.471±0.04419.96NCTD(10ng/mL)0.313±0.08754.37DMXAA(50|ig/mL)+NCTD(lOpg/mL)0.27U0.08362.94细胞对照0.600±0.105空白对照0.098±0.005—2、DMXAA与去甲斑蟊素(NCTD))联合用药对人肝癌SMMC-7721细胞的抑制表10为DMXAA，去甲斑蟊素(NCTD)单独给药和联合用药对人肝癌SMMC-7721细胞的作用结果(OD值和抑制率)。从表中可以看出DMXAA单独给药对人肝癌SMMC-7721细胞抑制作用很小(抑制率^10%)，去甲斑蟊素(NCTD)与DMXAA联合用药后对人肝癌SMMC-7721细胞的抑制率显著升高，抑制率最高可增加37.12%。用Webb氏分数乘积法进行计算联合用药的效应，联合用药的效应大于理论相加效应(即实际抑制率〉(fa)1，2，DMXAA与去甲斑蟊素(NCTD)联合用药具有协同效应。表10.DMXAA,去甲斑蟊素(NCTD)单独给药与联合用药对人肝癌SMMC-7721细胞生长的抑制作用(;士》组别OD值抑制率(0/0)DMXAA(50ng/mL)0.398±0.1356.94NCTD(5ng/mL)0.392±0.15610.43DMXAA(50ng/mL)+NCTD(5ng/mL)NCTD(10ng/mL)DMXAA(50ng/mL)+NCTD(10ng/mL)NCTD(20ng/mL)DMXAA(50ng/mL)+NCTD(2。ng/mL)细胞对照空白对照0.323±0.09330.400.361±0.15421.630.318±0.11734,070.352±0.14624.460.318±0.15437.120.419±0.146—0.111±0.009—权利要求1、一种具有抗肿瘤活性的药物组合物的制备方法，其特征在于它是由DMXAA或其药学上可接受的盐或酯和选自糖肽类抗生素、放线菌素类、丝裂霉素类、糖苷类抗生素、秋水仙属生物碱、榄香烯类、芳香化酶抑制剂、LH-RH受体拮抗剂、动物类抗肿瘤药或生长抑素类似物中的任意一种制备而成。2、根据权利要求1所述的具有抗肿瘤活性的药物组合物的制备方法，其特征在于其中DMXAA或其药学上可接受的盐或酯和选自糖肽类抗生素、放线菌素类、丝裂霉素类、糖苷类抗生素、秋水仙属生物碱、榄香烯类、芳香化酶抑制剂、LH-RH受体拮抗剂、动物类抗肿瘤药或生长抑素类似物中的任意一种是以增效比率构成。3、根据权利要求1所述的具有抗肿瘤活性的药物组合物的制备方法，其特征在于所述的DMXAA或其药学上可接受的盐或酯和选自糖肽类抗生素、放线菌素类、丝裂霉素类、糖苷类抗生素、秋水仙属生物碱、榄香烯类、芳香化ii抑制剂、LH-RH受体拮抗剂、动物类抗肿瘤药或生长抑素类似物中的任意一种的药物是同时给药或顺序给药。4、根据权利要求13中的任一项所述的具有抗肿瘤活性的药物组合物的制备方法，其特征在于选自糖肽类抗生素、放线菌素类、丝裂霉素类、糖苷类抗生素、秋水仙属生物碱、榄香烯类、芳香化酶抑制剂、LH-RH受体拮抗剂、动物类抗肿瘤药或生长抑素类似物的药物是选自平阳霉素、放线菌素D、丝裂霉素C、光辉霉素、秋水仙碱、榄香烯、来曲唑、亮丙瑞林、生长抑素或去甲斑蝥素。5、一种DMXAA及其药学上可接受的盐或酯和选自糖肽类抗生素、放线菌素类、丝裂霉素类、糖苷类抗生素、秋水仙属生物碱、榄香烯类、芳香化酶抑制剂、LH-RH受体拮抗剂、动物类抗肿瘤药或生长抑素类似物的药物中的任意一种以治疗癌症的药物的应用。6、选自糖肽类抗生素、放线菌素类、丝裂霉素类、糖苷类抗生素、秋水仙属生物碱、榄香烯类、芳香化酶抑制剂、LH-RH受体拮抗剂、动物类抗肿瘤药或生长抑素类似物的药物中的任意一种用于制备与DMXAA或其药学上可接受的盐或酯以治疗癌症的药物的应用。7、根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于DMXAA或其药学上可接受的盐或酯和选自糖肽类抗生素、放线菌素类、丝裂霉素类、糖苷类抗生素、秋水仙属生物碱、榄香烯类、芳香化酶抑制剂、LH-RH受体拮抗剂、动物类抗肿瘤药或生长抑素类似物的药物中的任意一种是以增效比率构成。8、根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于DMXAA或其药学上可接受的盐或酯和选自糖肽类抗生素、放线菌素类、丝裂霉素类、糖苷类抗生素、秋水仙属生物碱、榄香烯类、芳香化酶抑制剂、LH-RH受体拮抗剂、动物类抗肿瘤药或生长抑素类似物的药物中的任意一种是同时给药或顺序给药。9、根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于选自糖肽类抗生素、放线菌素类、丝裂霉素类、糖苷类抗生素、秋水仙属生物碱、榄香烯类、芳香化酶抑制剂、LH-RH受体拮抗剂、动物类抗肿瘤药或生长抑素类似物的药物中的任意一种是选自平阳霉素、放线菌素D、丝裂霉素C、光辉霉素、秋水仙碱、榄香烯、来曲唑、亮丙瑞林或去甲斑蝥素的药物中的任意一种。10、根据权利要求9所述的应用，其中选自糖肽类抗生素、放线菌素类、丝裂霉素类、糖苷类抗生素、秋水仙属生物碱、榄香烯类、芳香化酶抑制剂、LH-RH受体拮抗剂、动物类抗肿瘤药或生长抑素类似物的药物中的任意一种是选自平阳霉素、放线菌素D、丝裂霉素C、光辉霉素、秋水仙碱、榄香烯、来曲唑、亮丙瑞林、去甲斑蝥素或生长抑素的药物中的任意一种。11、一种具有抗肿瘤活性的药物组合物，其特征在于它是由DMXAA或其药学上可接受的盐或酯和选自糖肽类抗生素、放线菌素类、丝裂霉素类、糖苷类抗生素、秋水仙属生物碱、榄香烯类、芳香化酶抑制剂、LH-RH受体拮抗剂、动物类抗肿瘤药、生长抑素类似物的药物中的任意一种组成。12、根据权利要求11所述的具有抗肿瘤活性的药物组合物，其特征在于DMXAA或其药学上可接受的盐或酯和选自糖肽类抗生素、放线菌素类、丝裂霉素类、糖苷类抗生素、秋水仙属生物碱、榄香烯类、芳香化酶抑制剂、LH-RH受体拮抗剂、动物类抗肿瘤药或生长抑素类似物的药物中的任意一种是以增效比率组成。13、根据权利要求11或12所述的具有抗肿瘤活性的药物组合物，其特征在于选自糖肽类抗生素、放线菌素类、丝裂霉素类、糖苷类抗生素、秋水仙属生物碱、榄香烯类、芳香化酶抑制剂、LH-RH受体拮抗剂、动物类抗肿瘤药或生长抑素类似物的药物中的任意一种是选自平阳霉素、放线菌素D、丝裂霉素C、光辉霉素、秋水仙碱、榄香烯、来曲唑、亮丙瑞林或去甲斑蝥素或生长抑素的药物中的任意一种。全文摘要本发明涉及一种药物组合物，特别是涉及一种具有抗肿瘤活性的药物组合物。具有抗肿瘤活性的药物组合物，它是由化合物5，6-二甲基呫吨酮-4-乙酸(DMXAA)或其药学上可接受的盐或酯和选自糖肽类抗生素、放线菌素类、丝裂霉素类、糖苷类抗生素、秋水仙属生物碱、榄香烯类、芳香化酶抑制剂、LH-RH受体拮抗剂、动物类抗肿瘤药或生长抑素类似物的药物中的任意一种组成。这样的协同组合，使组合后的药物具有更好的抗肿瘤活性。更具体地说，本发明提供了这种组合在肿瘤治疗中的应用。文档编号A61K45/00GK101336915SQ20081001275公开日2009年1月7日申请日期2008年8月12日优先权日2008年8月12日发明者孟凡英,莉李,光王,郑剑峰申请人:沈阳斯佳科技发展有限公司