专利名称：一种肟类化合物及其制备方法与用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及肟类化合物及其制备方法与免疫抑制药物。
背景技术：
免疫抑制剂是用于医疗过程的一种重要的临床药物，其用于包括移植排斥反应和自身免疫性疾病的治疗如系统性红斑狼疮，类风湿关节炎和牛皮癣。T淋巴细胞在移植排斥反应中发挥了不可或缺的作用，使环孢素A(CsA)，他克莫司(FK506的)和西罗莫司(雷帕霉素)作为免疫抑制剂治疗脱颖而出。虽然免疫抑制药物已成功地用于器官移植和自身免疫性疾病的临床治疗，但其副作用包括肝毒性、肾毒性、恶性肿瘤、感染、心血管毒性等却不容忽视。因此，寻找新的调节免疫反应，和高效，低毒的潜在的新种的免疫抑制化合物能够治疗药物临床的要从未停止过。 据研究报道，黄酮和异黄酮类的化合物对免疫反应中的T细胞增殖有明显的抑制作用。脱氧安息香类化合物是黄酮类化合物的前体，其在很多活性方面例如抗癌、抗菌等与黄酮有类似的显著的活性。因此，作为脱氧安息香类的衍生物，其在免疫抑制方面的研究同样具有较大的潜力。
发明内容
本发明的目的在于提供一类新型肟类化合物以及它们的制备方法与用途。 本发明的技术方案如下 —类肟类化合物，其特征是它有如下通式
式中R1－为
<formula>formula see original document page 3</formula> R厂为
<formula>formula see original document page 4</formula> —种制备上述的肟类化合物的方法，它由下列步骤组成 步骤l.于三氟化硼乙醚溶液中，加入相应的苯酚类的化合物和相应的苯乙酸类
的化合物，苯酚类的化合物和苯乙酸类的化合物的物质的量之比为i : i左右，搅拌加热至
80-84°C ，反应2h后冷却，在搅拌下倒入乙酸钠的水溶液中，然后静止，24h后过滤出固体，将得到的固体溶于无水乙醇重结晶提纯， 步骤2.将步骤1得到的提纯后的固体溶于无水乙醇，加入乙酸钠，再加入等物质的量的盐酸羟胺，搅拌加热至6(TC，约3h后用薄层层析法检测反应，直至反应完全，冷却后过滤，滤液减压蒸干，得到肟类的化合物。 上述的制法，所述的步骤1中，三氟化硼乙醚溶液是质量百分浓度为47. 0-47. 7%三氟化硼乙醚溶液，其用量为每毫摩尔苯酚类的化合物加1. 0-1. 5ml。 上述的制法，所述的步骤2中所述的步骤2中，无水乙醇的用量为每毫摩尔盐酸羟胺加1.0-1. 5ml 。 本发明的肟类化合物对活化的T细胞明显的抑制作用，而对未活化的T细胞的抑制作用较弱，因此本发明的肟类化合物可在制备免疫抑制药物中应用。
(E)-2-(4-溴苯基)-l-(3，4二羟基苯基)乙酮后(化合物l)的制备
OH 于100ml单口圆底烧瓶中加入邻苯二酚(lOmmol)和对溴苯乙酸(lOmmol)，再加入10ml的三氟化硼乙醚(47. 0-47. 7%，以BF3计，下同)。搅拌反应，加热至80-84t:回流反应约2h后冷却，加入乙酸钠(8g)的水(200ml)溶液中，边加边搅拌，然后静止，24h后过滤，得到棕黄色的固体。将得到的产物放入100ml的烧杯，加无水乙醇至完全溶解，然后重结晶后过滤，得到黄色的晶体状物质2-(4-溴苯基)-l-(3，4-二羟基)苯基乙酮。再将其移
具体实施方式
实施例一
48. 22 ，2. 2Hz， 2H) ，7. 10 (d， J = 2. 2Hz， 1H) ， 7. 15 (d， J = 8. 4Hz， 1H) ， 7. 44 (d， J = 8. 4Hz， 1H) ，8. 96 (s， 1H) ，9. 09(s， 1H) ， 11. lO(s， 1H). ESI-MS :321. 00 ([M+H]+) Anal. Calcd for C14H12BrN03 : C，52. 20 ;H，3. 75 ;Br，24. 80 ;N，4. 35 ;0， 14. 90 % ;found :C，52. 11 ;H，3. 70 ;Br，24. 89 ;N， 4. 38 ;0， 14. 98% 实施例二 (E)-2-(4-溴苯基)-l-(2，3，4-羟基苯基)乙酮月亏(化合物2)的制备
OH 制备方法同实施例一。以连苯三酚代替邻苯二酚，得到棕色颗粒状目标化合物。 产率63 %。 Mp 143-1145 °C 丄HNMR (300MHz ， DMS0_d6) ，4. 14(s，2H) ，6. 24 (s， 1H) ，6. 39 (d， J = 9Hz， 1H) ，6. 90 (d， J = 8Hz，2H) ，7. 08 (d， J = 9Hz，2H) ，7. 88 (d， J = 9Hz， 1H) ，8. 71 (s， 1H) ，9. 45 (s， 1H) ， 10. 11 (s， 1H) ， 12. 45 (s， 1H). ESI-MS :336. 99 ([M+H]+) Anal. Calcd for C14H12BrN04 :C， 49. 73 ;H， 3. 58 ;Br， 23. 63 ;N， 4. 14 ;0， 18. 93 % ;found :C， 49. 71 ;H， 3. 56 ; Br，23. 65 ;N，4. 15 ;0， 18. 97% 实施例三(E)-2-(4-甲氧基苯基)-l-(2，4，6-羟基苯基)乙酮肟(化合物3)的
制备
制备方法同实施例一。以均苯三酚代替邻苯二酚，以对甲氧基苯乙酸代替对溴苯 乙酸，得到棕色粉末状目标化合物。产率60%。 Mp 143-144。C.111 NMR(300MHz，DMS0-d6)， 3. 93 (s， 2H) ， 6. 37 (d， J = 9Hz， 1H) ， 6. 92 (d， J = 8Hz， 2H) ， 7. 15 (d， J = 8Hz， 2H) ， 7. 34 (d， J = 9Hz， 1H) ，9. 15(s， 1H) ， 10. 34(s， 1H) ， 12. 11 (s，2H) ， 12. 98(s， 1H). ESI-MS :289. 10([M+H]+). Anal. Calcd for C15H15N05 :C， 62. 28 ;H， 5. 23 ;N， 4. 84 ;0， 27. 65 % ;found :C， 62. 24 ;H， 5. 22 ;N，4. 85 ;0，27. 67% . 实施例四:(E)-l-(2，4 二羟基苯基)-2_(4-氟苯基)乙酮月亏(化合物4)的制备
<formula>formula see original document page 6</formula>、OH 制备方法同实施例一。以对氟苯乙酸代替对溴苯乙酸，得到棕色粉末状目标化
合物。产率58X。Mp 110-112。C H NMR(300MHz， DMS0-d6) ，4. 02(s，2H) ，6. 25(d， J =
7. 32，2H) ，7. lO(t， J = 9Hz，2H) ，7. 28(t， J = 8. 8，3H) ，8. 90 (s， 1H) ，9. 08 (s， 1H) ， 11. 20 (s，
1H). ESI-MS :261. 08([M+H]+). Anal. Calcd for C14H12FN03 :C，64. 36 ;H，4. 63 ;F，7. 27 ;N，
5. 36 ;0， 18. 37% ;found :C，64. 34 ;H，4. 60 ;F，7. 29 ;N，5. 39 ;0， 18. 38% 实施例五(E)-2-(3-氯苯基)-l-(2，3，4-三羟基苯基)乙酮月亏(化合物5)的制
备 制备方法同实施例一。以间氯苯乙酸代替对溴苯乙酸，连苯三酚代替邻苯二酚，得 到白色粉末状目标化合物。产率64%。 Mp 115-117。C H NMR(300MHz，DMS0-d6) ，4. 17(s， 2H) ， 6. 29 (d， J = 8. 8， 1H) ， 6. 83 (d， J = 8. 8， 1H) ， 7. 23 (t， J = 8. 4， 2H) ， 7. 31 (t， J = 7. 7， 2H) ，8. 21 (s， 1H) ，9. 25(s， 1H) ， 11. 54(s， 1H) ， 11. 63(s， 1H). ESI-MS :293. 05 ([M+H]+) Anal. Calcd for C14H12C1N04 :C， 57. 25 ;H， 4. 12 ;C1， 12. 07 ;N， 4. 77 ;0， 21. 79 % ;found :C， 57. 22 ;H，4. 11 ;C1， 12. 09 ;N， 4. 74 ;0，21. 81% 实施例六(E)-2-(3-氯苯基)-l-(2，4-二羟基苯基)乙酮月亏(化合物6)的制备
制备方法同实施例一。以间苯二酚代替邻苯二酚，以间氯苯乙酸代替对溴苯乙 酸，得到白色粉末状目标化合物。产率62%。 Mp 121-122°C 1H NMR(300MHz， DMS0-d6)， 4. 18(s，2H)6. 25(d， J = 1. 29， 1H) ，6. 26(s， 1H) ，6. 41 (d， J = 1. 26， 1H) ，7. 23(dd， J = 4. 59， J = 9. 15， 1H) ，7. 30(d， J = 1. 65， 1H) ， 7. 94(d， J = 5. 31， 1H) ，8. 16(s， 1H) ， 11. 54(s， 1H)，11. 63(s，1H)，12. 37(s，1H) MS(ESI) :277. 05([M+H]+) Anal, calc. for C14H12C1N03 :C，60. 55 ;H，4. 36 ;Cl， 12. 77 ;N，5. 04 ;0， 17. 28 % ;found :C，60. 50 ;H，4. 34 ;Cl， 12. 79 ;N， 5. 07 ;0， 17. 25% . 实施例七(E)-2-(3-氯苯基)-l-(3，4-二羟基苯基)乙酮月亏(化合物7)的制备
<formula>formula see original document page 7</formula> 制备方法同实施例一 物。产率64%。 Mpl20-122。C 1H) ，6. 94(dd， J = 2. 19， J =
。以间氯苯乙酸代替对溴苯乙酸，得到白色粉末状目标化合
.工H NMR (300MHz, DMS0_d6) ，4. 10(s，2H) ，6. 68 (d， J = 8. 22， 8. 22， IH) ，7. 12 (d， J = 2. 01， IH) ，7. 22 (d， J = 5. 31， 2H)， 7.37(d， J = 6. 39，2H) ，8. 97(s， IH) ，9. 09(s， IH) ， 11. 13 (s， 1H). MS (ESI) :277. 05 ([M+H]+) Anal. calc. for C14H12C1N03 :C，60. 55 ;H，4. 36 ;Cl， 12. 77 ;N， 5. 04 ;0， 17. 28 % ;found :C， 60. 57 ;H，4. 37 ;Cl， 12. 75 ;N，5. 03 ;0， 17. 27% 实施例八(E)-2-(3-甲氧基苯基)-l-(2，3，4-三羟基苯基)乙酮肟(化合物8)
的制备
<formula>formula see original document page 7</formula> 制备方法同实施例一。以连苯三酚代替邻苯二酚，以间甲氧基苯乙酸代替对 溴苯乙酸，得到黄色粉末状目标化合物。产率52%。 Mp 120-121°C . "HNMR(300MHz, DMS0-d6) ，3. 70(s，3H) ，4. 07(s，2H) ，6. 27(d， J = 8. 6， IH) ，6. 75 (d， J = 7. 1， IH) ，6. 82 (d， J = 4. 95， IH) ，7. 18(t， J = 7. 68，3H) ，8. 19(s， IH) ，9. 15(s， IH) ， 11. 44(s， IH) ， 11. 73(s， IH). MS(ESI) :275. 12 ([M+H]+) Anal. calc. for C15H17N04 :C，65. 44 ;H，6. 22 ;N，5. 09 ;0， 23. 25% ;found :C，65. 47 ;H，6. 20 ;N，5. 07 ;0，23. 26% 实施例九(幻-1-(2，4-二羟基苯基)-2-(3-甲氧基苯基)乙酮月亏(化合物9)的
制备
<formula>formula see original document page 7</formula>
制备方法同实施例一。以间苯二酚代替邻苯二酚，间甲氧基苯乙酸代替对溴苯乙 酸，得到黄色粉末状目标化合物。产率49%。 Mp 153-156。C H NMR (500MHz ， DMS0-d6)， 3. 70(s，3H) ，4. 13(s，2H) ，6. 24(s， 1H) ， 6. 25(d， J = 2. 7， IH) ，6. 75(dd， J = 2. 45， J = 8. 25， IH) ， 6. 81 (s， IH) ， 6. 83 (d， J = 5. 8， 2H) ， 7. 18 (t， J = 7. 65， 1H) ， 7. 27 (d， J = 9. 15， IH) ，9. 18 (s， IH) ， 11. 66(s， 1H) ， 11. 76(s， 1H). MS(ESI) :273. 10 ([M+H]+). Anal, calc. for C15H15N04 :C， 65. 92 ;H， 5. 53 ;N， 5. 13 ;0， 23. 42 ;found :C， 65. 94 ;H， 5. 54 ;N， 5. 18 ;0， 23. 41. 实施例十(E)-l-(3，4-二羟基苯基)-2-(3-甲氧基苯基)乙酮月亏(化合物IO)的 制备
<formula>formula see original document page 8</formula>
制备方法同实施例一。以间甲氧基苯乙酸代替对溴苯乙酸，得到黄色粉末状目标 化合物。产率49%。 Mp 153-156。C H NMR(500MHz， DMS0-d6) ， 3. 70 (s， 3H) ， 4. 13 (s， 2H)， 6. 24 (s， 1H) ， 6. 25 (d， J = 2. 7， 1H) ， 6. 75 (dd， J = 2. 45， J = 8. 25， 1H) ， 6. 81 (s， 1H) ， 6. 83 (d， J = 5. 8，2H) ，7. 18(t， J = 7. 65， 1H) ， 7. 27(d， J = 9. 15， 1H) ，9. 18(s， 1H) ， 11. 66(s， 1H)， 11. 76(s， 1H). MS(ESI) :273. 10 ([M+H]+). Anal. calc. forC15H15N04 :C，65. 92 ;H，5. 53 ;N， 5. 13 ;0，23. 42% ;found :C，65. 94 ;H，5. 54 ;N， 5. 18 ;0，23. 41% 实施例十一 (E)-2-(3-溴苯基)-l-(2，3，4-三羟基苯基)乙酮月亏(化合物ll)的 制备<formula>formula see original document page 8</formula>
制备方法同实施例一。以连苯三酚代替邻苯二酚，以间溴苯乙酸代替对溴苯乙 酸，得到白色粉末状目标化合物。产率62%。 Mp 126-127。C H NMR(300MHz， DMS0-d6)， 4. 09 (s， 2H) ， 6. 29 (d， J = 8. 58， 1H) ， 6. 82 (d， J = 8. 76， 1H) ， 7. 23 (t， J = 8. 4， 2H) ， 7. 31 (d， J = 7. 7， 1H) ，7. 47(d， J = 6. 03， 1H) ，8. 20(s， 1H) ，9. 23(s， 1H) ， 11. 50(s， 1H) ， 11. 61(s， 1H) MS(ESI) :336. 99([M+H]+). Anal. calc. for C14H12BrN04 :C，49. 73 ;H，3. 58 ;Br，23. 63 ;N， 4. 14 ;0， 18. 93% ;found :C，49. 75 ;H，3. 60 ;Br，23. 61 ;N，4. 11 ;0， 18. 95% [OO52] 实施例十二 (E)-2-(3-溴苯基)-l-(3，4-二羟基苯基)乙酮月亏(化合物12)的 制备
制备方法同实施例一。以间溴苯乙酸代替对溴苯乙酸，得到白色粉末状目标化合 物。产率64%。 Mpl20-122。C .'H NMR(300MHz， DMS0-d6) ， 4. 10 (s， 2H) ， 6. 68 (d， J = 8. 22， 1H) ，6. 94(dd， J = 2. 19， J = 8. 22， 1H) ， 7. 12(d， J = 2. 01， 1H) ，7. 22(d， J = 5. 31，2H)， 7.37(d， J = 6. 39，2H) ，8. 97(s， 1H) ，9. 09(s， 1H) ， 11. 13 (s， 1H). MS (ESI) :321. 00 ([M+H]+) Anal, calc. for C14H12BrN03 :C， 52. 20 ;H， 3. 75 ;Br， 24. 80 ;N， 4. 35 ;0， 14. 90 % ;found :C， 52. 25 ;H，3. 77 ;Br，24. 77 ;N，4. 32 ;0， 14. 88% 实施例十三(E)-2-(3-溴苯基)-l-(2，4-二羟基苯基)乙酮月亏(化合物13)的 制备 制备方法同实施例一。以间苯二酚代替邻苯二酚，间溴苯乙酸代替对溴苯乙酸，得 到白色粉末状目标化合物。产率53%。 Mp 118-119°C . ^ NMR(300MHz，DMS0-d6) ，c4. 17(s， 2H) ， 6. 25 (s， 1H) ， 7. 25 (d， J = 5. 49， 2H) ， 7. 30 (d， J = 8. 97， 2H) ， 7. 38 (d， J = 8. 65， 1H)， 7. 50 (d， J = 5. 31， 1H) ， 9. 71 (s， 1H) ， 11. 61 (s， 1H) ， 11. 50 (s， 1H) MS (ESI) :321. 00 ([M+H]+) Anal, calc. for C14H12BrN03 :C， 52. 20 ;H， 3. 75 ;Br， 24. 80 ;N， 4. 35 ;0， 14. 90 % ;found :C， 52. 23 ;H，3. 77 ;Br，24. 82 ;N，4. 30 ;0， 14. 88% 实施例十四(E)-2-(4-氯苯基)-l-(2，3，4-三羟基苯基)乙酮月亏(化合物14)的 制备 制备方法同实施例一。以连苯三酚代替邻苯二酚，对氯苯乙酸代替对溴苯乙 酸，得到白色粉末状目标化合物。产率53%。 Mp 145-147。C.1！1 NMR(300MHz， DMS0-d6)， 4. 14(s，2H) ，6. 24(s， 1H) ，6. 39(d， J = 9Hz， 1H) ，6. 90(d， J = 8Hz，2H) ，7. 08(d， J = 9Hz， 2H)，7.88(d， J = 9Hz，1H)，8.71(s，1H)，9.45(s，1H)，10. 11 (s， 1H) ， 12. 45 (s， 1H) MS (ESI):293. 05([M+H]+). Anal. calc. for C14H12C1N04 :C，57. 25 ;H，4. 12 ;Cl， 12. 07 ;N，4. 77 ;0， 21. 79% ;found :C，57. 26 ;H，4. 13 ;Cl， 12. 08 ;N，4. 73 ;0，21. 80% 实施例十五(E)-2-(4-氯苯基)-l-(3，4-二羟基苯基)乙酮肟(化合物15)的
制备
<formula>formula see original document page 10</formula> 制备方法同实施例一。以对氯苯乙酸代替对溴苯乙酸，得到白色粉末状目标化合 物。产率:62%。Mp 144-145°C 'H NMR(300MHz，DMS0-d6) ， 3. 99(s，2H) ，6. 67(d， J = 8. 2Hz， IH) ，6. 92(dd， J = 8. 22，2. 2Hz，2H) ，7. 10(d， J = 2. 2Hz， 1H) ， 7. 15 (d， J = 8. 4Hz，lH)， 7. 44(d， J = 8. 4Hz， IH) ，8. 96(s， IH) ，9. 09(s， 1H) ， 11. 10(s， IH). ESI-MS :277. 05([M+H]+). Anal. Calcd for C14H12C1N03 :C，60. 55 ;H，4. 36 ;Cl， 12. 77 ;N，5. 04 ;0， 17. 28% ;found :C， 60. 53 ;H，4. 34 ;Cl， 12. 78 ;N，5. 05 ;0， 17. 30% 实施例十六(E)-l-(3，4-二羟基苯基)-2-(3-氟苯基)乙酮肟(化合物16)的
制备
<formula>formula see original document page 10</formula> 制备方法同实施例一。以间氟苯乙酸代替对溴苯乙酸，得到白色粉末状目标化合 物。产率64X。Mpl20-122。C.力NMR(300MHz，DMS0-d6) ，4. 10(s，2H) ，6. 68(d， J = 8. 22， 1H)， 6. 94(dd，J = 2. 19， J = 8. 22，1H)，7. 12(d，J = 2.01，1H)，7. 22(d，J = 5.31，2H)，7. 37 (d， J = 6. 39，2H) ，8. 97(s， IH) ，9. 09(s， IH) ， 11. 13(s， IH). MS(ESI) :261. 08 ([M+H]+) Anal. calc. for C14H12FN03 :C， 64. 36 ;H， 4. 63 ;F， 7. 27 ;N， 5. 36 ;0， 18. 37 % ;found :C， 64. 35 ;H， 4. 64 ;F，7. 23 ;N， 5. 35 ;0， 18. 39% 实施例十七(E)-l-(2，4二羟基苯基)-2-(3-氟苯基)乙酮月亏(化合物17)的制 备
制备方法同实施例一。以间苯二酚代替邻苯二酚，间氟苯乙酸代替对溴苯乙酸，得到白色粉末状目标化合物。产率53%。 Mp 118-119°C ^ NMR(300MHz，DMS0-d6) ，c4. 17(s，2H) ， 6. 25 (s， IH) ， 7. 25 (d， J = 5. 49， 2H) ， 7. 30 (d， J = 8. 97， 2H) ， 7. 38 (d， J = 8. 65， 1H)，7. 50 (d， J = 5. 31， IH) ， 9. 71 (s， IH) ， 11. 61 (s， IH) ， 11. 50 (s， IH) MS (ESI) :261. 08 ([M+H]+) Anal. calc. for C14H12FN03 :C， 64. 36 ;H， 4. 63 ;F， 7. 27 ;N， 5. 36 ;0， 18. 37 % ;found :C，64. 35 ;H， 4. 64 ;F， 7. 29 ;N， 5. 38 ;0， 18. 34% 实施例十八(E)-2-(3-氟苯基)-l-(2，3，4-三羟基苯基)乙酮后(化合物18)的
制备
oh
n、h V 制备方法同实施例一。以连苯三酚代替邻苯二酚，以间氟苯乙酸代替对溴苯乙酸，得到白色粉末状目标化合物。产率62%。 Mp 126-127。C H NMR(300MHz， DMS0-d6)，
4. 09 (s， 2H) ， 6. 29 (d， J = 8. 58， 1H) ， 6. 82 (d， J = 8. 76， 1H) ， 7. 23 (t， J = 8. 4， 2H) ， 7. 31 (d，J = 7. 7， 1H) ，7. 47(d， J = 6. 03， 1H) ， 8. 20 (s， 1H) ， 9. 23 (s， 1H) ， 11. 50 (s， 1H) ， 11. 61 (s，1H) MS (ESI) :277. 08 ([M+H] +) Anal. calc. for C14H12FN04 :C， 60. 65 ;H， 4. 36 ;F， 6. 85 ;N，
5. 05 ;0，23. 08% ;found :C，60. 67 ;H，4. 37 ;F，6. 84 ;N，5. 06 ;0，23. 09% 实施例十九(E)-2-(4-硝基苯基)-l-(2，3，4-三羟基苯基)乙酮月亏(化合物19)
的制备
<formula>formula see original document page 11</formula> 制备方法同实施例一。以连苯三酚代替邻苯二酚，对硝基苯乙酸代替对溴苯乙酸，得到白色粉末状目标化合物。产率53%。 Mp 145-147。C.1！1 NMR(300MHz， DMS0-d6)，4. 14(s，2H) ，6. 24(s， 1H) ，6. 39(d， J = 9Hz， 1H) ，6. 90 (d， J = 8Hz，2H) ，7. 08 (d， J = 9Hz，2H)，7.88(d， J = 9Hz，1H)，8.71(s，1H)，9.45(s，1H)，10. 11 (s， 1H) ， 12. 45 (s， 1H) MS (ESI):304. 07([M+H]+). Anal. calc. for C14H12N206 :C，55. 27 ;H，3. 98 ;N，9. 21 ;0，31. 55 % ; found :C，55. 26 ;H，3. 99 ;N，9. 20 ;0，31. 53% 实施例二十(E)-2-(4-硝基苯基)-l-(2，3，4-三羟基苯基)乙酮月亏(化合物20)
的制备
制备方法同实施例一。以对硝基苯乙酸代替对溴苯乙酸，得到白色粉末状目标 化合物。产率62X。Mp 144-145 。C H NMR(300MHz， DMS0-d6) ， 3. 99 (s， 2H) ， 6. 67 (d， J = 8. 2Hz， 1H) ，6. 92(dd， J = 8. 22， 2. 2Hz， 2H) ， 7. 10 (d， J = 2. 2Hz， 1H) ， 7. 15 (d， J = 8. 4Hz， 1H) ，7. 44(d， J = 8. 4Hz， 1H) ， 8. 96(s， 1H) ， 9. 09(s， 1H) ， 11. 10(s， 1H). ESI-MS : 288. 07([M+H]+). Anal. Calcd for C14H12N205 :C， 58. 33 ;H， 4. 20 ;N， 9. 72 ;0， 27. 75 %; found :C，58. 32 ;H，4. 22 ;N，9. 73 ;0，27. 77%
实施例二十一 肟类化合物免疫抑制活性的研究 采用MTT[3-(4，5)_双甲基_2_噻唑_(2，5)_苯基溴化四氮唑蓝]法 来测定肟类化合物对活化的T细胞和未活化的T细胞最低抑制浓度(minimal inhibitoryconcentration，MIC)。采用流式细胞仪和免疫印迹的方法对免疫活性最好的化 合物进行作用机制检测。 (1)动物准备购自江苏省实验动物中心的6至8周龄雌性BALB/c小鼠。在 21士2t:下，小鼠保持自由食用的的食物和水，并保持12小时光/暗周期。实验动物福利和 实验程序是严格按照照顾和实验动物指南(科学与中国，200年技术部)和南京大学相关的 伦理法规指南进行的。尽全力减少动物的痛苦和减少使用动物的数量。
(2)细胞和试剂准备分离自BALB/c小鼠的淋巴结细胞在37°C ， 5. 0 %的二氧化 碳增湿的空气中，在辅以10%胎牛血清(胎牛血清)的1640培养基中培养。抗CD3，抗 CD28鼠抗体，购自BD Pharmingen。膜联蛋白V-FITC/PI试剂盒购自晶美生物科技。反裂 caspase-3抗体和抗PARP抗体购自圣克鲁斯生物技术公司。抗13 _核糖抗体购自细胞信号 技术公司。所有其他化学品获得西格玛化工有限公司。 (3)细胞增殖实验淋巴结细胞以5X10s个/板的密度培养在96孔中，用不同浓 度的化合物的与抗CD3/抗CD28共同剌激，持续72h。在培养结束前4h，每孔加入20 y 1 MTT，增殖阶段开始。结束后，除去上清液后，加入20iU匿SO溶解甲臜结晶。用酶联免疫 吸附试验仪测试540nm下的吸光度。 (4)细胞毒性试验将细胞以5X 105个/孔的密度加入96孔板中，然后加入梯度 浓度的化合物培养72h。在结束培养前4h每孔加入20 iU的MTT。然后再加入200 y 1的 匿SO溶解甲臜晶体。最后测540nm的吸光度值。 (5)细胞凋亡检测用anti-CD3/anti-CD28在不同浓度的化合物下剌激淋巴结细
12胞，持续48小时。再用蛋白V-荧光(异硫氰酸荧光素)和碘化丙啶(PI)进行染色。最后 用流式细胞仪对样品进行分析。 (6)免疫印迹分析培养结束后，用磷酸缓冲液和裂解液(30mmol/L的Tris，pH值 7. 5， 150mmol/L的氯化钠，lmmol/L的苯甲磺酰氟，lmmol/L的原钒酸钠，1% NonidetP-40， 10%甘油和磷酸酶和蛋白酶抑制剂)洗涤裂解细胞。10，000Xg离心10分钟，用BCATM蛋白 检测试剂盒(Pierce， Rockford， IL)确定上清液的蛋白质的含量。再用10% SDS-PAGE裂 解分离这种蛋白质，随后放在聚偏氟乙烯膜上进行电转化。膜用5%脱脂牛奶在室温下密 封2h。密封的膜用以标记的一抗在4t:进行过夜探针标记，然后用辣根过氧化物酶结合二 抗孵育。再用LumiGLO化学发光底物系统对结果进行检测。
(7)统计分析 所有实验都重复进行了 3-5次，均得到类似的结果。该两个实验组P值是用双尾 学生t-检验进行测试的。显著性水平定在P值为0.05。如果适用，数据报告为平均值士 标准差(SD)。
抑制率的计算细胞生长的抑制率按照下列公式计算 生长抑制率=(l-存活率)X100%= [l-(0D实验-0D空白)/(0D对照-0D空白)]X100% (OD实验表示测试药物组的平均光密度，OD对gg表示对照组的平均光密度，OD空自表示对照组的 平均光密度)。 半数抑制浓度(IC5。)定义为当50%的肿瘤细胞存活时的药物浓度。根据测定的 光密度(0D值)，制作细胞生长抑制率的标准曲线，在标准曲线上求得其对应的药物浓度。
本发明的肟类化合物的对活化的T细胞的抑制IC5。值见表l，对未活化的T细胞 的抑制IC5。值见表2。 表1本发明所列肟类化合物的对活化的T细胞的抑制IC5。值(y M)
IC50(|_iM) IC50(|_iM) Compound - Compound
KB KB K562
11.0 ±0.03112.3± 0.02
21.5 ±0.03121.3 ±0,21
32.0 ±0.02132.2 ± 0.08
41.2±0.11142.0 ±0.01
1.7 ±0.04151.5 ±0.03
61.9 ±0.05161.1 ±0.02
71.3± 0.02171.6 ±0.02
82.3 ± 0.05182.6 ± 0.02
91.9 ±0.07192.1 ±0.01
101.1 ±0.04201.3 ±0.03
CsAIC50 (nM)/T: 0.15±0.02 表2本发明所列肟类化合物的对未活化的T细胞的抑制IC5。值(u M)
IC50, ICsoOiM) Compound - Compound
KB K562 KB K562
10.27 ± 0.01110.34 ± 0.02
20.29± 0.01120.28 ± 0.02
30.33 ± 0.04130.29 ± 0.03
40.28 ±0.01140.32 ± 0.02
0.30 ±0.02150.27 ± 0.03
60.31 ±0.02160.29 ± 0.02
70.28 ± 0.02170.33 ±0.01
80.32 ±0.05180.29 ± 0.02
90.30 ±0.07190.34 ±0.01
100.27 ± 0.05200.26± 0.03
CsAIC50 0iM)/T: 0.19±0.02
1权利要求
一类肟类化合物，其特征是它有如下通式式中R1-为基团；R2-为基团。
2. —种制备上述的肟类化合物的方法，其特征是它由下列步骤组成步骤1.于三氟化硼乙醚溶液中，加入相应的苯酚类的化合物和相应的苯乙酸类的化合物，苯酚类的化合物和苯乙酸类的化合物的物质的量之比为i : 1，搅拌加热至80-84t:，反应2h后冷却，在搅拌下倒入乙酸钠的水溶液中，然后静止，24h后过滤出固体，将得到的固体溶于无水乙醇重结晶提纯，步骤2.将步骤1得到的提纯后的固体溶于无水乙醇，加入乙酸钠，再加入等物质的量的盐酸羟胺，搅拌加热至60°C ，直至反应完全，冷却后过滤，滤液减压蒸干，得到肟类的化合物。
3. 根据权利要求2所述的制法，其特征是所述的步骤1中，三氟化硼乙醚溶液是质量百分浓度为47. 0-47.7%三氟化硼乙醚溶液，其用量为每毫摩尔苯酚类的化合物加1. 0-1. 5ml。
4. 根据权利要求2所述的制法，其特征是所述的步骤2中，无水乙醇的用量为每毫摩尔盐酸羟胺加1.0-1.5ml。
5. 权利要求1所述的肟类化合物在制备免疫抑制药物中应用。
全文摘要
一类肟类化合物，其特征是它有如下通式其中R1为多羟基苯基，R2为取代苯甲基。本发明的肟类衍生物对活化的T细胞明显的抑制作用，而对未活化的T细胞的抑制作用较弱，因此本发明的肟类化合物可在制备免疫抑制药物中应用。本发明公开了其制法。
文档编号A61P37/00GK101693674SQ200910233389
公开日2010年4月14日 申请日期2009年10月27日 优先权日2009年10月27日
发明者朱海亮, 李环球, 骆银 申请人:南京大学;