专利名称：制备(3-三氟甲磺酰基)-n-[4-甲基-3-(4-吡啶-3-基-嘧啶-2基氨基)-苯基]-苯甲酰胺的 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及从4-甲基-2-硝基-苯胺(式(II))起始，经中间体(3-三氟甲磺 酰基)-N44-甲基-3-硝基苯基]-苯甲酰胺(式(III))、(3-三氟甲磺酰基)-N-[3-氨 基-4-甲基苯基]-苯甲酰胺(式(IV))和(3-三氟甲磺酰基)-N-[3-胍基-4-甲基苯 基]-苯甲酰胺(式(V))制备(3-三氟甲磺酰基)-N-W-甲基-3-(4-吡啶-3基-嘧啶-2 基氨基)-苯基]-苯甲酰胺(式(I))的方法。本发明还涉及制备这些中间体的方法。式 (I)化合物为如下所示，其也称为AN-024
式-1开发代码AN-02背景技术：
在于2007年10月4日公布的US 2007/0232633的实施例13以及许多其他国 家的对应申请(PCT/IN 2005/000243)中描述了式(I)的(3-三氟甲磺酰基)-N-甲 基-3-(4-吡啶-3基-嘧啶-2基氨基)_苯基]-苯甲酰胺的制备及其应用尤其是作为抗 肿瘤剂的应用。鉴于(3-三氟甲磺酰基)-N<4-甲基-3-(4-吡啶-3基-嘧啶-2基氨基)_苯 基]-苯甲酰胺(式(I))作为抗肿瘤剂对社会和保健产业的有用性，开发了一种式(I)化 合物的制备方法。
发明内容
本发明涉及中间体的制备和使用所述中间体制备式(I)的(3-三氟甲磺酰 基)-N44-甲基-3-(4-吡啶-3-基-嘧啶-2-基氨基)-苯基]-苯甲酰胺的方法。式⑴ 的(3-三氟甲磺酰基)-N- [4-甲基-3- (4-吡啶-3-基-嘧啶-2-基氨基)-苯基]-苯甲 酰胺是一种抗增殖(例如抗肿瘤)齐U。因此，本发明提供了一种制备式(I)化合物的方法，所述方法包括(如下面的路线 图1所示)(a)提供(3-三氟甲磺酰基)苯甲酰氯(式(VI))或通过常规方法制备该化合物；(b)在氯烃(chlorohydrocarbon)溶剂中于约30°C到约40°C通过加入碱的水 溶液使4-甲基-2-硝基-苯胺(式(II))与式(XI)化合物缩合，获得(3-三氟甲磺酰 基)-N-W-甲基-3-硝基苯基]-苯甲酰胺(式(III))；(c)在约0到约5°C下用氯化亚锡/浓盐酸将式(III)化合物还原约3到约4小 时，获得(3-三氟甲磺酰基)-N-[3-氨基-4-甲基苯基]-苯甲酰胺(式(IV))；(d)在正丁醇溶剂中在约90到约95°C下使式(IV)化合物与氨腈溶液发生缩合反 应，获得(3-三氟甲磺酰基)-N-[3-胍基-4-甲基苯基]-苯甲酰胺(式(V))；(e)在回流温度下在碱的存在下使式(V)化合物与式(VII)化合物缩合，获得式 ⑴化合物。在一个实施方案中，本发明提供了一种制备式(III)化合物的方法，所述方法包 括(a)提供(3-三氟甲磺酰基)苯甲酰氯(式(VI))；或通过常规方法制备该化合 物；(b)在氯烃溶剂中于约30°C到约40°C通过加入碱的水溶液使4-甲基-2-硝基 苯胺(式(II))与式(VI)化合物缩合，获得(3-三氟甲磺酰基)-N-W-甲基-3-硝基苯 基]-苯甲酰胺(式(III))。在一个实施方案中，本发明提供了一种制备(3-三氟甲磺酰基)-N_[3-氨 基-4-甲基苯基]-苯甲酰胺(式(IV))的方法，所述方法包括a)提供(3-三氟甲磺酰基)苯甲酰氯(式(VI))；或通过常规方法制备该化合物；b)在氯烃溶剂中于约30°C到约40°C通过加入碱的水溶液使4-甲基-2-硝基-苯 胺(式(II))与式(VI)化合物缩合，获得(3-三氟甲磺酰基)-N44-甲基-3-硝基苯 基]-苯甲酰胺(式(III))；c)在约0到约5°C下用氯化亚锡/浓盐酸将式(III)化合物还原约3到约4小时， 获得(3-三氟甲磺酰基)-N-[3-氨基-4-甲基苯基]-苯甲酰胺(式(IV))。在一个实施方案中，本发明提供了一种制备N-{2_(4-甲基哌嗪甲基)苯甲酰氨 基]-5-甲基}盐酸胍(式(V))的方法，所述方法包括(a)提供(3-三氟甲磺酰基)苯甲酰氯(式(VI))；或通过常规方法制备该化合 物；(b)在氯烃溶剂中于约30°C到约40°C通过加入碱的水溶液使4-甲基_2_硝基 苯胺(式(II))与式(VI)化合物缩合，获得(3-三氟甲磺酰基)-N-W-甲基-3-硝基苯 基]-苯甲酰胺(式(III))；
(c)在约0到约5°C下用氯化亚锡/浓盐酸将式(III)化合物还原约3到约4小 时，获得(3-三氟甲磺酰基)-N-[3-氨基-4-甲基苯基]-苯甲酰胺(式(IV))；(d)在正丁醇溶剂中在约90到约95°C下使式(IV)化合物与氨腈水溶液发生缩合 反应，获得(3-三氟甲磺酰基)-N-[3-胍基-4-甲基苯基]-苯甲酰胺(式(V))。
图1.用多种浓度的ΑΝ024(1-10μ g/ml)处理K562细胞。收集细胞裂解产物并按 照标准方案进行蛋白质印迹分析。测定BCR-Abl、Crk和Stat5AY694Ai99的表达水平(实施例 1)。图2.通过口服剂量的AN-OM和伊马替尼(Imatinib)，植入了 K562的裸鼠中的脾 肿大的减轻(实施例幻。通过目视检查测定脾肿大，测得对照小鼠表现出脾肿大，这表示 K562细胞局域化。ANOM处理的细胞未显示任何脾肿大，而伊马替尼处理的小鼠显示了轻 微的脾肿大。图3A和3B.在植入K5621uc人白血病细胞并用ANOM或伊马替尼处理的裸鼠中 萤光素酶表达的下降(实施例4)。浓度为lmg/kg的ANOM未引起萤光素酶表达的下降，而 5mg/kg、10mg/kg和20mg/kg的浓度导致了萤光素酶表达的下降。给予浓度为lmg/kg的伊 马替尼未引起萤光素酶表达的下降，而10mg/kg和20mg/kg的浓度显示出萤光素酶表达的 抑制。图4A、4B和4C.这些图示出了与图3A和所示类似的研究结果，但使用的是对 照药物达沙替尼(dasatinib)。图4A(实施例6)是通过口服(or)给予达沙替尼，在植入 Baf3突变细胞(wt、T315I、M351T和E255K)的裸鼠中胚细胞计数下降的图示。图4B (实施 例6)是通过口服(or)给予伊马替尼，在植入Baf3突变细胞(wt、T315I、M351T和E255K) 的裸鼠中胚细胞计数下降的图示。图4C(实施例6)是通过口服(or)给予AN-024，在植入 Baf3突变细胞(wt、T315I、M351T和E255K)的裸鼠中胚细胞计数下降的图示。图5A和5B.在进行和不进行放射的情况下，4910、5310和U87胶质瘤细胞以及 MDAMB231和观71乳腺癌细胞在指定浓度的AN-024的存在下的体外基质胶(matrigel)侵 袭测定(实施例7)。图5C.在进行和不进行放射的情况下，4910、5310和U87胶质瘤细胞以及 MDAMB231和观71乳腺癌细胞在指定浓度的AN-OM的存在下的体外血管发生测定(实施例 7)。图5D.在进行和不进行放射的情况下，4910、5310和U87胶质瘤细胞以及 MDAMB231和观71乳腺癌细胞在指定浓度的AN-024的存在下的蛋白质印迹分析(实施例7)。图6A.用AN024、AN019或伊马替尼处理后的K562uc植入小鼠的萤光素酶表达。图6B.在第58天用ANOM或AN019处理治愈的动物的数量。药物处理在第42天 停止，停止药物处理后动物继续显示出用ANOM和AN019处理后的疗效(实施例8)。图6C.在标明的日期从动物获得的血涂片的胚细胞计数。药物处理在第42天停 止。在停止药物处理后AN024和AN019依然显示出有效性。发现伊马替尼无效(实施例8)。
图7A.在进行和不进行放射(5Gy)的情况下，用TMZ、AN024或AN019处理后的裸 鼠中颅内肿瘤的半定量分析(实施例9)。图7B.用AN-OM进行药物处理但不进行放射处理后不显示颅内肿瘤的裸鼠的图 示(实施例9)。
具体实施例方式制备本发明式(I)化合物的反应路线示于下面的路线图1中。SO,CF,步驟2NHSO2CF3SO2CF3O^ INMe2步骤(YII)SO2CF3(I)路线囷1在路线图1的反应的一个实施方案中，在步骤1中，碱可为氢氧化钠或氢氧化钾， 例如，氢氧化钾。此反应可在氯烃例如二氯甲烷或氯仿例如氯仿中进行。温度可为约30°C 到约40 0C ο在一个实施方案中，步骤2中的还原可通过使用6摩尔在浓盐酸介质中的氯化亚 锡实现。在一个实施方案中，在步骤3中使用的溶剂可为正丁醇。在一个实施方案中，本发明的步骤4可在正丁醇的存在下使用氢氧化钠进行。2007年3月5日提交的美国专利申请No. 11/714，565 (2007年10月4日公布， 美国专利申请公布号US 2007/0232633)和2005年7月19日提交的PCT申请No. PCT/IN 2005/00(^43(2006年3月16日公布，PCT公布号WO 2006/027795)的公开内容以引用的方 式全文纳入本文中。下面给出的实施例描述了本发明的实施方案，提供所述实施例只是为了阐释本发 明，因此他们不应被解释为对本发明范围的限制。实施例式I的本发明化合物(以开发代码AN-OM标示)被发现显示出有效的抗增殖(例 如抗肿瘤)活性。这种抗增殖活性优于某些现有批准的此类药物。开发代码AN-019是指 发明人在别处描述的另一种同类化合物。将本发明化合物的生物有效性和活性与在本研究 中用作阳性对照的批准药物如伊马替尼甲磺酸盐和达沙替尼进行了比较。在本研究中“伊 马替尼甲磺酸盐”缩写为“伊马替尼”t施例1在棺入了 k562细朐的裸鼠中AN-024的杭CML活t牛的确定(图1)用AN-024讲行的体外研究通过蛋白质印迹分析测定了用多种浓度的AN024(1、2. 5、5或10 μ g/ml)处理12 小时的K562细胞中BCR-Abl、Crk和磷酸Mat5AY694Ai99的表达水平。观察到BCR-Abl、Crk 和磷酸Stat5AY694Ai99蛋白水平以剂量依赖的方式降低。蛋白质印迹分析用1、2. 5、5或10μ g/ml的ANOM处理K562细胞。12小时后，收集细胞，并在含有 Tris
、Triton-Xl 14 (1. 0% )、EDTA (IOmM)、抑肽酶和苯甲基磺酰氟的提取缓 冲液中制备全细胞裂解产物。通过12% SDS-PAGE在非还原条件下从这些样品中分离10 μ g 蛋白并转移到硝酸纤维素膜(Schleicher紹chuell，Keene, NH)上。按照标准方案用针对 BCR-Abl、Crk和磷酸Mat5AY694/699的抗体对所述膜检测2小时。随后将所述膜用PBS洗 涤三次以除去过量的一抗，根据需要，用合适的HRP缀合的二抗孵育，然后根据加强化学发 光方案(Amersham, ArlingtonHeights, IL)显影。MTT细胞生长测定将K562细胞用多种浓度的AN0M(1、2. 5、5或10yg/ml)处理M小时，然后进行 MTT测定以测定所处理细胞的增殖指数。测定根据产商说明书(Chemicon Temecula,CA)按 照标准方案进行。在570nm下测量光密度并通过图表表示。吸光度与存在的细胞数量成正 比，由此确定活细胞数量。AN024以剂量依赖的方式抑制BCR-Abl激酶活性。图1示出了此试验的结果。用多种浓度的ΑΝ024(1-10μβ/πι1)处理Κ562细胞。收 集细胞裂解产物并按照标准方案进行蛋白质印迹。测定BCR-Abl、Crk和Stat5AY694Ai99的表 达水平。实施例2对植入K562细胞的裸鼠注射AN024不表现脾肿大并且无Crk表达(图 21通过腹膜内(ip)注射，用伊马替尼或ANOM处理植入K562细胞的裸鼠。在观察 到白血病生长百分指数(LGI)下降后处死小鼠并采集脾脏。通过目视检查测定脾肿大，测得对照小鼠表现出脾肿大，这表示K562细胞局域化。ANOM处理的细胞未显示任何脾肿大， 而伊马替尼处理的小鼠显示了轻微的脾肿大。这些结果示于图2。针对Crk蛋白的存在情况对脾石蜡切片进行免疫检测，发现Crk表达的强局域化， 并伴随细胞密度增加，这表示对照小鼠中的K562局域化。用AN-OM处理的小鼠只显示了基 础水平的Crk表达，与阴性对照相当。用伊马替尼处理的小鼠显示出Crk表达的局域化表 达区域，表明K562细胞在脾中。对照小鼠也出现显示Crk表达的随机皮下肿瘤，表明K562 细胞的存在。根据这些结果，可明显看出ANOM处理导致裸鼠中LGI的消退。伊马替尼处理的小 鼠也表现出LGI的显著下降，但是落后于AN-OM处理的小鼠。ANOM和伊马替尼处理的小 鼠都未表现出不正常的生理、表型或行为异常。对照小鼠显示出随机皮下肿瘤的存在，伴随 足趾的损失、皮肤下的淡红色斑点以及腹部的轻微肿大。根据这些结果，可明显看出AN-OM 具有作为治疗白血病的治疗性药物的希望。^MM 3 #用Baf3伊马替原杭t牛小鼠CML细胞,系讲行的体内研究为测定ANO19和ANOM的体内抗白血病活性，将Baf 3小鼠白血病细胞(Wt、T3151、 M351T和E225K)经腹膜内途径植入裸鼠，植入后15天通过经口管饲或腹膜内注射伊马替尼 (10mg/kg)、AN019(20mg/kg)和AN024 (20mg/kg)处理小鼠。每6天经尾静脉或经股静脉获 得血涂片，对胚细胞进行计数并通过图表示出。42 天后，用伊马替尼(10mg/kg)、AN019Q0mg/kg)或 ANOMQOmg/kg)处理的植入 Baf3fft的小鼠的血涂片与正常对照的相似。用伊马替尼(10mg/kg)、AN019(20mg/kg)或ANOMQOmg/kg)处理的植入 Baf3T315I的小鼠的血涂片显示，AN024和AN019处理的小鼠中的胚细胞计数显著下降。 通过口服剂量的伊马替尼处理的小鼠未显示出胚细胞计数的下降，与未处理的对照和植入 Baf3M351T的小鼠相似。植入Baf3E255K的小鼠的表现也与植入Baf3M351T和Baf3T315I的小鼠的相似。用伊马替尼、ANO19和ANOM处理(口服和腹膜内注射)植入Baf3突变细胞Wt、 E255K、T315I和M351T的裸鼠。简言之，在植入后15天，通过经口管饲或腹膜内注射伊马 替尼(10mg/kg)、AN019(20mg/kg)或AN024(20mg/kg)处理小鼠。每日监测腹部肿胀和活性 降低，每6天经尾静脉或股静脉获得血涂片并按照标准方案进行H&E染色。植入后42天， 处死小鼠并采集脾脏。测定脾肿大，并将其与血涂片胚细胞计数相关联。MM胚细胞计数的显微镜测定每6天从植入Baf3细胞的小鼠的尾静脉或股静脉采血直至第42天。在植入后 第15天，如前文所述用伊马替尼、AN019和ANOM( 口服和腹膜内注射)处理小鼠。观察到 在植入Baf3Wt的小鼠中，胚细胞计数在所有处理条件下都不断减少。Baf3M351T、T315I和 E22^(对伊马替尼处理的反应不佳。口服伊马替尼在植入Baf3M351T、T315I和E225K的小 鼠中无显著效果。总的来讲，ANOM和AN019的腹膜内处理在减少所有植入Baf3的小鼠中 的胚细胞计数方面明显更好。在植入Baf3Wt的小鼠中的AN019处理导致白血病胚细胞的完全消退，与未处理的 正常对照的水平相当。腹膜内处理优于口服处理。在第42天，在植入Baf3M351T、T315I和E225K的小鼠中的AN019处理显示出胚细胞计数的显著下降，并且与腹膜内处理的小鼠在 植入后第12天的水平相当；腹膜内处理的小鼠显示出比口服处理的小鼠更大程度的胚细 胞的消退。在第42天，在植入Baf3M351T、T315I和E225K的小鼠中的ANOM处理显示出胚 细胞计数的显著下降，并且优于AN019处理；腹膜内处理的小鼠显示出比口服处理的小鼠 更大程度的胚细胞的消退。实施例4.棺入K562 ιΗ常/Luc人白血病细胞的棵鼠对低剂量AN024、ANO19和伊 马替尼的反应(图3A和3B)AN024、AN019和伊马替尼的口服给药
权利要求
1.一种式I的化合物式(I)(开发代码AN-024)
2. 一种治疗增殖疾病的方法，包括给予需要治疗增殖疾病的受试者下式的抗增殖化合式(I)(开发代码AN-024)
3.一种化合物，其为(3-三氟甲磺酰基)-N-W-甲基-3-硝基苯基]-苯甲酰胺。
4.一种制备(3-三氟甲磺酰基)-N-[4-甲基-3-硝基苯基]-苯甲酰胺的方法，所述方 法包括提供式VI化合物(3-三氟甲磺酰基)苯甲酰氯；在氯烃溶剂中于约30°C到约40°C通过加入碱的水溶液使4-甲基-2-硝基苯胺与式 (VI)化合物缩合，获得(3-三氟甲磺酰基)-N-W-甲基-3-硝基苯基]-苯甲酰胺。
5.一种化合物，其为(3-三氟甲磺酰基)-N-[3-氨基-4-甲基苯基]-苯甲酰胺。
6.一种制备(3-三氟甲磺酰基)-N-[3-氨基-4-甲基苯基]-苯甲酰胺的方法，所述方 法包括提供式VI化合物(3-三氟甲磺酰基)苯甲酰氯；在氯烃溶剂中于约30°C到约40°C通过加入碱的水溶液使4-甲基-2-硝基苯胺与式 (IV)化合物缩合，获得式111化合物(3-三氟甲磺酰基)-N- [4-甲基-3-硝基苯基]-苯甲 酰胺；在约0到约5°C下用氯化亚锡/浓盐酸将式(III)化合物还原约3到约4小时，获得 (3-三氟甲磺酰基)-N- [3-氨基-4-甲基苯基]-苯甲酰胺。
7.一种化合物，其为(3-三氟甲磺酰基)-N-[3-胍基-4-甲基苯基]-苯甲酰胺。
8.一种制备(3-三氟甲磺酰基)-N-[3-胍基-4-甲基苯基]-苯甲酰胺的方法，所述方 法包括提供式VI化合物(3-三氟甲磺酰基)苯甲酰氯；在氯烃溶剂中于约30°C到约40°C通过加入碱的水溶液使4-甲基-2-硝基苯胺与式 (IV)化合物缩合，获得式III化合物(3-三氟甲磺酰基)-N-[4-甲基-3-硝基苯基]-苯甲酰胺；在约0到约5°C下用氯化亚锡/浓盐酸将式(III)化合物还原约3到约4小时，获得式 (IV)化合物(3-三氟甲磺酰基)-N-[3-氨基-4-甲基苯基]-苯甲酰胺；在正丁醇溶剂中在约90°C到约95°C下使式(IV)化合物与氨腈水溶液发生缩合反应， 获得(3-三氟甲磺酰基)-N- [3-胍基-4-甲基苯基]-苯甲酰胺。
9. 一种制备式I化合物的方法式(I)(开发代码AN-024) 所述方法包括提供式VI化合物(3-三氟甲磺酰基)苯甲酰氯；在氯烃溶剂中于约30°C到约40°C通过加入碱的水溶液使4-甲基-2-硝基苯胺与式 (IV)化合物缩合，获得式III化合物(3-三氟甲磺酰基)-N-[4-甲基-3-硝基苯基]-苯甲 酰胺；在约0到约5°C下用氯化亚锡/浓盐酸将式(III)化合物还原约3到约4小时，获得式 IV化合物(3-三氟甲磺酰基)-N-[3-氨基-4-甲基苯基]-苯甲酰胺；在正丁醇溶剂中在约90°C到约95°C下使式IV化合物与氨腈水溶液发生缩合反应，获 得式V化合物(3-三氟甲磺酰基)-N- [3-胍基-4-甲基苯基]-苯甲酰胺；在回流温度下在碱的存在下使式(V)化合物与3- 二甲基氨基-1-吡啶-3-基-丙烯 酮缩合，获得式(I)化合物。
全文摘要
本发明涉及一种从4-甲基-2-硝基苯胺(式II)起始，经中间体(3-三氟甲磺酰基)-N-[4-甲基-3-硝基苯基]-苯甲酰胺(式(III))、(3-三氟甲磺酰基)-N-[3-氨基-4-甲基苯基]-苯甲酰胺(式(IV))和(3-三氟甲磺酰基)-N-[3-胍基-4-甲基苯基]-苯甲酰胺(式(V))制备(3-三氟甲磺酰基)-N-[4-甲基-3-(4-吡啶-3基-嘧啶-2基氨基)-苯基]-苯甲酰胺(式(I))的方法。本发明还涉及制备这些中间体的方法。式(I)化合物也称为AN-024。
文档编号A61P35/00GK102046617SQ200980107583
公开日2011年5月4日 申请日期2009年3月2日 优先权日2008年3月4日
发明者A·K·肯佩拉, S·拉沙康达, 布疆加·劳·阿迪巴特拉卡利萨蒂亚, 纳纳潘尼·委卡拉筹德利 申请人:纳科法尔马有限公司