专利名称：一种基于抗TNF-α单克隆抗体的用于治疗银屑病的软膏的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基于抗TNF-α单克隆抗体的用于治疗银屑病的软膏。
背景技术：
肿瘤坏死因子(TNF-α)是一种具有复杂生物活性的细胞因子，主要由巨噬细胞和T细胞产生。该物质除了能够在体内或体外杀伤肿瘤细胞外，还具有抗病毒感染、激活巨噬细胞及多形核粒细胞、促进组织相容性抗原表达、调节机体免疫机能等多种功能。但是，当TNF-α过量表达时，它与其它炎症因子一起产生多种病理损伤，如自身免疫性疾病，感染性疾病，恶液质等。因此，中和体内过量的TNF-α，可为上述疾病的治疗提供一条有效途径。目前的TNF-α拮抗药物有hfliximab (Humiral)、Etanerc印t (Enbel)、 Adalimumab (Remicade)、CDP571 禾口 CDP870, Inf liximab>Etanercept 禾口 Adalimumab 已通过 FDA批准。hfliximab是Johnson&Johnson公司研制的一种对人TNF- α具有中和活性的人鼠嵌和抗体，被FDA批准用来治疗类风湿关节炎和克罗恩病(Crohn病)，临床试验表明对银屑病关节炎、非感染性色素层炎和巩膜炎、盘状红斑狼疮和强直性脊柱炎也有一定的治疗效果。Etanerc印t是美国Immunex禾口 Wyeth—Ayerst Laboratories公司研制的基因重组 STNFR75与人IgGFc段的融合蛋白，是第一个用于临床上的基因工程可溶性受体和抗TNF药物，可同时抑制TNF-α和TNF-β，主要用来治疗类风湿关节炎、幼年性类风湿关节炎、银屑病关节炎和强直性脊柱炎。Adalimumab是Abbott公司研制的一种具有TNF- α特异中和活性的重组的完全的人IgGl单克隆抗体，被FDA批准用来治疗类风湿关节炎和Crohn病，已在临床上取得了较好的疗效。银屑病又称牛皮癣，是一种常见易复发的慢性皮肤病。据调查，该病在人群中的发病率白种人明显高于黄种人，黑种人次之。美国近年来的调查，其发病率为2.6%，患者多达600-700万人。虽然我国无关于银屑病发病率的详细研究，但有资料显示在中国就大约有300万患者，且发病率有逐渐升高的趋势。银屑病的传统治疗药物副作用大，停药后易复发。近期的研究发现，在银屑病的皮肤损伤部位，TNF-α的含量极高，说明TNF-α在银屑病的发生发展中起着重要作用；临床研究结果表明，阻断TNF-α的作用，对银屑病具有良好的治疗作用；抗TNF-α抗体是目前关注的热点，国外静注剂型已进入临床试验。虽然用抗TNF-α方法治疗多种TNF-α过量表达的相关疾病比传统的治疗方法更具有效性和安全性，但TNF-α单抗静注后可能会影响人体内的细胞因子网络，引起不良反应。如发生结核杆菌肉芽肿感染、Hodgkin淋巴瘤、药物性狼疮、凡科尼综合症、脱髓鞘病、 不眠症、肾病综合症等不良反应的发生，同时在反复用药的过程中检测到抗TNF-α拮抗药物的抗体的产生，另外还可发生注射反应、迟发性超敏反应、新引发的自身免疫反应等不良反应。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于抗TNF-α单克隆抗体的用于治疗银屑病的软膏，克服了全身应用TNF-α的诸多毒副反应，降低了用药成本，简化了用药程序。为实现上述发明的目的，采用以下技术方案来解决的一种基于抗TNF-α单克隆抗体的用于治疗银屑病的软膏，其包括以下重量份组分抗TNF- α单克隆抗体0. 33 0. 5份丙烯酰二甲基牛磺酸铵/VP共聚物(AVC) 1. 5 2. 5份聚乙二醇4000 (PEG 4000) 4 6 份丙三醇4 6份防腐剂0. 02 0. 04份水85. 127 89. 98 份。本发明各组分的最佳数值范围为抗TNF- α单克隆抗体0. 35 0. 45份丙烯酰二甲基牛磺酸铵/VP共聚物(AVC) 1. 8 2. 2份聚乙二醇4000 4. 8 5. 2 份丙三醇4. 8 5. 2份防腐剂0.0 0.031份水87 88 份。作为本发明的一种实施方式所述的抗TNF- α单克隆抗体(抗TNF- α mAb)的重链可变区基因序列SEQ ID NO. 1，其轻链可变区基因序列如SEQ ID NO. 2所示。 本发明中所述的防腐剂采用凯松。本发明通过构建分泌抗TNF- α单克隆抗体(抗TNF- α mAb)的杂交瘤细胞株和细胞株种子库，应用发酵法或SPF级小鼠制备抗TNF-α单克隆抗体；并对抗TNF-α单克隆抗体进行纯化，其中包括TNF-α单克隆抗体的检测和鉴定。然后通过建立银屑病动物模型，进行药效学研究和局部毒性研究，并进行安全性评价、动物局部刺激试验、动物血清中抗TNF-α单克隆抗体浓度检测；实验结果说明了基于抗TNF-α单克隆抗体的软膏符合对小鼠银屑病模型具有良好的治疗作用，应用灵敏度为IOpg的ElISA试剂盒进行检测，未在小鼠血清中检测到抗TNF- α mAb,说明抗TNF- α mAb软膏透皮给药但不进入血液，避免了鼠源性免疫原性问题，简化了抗TNF- α mAb人源化的复杂操作环节，安全可靠。与现有技术相比，银屑病的传统治疗药物副作用大，停药后易复发，随着银屑病免疫机制的阐明，生物治疗已成为新的发展趋势；国外静注剂型TNF-α已进入临床试验，但抗TNF-α单克隆抗体静注后可能会影响人体内的细胞因子网络，引起不良反应，局部应用具有更大的优势。本发明提供的基于抗TNF-α单克隆抗体的软膏为水溶性基质，用于治疗银屑病， 在皮肤损伤部位应用TNF-α拮抗剂，既可起到治疗作用又不引起全身应用抗TNF-α抗体所导致的不良反应；实验证实，抗TNF-α单克隆抗体软膏可完全阻断TNF-α的作用，对动物银屑病模型具有良好的治疗作用；而且抗TNF-α单克隆抗体软膏通过透皮给药但不进入血液，这样就简化单克隆抗体人源化的复杂操作环节，降低药品生产成本；抗TNF-α单克隆抗体软膏是一种安全、有效、经济的生物技术新药。
图1是本发明抗TNF-α单克隆抗体鉴别试验结果其中，1.分子量marker ；
2.阴性对照无关抗原；
3. TNF- α。
具体实施例方式以下结合通过附图和实验例以及实施例对本发明进行阐述，然而本发明的保护范围并非仅仅局限于以下实施例。所属技术领域的普通技术人员依据本发明公开的内容，均可实现本发明的目的。以下实验涉及的试剂45%聚乙二醇(PEG，MW. 4000，Merck)不完全培养液(RPMI 1640)完全培养液含20%小牛血清RPMI 1640HAT 选择培养液(Sigma)HT 培养液(Sigma)细胞冻存液50% RPMI 1640、40%小牛血清、10%二甲基亚砜1、分泌抗TNF- α单克隆抗体细胞株的构建①以重组人肿瘤坏死因子(rhTNF-α)为免疫原，经皮下、腹腔等途径多点、多次免疫8周龄雌性Balb/c小鼠。第一次免疫使用完全福氏佐剂，第二、三次使用不完全福氏佐剂，两次免疫间隔约2 3周。进行杂交瘤细胞融合前3天腹腔及尾静脉追加免疫。②无菌条件下获取最后一次加强免疫3天以后的小鼠脾脏，研磨并制成免疫脾细胞悬液；取小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0细胞为亲本另一细胞系，经8氮杂鸟嘌呤(8-AG)筛选以确保该细胞系对HAT的敏感性；以45%聚乙二醇(PEG，WL 4000, Merck)为促融剂。③在融合前一天无菌取6 10周龄Balb/c小鼠腹腔巨噬细胞作为融合用饲养细胞。④取对数生长的骨髓瘤细胞SP2/0，IOOOrpm离心5min，弃上清，用不完全培养液(RPMI1640)混悬细胞后计数，根据小鼠脾细胞数取所需SP2/0的细胞数，用不完全培养液洗涤2次；同时取免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次。将骨髓瘤细胞与脾细胞按1 10或1 5的比例混合在一起，在50ml塑料离心管内用不完全培养液洗涤1次， 1200rpm离心8min，弃上清，用滴管吸净残留液体；轻轻弹击离心管底部，使细胞沉淀略为松动。在室温下，30s内加入37°C预热的含5% DMSO的Iml 45% PEG，边加边旋转离心管， 作用90s 120s后加入37°C预热的不完全培养液终止PEG作用，每^iin内分别加入1ml， 2ml, 3ml, 4ml, 5ml和IOml不完全培养液，800rpm离心6min。弃上清，先用6ml完全培养液 (含20%小牛血清RPMI 1640)轻轻混悬，补加完全培养液至40ml，将融合后细胞悬液按 100 μ 1/孔加入含有饲养细胞的96孔板，37°C、5% CO2孵箱培养，杂交瘤细胞融合M小时后加入HAT选择培养液(Sigma)，两周后改用HT培养液(Sigma)，再维持培养两周即改用含 10%小牛血清RPMI 1640培养液。2、杂交瘤的筛选及克隆化采用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤，浓度为1 μ g/ml的rhTNF-α包被96孔ELISA板(Nunc.)，4°C过夜。PBS洗板后，加入杂交瘤培养上清，37°C，2小时孵育。辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG(Sigma)作为第二抗体，ABTS(Sigma)底物系统显色后， 测定410nm OD值。采用有限稀释法进行克隆化(参考兴界图书出版公司的(细胞培养) 手册，2004年3月第一版315-32 。连续两次克隆化后所选单个克隆，培养上清中抗体检测(间接ELISA法)均达100%阳性者，即为可稳定分泌抗rhTNF-α单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株。将所得杂交瘤细胞用10%小牛血清RPMI 1640培养液扩大培养后IOOOrpm 离心10分钟，弃上清，将细胞悬入细胞冻存液(50% RPMI 1640、40%小牛血清、10%二甲基亚砜)，分装0. 8ml/支，每支含杂交瘤细胞1 X IO6,放入液氮罐冻存。3、抗rhTNF-α单克隆抗体的制备选取8-10周龄雌性Balb/c小鼠，每只腹腔注射液态石蜡0. 5ml。一周后再腹腔注射抗rhTNF-a杂交瘤细胞1 X IO6待小鼠腹腔产生腹水(大约8_12天)后，从小鼠腹腔取腹水，然后3000rpm离心20分钟，分离腹水，-80°C冻存备用。4、抗人TNF-α单克隆抗体纯化工艺①原理Q-SePharose Fast Flow为强阴离子交换介质，具有流速快、载量高的特点。小鼠 IgG的PI范围为pH7. 0 8. 5，而白蛋白和转铁蛋白PI范围为pH4. 7 5. 0，故在中性pH 环境中Q-^^harose Fast Flow更倾向于结合腹水中的非目的蛋白。在用盐溶液梯度洗脱时，mAb会较早被洗脱或出现在穿过液中，从而可得到分离纯化的IgG。②材料和器材(一)、材料Q-SePharose Fast Flow饱和硫酸铵(NH4)2SO4溶液起始缓冲液0.02M Tris-HCI 缓冲液，pH7. 5洗脱缓冲液0.02M Tris-HCI 缓冲液，1. OM NaCI，ρΗ7· 5再生缓冲液0. IM NaOH(二)、器材XK 16/20 层析柱Ampharmacia AKTAFPLC 层析系统③操作步骤(一)、样品的准备(1)取小鼠腹水进行IOOOOrpm离心lOmin，除去腹水中的沉淀物或残存的降植烷；(幻40%饱和硫酸铵溶液沉淀腹水中蛋白质，lOOOOrpm，离心30min后弃上清，沉淀用40%饱和硫酸铵溶液洗涤2次后用生理盐水重悬；(3)用 0. 02M Tris-HCI 缓冲液，ρΗ7· 5 透析除盐。(二)、分离纯化(1)按照Q-kPharose Fast Flow生产厂家提供的说明书装柱；(2)以5ml/min的流速，用起始缓冲液充分平衡层析柱至流出液的pH值与起始缓冲液的相同；
(3)上样后以2个柱体积的起始缓冲液洗掉非结合蛋白，以递增盐浓度的洗脱液洗脱，流速5ml/min。IgG将首先被洗脱。(4)以5ml/min的流速，2个柱体积的0. IM NaOH对层析柱进行再生。(5)用起始缓冲液重新平衡层析柱，以备下次再用。5、抗rhTNF-α单克隆抗体的鉴定 ①抗rhTNF- a mAb腹水效价测定采用间接ELISA法测定抗TNF- α小鼠腹水的效价达IX IO7。②免疫球蛋白(Ig)亚类的鉴定采用美国GIBCO公司ELISA试剂盒对杂交瘤培养上清中mAb的类、亚类及型进行鉴定，结果显示mAb为IgGl型。③抗rhTNF- a mAb与大肠杆菌菌体蛋白的交叉反应以1 10的大肠杆菌菌体蛋白包被ELISA板，用间接ELISA法检测mAb与大肠杆菌菌体蛋白的交叉反应。同时，以 rhTNF-α包被ELISA板，加1 10大肠杆菌菌体蛋白封闭后，用间接ELISA法检测大肠杆菌菌体蛋白对不同浓度mAb与rhTNF-α反应的阻断作用。结果表明mAb与大肠杆菌菌体蛋白无交叉反应，且大肠杆菌菌体蛋白对mAb与rhTNF-a的反应也无抑制作用。说明了 mAb是抗rhTNF- α的抗体而非抗菌体蛋白的抗体。④抗rhTNF-a mAb与各种重组人细胞因子的交叉反应rhIL_l、rhIL-3、rhIL-6、 rhIL-8、rhTNF- β、rhIFN- α 及 rhGM-CSF 均以 1 μ g/ml 浓度包被 ELISA 板，用间接 ELISA 法检测抗rhTNF- a mAb与各种重组人细胞因子的交叉反应，结果显示抗rhTNF- a mAb与各种重组人细胞因子均无交叉反应，说明了抗rhTNF- α抗体特异性强。⑤采用抗rhTNF- a mAb阻断TNF诱导细胞发生凋亡实验进行中和活性的鉴定0. 25%胰蛋白酶消化处于对数生长期的细胞，用RPMI 1640洗涤细胞后，调整细胞浓度至 2X 106/ml。加入 3H-TdR, 20Ci/ml，置 37°C>5% CO2 培养箱中 2 3h，1 次 /30min 摇动。用RPMI 1640洗涤2次，每次洗涤后800rpmX5min离心。调整细胞浓度至2X IO5 3XlO5Ail后，按100 μ 1/孔加入96孔培养板中。在固定浓度rhTNF-a (40U/ml)中等体积加入不同稀释度mAb (0，1 IO2 1 108)，37°〇孵育301^11后，将此混合物加入含有1^拟9 细胞的培养板中，100 μ 1/孔。(设三个重复孔)。加入放线菌素D，使最终浓度至1 μ g/ml。 同时设含有1 μ g/ml放线菌素D的完全培养液为阴性对照，在37°C、5% CO2，培养Mh。加入3%胰蛋白酶和0. 25% DNA酶各10 μ 1/孔，37°C，培养30min。用DYQ-II型多头细胞收集器收集样品于“9999”型玻璃纤维滤纸上。烤干滤纸后，进行计数。提供数据，结果发现 (参见图1) :mAb对rh TNF-α诱导的细胞凋亡有很强的中和作用，当mAb的稀释度为1 2X IO6时，抑制率仍可达30%，说明mAb与rh TNF-α有特异性的高亲和力。经测序，所述的抗TNF-α单克隆抗体的重链可变区基因序列如SEQ ID NO. 1所示，轻链可变区基因序列如SEQ ID NO. 2所示。抗人肿瘤坏死因子单克隆抗体凝胶实施例一配方(100kg制备用量)丙烯酰二甲基牛磺酸铵/VP共聚物(AVC)聚乙二醇PEG 4000丙三醇
2kg 5kg 5kg
7
防腐剂(凯松)0. 03kg抗TNF- α 单克隆抗体(2. 5mg/ml)400ml (0. 4kg)7jC87. 57kg实施例二 配方(100kg制备用量)丙烯酰二甲基牛磺酸铵/VP共聚物(AVC)1.5kgPEG 40004kg丙三醇4kg防腐剂(凯松)0.02kg抗TNF- α 单克隆抗体(2. Omg/ml)500ml (0. 5kg)水89. 98kg实施例三配方(IOOkg制备用量)丙烯酰二甲基牛磺酸铵/VP共聚物(AVC)2. 5kgPEG 40006kg丙三醇6kg防腐剂(凯松)O. 04kg抗TNF- α 单克隆抗体(3. Omg/ml)333. 3ml (0. 333kg)/K85. 127kg上述实施例一 三的抗人肿瘤坏死因子单克隆抗体凝胶的制备将AVC、聚乙二醇(PEG) 4000以60°C蒸馏水搅拌溶解备用。将丙三醇(甘油)、防腐剂(凯松)、抗TNF- α mAb、水加入，勻速搅拌，600-1000rpm，持续搅拌至分散均勻即可得到半成品凝胶。取出半成品凝胶，将其移入凝胶软管灌装机中，按20g/管或IOg/管的每管装量或其他生产指令规定的标示量进行灌装，灌装好的凝胶作为成品置于4°C冷库中保存。灌装过程中应动态进行灌装量的检测，成品检测合格后进行外包装包装。外包装完成进行包装检查，合格后入库。上述实施例中包含抗TNF-α单克隆抗体的软膏药效学研究1 材料1. 1 药品恩肤霜(丙酸氯倍他索软膏)，广东通用药业股份有限公司，批号040302。肿瘤坏死因子单克隆抗体(TNFa-Mab)凝胶剂(0. 3;3mg/支、Img/支、3mg/支)，每支 IOgo1.2 动物昆明种小鼠50只，早$各半，20 Mg，购自甘肃兰州生物制品研究所，合格证号 医第14-001号。1.3仪器和设备Leca显微镜，CMIAS病理图象分析仪。2实验方法
实验动物分组表1实验动物分组表
权利要求
1.一种基于抗TNF-α单克隆抗体的用于治疗银屑病的软膏，其特征在于，其包括以下重量份组分抗TNF- α单克隆抗体0. 33 0. 5份丙烯酰二甲基牛磺酸铵/VP共聚物(AVC) 1. 5 2. 5份聚乙二醇4000 4 6份丙三醇4 6份防腐剂0. 02 0. 04份水85. 127 89. 98 份。
2.根据权利要求1基于抗TNF-α单克隆抗体的用于治疗银屑病的软膏，其特征在于， 其包括以下重量份组分抗TNF- α单克隆抗体0. 35 0. 45份丙烯酰二甲基牛磺酸铵/VP共聚物(AVC) 1. 8 2. 2份聚乙二醇40004. 8 5. 2份丙三醇4. 8 5. 2份防腐剂0. 029 0. 031份水87 88份。
3.根据权利要求1或2基于抗TNF-α单克隆抗体的用于治疗银屑病的软膏，其特征在于，所述的抗TNF-α单克隆抗体的重链可变区基因序列如SEQ ID NO. 1所示，轻链可变区基因序列如SEQ ID NO. 2所示。
4.根据权利要求3基于抗TNF-α单克隆抗体的用于治疗银屑病的软膏，其特征在于， 所述的防腐剂采用凯松。
全文摘要
本发明公开了一种基于抗TNF-α单克隆抗体的用于治疗银屑病的软膏，其包括以下重量份组分抗TNF-α单克隆抗体0.33～0.5份、丙烯酰二甲基牛磺酸铵/VP共聚物(AVC)1.5～2.5份、聚乙二醇4000 4～6份、丙三醇4～6份、防腐剂0.02～0.04份、水85.127～89.98份。该基于抗TNF-α单克隆抗体的用于治疗银屑病的软膏，既可起到治疗作用又不引起全身应用抗TNF-α抗体所导致的不良反应。
文档编号A61K9/06GK102274165SQ20101020212
公开日2011年12月14日 申请日期2010年6月13日 优先权日2010年6月13日
发明者刘节, 张英起, 赵宁 申请人:赵宁